Diss.
ETH
No.11321
phosphorylated forms
of calmodulin and the development of
new techniques for analysing cell proteins
Characterisation of
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH
for the
degree
of Doctor of Natural Sciences
Presented
Manfredo
Dipl.
born 4th
on
September
1967
Arogno (TI)
the recommendation of
Prof. Dr. Ernesto
Prof. Dr. Thomas
Dr. Peter
Quadroni
Natw. ETH
citizen of
Accepted
by
Carafoli, examiner
Leisinger, co-examiner
James, co-examiner
1995
1
Summary
Calmodulin, the main protein mediator of intracellular signal transduction
by Ca2+,
on
reported by
was
ambiguous.
and
were scarce
To
determine die sites of
phosphorylation.
isolation of calmodulin
by
quickly
very
Approximately
phosphorylation
The in vivo
mass
containing
calmodulin
the effects of
was
necessary to
was
achieved
were
correspond
phosphorylation by
this may be the enzyme
study
sites
a
fraction
necessary
was
to
as
all
stop
found to be
was
determined
of
a
to
are
perturbed.
phosphorylated.
be Thr 79, Ser 81 and
of the PCaM
digestion
to three of the four in vitro
sites of
suggesting
that
phosphorylation in vivo. To
biological activity of CaM it
for the
responsable
a
produced
for the
triphospho-calmodulin
casein kinase II (CK-II),
phosphorylation
produce
was
tissue and
developed
the liver cells
once
spectrometric analysis
fraction .These
was
living
after excision of the tissue, since PCaM
15% of CaM in the cell
by
It
spectrometric analysis.
mass
dephosphorylated
Ser 101
procedure
A
mono-, di- and
phosphatase activity immediately
is
from
from rat liver which
(CaM)
containing non-phosphorylated,
determined
the relevance of this event, it
assess
phosphocalmodulin (PCaM)
necessary to isolate
of calmodulin in vivo
phosphorylated species
the detection of
concerning
in vitro
phosphorylated
several researchers to be
casein kinase II. At the outset of this work, reports
by
Ser/Thr residues
on
the
PCaM fraction devoid of native CaM. This
by extensively phosphorylating CaM
in vitro and
isolating
by preparative non-denaturing gel electrophoresis. The fraction thus
obtained showed reduced ability to stimulate five different CaM-dependent
enzymes. The magnitude of the effect was apparently enzyme-dependent,
PCaM
since in
one
activation
case,
was
type II Ca2+-CaM dependent kinase, the diminution in
much greater than for the other CaM targets. Further work,
and
experimental methods,
combining
theoretical
establishing
the structural basis for the
phosphorylation.
phosphorylated
A
central
aimed
activity
dynamics study performed
molecular
region
changes
was
in CaM
of CaM, togemer with indirect
filtration
at
upon
on
the
experimental
experiments, suggested
gel
gel electrophoresis
CaM might be fixed in an extended conformation.
Experimental data using peptide analoga of the phosphorylated central
helix gave results contradictory to this postulate. The structural basis for
and
evidence from
that
the
phosphorylated
change in CaM activity
conditions
under
which
remain
to
casein
be elucidated,
kinase
II
as
do the
becomes
physiological
activated
and
2
CaM. In order to be able to
phosphorylates
mass
identification
different
were
of the
pattern of each
application
The
high-sensitivity protein
methodologies rely
new
of the
exploit
the
protein
with
specific protease
peptide
in the
approaches
digestion
developed.
approach this last question,
for fast and
spectrometry-based techniques
that
a
masses
will allow
techniques
electrophoretic comparison of stimulated
of these
new
peptides generated by
the
or
cells
vs.
a
fragmentation
respectively.
spectrometer,
mass
two
on
The
2D-dimensional
resting
gel
cells to trace the
signalling cascades that lead to the activation of casein kinase II. The
newly developed methodologies were first tested on a model system: the
network that allows E.coli
regulatory
conditions. When E.coli
amounts
inorganic sulphate,
of
that increase both the
proteins
respond
to
grown in
are
a
the bacteria start
starvation
sulphate
to
medium
containing limiting
expressing
sulphate uptake capacity
and the
a
set
ability
of
to
exploit
alternative (organic) sulphur sources.
These so-called SSI
(sulphate starvation induced) proteins were identified by comparative 2D
electrophoresis
were
of normal and
recovered from the
sulphate starved
gels using
a
proteins
specially developed concentration gel
E.coli
.
The SSI
apparatus and then either N-terminally sequenced and/or fragmented with
a
protease. The digests
were
analzed
by
mass
spectrometry and the data
obtained allowed the immediate identification of those
already
present in the database.
"unknown"
genomic
ones to
DNA
sequencing
sequence,
even
an
though
leading to reading
promising especially
errors
was
produced
unreleased
preliminary
E.coli
the latter contained several
frame shifts. This kind of
in
were
for 2 of the
conjunction
approach
with the
enormous
of sequence data that will be made available in the
next years
appears very
amounts
Enough data
localize the genes in
that
proteins
from the various genome
sequencing projects.
