PathoDx Respiratory
Syncytial Virus Kit
IT
R62370
1. Finalità d’USO
Il kit RSV PathoDxTM è un test diretto di immunofluorescenza
per la determinazione qualitativa del virus respiratorio sinciziale
(RSV, Respiratory Syncytial Virus) su campioni diretti del paziente
preparati e successiva crescita in coltura cellulare.
2. Riassunto e spiegazione del test
Il virus respiratorio sinciziale (RSV) è la principale causa di affezioni
virali acute dell’apparato respiratorio in neonati e bambini. La
malattia si presenta in circa il 10-40% dei bambini infetti per la
prima volta.1 Tale virus è responsabile del 50% di tutti i casi di
bronchiolite e del 25% di tutti i casi di polmonite durante i primi
mesi di vita.2,3 L’infezione RSV in bambini più grandi e in adulti
si manifesta in genere con i sintomi di un comune raffreddore,
tuttavia può anche causare un’infezione importante del tratto
respiratorio inferiore in adulti, in particolare negli anziani.1
4. Reagenti
COMPONENTI DEL KIT
Respiratory Syncytial Virus
1.
Reagente per virus
respiratorio sinciziale (RSV)
2.
Liquido di montaggio
(R62230)
3.
Vetrini di controllo
per RSV (R62375)
4.
Instruzioni per l’uso
1 confezione da 5 vetrini
1
Fare riferimento anche alla sezione Avvertenze e precauzioni di
impiego.
Conservare a 2-8°C, al riparo dalla luce. Usare entro la data di
scadenza riportata sull’etichetta. Il prodotto deve essere portato
a temperatura ambiente (15-28°C) prima dell’uso.
L’aerosol con ribavirina controlla la brionchiolite e la polmonite
causata dal virus RSV.8,9 Una diagnosi rapida e precoce di infezioni
RSV è critica per l’inizio della terapia e per il controllo di infezioni
nosocomiali. È stato dimostrato che l’immunofluorescenza è
sensibile e specifica per la determinazione degli antigeni RSV in
secrezioni nasofaringee.10-13
3. PRINCIPIO del Metodo
Il PathoDx RSV Kit utilizza due anticorpi monoclonali coniugati
con fluoresceina specifici per RSV per determinare ed identificare
il virus RSV su campioni diretti del paziente e coltura cellulare
inoculata. Il singolo reagente contiene un anticorpo monoclonale
specifico per un polipeptide da 35.000-40.000 dalton e un altro
anticorpo monoclonale specifico per la proteina F (fusione). Le
cellule fissate con acetone provenienti da campioni paziente
o da coltura cellulare vengono colorate con il reagente. Gli
anticorpi monoclonali coniugati con fluoresceina reagiranno in
modo specifico con antigeni virali RSV, se presenti nella cellula.
L’anticorpo non legato e il colorante di contrasto Evans blue
vengono eliminati con soluzione fisiologica tamponata e il vetrino
viene montato con glicerolo tamponato. Gli antigeni virali RSV
mostrano una caratteristica fluorescenza verde-mela mentre le
cellule non infette si controcolorano di rosso con Evans blue sotto
microscopia a fluorescenza.
1 boccetta contagocce (cappuccio nero)
DESCRIZIONE, PREPARAZIONE PER L’USO E RACCOMANDAZIONI
PER LA CONSERVAZIONE
Il virus RSV è prevalente a livello mondiale e causa ogni anno
nel periodo invernale epidemie di malattie respiratorie, in
particolare nei climi temperati.3 Il virus è molto contagioso, con
bambini infetti che diffondono il virus per 1-2 settimane dopo il
ricovero in ospedale e complessivamente fino a 2-3 settimane.4
A causa dell’elevata infettività del virus RSV e della ricomparsa
dell’infezione, nonostante la presenza degli anticorpi5,6 in
circolazione, il virus RSV è diventato la causa più frequente di
infezioni nosocomiali nei reparti pediatrici.7
Questi studi dimostrano che è possibile usare anticorpi altamente
specifici all’RSV per la determinazione di antigeni in un campione
diretto del paziente nonché in coltura cellulare.
100 test (R62370)
1 boccetta contagocce (cappuccio grigio)
Reagente per virus respiratorio sinciziale
(RSV)
Una boccetta contagocce in plastica
contenente 5,0 ml di anticorpi monoclonali
di topo purificati coniugati con fluoresceina
specifici per RSV, colorante di contrasto Evans
Blue, un inibitore di colorazione aspecifica,
in una soluzione tamponata stabilizzata con
proteina, contenente sodio azide allo 0,098%
come conservante.
Liquido di montaggio
Una boccetta contagocce in plastica
contenente 5,0 ml di fluido di montaggio,
composto da glicerolo tamponato contenente
sodio azide allo 0,01% come conservante.
Vetrini di controllo per RSV
Cinque vetrini confezionati singolarmente
in confezioni metallizzate sigillate, con
dessiccante. Ciascun vetrino di controllo
contiene un pozzetto positivo e uno negativo
rispettivamente con cellule infette (RSV, ceppo
Long) e cellule non infette HEp-2, fissate con
acetone. Prima dell’uso, portare il vetrino
a temperatura ambiente (15-28°C) nella
confezione metalizzata. Estrarre il vetrino
afferrandolo solo dai bordi.
5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI DI IMPIEGO
Esclusivamente per uso diagnostico in vitro.
Esclusivamente per uso professionale.
