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Determinazione della attività della alfa-galattosidasi umana
Albeggiani G., Sciarrino S., Messineo R., Filogamo M., Bartolotta C.
Razionale
Il razionale, del protocollo presentato, nasce dalla considerazione che in letteratura
veniva descritto ed eseguito, prevalentemente il dosaggio della attivita’ plasmatica della
alpha-GALA. Essa presentava pero’, notevoli problemi di dosaggio (quanto plasma
usare) e di campionamento (campione freschissimo) non sempre bypassabili (come
descritto in letteratura) .
Il dosaggio della attività su linfociti, il più affidabile, poteva essere normalizzato
rapportandolo alla quantità di proteina linfocitaria ma esso era costoso e time
consuming (Medin ).
Il saggio su DBFP (Dried Bloof Filter Paper) descritto da Camole appariva piu’ rapido,
con una incredibile stabilita’ dell’enzima, una volta che il sangue era stato essiccato sopra
i dischetti di carta da filtro, con l’enorme vantaggio che la procedura analitica era
facilmente automatizzabile.
Questi tre tipi di dosaggio presentavano però un punto debole. Tutti infatti
adoperavano, per computare l’attività enzimatica, una singola reazione ‘end point’ non
apportando alcuna informazione su cio’ che avvenisse durante il tempo di reazione.
Nessuna informazione dunque sulla bontà della reazione e sul suo andamento cinetico.
Noi abbiamo sviluppato e implementato la metodica delle DBFP rendendola affidabile,
riproducibile e di significato diagnostico mediante l’introduzione di tali accorgimenti:
Controllo specificita’ della reazione mediante l’uso del DGJ, inibitore della forma A della
alpha galattosidasi (l’enzima di cui misurare l’attività).
Controllo cinetico mediante l’integrazione di tre reazioni “end point”, rispettivamente di
1hr 2hr 3hr. Adoperando tale sistema potevamo non solo ottenere il valore di attività
enzimatica ma osservare l’andamento cinetico accorgendoci di eventuali fattori inibenti
che, probabilmente dovuti al plasma (medicinali), ne alterassero l’andamento. Quando si
verificava una situazione di tal genere, ripetevamo il saggio adoperando spot ottenute da
sangue cui era stato rimosso il plasma.
Controllo attivita’ specifica
Per ogni campione venivano contati i globuli bianchi e l’attivita’ enzimatica era espressa
in funzione del loro numero. In tale maniera abbiamo ottenuto una attivita’ specifica
che era un intorno di 5 U/ml/hr. Cio’ ci ha permesso una piu’ accurata definizione dei
valori normali e patologici.
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Inoltre tale procedura ci ha permesso di azzerare la variabile dovuta alla marea
postprandiale. Ai pazienti veniva detto che, dal momento che si sarebbe eseguita una
analisi genetica, potevano assumere cibo prima del prelievo.
E’ un fatto noto che l’assunzione di cibo produce un aumento dei leucociti circolanti
immessi temporaneamente nel circolo sanguigno dalla milza. Tale innalzamento detto
appunto marea post prandiale induce un aumento dell’attivita’ enzimatica assoluta legata
all’aumento dei leucociti circolanti. . Abbiamo dimostrato che tale aumento e’ solo
fittizio, mantenendosi, il valore di attivita’ enzimatica specifica nell’intorno di 5
U/ml/hr.
Veniva eliminata inoltre la variabile dovuta ai leucociti circolanti cosicché una semplice
infezione o al contrario una leucopenia, non avevano alcuna influenza sulla attività
“ house Keeping” dell’enzima alfa galattosidasi.
Abbiamo dimostrato che tale aumento e’ solo apparente e che il valore di attivita’
enzimatica specifica rimane nell’intorno di 5 U/ml/hr quando normalizzato per numero
di leucociti
Avere adoperato il conteggio dei globuli bianchi ci ha permesso inoltre, di calcolare
l’attivita’ Linfocitaria e Leucocitaria specifica (la Bibbia di riferimento per i valori di
aGALA)
Infatti, adoperando la stessa metodica analitica delle DBFP abbiamo utilizzato una
preparazione proveniente soltanto da 350ul di sangue e abbiamo eliminato la procedura
di dosaggio delle proteine totali fonte:
a) di errore di determinazione
b) variabilita’ dei risultati ottenuti a seconda della metodica usata
c) necessita’ di una grossa preparazione (10 ml di sangue vs. 350 ul) per avere una
quantita’ di proteine apprezzabile.
