PathoDx Respiratory Syncytial Virus Kit [IT]
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PathoDx Respiratory Syncytial Virus Kit IT R62370 1. Finalità d’USO Il kit RSV PathoDxTM è un test diretto di immunofluorescenza per la determinazione qualitativa del virus respiratorio sinciziale (RSV, Respiratory Syncytial Virus) su campioni diretti del paziente preparati e successiva crescita in coltura cellulare. 2. Riassunto e spiegazione del test Il virus respiratorio sinciziale (RSV) è la principale causa di affezioni virali acute dell’apparato respiratorio in neonati e bambini. La malattia si presenta in circa il 10-40% dei bambini infetti per la prima volta.1 Tale virus è responsabile del 50% di tutti i casi di bronchiolite e del 25% di tutti i casi di polmonite durante i primi mesi di vita.2,3 L’infezione RSV in bambini più grandi e in adulti si manifesta in genere con i sintomi di un comune raffreddore, tuttavia può anche causare un’infezione importante del tratto respiratorio inferiore in adulti, in particolare negli anziani.1 4. Reagenti COMPONENTI DEL KIT Respiratory Syncytial Virus 1. Reagente per virus respiratorio sinciziale (RSV) 2. Liquido di montaggio (R62230) 3. Vetrini di controllo per RSV (R62375) 4. Instruzioni per l’uso 1 confezione da 5 vetrini 1 Fare riferimento anche alla sezione Avvertenze e precauzioni di impiego. Conservare a 2-8°C, al riparo dalla luce. Usare entro la data di scadenza riportata sull’etichetta. Il prodotto deve essere portato a temperatura ambiente (15-28°C) prima dell’uso. L’aerosol con ribavirina controlla la brionchiolite e la polmonite causata dal virus RSV.8,9 Una diagnosi rapida e precoce di infezioni RSV è critica per l’inizio della terapia e per il controllo di infezioni nosocomiali. È stato dimostrato che l’immunofluorescenza è sensibile e specifica per la determinazione degli antigeni RSV in secrezioni nasofaringee.10-13 3. PRINCIPIO del Metodo Il PathoDx RSV Kit utilizza due anticorpi monoclonali coniugati con fluoresceina specifici per RSV per determinare ed identificare il virus RSV su campioni diretti del paziente e coltura cellulare inoculata. Il singolo reagente contiene un anticorpo monoclonale specifico per un polipeptide da 35.000-40.000 dalton e un altro anticorpo monoclonale specifico per la proteina F (fusione). Le cellule fissate con acetone provenienti da campioni paziente o da coltura cellulare vengono colorate con il reagente. Gli anticorpi monoclonali coniugati con fluoresceina reagiranno in modo specifico con antigeni virali RSV, se presenti nella cellula. L’anticorpo non legato e il colorante di contrasto Evans blue vengono eliminati con soluzione fisiologica tamponata e il vetrino viene montato con glicerolo tamponato. Gli antigeni virali RSV mostrano una caratteristica fluorescenza verde-mela mentre le cellule non infette si controcolorano di rosso con Evans blue sotto microscopia a fluorescenza. 1 boccetta contagocce (cappuccio nero) DESCRIZIONE, PREPARAZIONE PER L’USO E RACCOMANDAZIONI PER LA CONSERVAZIONE Il virus RSV è prevalente a livello mondiale e causa ogni anno nel periodo invernale epidemie di malattie respiratorie, in particolare nei climi temperati.3 Il virus è molto contagioso, con bambini infetti che diffondono il virus per 1-2 settimane dopo il ricovero in ospedale e complessivamente fino a 2-3 settimane.4 A causa dell’elevata infettività del virus RSV e della ricomparsa dell’infezione, nonostante la presenza degli anticorpi5,6 in circolazione, il virus RSV è diventato la causa più frequente di infezioni nosocomiali nei reparti pediatrici.7 Questi studi dimostrano che è possibile usare anticorpi altamente specifici all’RSV per la determinazione di antigeni in un campione diretto del paziente nonché in coltura cellulare. 100 test (R62370) 1 boccetta contagocce (cappuccio grigio) Reagente per virus respiratorio sinciziale (RSV) Una boccetta contagocce in plastica contenente 5,0 ml di anticorpi monoclonali di topo purificati coniugati con fluoresceina specifici per RSV, colorante di contrasto Evans Blue, un inibitore di colorazione aspecifica, in una soluzione tamponata stabilizzata con proteina, contenente sodio azide allo 0,098% come conservante. Liquido di montaggio Una boccetta contagocce in plastica contenente 5,0 ml di fluido di montaggio, composto da glicerolo tamponato contenente sodio azide allo 0,01% come conservante. Vetrini di controllo per RSV Cinque vetrini confezionati singolarmente in confezioni metallizzate sigillate, con dessiccante. Ciascun vetrino di controllo contiene un pozzetto positivo e uno negativo rispettivamente con cellule infette (RSV, ceppo Long) e cellule non infette HEp-2, fissate con acetone. Prima dell’uso, portare il vetrino a temperatura ambiente (15-28°C) nella confezione metalizzata. Estrarre il vetrino afferrandolo solo dai bordi. 