Per informazioni su componenti potenzialmente pericolosi,
fare riferimento ai prospetti informativi sulla sicurezza forniti
dal produttore e alle informazioni riportate sulle etichette dei
prodotti.
PRECAUZIONI DI SICUREZZA
campioni entro 2 giorni, essi devono essere congelati a -70°C.
1.
7. Procedura
MATERIALE FORNITO
Al reagente, come agente antibatterico, è stata aggiunta
la sodio azide a una concentrazione inferiore a 0,1%. Per
evitare la formazione di azidi di metallo esplosive a contatto
con tubazioni in piombo o rame, il reagente può essere
gettato nella rete fognaria solo se diluito e irrigato con grandi
volumi di acqua. Usare impianti di scarico privi di rame e
piombo, laddove possibile.
2.
Campioni clinici: è necessario attenersi alle precauzioni di
sicurezza durante la manipolazione e il trattamento di tutti
i campioni clinici, poiché possono essere presenti organismi
patogeni. È necessario seguire buone pratiche di laboratorio
durante la manipolazione di colture sospette contenenti
virus infettivi.
3.
Rifiuti: sterilizzare tutti i rifiuti prima dello smaltimento, in
conformità con le procedure di laboratorio standard e le
normative locali.
4.
Nel Reagente è presente il colorante blu di Evans. Sebbene
la concentrazione presente sia inferiore alla percentuale
necessaria affinché il prodotto sia classificato come
cancerogeno, è necessario evitare il contatto con la pelle.
5.
L’acetone (non fornito) è un solvente organico infiammabile.
Usare in una zona ben ventilata lontano da qualunque
potenziale sorgente di accensione.
PRECAUZIONI ANALITICHE
Questo prodotto non deve essere usato se (1) è trascorsa la data
di scadenza o (2) se sono presenti segni di deterioramento.
6. PRELIEVO, CONSERVAZIONE E TRASPORTO DEI
CAMPIONI
Prelievo dei campioni: il virus RSV può essere isolato da una
varietà di campioni respiratori, compresi i tamponi della gola e
l’espettorato di adulti. Lavaggi o tamponi nasofaringei e tamponi
della gola sono le sorgenti più comuni per l’isolamento del
virus. Per ottenere risultati ottimali, è necessario prelevare i
campioni 1-3 giorni dopo l’inizio dei sintomi.14 I laboratori devono
definire le procedure per il prelievo e il trasporto dei campioni
che soddisfano al meglio le loro esigenze. È possibile trovare
direttive e consigli in numerosi manuali da laboratorio di larga
diffusione.14-16 Il recupero virale portato a termine con successo
necessita di un rapido trasporto e trattamento dei campioni.
Secrezioni nasofaringee: le secrezioni nasofaringee sono
i campioni consigliati. È adeguato effettuare un aspirato
nasofaringeo diretto o un lavaggio nasofaringeo. Per il prelievo
di un aspirato è possibile utilizzare una cannula di alimentazione
pediatrica morbida, sterile, in polietilene, misura n. 8 collegata
a un contenitore di aspirazione monouso o a una siringa da 10
ml. Per il prelievo ottimale di un lavaggio è possibile instillare
e aspirare 1-2 ml di soluzione fisiologica sterile o di soluzione
fisiologica tamponata con fosfato (PBS) in un solo movimento con
un bulbo di gomma da 1 oncia (28,35 g). Combinare il lavaggio con
un uguale volume di terreno di trasporto virale.
Tamponi nasofaringei: i campioni devono essere prelevati dalla
nasofaringe con un tampone di cotone sterile o di dacron e
collocati nel terreno di trasporto virale.
Trasporto e conservazione: porre immediatamente tutti i campioni
nel terreno di trasporto virale. Trasportare il terreno al laboratorio
in ghiaccio. Il virus RSV è termo-labile. I campioni devono essere
inoculati nelle cellule per la coltura quanto prima possibile. Evitare
il congelamento dei campioni. Se non è possibile inoculare i
Il Respiratory Syncytial Virus Kit (R62370) contiene materiale
sufficiente per 100 test (fare riferimento a Componenti del kit).
MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO
1.
Usare il terreno di trasporto virale (VTM), noto come non
inibente la crescita di RSV o di cellule in coltura15
2.
Acetone (di qualità reagente o migliore) conservato in
contenitore di vetro
3.
Vetrini per microscopio con pozzetti di 7-10 mm di diametro
con rivestimento idrofobo resistente all’acetone. I pozzetti
devono essere sufficientemente distanziati per evitare
scambi di campione o reagente (circa 5 mm)
4.
Provette di coltura da 16×125 mm o fiale “shell vial” da una
dracma con 12 mm diametro, copri oggetto n. 1, contenente
cellule idonee per l’isolamento del virus RSV. Le cellule
HEp–2 sono consigliate per l’isolamento
5.
Centrifuga con una capacità di almeno 700×g per il
trattamento di campioni paziente
6.
Ceppi RSV noti come controlli, ad esempio ceppo Long
(ATCC® VR26), 9320 (ATCC® VR955) o isolati di laboratorio
precedentemente identificati
7.
Terreno di mantenimento della coltura del tessuto [Eagle’s
Minimal Essential Medium con 2% di siero bovino fetale,
0,8 g/l di bicarbonato di sodio e antibiotici (100-250 U/ml
di penicillina G e 100 µg/ml di streptomicina o 5-10 µg/ml
di gentamicina o equivalente)]
8.
