Cinetica enzimatica
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La cinetica delle reazioni
Concetti chiave
• Le semplici equazioni di velocità descrivono il progredire
delle reazioni di primo e di secondo ordine.
• L'equazione di Michaelis-Menten mette in relazione la
velocità iniziale di una reazione con la velocità massima e con
la costante di Michaelis per un particolare enzima e un dato
substrato.
• L'efficienza catalitica complessiva di un enzima è espressa
come kcat/KM.
• Il grafico di Lineweaver-Burk può essere utilizzato per
presentare i dati cinetici e per calcolare i valori di KM e Vmax.
Richiami di Cinetica Chimica
La cinetica chimica studia la velocità e il meccanismo con cui procede una reazione chimica.
La velocità di reazione è la velocita di trasformazione di questo o quel reagente o la velocità
di formazione di questo o quel prodotto.
Reazioni elementari e
molecolarità di reazione
La maggior parte delle reazioni si prestano ad essere analizzate in una successione di fasi (reazioni
elementari, o eventi reattivi) a ciascuna delle quali partecipano, una, due, o, molto più raramente, tre
molecole.
La molecolarità di un singolo evento reattivo è il numero di molecole che vi prendono parte. Un evento
monomolecolare vede la scissione di una sola molecola o il riordinarsi dei suoi atomi in una nuova
disposizione. Se l’evento è bimolecolare, saranno due molecole ad urtarsi, scambiandosi energia, atomi,
gruppi di atomi o subendo qualche altgro tipo di trasformazione.
Il meccanismo cinetico di una reazione è la sequenza di reazioni elementari che vi prendono parte.
Meccanismo di reazione
Data una determinata reazione chimica:
Il meccanismo cinetico con cui procede è la sequenza di reazioni elementari che dai reagenti portano ai
prodotti. Per es.,
Prima reazione elementare, monomolecolare
Seconda reazione elementare, bimolecolare
Equazione cinetica di reazione
La dipendenza funzionale della velocità di una reazione dalle concentrazioni delle specie reagenti è
espressa dall’equazione cinetica:
La cui forma esplicita può essere di vario tipo e deve essere caso per caso determinata
sperimentalmente. Almeno nelle fasi iniziali, quando i prodotti non si sono ancora sufficientemente
accumulati, la velocità della reazione risulta direttamente proporzionale al prodotto delle concentrazioni
dei reagenti elevate ad opportuni esponenti, interi o frazionari (e talora anche negativi):
Costante cinetica e ordine di
reazione
La costante di proporzionalità dell’equazione cinetica è funzione della temperatura ed è chiamata
costante cinetica (è numericamente uguale alla velocità di reazione quando tutte le concentrazioni dei
componenti sono unitarie). Si definisce ordine totale della reazione la somma degli esponenti a cui sono
elevate le concentrazioni dei componenti; mentre i singoli esponenti rappresentano gli ordini parziali
della reazione rispetto a ciascun componente.
Né l’equazione cinetica, né gli ordini parziali di ciascuna specie partecipante alla reazione sono deducibili
dall’equazione stechiometrica. Infatti, la forma dell’equazione cinetica e l’ordine della reazione rispetto
a ciascun componente dipendono dal meccanismo con cui la reazione si svolge.
Equazioni cinetiche e reazioni
elementari
Equazione di Arrhenius
CINETICA ENZIMATICA
La cinetica enzimatica è lo studio delle velocità di reazione
catalizzate da enzimi.
Il suo studio consente di individuare il meccanismo di catalisi.
Meccanismo cinetico
In condizioni di velocità iniziale, [P] ~ 0,
quindi possiamo trascurare la reazione che
dai prodotti porta ad ES:
Curva di progressione di una semplice reazione
catalizzata da un enzima
Stato
stazionario
Velocità iniziale
Condizioni per lo studio della cinetica
enzimatica
[S]0 >> [E]0
dt tale che [S] ~ 0
e [P] ~ 0
in pratica:
[S] < 10%
Meccanismo cinetico di Michaelis Menten
Secondo questo meccanismo semplificato, l'enzima libero (E) interagisce con il substrato (S), dando
origine al complesso enzima-substrato (ES, detto anche complesso di Michaelis Menten), il quale si scomporrà
originando il prodotto della reazione enzimatica (P) e riformando l'enzima libero
Riassumendo schematicamente:
dove i termini indicati con k rappresentano le costanti cinetiche relative alle diverse tappe elementari
del meccanismo cinetico.
In condizioni di velocità iniziale si ha che [P] ~ 0,
quindi si può trascurare la tappa di reazione che dai prodotti porta a
ES:
Secondo questo meccanismo la tappa che limita l’intera reazione è la scomposizione del complesso ES nel
prodotto e nell’enzima libero, cioè la tappa retta dalla costante cinetica k2, detta anche costante catalitica.
stadio lento
A questo punto si considera la condizione dello stato stazionario.