5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI DI IMPIEGO Esclusivamente per uso diagnostico in vitro. Esclusivamente per uso professionale. Per informazioni su componenti potenzialmente pericolosi, fare riferimento ai prospetti informativi sulla sicurezza forniti dal produttore e alle informazioni riportate sulle etichette dei prodotti. PRECAUZIONI DI SICUREZZA campioni entro 2 giorni, essi devono essere congelati a -70°C. 1. 7. Procedura MATERIALE FORNITO Al reagente, come agente antibatterico, è stata aggiunta la sodio azide a una concentrazione inferiore a 0,1%. Per evitare la formazione di azidi di metallo esplosive a contatto con tubazioni in piombo o rame, il reagente può essere gettato nella rete fognaria solo se diluito e irrigato con grandi volumi di acqua. Usare impianti di scarico privi di rame e piombo, laddove possibile. 2. Campioni clinici: è necessario attenersi alle precauzioni di sicurezza durante la manipolazione e il trattamento di tutti i campioni clinici, poiché possono essere presenti organismi patogeni. È necessario seguire buone pratiche di laboratorio durante la manipolazione di colture sospette contenenti virus infettivi. 3. Rifiuti: sterilizzare tutti i rifiuti prima dello smaltimento, in conformità con le procedure di laboratorio standard e le normative locali. 4. Nel Reagente è presente il colorante blu di Evans. Sebbene la concentrazione presente sia inferiore alla percentuale necessaria affinché il prodotto sia classificato come cancerogeno, è necessario evitare il contatto con la pelle. 5. L’acetone (non fornito) è un solvente organico infiammabile. Usare in una zona ben ventilata lontano da qualunque potenziale sorgente di accensione. PRECAUZIONI ANALITICHE Questo prodotto non deve essere usato se (1) è trascorsa la data di scadenza o (2) se sono presenti segni di deterioramento. 6. PRELIEVO, CONSERVAZIONE E TRASPORTO DEI CAMPIONI Prelievo dei campioni: il virus RSV può essere isolato da una varietà di campioni respiratori, compresi i tamponi della gola e l’espettorato di adulti. Lavaggi o tamponi nasofaringei e tamponi della gola sono le sorgenti più comuni per l’isolamento del virus. Per ottenere risultati ottimali, è necessario prelevare i campioni 1-3 giorni dopo l’inizio dei sintomi.14 I laboratori devono definire le procedure per il prelievo e il trasporto dei campioni che soddisfano al meglio le loro esigenze. È possibile trovare direttive e consigli in numerosi manuali da laboratorio di larga diffusione.14-16 Il recupero virale portato a termine con successo necessita di un rapido trasporto e trattamento dei campioni. Secrezioni nasofaringee: le secrezioni nasofaringee sono i campioni consigliati. È adeguato effettuare un aspirato nasofaringeo diretto o un lavaggio nasofaringeo. Per il prelievo di un aspirato è possibile utilizzare una cannula di alimentazione pediatrica morbida, sterile, in polietilene, misura n. 8 collegata a un contenitore di aspirazione monouso o a una siringa da 10 ml. Per il prelievo ottimale di un lavaggio è possibile instillare e aspirare 1-2 ml di soluzione fisiologica sterile o di soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) in un solo movimento con un bulbo di gomma da 1 oncia (28,35 g). Combinare il lavaggio con un uguale volume di terreno di trasporto virale. Tamponi nasofaringei: i campioni devono essere prelevati dalla nasofaringe con un tampone di cotone sterile o di dacron e collocati nel terreno di trasporto virale. Trasporto e conservazione: porre immediatamente tutti i campioni nel terreno di trasporto virale. Trasportare il terreno al laboratorio in ghiaccio. Il virus RSV è termo-labile. I campioni devono essere inoculati nelle cellule per la coltura quanto prima possibile. Evitare il congelamento dei campioni. Se non è possibile inoculare i Il Respiratory Syncytial Virus Kit (R62370) contiene materiale sufficiente per 100 test (fare riferimento a Componenti del kit). MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO 1. Usare il terreno di trasporto virale (VTM), noto come non inibente la crescita di RSV o di cellule in coltura15 2. Acetone (di qualità reagente o migliore) conservato in contenitore di vetro 3. Vetrini per microscopio con pozzetti di 7-10 mm di diametro con rivestimento idrofobo resistente all’acetone. I pozzetti devono essere sufficientemente distanziati per evitare scambi di campione o reagente (circa 5 mm) 4. Provette di coltura da 16×125 mm o fiale “shell vial” da una dracma con 12 mm diametro, copri oggetto n. 1, contenente cellule idonee per l’isolamento del virus RSV. Le cellule HEp–2 sono consigliate per l’isolamento 5. Centrifuga con una capacità di almeno 700×g per il trattamento di campioni paziente 6. Ceppi RSV noti come controlli, ad esempio ceppo Long (ATCC® VR26), 9320 (ATCC® VR955) o isolati di laboratorio precedentemente identificati 7. Terreno di mantenimento della coltura del tessuto [Eagle’s Minimal Essential Medium con 2% di siero bovino fetale, 