Pipette graduate sterili: 1, 5 e 10 ml
9.
Pipette di Pasteur sterili
10. Pinza con punta fine
11. Soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS: 0,01 M di
fosfato di sodio, 0,15 M di cloruro di sodio, pH 7,2-7,4, privo
di ioni di calcio e di magnesio)
12. Copri oggetto n. 1 da 22×50 mm
13. Ciotola, contenitore Coplin o flacone per lavaggio vetrini
14. Carta assorbente per asciugare i vetrini
15. Camera umida oscurata idonea per l’incubazione di vetrini
16. Incubatore in grado di mantenere 37°C
17. Microscopio a fluorescenza con filtri per fluoresceina
(eccitazione massima: 490 nm, emissione massima: 520
nm) con obiettivi di ingrandimento da 160-250 e 400-630
18. Centrifuga con supporto in grado di contenere fiale da una
dracma, opzionale (solo per coltura “shell vial” migliorata
tramite centrifugazione)
PROCEDURA DEL TEST
Trattamento dei campioni
Fase 1 Agitare i campioni su vortex con numerosi granuli
di vetro per ottenere il rilascio di qualunque virus
associato alle cellule.
Fase 2 Centrifugare l’eluato del tampone o la secrezione
nasofaringea trattata a 600×g per 5 minuti per ottenere
un pellet cellulare.
Fase 3
Rimuovere il sovranatante tramite aspirazione con una
pipetta sterile, rimuovere il muco e conservare questo
sovranatante di campioni trattati per l’inoculo di “shell
vial” e/o coltura in provetta. Sospendere di nuovo il
pellet cellulare con 5 ml di soluzione fisiologica sterile
tamponata di fosfato (PBS), pH 7,0-7,6.
Fase 4 Centrifugare le cellule a 600×g per 5 minuti e ripetere
ancora una volta il lavaggio PBS, se necessario, per
rimuovere qualunque muco residuo che possa produrre
una fluorescenza aspecifica.
Fase 5 Dopo l’ultimo lavaggio, rimuovere solo 100-200 µl del
sovranatante. Sospendere di nuovo il pellet cellulare
nel fluido restante pipettando delicatamente su e in
giù per ottenere una sospensione uniforme.
Preparazione diretta del vetrino campione
Fase 1 Porre 20-30 µl del campione trattato su un pozzetto
da 6-8 mm di un vetrino per microscopio adeguato.
Lasciare asciugare completamente il campione all’aria.
Fase 2 Fissare il vetrino con acetone per 10 minuti a temperatura
ambiente. Rimuovere il vetrino dall’acetone e asciugarlo
all’aria (i vetrini possono essere conservati a 2-8°C al
massimo per una settimana prima della colorazione).
Inoculazione di colture di cellule
Oltre alle fiale “shell vial”, è vivamente consigliata
l’inoculazione di colture in provetta per aumentare la
probabilità di isolare l’RSV e per recuperare altri virus.
È necessario inoculare colture di cellule suscettibili in
conformità con le procedure standard.7,14,17 Quando si
utilizza il saggio “shell vial” amplificato per rotazione,
è necessario inoculare fiale “shell vial” doppie in modo
da poter colorare il campione dopo 24 e 48 ore.
Le colture di controllo positivo costituite da ceppi
conosciuti di RSV, ad es. ceppo Long (ATCC® VR26)
o 9320 (ATCC® VR955) devono essere inoculate in
“shell vial” e/o colture in provetta con ciascun gruppo
di campioni paziente per garantire di aver seguito la
procedura di coltura e di rilevamento.
Il fibroblasto del polmone umano (WI-38 o MRC-5) o
le cellule Rhesus dei reni di scimmia sono adatti per
il recupero del virus RSV. Linee continue di cellule
epiteliali umane quali HeLa o HEp-2 sembrano essere
le linee cellulari più sensibili per l’isolamento primario
di RSV. Le cellule HEp-2 sono quelle maggiormente
utilizzate per la crescita. Al momento dell’inoculo, le
cellule devono essere esaminate al microscopio per
la determinazione della qualità e della sub-confluenza
(confluente dal 50 al 75%) al fine di garantire la massima
sensibilità.1,14
Procedura di coltura cellulare “shell vial”
È necessario inoculare fiale “shell vial” doppie per
ciascun campione paziente per ottenere la massima
sensibilità con una shell vial incubata per 24 ore e l’altra
incubata per 48 ore. Le fiale “shell vial” (con cappucci)
contenenti cellule HEp-2 sane o altre cellule sensibili
dovranno essere utilizzate per l’inoculo.1,14
Fase 1 Usare 0,2 ml di campione trattato per inoculare ciascuna
fiala “shell vial” nella quale è stato appena aspirato il
terreno di coltura. Non lasciare asciugare il monostrato
cellulare.
Fase 2
Richiudere la fiala con il cappuccio e centrifugare
ciascuna fiala a 700×g per un’ora a temperatura
ambiente.
Fase 3 Dopo la centrifuga, aggiungere un nuovo terreno di
mantenimento del tessuto, pre-riscaldato (35-37°C).
Fase 4 Incubare le fiale “shell vial” a 35-37°C: una fiala per 24
ore e l’altra per 48 ore.
Procedura di coltura in provetta
Fase 1 Rimuovere il terreno di coltura da una linea cellulare
adeguata coltivata in provette di coltura di vetro
(16×125 mm).