Recentemente poi, abbiamo sperimentato una innovativa metodica di cinetica pura per le
DBFP dove anziche’ utilizzare l’integrazione di tre differenti reazioni end point
utilizzavamo un’unica reazione. In essa si incubavano assieme quattro spot per ciascun
campione e la reazione, di pura cinetica enzimatica, veniva derivata in tempi successivi
di 1hr, 2hr, 3hr. Ottenevamo così, un ottima correlazione tempo-linearità cinetica
riducendo il numero di pipettate e l’errore intra saggio.
Il metodo, messo a punto per l’analisi enzimatica su DBFP, è stato adoperato per il
saggio simultaneo della attività di a-galA proveniente da diversi distretti. Si azzeravano in
tal modo le variabili dovute a differenti procedimenti analitici, si uniformavano i valori di
attività dei vari comparti cellulari che, per un soggetto sano, erano totalmente
paragonabili.
La conseguenza di tale ottimizzazione è stata quella di poter lanciare uno sguardo alla
fisiologia del processamento dell’enzima. Osservare infatti uno sbilanciamento dei valori
di quest’ultimo nei vari distretti analizzati, così come a volte accade per quei pazienti
che sono normali dal punto di vista genetico suggerisce come la patologia sia dovuta ad
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una alterazione nel ricaptaggio e nell’indirizzamento dell’enzima nei lisosomi piuttosto
che ad una alterazione del gene Gla.
Quale è il razionale di tale affermazione e perché normalizzare per numero di globuli bianchi in tutti i
tipi di saggio?
In una spot di sangue intero ci sono gobuli rossi essiccati (i globuli rossi non contengono lisosomi nucleo
ecc. e non possiedono attività enzimatica ) Ciò è confermato sperimentalmente.
L’enzima contenuto nel plasma una volta essiccato sulle spot a ph 7 non diventa attivo in vitro a ph 4,5
anche tale asserzione è confermata sperimentalmente.
I lisosomi dei leucociti essiccati nelle spot mantengono l’enzima in una conformazione strutturale attiva
per il saggio in vitro. Anche questo è confermato sperimentalmente.
Dunque la determinazione sulle spot è direttamente dovuta ai leucociti presenti e l’attività assoluta
direttamente proporzionale al loro numero per spot. Allora la normalizzazione per numero di leucociti
nel campione è l’equivalente alla normalizzazione per mg di proteine nel saggio su leucociti isolati. Ma
anche qui: le proteine quantizzate nel saggio dei leucociti sono proporzionali al loro numero e dunque
all’attività assoluta. Allora normalizzare per proteine o per numero di leucociti è identica cosa. Questa
considerazione ci permette di normalizzare, per numero di leucociti, il saggio sui leuco-linfociti e su spot
rendendo cosi i tre saggi assolutamente paragonabili
DRIED BLOOD SPOT TEST
Per il saggio enzimatico della α-gattosidasi A su sangue intero, si adopera il saggio Dried
Blood Spot Test (DBST) o dried blood filter paper (DBFP). E’ un saggio in fluorescenza,
estremamente sensibile, che adopera il substrato sintetico 4-MethylumbelliferilGalactopiranoside, che una volta scisso dall’enzima α-gattosidasi A, rilascia un
composto fluorescente, il 4-methylumbelliferone (4-MU) la cui concentrazione è
rilevabile mediante una lettura spettrofluorimetrica. Questa ultima, ci fornisce nel tempo,
la velocità della reazione e, dunque, l’attività enzimatica.
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Materiali occorrenti:
Fluorimetro Wallac con lettore di piastra multi well impostato con programma di lettura
in fluorescenza per methylumbelliferone
Termostato oscillante per piastra (nera Perkin Elmer optiwell).