0,8 g/l di bicarbonato di sodio e antibiotici (100-250 U/ml di penicillina G e 100 µg/ml di streptomicina o 5-10 µg/ml di gentamicina o equivalente)] 8. Pipette graduate sterili: 1, 5 e 10 ml 9. Pipette di Pasteur sterili 10. Pinza con punta fine 11. Soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS: 0,01 M di fosfato di sodio, 0,15 M di cloruro di sodio, pH 7,2-7,4, privo di ioni di calcio e di magnesio) 12. Copri oggetto n. 1 da 22×50 mm 13. Ciotola, contenitore Coplin o flacone per lavaggio vetrini 14. Carta assorbente per asciugare i vetrini 15. Camera umida oscurata idonea per l’incubazione di vetrini 16. Incubatore in grado di mantenere 37°C 17. Microscopio a fluorescenza con filtri per fluoresceina (eccitazione massima: 490 nm, emissione massima: 520 nm) con obiettivi di ingrandimento da 160-250 e 400-630 18. Centrifuga con supporto in grado di contenere fiale da una dracma, opzionale (solo per coltura “shell vial” migliorata tramite centrifugazione) PROCEDURA DEL TEST Trattamento dei campioni Fase 1 Agitare i campioni su vortex con numerosi granuli di vetro per ottenere il rilascio di qualunque virus associato alle cellule. Fase 2 Centrifugare l’eluato del tampone o la secrezione nasofaringea trattata a 600×g per 5 minuti per ottenere un pellet cellulare. Fase 3 Rimuovere il sovranatante tramite aspirazione con una pipetta sterile, rimuovere il muco e conservare questo sovranatante di campioni trattati per l’inoculo di “shell vial” e/o coltura in provetta. Sospendere di nuovo il pellet cellulare con 5 ml di soluzione fisiologica sterile tamponata di fosfato (PBS), pH 7,0-7,6. Fase 4 Centrifugare le cellule a 600×g per 5 minuti e ripetere ancora una volta il lavaggio PBS, se necessario, per rimuovere qualunque muco residuo che possa produrre una fluorescenza aspecifica. Fase 5 Dopo l’ultimo lavaggio, rimuovere solo 100-200 µl del sovranatante. Sospendere di nuovo il pellet cellulare nel fluido restante pipettando delicatamente su e in giù per ottenere una sospensione uniforme. Preparazione diretta del vetrino campione Fase 1 Porre 20-30 µl del campione trattato su un pozzetto da 6-8 mm di un vetrino per microscopio adeguato. Lasciare asciugare completamente il campione all’aria. Fase 2 Fissare il vetrino con acetone per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il vetrino dall’acetone e asciugarlo all’aria (i vetrini possono essere conservati a 2-8°C al massimo per una settimana prima della colorazione). Inoculazione di colture di cellule Oltre alle fiale “shell vial”, è vivamente consigliata l’inoculazione di colture in provetta per aumentare la probabilità di isolare l’RSV e per recuperare altri virus. È necessario inoculare colture di cellule suscettibili in conformità con le procedure standard.7,14,17 Quando si utilizza il saggio “shell vial” amplificato per rotazione, è necessario inoculare fiale “shell vial” doppie in modo da poter colorare il campione dopo 24 e 48 ore. Le colture di controllo positivo costituite da ceppi conosciuti di RSV, ad es. ceppo Long (ATCC® VR26) o 9320 (ATCC® VR955) devono essere inoculate in “shell vial” e/o colture in provetta con ciascun gruppo di campioni paziente per garantire di aver seguito la procedura di coltura e di rilevamento. Il fibroblasto del polmone umano (WI-38 o MRC-5) o le cellule Rhesus dei reni di scimmia sono adatti per il recupero del virus RSV. Linee continue di cellule epiteliali umane quali HeLa o HEp-2 sembrano essere le linee cellulari più sensibili per l’isolamento primario di RSV. Le cellule HEp-2 sono quelle maggiormente utilizzate per la crescita. Al momento dell’inoculo, le cellule devono essere esaminate al microscopio per la determinazione della qualità e della sub-confluenza (confluente dal 50 al 75%) al fine di garantire la massima sensibilità.1,14 Procedura di coltura cellulare “shell vial” È necessario inoculare fiale “shell vial” doppie per ciascun campione paziente per ottenere la massima sensibilità con una shell vial incubata per 24 ore e l’altra incubata per 48 ore. Le fiale “shell vial” (con cappucci) contenenti cellule HEp-2 sane o altre cellule sensibili dovranno essere utilizzate per l’inoculo.1,14 Fase 1 Usare 0,2 ml di campione trattato per inoculare ciascuna fiala “shell vial” nella quale è stato appena aspirato il terreno di coltura. Non lasciare asciugare il monostrato cellulare. Fase 2 Richiudere la fiala con il cappuccio e centrifugare ciascuna fiala a 700×g per un’ora a temperatura ambiente. Fase 3 Dopo la centrifuga, aggiungere un nuovo terreno di mantenimento del tessuto, pre-riscaldato (35-37°C). Fase 4 Incubare le fiale “shell vial” a 35-37°C: una fiala per 24 ore e l’altra per 48 ore. Procedura di coltura in provetta Fase 1 Rimuovere il terreno di coltura da una linea cellulare adeguata coltivata in provette di coltura di vetro (16×125 mm). Fase 2 Inoculare 0,2 ml di campione trattato in ciascuna coltura