Fase 2 Inoculare 0,2 ml di campione trattato in ciascuna
coltura in provetta. Si consiglia di eseguire una doppia
inoculazione di tutti i campioni clinici per aumentare
la sensibilità.
Fase 3 Incubare le provette per un’ora a 35-37°C.
Fase 4 Rimuovere l’inoculo e aggiungere 2 ml di terreno
di mantenimento della coltura di tessuto, nuovo e
preriscaldato.
Fase 5 Incubare le provette a 35-37°C con o senza rotazione
ed esaminare regolarmente il monostrato della coltura
per un effetto citopatico specifico (CPE) tipico del virus
RSV (ad es., formazione del sincizio nelle cellule HEp-2).
Il tipico valore CPE appare solitamente entro 3-7 giorni
dall’inoculo. I campioni senza CPE a 7-10 giorni possono
essere analizzati in cieco sia con le cellule che con il
terreno per confermare l’assenza del virus.
Procedura di colorazione
Tutti i componenti devono trovarsi a temperatura
ambiente prima della colorazione. Miscelare
completamente i reagenti dell’anticorpo facendo
girare delicatamente i flaconi. Attenzione: adottare
una tecnica sterile per l’intera procedura di test.
Colorazione di strisci diretti del campione
Oltre ai campioni paziente, è necessario analizzare il
vetrino di controllo per RSV per verificare le prestazioni
dei reagenti.
Fase 1 Porre una o due gocce di reagente per virus respiratorio
sinciziale (RSV) sul pozzetto, verificando che il reagente
ricopra l’intero pozzetto. Nel vetrino di controllo per
RSV, porre il reagente per virus respiratorio sinciziale
(RSV) su ciascun pozzetto.
Fase 2 Porre il vetrino in una camera umida a 37°C per 1530 minuti.
Fase 3 Lavare il vetrino con un getto di PBS da una pipetta di
Pasteur orientata nella parte superiore e laterale del
pozzetto per 5-10 secondi.
Fase 4 Picchiettare o assorbire il PBS in eccesso dal vetrino e
montare con liquido di montaggio PathoDx® e un copri
oggetto. Rimuovere eventuali bolle d’aria e il fluido di
montaggio in eccesso con carta assorbente.
Fase 5 Esaminare tramite microscopia a fluorescenza con un
ingrandimento da 100 a 400.
Preparazione e colorazione delle “shell vial”
Fase 1 Aspirare il terreno di mantenimento in modo da non
distruggere il monostrato cellulare sul copri oggetto
all’interno della fiala.
Fase 2 Sciacquare due volte il monostrato con 1 ml di PBS,
aggiunto all’interno della fiala per evitare la distruzione
del monostrato cellulare.
Fase 3 Dopo aver aspirato il lavaggio finale, aggiungere
immediatamente 1 ml di acetone.
Fase 4 Aspirare l’acetone e aggiungere 1 ml di acetone nuovo.
Lasciare le fiale in posa per 10 minuti a temperatura
ambiente.
Fase 5 Rimuovere l’acetone e lasciare asciugare il monostrato
cellulare (se il copri oggetto non deve essere colorato
immediatamente, richiudere la fiala e conservarla a
una temperatura di -20°C o inferiore. Quando il copri
oggetto è pronto per essere colorato, lasciare che la fiala
raggiunga la temperatura ambiente prima di togliere il
tappo).
Fase 6 Sciacquare la fiala con 1 ml di PBS per aumentare la
coesione superficiale. Aspirare il PBS dalla fiala prima
di aggiungere i reagenti di tipizzazione.
Fase 7 Aggiungere due o tre gocce di reagente per virus
respiratorio sinciziale (RSV) (circa 150 µl) nella fiala,
verificando che il reagente ricopra l’intero copri oggetto.
Fase 8 Richiudere la fiala e incubare a 35-37°C per 1530 minuti.
Fase 9 Aspirare il reagente per virus respiratorio sinciziale (RSV)
e lavare due volte con 1 ml di PBS.
Fase 10 Rimuovere il copri oggetto con un ago o pinze curve e
picchiettare delicatamente o toccare il bordo del copri
oggetto con carta assorbente per rimuovere la quantità
di PBS in eccesso.
Fase 11 Montare ciascun copri oggetto su un vetrino per
microscopio in vetro posizionandolo con il lato con
cellule rivolto verso il basso su una goccia di liquido di
montaggio PathoDx.
Fase 12 Rimuovere dal copri oggetto eventuali bolle d’aria e il
fluido di montaggio in eccesso con carta assorbente.
Esaminare tramite microscopia a fluorescenza
utilizzando un ingrandimento da 100 a 400.
Trattamento e colorazione di cellule nelle provette di coltura
Fase 1 Quando il monostrato della coltura mostra il CPE,
rimuovere il terreno di crescita dalla provetta e porlo
in una provetta sterile per un ulteriore passaggio, se
necessario.
Fase 2 Sciacquare il monostrato con PBS sterile e aspirare.
Aggiungere 0,5 ml di PBS sterile.
Fase 3 Raschiare e rimuovere le cellule dalla superficie della
provetta utilizzando una pipetta di Pasteur. Usare una
pipetta nuova per ciascun isolato.
Fase 4 Utilizzando la stessa pipetta, aspirare delicatamente la
sospensione cellulare per ottenere una sospensione
a una sola cellula. Deve essere presente una quantità
sufficiente di cellule affinché la sospensione appaia
visibilmente torbida.
