Studio dello svernamento di Tomato Spotted Wilt - ETH E

Studio dello svernamento di
Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV)
e della sua incidenza su diverse colture
orticole in una serra del Canton Ticino
Lavoro di diploma
Dafne Gianettoni
Novembre 2002 – Aprile 2003
Institute of Plant Sciences
Referente:
Plant Pathology Group
Supervisori scientifici:
Swiss Federal Institute of Technology
Zurich
Dr. Cesare Gessler
Dr. Andrea Patocchi
Giovanni Broggini
RIASSUNTO ..................................................................................................................... 3
ABSTRACT....................................................................................................................... 4
1.
INTRODUZIONE..................................................................................................... 5
1.1. CENNI STORICI ................................................................................................ 5
1.2. DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA.................................................................... 5
1.3. LA SITUAZIONE NEL CANTON TICINO ...................................................... 7
1.4. IMPORTANZA ECONOMICA ......................................................................... 9
1.5.
IL VIRUS .......................................................................................................... 10
1.5.1. TASSONOMIA ............................................................................................ 10
1.5.2. BIOLOGIA ................................................................................................... 11
1.6. PIANTE OSPITI ............................................................................................... 12
1.7.
SINTOMATOLOGIA....................................................................................... 13
1.7.1. SINTOMI SU POMODORO (Lycopersicon esculentum)............................ 13
1.7.2. SINTOMI SU MELANZANA (Solanum melongena) ................................. 14
1.7.3. SINTOMI SU LATTUGA (Lactuca sativa)................................................. 14
1.7.4. SINTOMI SU MALERBE............................................................................ 14
1.8. TRASMISSIONE DEL VIRUS ........................................................................ 15
1.8.1. INSETTI VETTORI ..................................................................................... 15
1.8.1.1. F. OCCIDENTALIS PERGANDE....................................................... 16
1.8.1.2. T. TABACI LINDERMAN.................................................................... 17
1.8.2. ALTRI MODI DI TRASMISSIONE............................................................ 17
1.9. METODI DI LOTTA ........................................................................................ 18
1.9.1. RIDUZIONE DELL’INOCULO .................................................................. 18
1.9.2. CONTROLLO DEI VETTORI..................................................................... 18
1.9.3. PIANTE RESISTENTI A TSWV................................................................. 19
1.10. EVOLUZIONE DEI VIRUS............................................................................. 19
1.11. EVOLUZIONE DI TSWV................................................................................ 20
1.12. ANALISI FILOGENETICHE .......................................................................... 20
1.13. SCOPI DEL LAVORO ..................................................................................... 21
2.
MATERIALE E METODI..................................................................................... 22
2.1.
2.2.
2.3.
2.4.
2.5.
2.6.
2.7.
2.8.
2.9.
2.10.
2.11.
2.12.
2.13.
2.14.
PRELIEVO DEI CAMPIONI ........................................................................... 22
ESTRAZIONE DI RNA.................................................................................... 24
SINTESI DI CDNA ........................................................................................... 25
AMPLIFICAZIONE SPECIFICA TRAMITE PCR ......................................... 26
NESTED PCR.................................................................................................... 27
GEL ELETTROFORESI DEL PRODOTTO PCR ........................................... 27
PURIFICAZIONE DEL PRODOTTO PCR ..................................................... 28
QUANTIFICAZIONE DEL PRODOTTO PCR ............................................... 28
CYCLE SEQUENCING..................................................................................... 28
PURIFICAZIONE DEI PRODOTTI DI CYCLE SEQUENCING..................... 29
SEQUENZIAMENTO...................................................................................... 29
ELABORAZIONE DEGLI ELETTROFEROGRAMMI ................................. 29
ALLINEAMENTO DELLE SEQUENZE ........................................................ 30
ANALISI FILOGENETICHE .......................................................................... 30
1
3.
RISULTATI............................................................................................................. 31
3.1. INCIDENZA DI TSWV IN OTTO COLTURE ORTICOLE ........................... 31
3.2. INCIDENZA DI TSWV IN UNA COLTURA INVERNALE.......................... 33
3.3. PIANTE INFESTANTI .................................................................................... 34
3.4.