in provetta. Si consiglia di eseguire una doppia inoculazione di tutti i campioni clinici per aumentare la sensibilità. Fase 3 Incubare le provette per un’ora a 35-37°C. Fase 4 Rimuovere l’inoculo e aggiungere 2 ml di terreno di mantenimento della coltura di tessuto, nuovo e preriscaldato. Fase 5 Incubare le provette a 35-37°C con o senza rotazione ed esaminare regolarmente il monostrato della coltura per un effetto citopatico specifico (CPE) tipico del virus RSV (ad es., formazione del sincizio nelle cellule HEp-2). Il tipico valore CPE appare solitamente entro 3-7 giorni dall’inoculo. I campioni senza CPE a 7-10 giorni possono essere analizzati in cieco sia con le cellule che con il terreno per confermare l’assenza del virus. Procedura di colorazione Tutti i componenti devono trovarsi a temperatura ambiente prima della colorazione. Miscelare completamente i reagenti dell’anticorpo facendo girare delicatamente i flaconi. Attenzione: adottare una tecnica sterile per l’intera procedura di test. Colorazione di strisci diretti del campione Oltre ai campioni paziente, è necessario analizzare il vetrino di controllo per RSV per verificare le prestazioni dei reagenti. Fase 1 Porre una o due gocce di reagente per virus respiratorio sinciziale (RSV) sul pozzetto, verificando che il reagente ricopra l’intero pozzetto. Nel vetrino di controllo per RSV, porre il reagente per virus respiratorio sinciziale (RSV) su ciascun pozzetto. Fase 2 Porre il vetrino in una camera umida a 37°C per 1530 minuti. Fase 3 Lavare il vetrino con un getto di PBS da una pipetta di Pasteur orientata nella parte superiore e laterale del pozzetto per 5-10 secondi. Fase 4 Picchiettare o assorbire il PBS in eccesso dal vetrino e montare con liquido di montaggio PathoDx® e un copri oggetto. Rimuovere eventuali bolle d’aria e il fluido di montaggio in eccesso con carta assorbente. Fase 5 Esaminare tramite microscopia a fluorescenza con un ingrandimento da 100 a 400. Preparazione e colorazione delle “shell vial” Fase 1 Aspirare il terreno di mantenimento in modo da non distruggere il monostrato cellulare sul copri oggetto all’interno della fiala. Fase 2 Sciacquare due volte il monostrato con 1 ml di PBS, aggiunto all’interno della fiala per evitare la distruzione del monostrato cellulare. Fase 3 Dopo aver aspirato il lavaggio finale, aggiungere immediatamente 1 ml di acetone. Fase 4 Aspirare l’acetone e aggiungere 1 ml di acetone nuovo. Lasciare le fiale in posa per 10 minuti a temperatura ambiente. Fase 5 Rimuovere l’acetone e lasciare asciugare il monostrato cellulare (se il copri oggetto non deve essere colorato immediatamente, richiudere la fiala e conservarla a una temperatura di -20°C o inferiore. Quando il copri oggetto è pronto per essere colorato, lasciare che la fiala raggiunga la temperatura ambiente prima di togliere il tappo). Fase 6 Sciacquare la fiala con 1 ml di PBS per aumentare la coesione superficiale. Aspirare il PBS dalla fiala prima di aggiungere i reagenti di tipizzazione. Fase 7 Aggiungere due o tre gocce di reagente per virus respiratorio sinciziale (RSV) (circa 150 µl) nella fiala, verificando che il reagente ricopra l’intero copri oggetto. Fase 8 Richiudere la fiala e incubare a 35-37°C per 1530 minuti. Fase 9 Aspirare il reagente per virus respiratorio sinciziale (RSV) e lavare due volte con 1 ml di PBS. Fase 10 Rimuovere il copri oggetto con un ago o pinze curve e picchiettare delicatamente o toccare il bordo del copri oggetto con carta assorbente per rimuovere la quantità di PBS in eccesso. Fase 11 Montare ciascun copri oggetto su un vetrino per microscopio in vetro posizionandolo con il lato con cellule rivolto verso il basso su una goccia di liquido di montaggio PathoDx. Fase 12 Rimuovere dal copri oggetto eventuali bolle d’aria e il fluido di montaggio in eccesso con carta assorbente. Esaminare tramite microscopia a fluorescenza utilizzando un ingrandimento da 100 a 400. Trattamento e colorazione di cellule nelle provette di coltura Fase 1 Quando il monostrato della coltura mostra il CPE, rimuovere il terreno di crescita dalla provetta e porlo in una provetta sterile per un ulteriore passaggio, se necessario. Fase 2 Sciacquare il monostrato con PBS sterile e aspirare. Aggiungere 0,5 ml di PBS sterile. Fase 3 Raschiare e rimuovere le cellule dalla superficie della provetta utilizzando una pipetta di Pasteur. Usare una pipetta nuova per ciascun isolato. Fase 4 Utilizzando la stessa pipetta, aspirare delicatamente la sospensione cellulare per ottenere una sospensione a una sola cellula. Deve essere presente una quantità sufficiente di cellule affinché la sospensione appaia visibilmente torbida. Fase 5 Mettere 20-30 µl di sospensione cellulare in un pozzetto di un vetrino pulito. Cambiare i puntali della pipetta per ciascun campione. Lasciare asciugare completamente il vetrino all’aria. Fase 6 Porre il vetrino in un contenitore