Fase 5
Mettere 20-30 µl di sospensione cellulare in un pozzetto
di un vetrino pulito. Cambiare i puntali della pipetta per
ciascun campione. Lasciare asciugare completamente
il vetrino all’aria.
Fase 6 Porre il vetrino in un contenitore Coplin o ciotola e
fissare con acetone a temperatura ambiente per 10
minuti. Gettare l’acetone ogni 10-12 vetrini.
Fase 7 Rimuovere il vetrino dall’acetone e lasciar asciugare
completamente all’aria. Se il vetrino non può essere
colorato immediatamente, è possibile conservarlo a
-20°C con dessiccante in un contenitore chiuso.
Fase 8 Porre una o due gocce di reagente per virus respiratorio
sinciziale (RSV) sul pozzetto, verificando che il reagente
ricopra l’intero pozzetto.
Fase 9 Porre il vetrino in una camera umida a 35-37°C per
15-30 minuti.
Fase 10 Lavare il vetrino con un getto di PBS da una pipetta di
Pasteur orientata nella parte superiore e laterale del
pozzetto per 5-10 secondi.
Fase 11 Picchiettare o assorbire il PBS in eccesso dal vetrino e
montare con liquido di montaggio PathoDx e un copri
oggetto. Rimuovere eventuali bolle d’aria e il fluido di
montaggio in eccesso con carta assorbente.
Fase 12 Esaminare tramite microscopia a fluorescenza con un
ingrandimento da 100 a 400.
Microscopio
I copri oggetto delle fiale “shell vial” e i vetrini della
coltura di cellule in provetta devono essere letti
immediatamente con l’ausilio di un microscopio
a fluorescenza con ingrandimento di 160-250. La
morfologia di cellule infette può essere confermata
con ingrandimenti di 400-630. Se necessario, i vetrini
possono essere conservati al buio a 2-8°C e letti entro
24 ore. Prima di eseguire la lettura, portare i vetrini a
temperatura ambiente. Effettuata la lettura, i vetrini
possono essere conservati a -20°C.
8. Note sulla tecnica
1.
L’acetone assorbirà l’umidità in assenza di adeguata
conservazione. Tale umidità causerà un intorbidamento
aspecifico durante il processo di fissazione. In tal caso, usare
una boccetta di acetone nuovo e ripetere il saggio.
2.
Non congelare i campioni prima dell’inoculazione nella
coltura di cellule se non assolutamente necessario. Il virus
RSV non può resistere al congelamento.
3.
Non lasciare asciugare il reagente per virus respiratorio
sinciziale (RSV) sul copri oggetto o sul vetrino. L’eventuale
asciugatura produrrà la colorazione nel perimetro del copri
oggetto o del vetrino. Verificare che vi sia colorazione
sufficiente per coprire il copri oggetto o il pozzetto e che la
provetta “shell vial” sia saldamente chiusa o che la camera
d’incubazione sia ben umidificata per impedire l’asciugatura.
4.
La fluorescenza di fondo non associata alla colorazione
superficiale può essere il risultato di un lavaggio insufficiente
che provoca la rimozione incompleta del coniugato di
fluoresceina. In tal caso, rimuovere il copri oggetto, lavarlo
completamente con PBS e rimontarlo.
5.
Un fluorescenza giallo-verde opaca può essere provocata
dal coniugato catturato dalle cellule aggregate che rendono
difficoltosi la fissazione e il lavaggio. Evitare l’osservazione
di questa area del copri oggetto o del pozzetto.
6.
È necessario rimuovere la maggior quantità possibile di
muco da un campione per eliminare l’occorrenza di reazioni
falso-positive e falso-negative con gli anticorpi fluorescenti.
Prestare la massima attenzione durante l’interpretazione di
campioni di striscio diretti in presenza di muco.
9. CONTROLLO DI QUALITÀ
Per verificare la specificità e il tipo di colorazione di ciascun
reagente, è necessario includere un vetrino di controllo per RSV
con ogni lotto di vetrini campione diretti.
I controlli positivi per colture di cellule devono essere preparati
con un ceppo RSV di laboratorio noto, ad es., Long (ATCC®
VR26) o 9320 (ATCC® VR955) oppure con un isolato clinico
precedentemente identificato.
I controlli negativi per le colture di cellule devono essere infettati
in modo fittizio con un terreno di mantenimento e trattati allo
stesso modo dei campioni clinici per dimostrare l’efficacia della
procedura della coltura cellulare e dei reagenti di rilevamento
RSV.
10. INTERPRETAZIONI
NOTA: i risultati devono essere interpretati da un tecnico
addestrato all’utilizzo di un microscopio a fluorescenza.
Vetrini campione diretti: leggere prima il vetrino di controllo per
RSV per determinare l’intensità di reazione e il tipo di colorazione.
La qualità del campione dovrà essere valutata successivamente
contando il numero di cellule presenti sul vetrino. Un campione
soddisfacente ha circa 200 cellule sul vetrino con almeno 2 cellule
epiteliali colonnari per campo di 250X.1,17
Risultato positivo: le cellule sono di tipo citoplasmico granulare
con una brillante fluorescenza verde-mela in cellule colonnari e
mononucleari infette.
Risultato negativo: le cellule mostrano solo una colorazione
di contrasto rosso scuro e hanno una minima fluorescenza
aspecifica.
Preparazioni per copri oggetto “shell vial” colorati e per coltura
in provetta: esaminare prima i controlli osservando la colorazione
di contrasto rossa del controllo non infetto e l’intensità della
fluorescenza del controllo infetto.