SEQUENZE DEI CAMPIONI ANALIZZATI ................................................. 36
3.5. APLOTIPI......................................................................................................... 37
3.6. ANALISI FILOGENETICHE .......................................................................... 40
3.6.1. VARIABILITÀ DELLE SEQUENZE ......................................................... 41
3.6.1.1. SEQUENZE TROVATE DURANTE QUESTA RICERCA ............... 41
3.6.1.2. SEQUENZE DI TUTTI GLI ISOLATI TICINESI .............................. 42
3.6.1.3. CONFRONTO TRA SEQUENZE TICINESI E SEQUENZE
PUBBLICATE...................................................................................................... 43
3.6.2. DENDOGRAMMI BASATI SULLE SEQUENZE NUCLEOTIDICHE.... 46
3.6.2.1. SEQUENZE TROVATE DURANTE QUESTA RICERCA ............... 46
3.6.2.2. SEQUENZE DI TUTTI GLI ISOLATI TICINESI .............................. 46
3.6.2.3. CONFRONTO TRA SEQUENZE TICINESI E SEQUENZE
PUBBLICATE...................................................................................................... 46
3.6.3. DENDOGRAMMI BASATI SULLE SEQUENZE AMINOACIDICHE ... 50
3.6.3.1. SEQUENZE TROVATE DURANTE QUESTA RICERCA ............... 50
3.6.3.2. SEQUENZE DI TUTTI GLI ISOLATI TICINESI .............................. 50
3.6.3.3. CONFRONTO TRA SEQUENZE TICINESI E SEQUENZE
PUBBLICATE...................................................................................................... 50
3.6.4. APLOTIPI PARTICOLARI ......................................................................... 54
4.
DISCUSSIONE ....................................................................................................... 56
4.1. INCIDENZA DI TSWV IN OTTO COLTURE ORTICOLE ........................... 56
4.2. TSWV IN UNA COLTURA INVERNALE ..................................................... 57
4.3. PIANTE INFESTANTI COME SERBATOIO DI TSWV................................ 58
4.4. FREQUENZA E DISTRIBUZIONE DEGLI APLOTIPI DI TSWV................ 59
4.5. EVOLUZIONE DI TSWV IN TICINO............................................................. 60
4.6. APLOTIPI PARTICOLARI.............................................................................. 62
4.7. CONCLUSIONI ............................................................................................... 62
4.8. OUTLOOK ....................................................................................................... 63
4.8.1. COLTURA INVERNALE............................................................................ 63
4.8.2. EVOLUZIONE DI TSWV ........................................................................... 63
4.8.3. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) ............................................ 63
5.
RINGRAZIAMENTI.............................................................................................. 64
6.
LETTERATURA .................................................................................................... 65
7.
APPENDICE ........................................................................................................... 68
2
RIASSUNTO
La malattia causata da Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) provoca ingenti danni alle
numerose colture sensibili. In Ticino i sintomi dell’avvizzimento maculato del pomodoro
sono stati osservati per la prima volta nel 1997. Da allora il virus è stato rilevato in
diverse aziende ed è divenuto un grave problema nelle colture orticole del Cantone.
Per sviluppare una strategia di lotta basata su una miglior conoscenza della diffusione del
patogeno, della sua presenza in diverse colture, del suo luogo di svernamento e del modo
con cui è importato nelle colture, e basandosi su una ricerca svolta nel 2002 (Matasci,
2002) sono stati fissati gli scopi seguenti per questo lavoro: stabilire l’incidenza di TSWV
in otto colture orticole, testarne la presenza in una coltura invernale, valutare
l’importanza delle malerbe come serbatoio del virus e valutare l’evoluzione di TSWV in
Ticino.
Sono stati analizzati 263 campioni di foglia di undici specie ospiti del virus: cavolo rapa,
coste, formentino, Galinsoga sp., lattuga batavia, lattuga cappuccio, lattuga foglia di
quercia, lattughino lollo rosso, melanzane, pomodori e Stellaria media; tutti i campioni
sono stati prelevati in un’azienda di Muzzano presso la quale era stata accertata in
precedenza la presenza del virus. Cavolo rapa, formentino, lattughino lollo rosso,
melanzane, S. media e lattuga foglia di quercia (messa a dimora durante l’inverno) non
presentavano sintomi. Le analisi sono state eseguite tramite estrazione di RNA, sintesi di
cDNA e successiva amplificazione tramite nested PCR del gene NP, il gene virale che
codifica la proteina nucleocapsidica.
L’incidenza del virus nelle colture orticole prese in considerazione si è rivelata elevata;
nessuna ne era esente, a conferma dell’elevata polifagia di TSWV. Le percentuali di
infezioni variano dal 25 % al 100 %. Anche nella coltura messa a dimora durante il
periodo invernale, ovvero quando i tripidi vettori del virus sono attivi in misura ridotta, è
stata rilevata la presenza di TSWV (19,5 % di campioni infetti). Pure le piante infestanti
analizzate si sono rivelate infette, a riprova della loro possibile funzione come serbatoio
per il virus; le percentuali di campioni positivi variano dal 63,6 % al 100 %.
Tramite il sequenziamento di 154 prodotti RT-PCR sono stati individuati 30 aplotipi di
TSWV: in Ticino è presente un’elevata diversità genetica. 29 aplotipi sono nuovi; uno, il
più frequente in tutte le specie, era già stato trovato nell’azienda di Muzzano ed in altre
due aziende ticinesi (a Stabio e a Novazzano). Eseguendo le analisi filogenetiche si è
potuta osservare una probabile evoluzione dall’aplotipo più frequente che potrebbe aver
generato tutti i nuovi aplotipi, con un numero ridotto di sostituzioni nucleotidiche e
aminoacidiche. Il confronto degli aplotipi presenti sul territorio cantonale con le sequenze
pubblicate in GenBank (confronto effettuato con sequenze di 513 nucleotidi), ha
permesso di situare gli aplotipi ticinesi in due gruppi: uno è simile ad isolati provenienti
dall’Olanda e dalla Repubblica Ceca; l’altro è vicino ad un isolato italiano. Questo lascia
ipotizzare una correlazione tra il Paese di provenienza delle piantine acquistate (Olanda
ed Italia) e gli aplotipi presenti in origine, dai quali sarebbero stati generati tutti gli altri
presenti nell’azienda considerata.