Coplin o ciotola e fissare con acetone a temperatura ambiente per 10 minuti. Gettare l’acetone ogni 10-12 vetrini. Fase 7 Rimuovere il vetrino dall’acetone e lasciar asciugare completamente all’aria. Se il vetrino non può essere colorato immediatamente, è possibile conservarlo a -20°C con dessiccante in un contenitore chiuso. Fase 8 Porre una o due gocce di reagente per virus respiratorio sinciziale (RSV) sul pozzetto, verificando che il reagente ricopra l’intero pozzetto. Fase 9 Porre il vetrino in una camera umida a 35-37°C per 15-30 minuti. Fase 10 Lavare il vetrino con un getto di PBS da una pipetta di Pasteur orientata nella parte superiore e laterale del pozzetto per 5-10 secondi. Fase 11 Picchiettare o assorbire il PBS in eccesso dal vetrino e montare con liquido di montaggio PathoDx e un copri oggetto. Rimuovere eventuali bolle d’aria e il fluido di montaggio in eccesso con carta assorbente. Fase 12 Esaminare tramite microscopia a fluorescenza con un ingrandimento da 100 a 400. Microscopio I copri oggetto delle fiale “shell vial” e i vetrini della coltura di cellule in provetta devono essere letti immediatamente con l’ausilio di un microscopio a fluorescenza con ingrandimento di 160-250. La morfologia di cellule infette può essere confermata con ingrandimenti di 400-630. Se necessario, i vetrini possono essere conservati al buio a 2-8°C e letti entro 24 ore. Prima di eseguire la lettura, portare i vetrini a temperatura ambiente. Effettuata la lettura, i vetrini possono essere conservati a -20°C. 8. Note sulla tecnica 1. L’acetone assorbirà l’umidità in assenza di adeguata conservazione. Tale umidità causerà un intorbidamento aspecifico durante il processo di fissazione. In tal caso, usare una boccetta di acetone nuovo e ripetere il saggio. 2. Non congelare i campioni prima dell’inoculazione nella coltura di cellule se non assolutamente necessario. Il virus RSV non può resistere al congelamento. 3. Non lasciare asciugare il reagente per virus respiratorio sinciziale (RSV) sul copri oggetto o sul vetrino. L’eventuale asciugatura produrrà la colorazione nel perimetro del copri oggetto o del vetrino. Verificare che vi sia colorazione sufficiente per coprire il copri oggetto o il pozzetto e che la provetta “shell vial” sia saldamente chiusa o che la camera d’incubazione sia ben umidificata per impedire l’asciugatura. 4. La fluorescenza di fondo non associata alla colorazione superficiale può essere il risultato di un lavaggio insufficiente che provoca la rimozione incompleta del coniugato di fluoresceina. In tal caso, rimuovere il copri oggetto, lavarlo completamente con PBS e rimontarlo. 5. Un fluorescenza giallo-verde opaca può essere provocata dal coniugato catturato dalle cellule aggregate che rendono difficoltosi la fissazione e il lavaggio. Evitare l’osservazione di questa area del copri oggetto o del pozzetto. 6. È necessario rimuovere la maggior quantità possibile di muco da un campione per eliminare l’occorrenza di reazioni falso-positive e falso-negative con gli anticorpi fluorescenti. Prestare la massima attenzione durante l’interpretazione di campioni di striscio diretti in presenza di muco. 9. CONTROLLO DI QUALITÀ Per verificare la specificità e il tipo di colorazione di ciascun reagente, è necessario includere un vetrino di controllo per RSV con ogni lotto di vetrini campione diretti. I controlli positivi per colture di cellule devono essere preparati con un ceppo RSV di laboratorio noto, ad es., Long (ATCC® VR26) o 9320 (ATCC® VR955) oppure con un isolato clinico precedentemente identificato. I controlli negativi per le colture di cellule devono essere infettati in modo fittizio con un terreno di mantenimento e trattati allo stesso modo dei campioni clinici per dimostrare l’efficacia della procedura della coltura cellulare e dei reagenti di rilevamento RSV. 10. INTERPRETAZIONI NOTA: i risultati devono essere interpretati da un tecnico addestrato all’utilizzo di un microscopio a fluorescenza. Vetrini campione diretti: leggere prima il vetrino di controllo per RSV per determinare l’intensità di reazione e il tipo di colorazione. La qualità del campione dovrà essere valutata successivamente contando il numero di cellule presenti sul vetrino. Un campione soddisfacente ha circa 200 cellule sul vetrino con almeno 2 cellule epiteliali colonnari per campo di 250X.1,17 Risultato positivo: le cellule sono di tipo citoplasmico granulare con una brillante fluorescenza verde-mela in cellule colonnari e mononucleari infette. Risultato negativo: le cellule mostrano solo una colorazione di contrasto rosso scuro e hanno una minima fluorescenza aspecifica. Preparazioni per copri oggetto “shell vial” colorati e per coltura in provetta: esaminare prima i controlli osservando la colorazione di contrasto rossa del controllo non infetto e l’intensità della fluorescenza del controllo infetto. Risultato positivo: le cellule sono di tipo citoplasmico granulare con una brillante fluorescenza verde-mela in contrasto con il fondo rosso. Le cellule infette possono apparire come cellule singole o multinucleate, a seconda della durata e dello stadio dell’infezione. Risultato negativo: le cellule mostrano solo una colorazione di contrasto rosso scuro e hanno una minima fluorescenza aspecifica. 