Risultato positivo: le cellule sono di tipo citoplasmico granulare
con una brillante fluorescenza verde-mela in contrasto con il
fondo rosso. Le cellule infette possono apparire come cellule
singole o multinucleate, a seconda della durata e dello stadio
dell’infezione.
Risultato negativo: le cellule mostrano solo una colorazione
di contrasto rosso scuro e hanno una minima fluorescenza
aspecifica.
11. LIMITAZIONI
1.
La determinazione del virus RSV in campioni diretti e in
coltura dipende dal prelievo adeguato dei campioni, dal
loro trasporto, dalla tecnica di coltura del tessuto e dalla
preparazione del vetrino.
2.
Una prolungata esposizione alla luce del vetrino colorato
ridurrà anche l’intensità della fluorescenza.
3.
Il reagente attivo (Reagente per virus respiratorio sinciziale
(RSV)) è pronto per l’uso ed è ottimizzato per il rilevamento
degli antigeni RSV. La diluizione o un’alterazione del reagente
attivo può produrre perdita di sensibilità o diminuzione di
fluorescenza.
4.
L’intensità della fluorescenza osservata dipende dalle
proprietà del microscopio a fluorescenza utilizzato. Il
tipo di microscopio e l’obiettivo, l’età e il tipo di sorgente
luminosa, il gruppo filtro e lo spessore, ecc., sono tutti
fattori che possono influire sulle prestazioni del test. L’uso
di un controllo positivo aiuta a monitorare il corretto
funzionamento del microscopio a fluorescenza.
5.
La presenza di fluorescenza specifica con un test di campione
diretto per RSV con un risultato di coltura negativo può
verificarsi quando il kit rileva la presenza di antigeni specifici
dell’RSV non realizzabili nel campione diretto.
6.
Un risultato che mostra solo cellule con colorazione di
contrasto rosso scuro su copri oggetto “shell vial” non
esclude la possibilità di un’infezione da RSV. Per tale motivo,
è necessario effettuare le colture in provetta per passare al
valore CPE. Se tali colture sono negative al termine di dieci
giorni, le cellule e il sovranatante devono essere di nuovo
trasferiti in un altro gruppo di colture. Se alla fine dei dieci
giorni questo secondo gruppo non mostra alcun valore CPE,
è possibile riportare che nel campione non è stato rilevato
alcun virus RSV.
7.
L’interpretazione dei risultati deve comprendere la
valutazione clinica del paziente e altre procedure
diagnostiche. Se si sospetta fortemente la presenza del
virus RSV è necessario presentare un altro campione.
8.
Gli effetti della terapia antivirale sui risultati ottenuti da
questo kit di test sono sconosciuti.
9.
È possibile riscontrare una colorazione aspecifica come
artefatto per via del legame fra le regioni Fc dell’anticorpo
e le proteine A e G presenti nella parete cellulare di alcuni
ceppi di Staphylococcus aureus. Questo reagente contiene
un inibitore di tale reazione.
12. RISULTATI ATTESI
Nei mesi autunnali, invernali e primaverili non è insolito trovare
un’incidenza di RSV positivo nel 25-50% dei neonati e bambini
sottoposti al test di infezioni del tratto respiratorio inferiore.1 I
risultati possono variare in base alla popolazione, alla posizione
geografica e al periodo dell’anno. Mentre gli adulti e i bambini
maggiori di 8 anni presentano infezioni RSV lievi o asintomatiche,
i neonati e i bambini contraggono spesso delle infezioni al tratto
respiratorio inferiore con le relative complicanze. L’RSV può
anche essere una causa insolita di infezione del tratto respiratorio
inferiore negli adulti, in particolare negli anziani.1
13. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE
Allo scopo di dimostrare la specificità del test RSV PathoDx, i
seguenti virus e linee cellulari sono stati colorati con reagente
per virus respiratorio sinciziale (RSV). Sono stati acquistati vetrini
del substrato per coltura cellulare infettati da virus oppure i virus
sono stati coltivati su monostrati di coltura cellulare e colorati
quando era evidente il valore CPE 2+. Nessuno dei 25 campioni
di tipi diversi di virus e ceppi o nessuna delle sei linee cellulari
elencate qui sotto, quando sottoposti a test almeno una volta, ha
mostrato una fluorescenza con il reagente per virus respiratorio
sinciziale (RSV).
Microrganismo­
Adenovirus tipo 3­
Adenovirus tipo 5­
Adenovirus tipo 7­
Adenovirus tipo 10­
Adenovirus tipo 14­
Virus Coxsackie A9­
Virus Coxsackie B4­
Citomegalovirus­
Echovirus 4­
Echovirus 20­
Echovirus 22­
Virus dell’Herpes simplex I­
Virus dell’Herpes simplex I­
Influenza A­
Influenza B­
Morbillo­
Parotite­
Parainfluenza 1­
Parainfluenza 2­
Parainfluenza 3­
Rinovirus 32­
Rinovirus 39­
Varicella-zoster­
Ceppo­
ATCC® VR3­
ATCC® VR5­
ATCC® VR7­
ATCC® VR11­
ATCC® VR15­
ATCC® VR186­
ATCC® VR184­
Isolato clinico­
ATCC® VR34­
ATCC® VR50­
ATCC® VR52­
Ceppo MacIntyre­
Ceppo MS­
Isolato clinico­
Isolato clinico­
Isolato clinico­
Isolato clinico­
Isolato clinico­
Isolato clinico­
Isolato clinico­
ATCC® VR329­
ATCC® VR340­
Isolato clinico­
presenza di focolai. Dopo che i monostrati della coltura hanno
mostrato un valore CPE di almeno 2+ (10-50 focolai), questi sono
stati preparati e colorati con il metodo PathoDx e il metodo di
riferimento.