In tale stato, la [ES] è costante, non perché il
sistema abbia raggiunto l’equilibrio,
ma perché la velocità di formazione di ES è
esattamente bilanciata dalla sua velocità di
scomparsa. L’unica tappa implicata nella
formazione di ES è retta dalla costante cinetica
k1; le reazioni elementari che portano alla
scomparsa di ES sono quelle rette dalle costanti
cinetiche k-1 e k2:
Dopo lo stato prestazionario, la [ES] rimarrà costante in
quanto:
Riarrangiando:
(per la conservazione della massa)
(qui [S] coincide praticamente con [S]0, in quanto
si è nelle condizioni iniziali di reazione e, inoltre,
[E]T è trascurabile rispetto a [S]0)
Si noti che visto che k2 e [E]0 sono costanti, il loro prodotto è una
costante e corrisponde
alla velocità massima, Vmax.
L'equazione di Michaelis-Menten può anche essere espressa nella
forma alternativa (più usata):
L'equazione di Michaelis-Menten mette, quindi, in relazione la velocità
di formazione (iniziale) del prodotto V0 con la concentrazione del
substrato [S].
La curva di Michaelis-Menten, un’iperbole rettangolare, descrive l'andamento della velocità di una reazione
catalizzata da enzimi, al variare della concentrazione del substrato.
Questa equazione è generalmente valida per gli enzimi non allosterici.
Il modello cinetico di Michaelis Menten spiega come all'aumentare della concentrazione del substrato disponibile
per una data quantità di enzima, la velocità della reazione aumenti in modo lineare con la [S] quando questa sia
trascurabile rispetto al valore Km. In corrispondenza di tale valore la reazione raggiunge il suo valore semimassimale
(i.e., 1/2 Vmax). A [S] più elevate, la velocità della reazione tende a aumentare in modo non-lineare e via via sempre
più lentamente fino al raggiungimento di un valore massimo, chiamato velocità massima (Vmax).
In questo punto è presente tanto substrato da saturare tutto l'enzima presente in soluzione, perciò un'ulteriore
aggiunta di substrato non servirebbe, in quanto non verrebbe più attaccato da enzimi, che sono tutti già legati al
substrato.
KM
La costante di Michaelis-Menten, KM, rappresenta la concentrazione di substrato necessaria, affinché la reazione abbia
velocità pari a metà della velocità massima
Essa equivale al seguente rapporto tra costanti di velocità:
La costante di Michaelis-Menten è una grandezza caratteristica di ciascun enzima.
Essa indica quantitativamente l'affinità tra un enzima e il suo substrato: più basso è il valore di KM e più
bassa sarà la concentrazione di substrato che permette di raggiungere un valore di velocità di reazione
pari alla metà della velocità massima, il che indica un’alta affinità dell'enzima per il substrato.
Viceversa, un alto valore di KM indica che sarà necessario più substrato per raggiungere una velocità di
reazione pari alla metà della velocità massima,
il che significa una minore affinità dell'enzima per il substrato.
La cinetica di Michaelis-Menten
La costante di Michaelis-Menten: KM
La costante KM viene spesso associata all’affinità dell’enzima per il
substrato. Questa relazione è matematicamente vera solo nel caso
del meccanismo di Michaelis Menten, in cui si abbia che k2 << k-1 e
quindi si ottiene:
k1
k2
Trascurabile
rispetto a k-1
E+S
k-1
ES
E+P
KS = k-1/k1 KM
Dove KS è la costante di equilibrio (di dissociazione) definita dalla
seguente equazione:
KS = k-1/k1 = [E][S]/[ES]
Quindi, quando la velocità di formazione del prodotto è molto
bassa, la KM è una misura dell’inverso della forza di legame del
substrato all’enzima.
Costante Catalitica/Numero di
Turnover
Efficienza catalitica: kcat/KM
Quando [S]<<KM la maggior parte delle molecole di enzima è in
forma libera e l’eq. di M.M. prende la forma:
Limite fisico al valore di kcat/KM
k2k1 < k2k1 + k-1k1
...
kcat/KM<k1
Velocità di Diffusione: 108-109 M-1s-1
I parametri della cinetica enzimatica
Velocità di Diffusione: 108-109 M-1s-1
Perfezione catalitica
Grafico dei doppi reciproci
(di Lineweaver-Burk)
La cinetica delle reazioni
Punto di verifica
• Scrivete le equazioni di velocità per una reazione di
primo ordine e per una di secondo ordine.
• Che differenze vi sono tra la velocità istantanea, la
velocità iniziale e la velocità massima di una reazione
enzimatica?
• Ricavate l'equazione di Michaelis–Menten.
La cinetica delle reazioni
Punto di verifica
• Cosa rivelano i valori di KM e di kcat/KM riguardo a un
enzima?
• Perché un enzima non può avere un valore del
rapporto kcat/KM più grande di 109 M–1 · s–1?
• Scrivete l'equazione di Lineweaver-Burk (dei doppi
reciproci) e descrivete le caratteristiche di un grafico di
Lineweaver-Burk.