11. LIMITAZIONI 1. La determinazione del virus RSV in campioni diretti e in coltura dipende dal prelievo adeguato dei campioni, dal loro trasporto, dalla tecnica di coltura del tessuto e dalla preparazione del vetrino. 2. Una prolungata esposizione alla luce del vetrino colorato ridurrà anche l’intensità della fluorescenza. 3. Il reagente attivo (Reagente per virus respiratorio sinciziale (RSV)) è pronto per l’uso ed è ottimizzato per il rilevamento degli antigeni RSV. La diluizione o un’alterazione del reagente attivo può produrre perdita di sensibilità o diminuzione di fluorescenza. 4. L’intensità della fluorescenza osservata dipende dalle proprietà del microscopio a fluorescenza utilizzato. Il tipo di microscopio e l’obiettivo, l’età e il tipo di sorgente luminosa, il gruppo filtro e lo spessore, ecc., sono tutti fattori che possono influire sulle prestazioni del test. L’uso di un controllo positivo aiuta a monitorare il corretto funzionamento del microscopio a fluorescenza. 5. La presenza di fluorescenza specifica con un test di campione diretto per RSV con un risultato di coltura negativo può verificarsi quando il kit rileva la presenza di antigeni specifici dell’RSV non realizzabili nel campione diretto. 6. Un risultato che mostra solo cellule con colorazione di contrasto rosso scuro su copri oggetto “shell vial” non esclude la possibilità di un’infezione da RSV. Per tale motivo, è necessario effettuare le colture in provetta per passare al valore CPE. Se tali colture sono negative al termine di dieci giorni, le cellule e il sovranatante devono essere di nuovo trasferiti in un altro gruppo di colture. Se alla fine dei dieci giorni questo secondo gruppo non mostra alcun valore CPE, è possibile riportare che nel campione non è stato rilevato alcun virus RSV. 7. L’interpretazione dei risultati deve comprendere la valutazione clinica del paziente e altre procedure diagnostiche. Se si sospetta fortemente la presenza del virus RSV è necessario presentare un altro campione. 8. Gli effetti della terapia antivirale sui risultati ottenuti da questo kit di test sono sconosciuti. 9. È possibile riscontrare una colorazione aspecifica come artefatto per via del legame fra le regioni Fc dell’anticorpo e le proteine A e G presenti nella parete cellulare di alcuni ceppi di Staphylococcus aureus. Questo reagente contiene un inibitore di tale reazione. 12. RISULTATI ATTESI Nei mesi autunnali, invernali e primaverili non è insolito trovare un’incidenza di RSV positivo nel 25-50% dei neonati e bambini sottoposti al test di infezioni del tratto respiratorio inferiore.1 I risultati possono variare in base alla popolazione, alla posizione geografica e al periodo dell’anno. Mentre gli adulti e i bambini maggiori di 8 anni presentano infezioni RSV lievi o asintomatiche, i neonati e i bambini contraggono spesso delle infezioni al tratto respiratorio inferiore con le relative complicanze. L’RSV può anche essere una causa insolita di infezione del tratto respiratorio inferiore negli adulti, in particolare negli anziani.1 13. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE Allo scopo di dimostrare la specificità del test RSV PathoDx, i seguenti virus e linee cellulari sono stati colorati con reagente per virus respiratorio sinciziale (RSV). Sono stati acquistati vetrini del substrato per coltura cellulare infettati da virus oppure i virus sono stati coltivati su monostrati di coltura cellulare e colorati quando era evidente il valore CPE 2+. Nessuno dei 25 campioni di tipi diversi di virus e ceppi o nessuna delle sei linee cellulari elencate qui sotto, quando sottoposti a test almeno una volta, ha mostrato una fluorescenza con il reagente per virus respiratorio sinciziale (RSV). Microrganismo­ Adenovirus tipo 3­ Adenovirus tipo 5­ Adenovirus tipo 7­ Adenovirus tipo 10­ Adenovirus tipo 14­ Virus Coxsackie A9­ Virus Coxsackie B4­ Citomegalovirus­ Echovirus 4­ Echovirus 20­ Echovirus 22­ Virus dell’Herpes simplex I­ Virus dell’Herpes simplex I­ Influenza A­ Influenza B­ Morbillo­ Parotite­ Parainfluenza 1­ Parainfluenza 2­ Parainfluenza 3­ Rinovirus 32­ Rinovirus 39­ Varicella-zoster­ Ceppo­ ATCC® VR3­ ATCC® VR5­ ATCC® VR7­ ATCC® VR11­ ATCC® VR15­ ATCC® VR186­ ATCC® VR184­ Isolato clinico­ ATCC® VR34­ ATCC® VR50­ ATCC® VR52­ Ceppo MacIntyre­ Ceppo MS­ Isolato clinico­ Isolato clinico­ Isolato clinico­ Isolato clinico­ Isolato clinico­ Isolato clinico­ Isolato clinico­ ATCC® VR329­ ATCC® VR340­ Isolato clinico­ presenza di focolai. Dopo che i monostrati della coltura hanno mostrato