Pipetta automatica a pressione positiva Drummond ( per caricare il sangue sulle spot)
Soluzioni vedi foglio allegato
1) Preparazione Spot
Con un fora documenti si preparano numerosi dischetti di 6mm di diametro.
Per ogni campione da analizzare si adoperano 10 dischetti, che per comodità di lettura
vengono disposti orizzontalmente nella piastra (es da A1 a A10).
5,5 μL di sangue intero in EDTA vengono dispensati con la pipetta Drummond in
ciascun pozzetto contenente la spot(10). I dischetti così preparati devono asciugare per
lo meno 2h all’aria.
Esecuzione del saggio
2) Preparazione piastra
Il saggio è eseguito sempre in doppio e consta di cinque tipi di reazioni preparate
come descritto di seguito:
BIANCO (pozzetti A1- A2): 50 μL di substrato (Sol 3), 20 μL di inibitore
forma b (Sol 2) e 250μL di ethilendiammina (per bloccare ogni eventuale
reazione).
1h (pozzetti A3-A4): 50 μL di substrato (Sol 3),, 20 μL di inibitore forma b
(Sol 2).
2h (pozzetti A5 A6): 50 μL di substrato (Sol 3),, 20 μL di inibitore forma b (Sol
2)
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3h (pozzetti A7-A8): 50 μL di substrato (Sol 3),, 20 μL di inibitore forma b
(Sol 2)
INIBITO (pozzetti A9-A10): 50 μL di substrato (Sol 3), 20 μL di inibitore
forma b (Sol 2), e 3μL di inibitore per l’alfa galattosidasi A (DGJ). I valori
ottenuti paragonabili al bianco suggeriscono la specificità della reazione. Infatti se
la reazione fosse aspecifica avremmo una emmissione notevolmente superiore
ma aspecifica.
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A
2
BIANCO
3
4
1h
5
6
2h
7
8
3h
9
10
11
12
INIBITO
B
C
D
E
F
G
H
3) La piastra così preparata è incubata a 37 °C per 1 ora
4) Al termine della prima ora di incubazione, si aggiungono di 250μL di
ethilendiammina ai pozzetti 1h e INIBITO per bloccare la reazione, la piastra si
continua a incubare 37 °C .
5) Al termine della seconda ora di incubazione, aggiungere di 250μL di ethilendiammina
ai pozzetti 2h per bloccare la reazione, e si continua a incubare la piastra a 37 °C .
6) Al termine della terza ora di incubazione, aggiungere di 250μL di ethilendiammina ai
pozzetti 3h. La piastra viene tolta dal termostato oscillante. (Durante il periodo di
incubazione i pozzetti sono sigillati con una membrana adesiva al fine di evitare la
evaporazione.)
7) Lettura spettrofluorimetrica.
Si esegue al fluorimetro Vallak con l’ausilio del programma di lettura per il MTU che
eccitato nel basso UV emette sul visibile.
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Nota: successivamente si è adoperata una miscela della soluzione 2 e 3 e tale
miscela è stata adoperata per aggiungere 70ul (50+20) in ciascun pozzetto della
piastra.
8) Elaborazione dati:
- il valore di fluorescenza del BIANCO si sottrae ai valori di fluorescenza delle altre
reazioni (1h, 2h, 3h e INIBITO).
Nota: i valori di BIANCO servono per azzerare l’emissione del dischetto, quella del sangue ed
eventuale bilirubina e lipidi, del tampone, dell’inibitore e del substrato
Nota: l’INIBITO (in cui l’attività dell’enzima è stata bloccata in modo specifico) avrà valore
zero.
- Si calcola l’emissione di fluorescenza media tra le reazioni 1h, 2h, 3h e il valore
ottenuto (media dei tre valori) viene moltiplicato per 0,32 è comparato con la curva
standard di calibrazione, cioè, con i valori di fluorescenza del 4-MU a concentrazione
nota, ottenendo così, i valori di attività enzimatica (definiamo come unità
enzimatica quella quantità di enzima che a 37C°, in 1 ora, libera una nanomole di
4-methylumbelliferone.).