Confrontando strisci diretti colorati con RSV PathoDx e con il
Kit A, un totale di 67 sottoposti a test sono risultati positivi con
entrambi i metodi e 520 sottoposti a test sono risultati negativi
con entrambi i metodi; tuttavia, 8/520 che erano risultati negativi
tramite lo striscio diretto sono stati confermati positivi tramite il
metodo di riferimento della coltura in provetta. Due campioni di
strisci diretti sottoposti a test sono risultati positivi con PathoDx e
negativi con il Kit A, tuttavia questi sono stati confermati positivi
tramite il metodo “shell vial” e il metodo di riferimento della
coltura in provetta (Tabella 1).
Tabella 1
Strisci diretti RSV PathoDx rispetto a strisci
diretti Kit A (n = 589)
­
Strisci diretti
PathoDx RSV
+­
–­
Strisci diretti RSV Kit A
+­
–­
67­
2­
0­
520­
Due ceppi bovini di RSV ATCC® VR794 e ATCC® VR1339 hanno
fornito una colorazione positiva con il test RSV PathoDx®.
Limiti di confidenza del 95% rispettivamente per la sensibilità
relativa e la specificità: 93,2% - 100% e 98,5% - 99,9%.
Linee cellulari
Rene di scimmia verde africana
Rene di scimmia cynomolgus primaria
Rene di scimmia Rhesus primaria
Rene di scimmia Rhesus
HF (prepuzio umano)
Rene canino Madin-Darby
La concordanza fra gli strisci diretti RSV PathoDx e il metodo di
coltura “shell vial” Kit A era pari al 96,4% (568/589 - Tabella 2).
A–549­
Vero­
HEp–2­
LLC-MK2­
WI–38­
MRC–5­
14. STUDI CLINICI
In uno studio eseguito in due centri, uno nella zona mediooccidentale e l’altro nella zona nord-occidentale, è stato
sottoposto al test dell’RSV un numero complessivo di 594
campioni (308 maschi, 285 femmine, 1 non segnalato; da neonati
fino a 98 anni) prelevati da pazienti con affezioni acute del tratto
respiratorio inferiore. I campioni (sangue, tampone/lavaggi della
gola, espettorati di adulti, tamponi/secrezioni nasofaringee,
tessuto per biopsia) sono stati analizzati seguendo le procedure
del produttore utilizzando RSV PathoDx e il Kit A, il metodo di
riferimento (anche un metodo diretto FA). (Tabella 8).
Sono stati preparati due vetrini da un pozzetto con ciascun
campione. I vetrini sono stati fissati e successivamente colorati
con PathoDx o reagenti FA disponibili in commercio ed esaminati
tramite microscopia a fluorescenza.
Quattro fiale “shell vial” contenenti cellule HEp-2 sane sono
state inoculate con ciascun campione, due per ogni gruppo di
reagenti del produttore, utilizzando la metodologia della coltura
“shell vial” amplificata tramite rotazione. I duplicati delle fiale
“shell vial” sono stati incubati, un gruppo per 16-24 ore e l’altro
per 40-48 ore. Dopodiché si sono colorate le “shell vial”. Se il
test di una delle due fiale “shell vial” ha dato risultato negativo,
ciascun copri oggetto degli altri due copri oggetto restanti per il
campione è stato colorato dopo 40-48 ore con i metodi PathoDx®
e Kit A. Quando entrambe le fiale “shell vial” si sono colorate
positivamente all’RSV dopo 16-24 ore d’incubazione, le restanti
fiale “shell vial” sono state scartate.
Anche le provette di coltura tradizionali sono state inoculate
con ciascun campione conformemente alle procedure standard.
Durante l’incubazione per un periodo massimo di 4 settimane,
le provette della coltura sono state monitorate per verificare la
Tabella 2
Strisci diretti RSV PathoDx rispetto a coltura
“shell vial” Kit A (n = 589)
­
Strisci diretti
PathoDx RSV
+­
–­
“Shell Vial” RSV Kit A
+­
–­
58
11­
10­
510­
Limiti di confidenza del 95% rispettivamente per la sensibilità
relativa e la specificità: 74,2% - 92,3% e 96,1% - 98,9%.
La concordanza fra gli strisci diretti RSV PathoDx e il metodo di
coltura in provetta Kit A era pari al 95,4% (562/589 - Tabella 3).
Tabella 3
Strisci diretti RSV PathoDx rispetto a coltura in
provetta Kit A (n = 589)
­
Strisci diretti
PathoDx RSV
+­
–­
Coltura in provetta RSV Kit A
+­
–­
59
10­
17­
503
Limiti di confidenza del 95% rispettivamente per la sensibilità
relativa e la specificità: 66,4% - 86,1% e 96,3% - 99,0%.
Si sono ottenuti eccellenti risultati qualitativi quando sono stati
confrontati i metodi di coltura “shell vial” amplificata tramite
rotazione RSV PathoDx e Kit A (Tabella 4). Su 594 campioni, 69
sottoposti a test sono risultati positivi con il metodo “shell vial”
e 524 sottoposti a test sono risultati negativi per ciascun metodo
“shell vial” (concordanza 99,8%; sensibilità relativa 100%;
specificità relativa 99,8%). Un campione il cui test è risultato
positivo con il metodo “shell vial” PathoDx e negativo con il
metodo “shell vial” Kit A è stato confermato positivo da entrambi
i metodi di riferimento della coltura in provetta PathoDx e Kit A.