un valore CPE di almeno 2+ (10-50 focolai), questi sono stati preparati e colorati con il metodo PathoDx e il metodo di riferimento. Confrontando strisci diretti colorati con RSV PathoDx e con il Kit A, un totale di 67 sottoposti a test sono risultati positivi con entrambi i metodi e 520 sottoposti a test sono risultati negativi con entrambi i metodi; tuttavia, 8/520 che erano risultati negativi tramite lo striscio diretto sono stati confermati positivi tramite il metodo di riferimento della coltura in provetta. Due campioni di strisci diretti sottoposti a test sono risultati positivi con PathoDx e negativi con il Kit A, tuttavia questi sono stati confermati positivi tramite il metodo “shell vial” e il metodo di riferimento della coltura in provetta (Tabella 1). Tabella 1 Strisci diretti RSV PathoDx rispetto a strisci diretti Kit A (n = 589) ­ Strisci diretti PathoDx RSV +­ –­ Strisci diretti RSV Kit A +­ –­ 67­ 2­ 0­ 520­ Due ceppi bovini di RSV ATCC® VR794 e ATCC® VR1339 hanno fornito una colorazione positiva con il test RSV PathoDx®. Limiti di confidenza del 95% rispettivamente per la sensibilità relativa e la specificità: 93,2% - 100% e 98,5% - 99,9%. Linee cellulari Rene di scimmia verde africana Rene di scimmia cynomolgus primaria Rene di scimmia Rhesus primaria Rene di scimmia Rhesus HF (prepuzio umano) Rene canino Madin-Darby La concordanza fra gli strisci diretti RSV PathoDx e il metodo di coltura “shell vial” Kit A era pari al 96,4% (568/589 - Tabella 2). A–549­ Vero­ HEp–2­ LLC-MK2­ WI–38­ MRC–5­ 14. STUDI CLINICI In uno studio eseguito in due centri, uno nella zona mediooccidentale e l’altro nella zona nord-occidentale, è stato sottoposto al test dell’RSV un numero complessivo di 594 campioni (308 maschi, 285 femmine, 1 non segnalato; da neonati fino a 98 anni) prelevati da pazienti con affezioni acute del tratto respiratorio inferiore. I campioni (sangue, tampone/lavaggi della gola, espettorati di adulti, tamponi/secrezioni nasofaringee, tessuto per biopsia) sono stati analizzati seguendo le procedure del produttore utilizzando RSV PathoDx e il Kit A, il metodo di riferimento (anche un metodo diretto FA). (Tabella 8). Sono stati preparati due vetrini da un pozzetto con ciascun campione. I vetrini sono stati fissati e successivamente colorati con PathoDx o reagenti FA disponibili in commercio ed esaminati tramite microscopia a fluorescenza. Quattro fiale “shell vial” contenenti cellule HEp-2 sane sono state inoculate con ciascun campione, due per ogni gruppo di reagenti del produttore, utilizzando la metodologia della coltura “shell vial” amplificata tramite rotazione. I duplicati delle fiale “shell vial” sono stati incubati, un gruppo per 16-24 ore e l’altro per 40-48 ore. Dopodiché si sono colorate le “shell vial”. Se il test di una delle due fiale “shell vial” ha dato risultato negativo, ciascun copri oggetto degli altri due copri oggetto restanti per il campione è stato colorato dopo 40-48 ore con i metodi PathoDx® e Kit A. Quando entrambe le fiale “shell vial” si sono colorate positivamente all’RSV dopo 16-24 ore d’incubazione, le restanti fiale “shell vial” sono state scartate. Anche le provette di coltura tradizionali sono state inoculate con ciascun campione conformemente alle procedure standard. Durante l’incubazione per un periodo massimo di 4 settimane, le provette della coltura sono state monitorate per verificare la Tabella 2 Strisci diretti RSV PathoDx rispetto a coltura “shell vial” Kit A (n = 589) ­ Strisci diretti PathoDx RSV +­ –­ “Shell Vial” RSV Kit A +­ –­ 58 11­ 10­ 510­ Limiti di confidenza del 95% rispettivamente per la sensibilità relativa e la specificità: 74,2% - 92,3% e 96,1% - 98,9%. La concordanza fra gli strisci diretti RSV PathoDx e il metodo di coltura in provetta Kit A era pari al 95,4% (562/589 - Tabella 3). Tabella 3 Strisci diretti RSV PathoDx rispetto a coltura in provetta Kit A (n = 589) ­ Strisci diretti PathoDx RSV +­ –­ Coltura in provetta RSV Kit A +­ –­ 59 10­ 17­ 503 Limiti di confidenza del 95% rispettivamente per la sensibilità relativa e la specificità: 66,4% - 86,1% e 96,3% - 99,0%. Si sono ottenuti eccellenti risultati qualitativi quando sono stati confrontati i metodi di coltura “shell vial” amplificata tramite rotazione RSV PathoDx e Kit A (Tabella 4). Su 594 campioni, 69 sottoposti a test sono risultati positivi con il metodo “shell vial” e 524 sottoposti a test sono risultati negativi per ciascun metodo “shell vial” (concordanza 99,8%; sensibilità relativa 100%; specificità relativa 99,8%). Un campione il cui test è risultato positivo con il metodo “shell vial” PathoDx e negativo con il metodo “shell vial” Kit A è stato confermato positivo da entrambi i metodi di riferimento della coltura in provetta PathoDx e Kit A. Un campione il cui test è risultato negativo da entrambi i metodi “shell vial” è stato confermato positivo da entrambi i metodi di riferimento