3
Riassunto
La calmodulina
intracellular! nei
secondario
e
proteina
una
e
tale
in
e
da mediatore dei
funge
(Ca2+) funge
lo ione calcio
quali
come
che
grado di interagire
processi
da messaggero
numerosi enzimi,
con
stimolandone l'attivita. Diversi studi hanno mostrato in passato che la
calmodulina pud
era
mai stato
essere
possibile
vivo. Per stabilire
se
fosforilata in vitro dalla casein chinasi II,
dimostrare
il processo
ma non
la reazione avvenga effettivamente
se
rilevanza
avesse
fisiologica,
in
necessario
era
isolare la calmodulina da tessuti normali, individuare eventuali forme
fosforilate
e
sviluppato
fegato
determinarne i siti di fosforilazione. Per questo scopo
procedimento
un
per la
purificazione
piu velocemente possibile
di ratto, mirato ad inattivare il
e
stato
della calmodulina da
tutte le
fosfatasi. Mediante questa procedura
contenente
bi-
mono-
e stato possibile isolare una frazione
trifosfocalmodulina, oltre alia forma non
e
fosforilata. Circa il 15% della
L' analisi per
spettrometria
proteina presenta
di
di
massa
piu gruppi
uno o
fosforici.
digestione proteolitica
una
della
frazione fosforilata ha permesso l'identificazione dei siti modificati nei
residui
79
(serina)
81
(treonina),
esattamente a tre
e
101
serina).
Essi
suggerendo che questo possa essere l'enzima responsabile
vivo.
Per accertare
della calmodulina,
cinque
enzimi
gli effetti
sono
calmodulin-dipendenti.
dopo
sembra
essere
e
stato
specifico
una
tentato
vitro.
mentre per
dipendente
una
fosforilazione
tipo
bersagli,
potrebbe stabilizzare
e
ipotesi.
specie
non
che la
che l'effetto
e
ottenuta
con
minore. Si
questi cambiamenti
e
la
poi
di affinita
combinando metodi teorici
regione
e
centrale
bifosforilato, hanno indicato che la
la conformazione estesa della
Tuttavia, dati sperimentali ottenuti
contraddire questa
e
su
II stimolata dalla
quella
Simulazioni di dinamica molecolare della
della calmodulina alio stato nativo
pool
di
l'attivita massima
esempio
di
frazione di
di caratterizzare le basi strutturali di
sperimentali.
biologica,
altri enzimi la differenza
della calmodulina per i suoi
un
I risultati indicano
minore attivita
fosfocalmodulina rappresenta solo
proteina nativa,
A tale scopo,
per alcuni enzimi. Per
della chinasi Ca2+/calmodulina
biologica
di attivita enzimatica
saggi
isolato mediante elettroforesi
fosforilazione in
calmodulina fosforilata ha
della reazione in
della fosforilazione sulla attivita
stati effettuati
fosforilate di calmodulina
denaturante
corrispondono
dei quattro siti modificati in vitro dalla casein chinasi II,
su
peptidi analoghi
proteina.
tendono
a
La base strutturale dei cambiamenti di attivita
4
della calmodulina rimane
fisiologici
meccanismi
da
esplorare
i
e
restano
come
alia fosforilazione della calmodulina. Per tentare in futuro di
quindi
affrontare
questi problemi,
l'identificazione
spettrometria
di
molecolare dei
specifica
metodi
rapida
e
lavorato alio
sviluppo
ad alta sensibilita delle
Queste
massa.
di nuovi metodi per
proteine,
tecniche sfruttano da
nuove
peptidi generati digerendo
con un
una
proteina
gas inerte nello spettrometro di
stati
sono
meccanismo
a
assenza
proteine
di solfato
lato il peso
con una
proteasi
ogni peptide
in
Questi nuovi
modello
come
il
E. coli di compensare la scarsita di
se
E. coli
inorganico,
che permettono da
basati sulla
un
massa.
alia prova utilizzando
che permette
nell'ambiente. Infatti,
brodo di coltura in
di
messi
regolatorio
inorganico
famiglia
e
si
dall'altro lo spettro di frammentazione di
e
collisione
solfato
dunque incerta,
che portano all'attivazione della casein chinasi II
un
viene coltivato in
i batteri
esprimono
lato di aumentare la
un
una
capacita
di
assorbimento del solfato residuo, dall'altro di sfruttare fonti alternative di
zolfo
SSI
come
sulfonati
(sulphate
bidimensionali,
esteri solforici. Sette di queste cosiddette
o
starvation
induced)
estratte con un
da
un
hanno fornito
una
o con
rilevante
le
nuove
quantita
genomiche
tecniche
proteine
in banca dati, dall'altro l'individuazione dei
sequenze
su
gel
e
sviluppate.
di dati, che ha permesso
lato l'identificazione di buona parte delle
presenti
proteine
apparecchiatura sviluppata appositamente
analizzate per sequenza N-terminale
Queste ultime
identificate
state
sono
con
proteine
corrispondenti geni
di E.coli. Inoltre i dati concernenti
in
peptidi proteolitici
hanno permesso in alcuni casi di individuare errori nelle sequenze
genomiche. Questo tipo
di sfruttare la
di sequenza
enorme
di
aproccio
quantita
genomica
appare promettente in quanto permette
di dati
messa a
totale. Combinando le
disposizione
nuove
dai vari
tecniche
per elettroforesi bidimensionale di colture cellulari stimolate
fosforo radioattivo
sara
possibile
in futuro analizzare i
che portano alia fosforilazione della calmodulina.
e
segnali
con
progetti
l'analisi
marcate con
intracellulari