SOLUZIONI
Etilendiammina 0,1 M
Diluire 6,01 ml di etilendiammina 99% (frigo 4°) in un litro d’acqua per avere una
soluzione 0,1 M portare eventualmente a pH 11,4 ( aggiungendo NaOH 1N )
SOL 1 Tampone citrato 0.5M
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Prendere una pillola di tampone citrato e sciogliere in 33 ml di acqua distillata in un
falcon da 50 ml.
La soluzione così ottenuta è a pH di circa 5.
Portare a pH 4.4 con HCl 2 M circa 250 µl (poche gocce) controllando il pH con le
cartine tornasole.
SOL 2 N-acetil D-galattosammina 0,25 M (inibitore ) A2795
Pesare 55 mg di N-acetil D-galattosammina (nel frigo -20 °C) e portarlo ad 1 ml con la
sol 1 in tubo.
SOL 3
4 MU-a-D-galattopiranoside 5mM (substrato) M7633
Pesare 5 mg di 4 MU-a D-galattopiranoside (nel frigo -20° cassetto Fabry) e portarli a 3
ml la con la Sol 1 in un tubo . Dopo aver agitato al vortex per ca filtrare la soluzione con
un filtro per siringa. (0,45 µm Whattman)
La soluzione 2 e 3 possono essere adoperate separatamente dispensando in ciascun
pozzetto di reazione prima 20 μl di Sol 2 seguiti da 50 μl di Sol 3 .Oppure si può
preparare prima dell’uso la miscela di reazione della quale si adopereranno direttamente
70 μl per spot, deponendoli in ogni pozzetto (MIX)
Mix di reazione
Mescolare 2,5 ml di Sol 3 con 1 ml di soluzione 1 di questa miscela si adopereranno
direttamente 70 μl a pozzetto
INIBITORE α-GAL A DGJ (Deoxygalactonojirimycin-hydrochloride)- SIGMA
D9641-2mg
Sciogliere la bottiglietta in 1 ml di H2O mQ; aliquotare a 100 µl in eppendorf da 50 μl e
conservare a -20°C.
Utilizzare l’inibitore diluendolo 1:3 con tampone CPB e dispensare, poi, 3µl di inibitore
per campione file 9 e 10.
Materiali
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Phosphate-Citrate Buffer ph 5 Tablets
P4809-50 TAB
Sigma
Ethylenediamina
03550
Fluka
4-methylumbelliferyl-α-galactpyranoside
M7633
Sigma
4-Methylumbelliferone sodium salt
N-Acetyl-D-galactosamine
M1508
A2795-1G
Sigma
Sigma
Deoxygalactonojirimycin hydrochloride
D9641
Sigma
H20 grado milliQ
Piastre 96 well per fluorimetria nere
Perkin Elmer
Spettrofluorimetro automatico Wallac
Perkin Elmer
Spettrofotometro
Bekmann DU50
Pipetta a pressione positiva 10µl
Drummonds
Pipette Gilson
(10-20-100-200-1000) μL
Tubi da ematocrito wintroube (1 ml)
Quando la piastra viene letta al fluorimetro si presenta una situazione di questo genere
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2010-01-20
A= Controllo
B=D010
C=D011
D=D012
E=D013
7.28 (assoluto)
4.2
5.7
5.8
6
Attivita’ enzimatica specifica normalizzata per 5000 globuli bianchi per ml di sangue. Il range di variabilita’
del valore assoluto di attivita’ enzimatica diventa una funzione dipendente dal numero dei bianchi
rispettando cosi l’attivita’ specifica del campione.
Come si puo’ notare, i campioni sono tutti in doppio: le colonne 1 e 2 rappresentano i
bianchi, le colonne 9 e 10 i campioni dove era presente il DGJ. Essi, incubati per un’ora
mostrano la specificita’ della reazione dal momento che i valori sono simili al bianco e
che non esiste fluorescenza aspecifica, cioe fluorescenza non dovuta all’attività
galattosidasica .
Le colonne 3 e 4 rappresentano la prima ora di incubazione, la 5 e la 6 la seconda , la 7 e
la 8 la terza.