Un campione il cui test è risultato negativo da entrambi i metodi
“shell vial” è stato confermato positivo da entrambi i metodi di
riferimento della coltura in provetta.
Tabella 4
Coltura “shell vial” RSV PathoDx rispetto alla
coltura “shell vial” Kit A (n = 594)
­
+­
–­
“Shell vial”
PathoDx RSV
“Shell vial” RSV Kit A
+­
–­
69
1­
0
524
Limiti di confidenza del 95% rispettivamente per la sensibilità
relativa e la specificità: 93,4% - 100% e 98,8% - 100%.
Successivamente sono stati confrontati i risultati derivanti da
entrambi i metodi di coltura in provetta. È stata riscontrata una
completa concordanza fra i metodi di coltura in provetta RSV
PathoDx e Kit A (sensibilità relativa 100%; specificità relativa 100%
(Tabella 5).
Tabella 5
Coltura in provetta RSV PathoDx rispetto alla
coltura in provetta Kit A (n = 593)
­
Coltura in provetta
PathoDx® RSV
+­
–­
Coltura in provetta RSV Kit
+­
–­
77
0­
0
516
Tabella 8
RSV PathoDx rispetto a Kit A
PDx RSV
Kit A RSV­
Strisci diretti
Shell vial
Coltura in provetta
+
+
67­
69­
77­
–
–
520­
524­
516­
–
+
0­
0­
0­
+
–
2­
1­
0­
Sensibilità
relativa
589­
100%­
594­
100%­
593­
100%­
n
Specificità
relativa
99,6%­
99,8%­
100%­
15. BIBLIOGRAFIA
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Lennette,E.H., P. Halonen, and H.A. Murphy 1988. Laboratory
Diagnosis of Infectious Diseases: Principles and Practice. Vol. 2.
Springer-Verlag, New York, NY.
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R.E. Shope.1985. Virology. Raven Press, New York, NY.
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White, D.O. and F. Fenner. 1986. Medical Virology, 3rd ed. Academic
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8.
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Limiti di confidenza del 95% rispettivamente per la sensibilità
relativa e la specificità: 94,1% - 100% e 99,1% - 100%.
9.
Taber, L.H., et al. 1983. Pediatrics. 72:613-618.
La concordanza fra i metodi di coltura in provetta e striscio diretto
RSV PathoDx® era pari al 95,4% (561/588 - Tabella 6).
11. Kaul, A., et al.1978. Am. J. Dis. Child. 132:1088-1090.
Tabella 6
Strisci diretti RSV PathoDx rispetto a coltura in
provetta RSV PathoDx (n = 588)
13. Minnich, L. and C.G. Ray. 1982. J. Clin. Microbiol. 12:391-394.
­
Strisci diretti
PathoDx RSV
+­
–­
Coltura in provetta RSV PathoDx
+­
–­
59
10­
17
502
Limiti di confidenza del 95% rispettivamente per la sensibilità
relativa e la specificità: 66,4% - 86,1% e 96,3% - 99,0%.
L­ a concordanza fra i metodi di coltura “shell vial” e di coltura in
provetta RSV PathoDx era pari al 98,5% (584/593 - Tabella 7).
Tabella 7
“Shell vial” RSV PathoDx rispetto a coltura in
provetta RSV PathoDx (n = 593)
­
“Shell vial”
PathoDx RSV
+­
–­
Coltura in provetta RSV PathoDx
+­
–­
69
1­
8
515
Limiti di confidenza del 95% rispettivamente per la sensibilità
relativa e la specificità: 80,0% - 95,1% e 98,8% - 100%.
La prevalenza osservata di RSV nelle popolazioni oggetto dello
studio, definita dal metodo di coltura in provetta, era di circa il
15% per il centro 1 e del 10% per il centro 2. Sulla base dei valori
di sensibilità e specificità complessivi per la coltura “shell vial”
amplificata tramite rotazione PathoDx rispetto alla coltura di
cellule tradizionale, i valori di previsione positivi e negativi sono
stati calcolati per una popolazione a prevalenza ipoteticamente
bassa (2,5%) e alta (15%). Nel 2,5% della popolazione, i valori di
previsione per un risultato positivo e negativo sono stati calcolati
come rispettivamente del 92,0% e del 99,7%. I valori di previsione
positivi e negativi per il 15% della popolazione sono stati stimati
rispettivamente pari al 98,8% e al 98,2%.
10. McQuillin, J. and P.S. Gardner.1968. Br. Med. J. 1:602-605.
12. Laur, B.A. 1982. J. Clin. Microbiol. 16:411-412.
14. Wiedbrauk, D.L. and S.L.G. Johnston. 1993. Manual of Clinical Virology.
Raven Press, New York, NY.
15. Spector, S. and G. Lancz. 1986. Clinical Virology Manual. Elsevier, New
York, NY.
16. Murray, P.R., E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller, and R.H. Yolken.
2003. Manual of Clinical Microbiology. 8th ed., Vol II. ASM, Washington,
D.C.
17. Costello, M.J., et al. 1993. Lab. Med. 24:150-157.
16. CONFEZIONE
R62370.........................................................100 Test/Kit
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