della coltura in provetta. Tabella 4 Coltura “shell vial” RSV PathoDx rispetto alla coltura “shell vial” Kit A (n = 594) ­ +­ –­ “Shell vial” PathoDx RSV “Shell vial” RSV Kit A +­ –­ 69 1­ 0 524 Limiti di confidenza del 95% rispettivamente per la sensibilità relativa e la specificità: 93,4% - 100% e 98,8% - 100%. Successivamente sono stati confrontati i risultati derivanti da entrambi i metodi di coltura in provetta. È stata riscontrata una completa concordanza fra i metodi di coltura in provetta RSV PathoDx e Kit A (sensibilità relativa 100%; specificità relativa 100% (Tabella 5). Tabella 5 Coltura in provetta RSV PathoDx rispetto alla coltura in provetta Kit A (n = 593) ­ Coltura in provetta PathoDx® RSV +­ –­ Coltura in provetta RSV Kit +­ –­ 77 0­ 0 516 Tabella 8 RSV PathoDx rispetto a Kit A PDx RSV Kit A RSV­ Strisci diretti Shell vial Coltura in provetta + + 67­ 69­ 77­ – – 520­ 524­ 516­ – + 0­ 0­ 0­ + – 2­ 1­ 0­ Sensibilità relativa 589­ 100%­ 594­ 100%­ 593­ 100%­ n Specificità relativa 99,6%­ 99,8%­ 100%­ 15. BIBLIOGRAFIA 1. Lennette,E.H., P. Halonen, and H.A. Murphy 1988. Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases: Principles and Practice. Vol. 2. Springer-Verlag, New York, NY. 2. Fields, B.N., D.M. Knipe, J. L. Melnick, R.M. Chanock, B. Roizman, and R.E. Shope.1985. Virology. Raven Press, New York, NY. 3. White, D.O. and F. Fenner. 1986. Medical Virology, 3rd ed. Academic Press, New York, NY. 4. Hall, C.B., et al. 1976. J. Pediatr. 89:1-15. 5. Parrott, R.H., et al. 1974. Prev. Med. 3:473-480. 6. Welliver, R.C.1988. Clin. Microbiol. Rev. 1:27-39. 7. Balows, A., W.J. Hausler Jr, K.L. Hermann H.D. Isenberg, and H.J. Shadomy. 1991. Manual of Clinical Microbiology. 5th ed. ASM. Washington, D.C. 8. Hall, C.B., et al. 1983. N. Engl. J. Med. 308:1443-1447. Limiti di confidenza del 95% rispettivamente per la sensibilità relativa e la specificità: 94,1% - 100% e 99,1% - 100%. 9. Taber, L.H., et al. 1983. Pediatrics. 72:613-618. La concordanza fra i metodi di coltura in provetta e striscio diretto RSV PathoDx® era pari al 95,4% (561/588 - Tabella 6). 11. Kaul, A., et al.1978. Am. J. Dis. Child. 132:1088-1090. Tabella 6 Strisci diretti RSV PathoDx rispetto a coltura in provetta RSV PathoDx (n = 588) 13. Minnich, L. and C.G. Ray. 1982. J. Clin. Microbiol. 12:391-394. ­ Strisci diretti PathoDx RSV +­ –­ Coltura in provetta RSV PathoDx +­ –­ 59 10­ 17 502 Limiti di confidenza del 95% rispettivamente per la sensibilità relativa e la specificità: 66,4% - 86,1% e 96,3% - 99,0%. L­ a concordanza fra i metodi di coltura “shell vial” e di coltura in provetta RSV PathoDx era pari al 98,5% (584/593 - Tabella 7). Tabella 7 “Shell vial” RSV PathoDx rispetto a coltura in provetta RSV PathoDx (n = 593) ­ “Shell vial” PathoDx RSV +­ –­ Coltura in provetta RSV PathoDx +­ –­ 69 1­ 8 515 Limiti di confidenza del 95% rispettivamente per la sensibilità relativa e la specificità: 80,0% - 95,1% e 98,8% - 100%. La prevalenza osservata di RSV nelle popolazioni oggetto dello studio, definita dal metodo di coltura in provetta, era di circa il 15% per il centro 1 e del 10% per il centro 2. Sulla base dei valori di sensibilità e specificità complessivi per la coltura “shell vial” amplificata tramite rotazione PathoDx rispetto alla coltura di cellule tradizionale, i valori di previsione positivi e negativi sono stati calcolati per una popolazione a prevalenza ipoteticamente bassa (2,5%) e alta (15%). Nel 2,5% della popolazione, i valori di previsione per un risultato positivo e negativo sono stati calcolati come rispettivamente del 92,0% e del 99,7%. I valori di previsione positivi e negativi per il 15% della popolazione sono stati stimati rispettivamente pari al 98,8% e al 98,2%. 10. McQuillin, J. and P.S. Gardner.1968. Br. Med. J. 1:602-605. 12. Laur, B.A. 1982. J. Clin. Microbiol. 16:411-412. 14. Wiedbrauk, D.L. and S.L.G. Johnston. 1993. Manual of Clinical Virology. Raven Press, New York, NY. 15. Spector, S. and G. Lancz. 1986. Clinical Virology Manual. Elsevier, New York, NY. 16. Murray, P.R., E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller, and R.H. Yolken. 2003. Manual of Clinical Microbiology. 8th ed., Vol II. ASM, Washington, D.C. 17. Costello, M.J., et al. 1993. Lab. Med. 24:150-157. 16. CONFEZIONE R62370.........................................................100 Test/Kit Legenda dei simboli Numero catalogo Dispositivo medico per la diagnostica in vitro Per uso in laboratorio Consultare le Istruzioni per l’uso Limiti di temperatura (temp. di conservazione) Numero lotto Data di scadenza Fabbricante PathoDx è un marchio di fabbrica registrato di Remel Inc. ATCC® è un marchio di fabbrica registrato di American Type Culture Collection. IFU X7789 Revised novembre 2012 Remel Europe Ltd. Clipper Boulevard West, Crossways Dartford, Kent, DA2 6PT Regno Unito Per l’assistenza tecnica, rivolgersi al distributore di zona.