Apparentemente D011 ha una attivita’ notevolmente superiore alla D013……ma
normalizzando per il numero dei leucociti la differenza e’ solamente di tre decimi di
unita’
10
Viene ora riportato un dettaglio della preparazioni che vengono eseguite al momento
dell’arrivo del campione …..
Spot Sangue
1. Agitare la provetta di sangue intero.
2. Aliquotare 400 µl di sangue intero in un eppendorf da 1,5 ml;
3. Dispensare con la pipetta automatica a pressione positiva Drummond 5,5 µl di
sangue intero nelle spot presenti nei pozzetti della piastra (ogni 10 spot agitare x
inversione l`eppendorf);
4. Lasciare asciugare o.n.
5. Conservare a -20°C coprendo la piastra con film plastico.
Spot senza plasma
1. Aliquotare 400 µl di sangue intero in un eppendorf da 1,5 ml ( segnare il volume
di sangue presente nell’eppendorf con un pennarello );
2. Centrifugare per 10 minuti a 4000 rpm;
3. Prelevare il plasma (supernatante) ed aliquotarlo in eppendorf da 0.2 e conservare
a -20°C
3. Risospendere il pellet con 1 ml di PBS 1X o sol.fisiologica;
4. Centrifugare per 10 min. a 4000 rpm; ripetendo il lavaggio tre volte
5. Allontanare il supernatante e risospendere fino a volume iniziale (adoperando il
segnale posto in precedenza sull’eppendorf) con PBS 1X o soluzione fisiologica;
6. Agitare al vortex e dispensare 5,5 µl nelle spot presenti nei pozzetti della piastra.
7. Lasciare asciugare o. n.;
8. Conservare a -20.
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Linfociti
1. Nei tubi da ematocrito inserire con una pasteur 300 µl di Linphoprep;
2. In un eppendorf da 1.5 ml dispensare 350 µl di sangue intero e 350 µl di PBS 1X
o soluzione fisiologica (diluizione 1:1);
3. Inserire il sangue diluito 700ul nel tubo da ematocrito con una pasteure;
4. Centrifugare per 30 minuti a 900 rcf (3000 rpm CR15 Centrifuge);
5. Prelevare l’anello di linfociti con l’ausilio di una pasteure e dispensarlo in un
eppendorf da 1.5 ml;
6. Dispensare 1 ml di PBS 1X o sol. fisiologica;
7. Centrifugare per 10 min. a 4000 rpm in eppendorf e ripetere il processo 3x
8. Decantare e conservare a -20°C.
Leucociti sangue intero
Una aliquota di 350 ul di sangue intero viene emolizzata con un reagente emolizzante
secondo il protocollo specifico. Il pellet di leucociti viene trattato in maniera identica ai
linfociti e conservato a -20°C.
Soluzioni per il test spettrofluorimetrico
Ethylendiammina
1. Diluire 3 ml di ethylendiammina 99% in 500 ml di H2O per ottenere una
soluzione 0,1 M a pH 11.4.
2. Controllare il pH ed eventualmente aggiungere HCl.
Tampone citrato (CPB)
1. Sciogliere una pillola di tampone citrato in 33 ml di H2O milliQ.
2. Aggiungere 250 µl HCl 2N. Controllare il pH che deve essere 4,5
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N-acetil-D- galattosammina (inibitore β-Gal) 0.25 M
1. Pesare 55 mg di N-acetil-D-galattosammina (frigo Fabry 4°C)
2. Aggiungere 1 ml di Tampone CPB
3. Vortexare
4 MU-α-D-galattopiranoside 5mM (substrato)
1. Pesare 5 mg di 4 MU-α-D-galattopiranoside (frigo Fabry -20°C)
2. Aggiungere 3 ml di tampone CPB
3. Vortexare e filtrare la soluzione.per siringa 20-45(µm)
DGJ (inibitore α-Gal)
1. Sciogliere in 1 ml di H2O milliQ;
2. Aliquotare 100 µl in eppendorf da 0.5 ml
3. Conservare a -20°C.
Mix reazione
1. Unire le soluzioni relative al substrato e all’inibitore della β-Gal. (3ml+1ml)
sufficienti per 4 campioni.
PREPARAZIONE PIASTRA
(spot sangue intero e senza plasma)
Il saggio è eseguito in doppio.
1. Disporre 10 spot di sangue intero o senza plasma direttamente al fondo del
pozzetto della piastra a 96 poz.
2. Aliquotare 250 µl di Ethylendiammina nelle file 1-2 (bianco)
3. Aliquotare 3 µl di DGJ (inibitore α-Gal) nelle file 9-10 (inibito)
4. Aliquotare 70 µl di mix di reazione in tutti i pozzetti della piastra.
5. Incubare a 37°C per 1 ora;
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6. Bloccare la reazione aggiungendo 250 µl di ethylendiammina nelle file 3-4 e 9-10;
7. Incubare a 37°C per 1 ora;
8. Bloccare la reazione aggiungendo 250 µl di ethylendiammina nelle file 5-6
9. Incubare a 37°C per 1 ora;
10. Bloccare la reazione aggiungendo 250 µl di ethylendiammina nelle file 7-8.
11. Eseguire la lettura allo spettroflurimetro (Victor X3).
PREPARAZIONE PIASTRA
(Plasma)
1. Per ciascun campione dispensare nella piastra a 96 pozzetti 10 µl di plasma;
2. Eseguire la reazione come per le spot di sangue intero e spot senza plasma.
PREPARAZIONE PIASTRA
(Linfociti)
1. Risospendere i linfociti purificati con l`ausilio del Linphoprep in 350 µl di H 2O
milliQ;
2. Congelare e Scongelare per 3 volte;
3. Sonicare per 3 minuti;
4. Eseguire la reazione in fase liquida adoperando 5.5 µl di sopensione dei bianchi
lisati. Il riferimento per il calcolo come per le spot di sangue intero.
Ps la stessa metodica va adoperata sul pellet di leucociti ottenuti per emolisi
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Il tutto puo’essere riassunto dal seguente schema
5,5 µl
Spot sangue intero
lavaggio
Spot sangue senza plasma
risospendere a volume
NaCl 0,9%
5,5 µl
5,5µl plasma
Plasma
emolisi
Leucociti
lavaggio
H2 O
3 x freeze thawing
350µl
sonication
5,5 µl
Linfociti
350µl
Sangue intero
350µl
NaCl 0,9%
700µl
H2 O
350µl
3 x freeze thawing
sonication
5,5 µl
Linphoprep
300µl
Conteggio leucociti per normalizzazione
Osserviamo piu’ in dettaglio la preparazione di linfociti in tubo wintrobe
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Si noti la banda bianca dei linfociti all’interno di un
tubo wintrobe. Sono stati adoperati solamente 350 ul di sangue e una volta recuperato
l’anello di linfociti che viene portato a volume con 350 ul di acqua si adopereranno solo
5.5 ul.
Analogamente, una volta preparato il lisato (sempre 350ul ) ne verranno impiegati 5,5 ul
a determinazione.
I linfociti vengono raccolti con l’ausilio di una pasteure…..
E questa e’ la rappresentazione dei linfomonociti ottenuta
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Si notino i linfociti insieme ai monociti (forme a fagiolo) assieme a cellule danneggiate
dal lymphoprep. ( resa media di circa il 90%)
Preparazione leucociti per emolisi si notino i neutrofili plurilobati insieme agli eosinofili
con citoplasma arancio-rosella
Le due preparazioni sono state riportate per paragonare i due tipi di estrazione di cui
quella per emolisi e’ ancora piu’ rapida della preparazione linfocitaria da noi resa gia’
rapida: Dati preliminari ci indicano che i valori di attivita’ enzimatica sono sovrapponibili
suggerendo l’uso della metodica emolitica come nuova procedura standard per l’analisi
dei leucociti.
L’analisi cinetica dei linfociti in piastra da’ in immagine di questo tipo con valori che
sono nell’intorno do 15 U/ml/hr
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Si noti la linearita’ dell’incremento cinetico il campione lettera E con attivita’
apparentemente elevata alla conta possedeva 12.500 globuli bianchi con una attivita’
specifica di 16,2 U/ml/Hr
Queste in breve la schematizzazione della procedura di campionamento nelle reazioni di
cinetica pura
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