3
ABSTRACT
Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) has become an increasing problem as a result of
significant economic losses in many agronomic and ornamental crops worldwide. The
virus was detected in Ticino for the first time in 1997 and has become an important
problem in many horticultural cultures.
The aims of this study were to investigate the incidence of TSWV in eight cultures, to
verify its presence in a winter cultivated culture, to test the importance of infesting weeds
as reservoirs of virus and to determine the genetic diversity of TSWV in Ticino.
Cabbage, eggplant, lettuce (four varieties), swiss chard, Valerianella locusta, tomato (as
infesting weed in other cultures), Galinsoga sp. and Stellaria media leafs were sampled
from October 2002 to February 2003. The samples were taken from a greenhouse in
Muzzano where the virus was present during 2000 and 2001. Total RNA of 263 samples
was extracted and the nucleoprotein gene (NP) was amplified by nested RT-PCR with
specific primers. RT-PCR products were sequenced.
Nested RT-PCR testing showed that TSWV was present in all the species, infecting a
high percentage of plants (166 samples): 68,2 % of the samples of eight cultures, 19,5 %
of the plants cultivated during the winter and 82,6 % of the weeds were infected. Plants
without symptoms were also infected. The infected plants were randomly distributed in
the field; it is hypothesized that vector insects coming from outside were responsible for
the primary infection. The infesting weeds can act as reservoirs from which the virus can
spread to susceptible crops.
30 haplotypes were detected by sequencing 154 RT-PCR products; 29 haplotypes are
new, one was previously discovered on the same greenhouse. This one is the more
frequent in all the species. Strong similarities were found between the 30 haplotypes by
comparison of the nucleotide sequences. The 29 new haplotypes could have been
generated by mutation from the haplotype which was previously present. Comparison of
amino acid sequences showed lower variability: the most substitutions are synonymous.
4
1. INTRODUZIONE
1.1. CENNI STORICI
I sintomi della malattia causata da Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) furono osservati
per la prima volta nel 1915 su piante di pomodoro nello stato di Victoria, in Australia
(Brittlebank, 1919). L’autore denominò la malattia spotted wilt of tomato. La prima
indicazione di un virus quale agente causale della malattia, fu riportata da Samuel et al.
(1930) che diede alla malattia il nome tomato spotted wilt virus.
In Europa il virus fu osservato per la prima volta nel 1931 in Gran Bretagna (Smith,
1932). Dopo la seconda guerra mondiale TSWV perse d’importanza in Europa,
probabilmente perché il vettore Thrips tabaci era presente in quantità relativamente
debole. Il tripide californiano Frankliniella occidentalis, vettore molto efficiente del
virus, iniziò a diffondersi verso il 1980 ed è attualmente presente in tutte le zone europee
e del mediterraneo. La diffusione di TSWV in Europa è associata all’introduzione ed in
seguito all’espansione di questo vettore (EPPO, 2001). Nel 1987 la malattia riapparve
quindi in Francia su peperone (Gebre-Selassie et al., 1989) e nei Paesi Bassi su pomodoro
(Stijger et al., 1989). In seguito fu segnalata in Inghilterra (Barker, 1989), in Italia
(Bellardi & Vicchi, 1990), in Portogallo (Louro, 1990) ed in Spagna (Jordá & Osca,
1991).
Nel 1994, nel Canton Vaud, fu fatta la prima osservazione del virus in Svizzera
(OCVCM, 1996).
Il TSWV o virus della bronzatura del pomodoro, detto anche avvizzimento maculato del
pomodoro, è dichiarato dall’EPPO (European and Mediterranean Plant Protection
Organization) organismo di quarantena.
1.2. DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA
Il virus TSWV è presente in tutte le regioni temperate e subtropicali del pianeta (Fig. 1); è
stato segnalato in Asia, Africa, America, Europa ed Oceania. Prima della seconda guerra
mondiale era considerato in molte regioni il virus più pericoloso, in particolare per quel
che riguarda i pomodori (Gebre-Selassie, 1989).
Nelle zone europee e mediterranee è presente in Algeria, Austria, Belgio, Bulgaria,
Cechia, Croazia, Cipro, Egitto, Francia, Germania, Gran Bretagna, Grecia, Irlanda,
Israele, Italia (Sicilia inclusa), Libia, Lituania, Malta, Marocco (non confermato),
Moldavia, Norvegia (in via d’eradicazione), Polonia, Portogallo, Romania, Russia,
Slovacchia, Spagna (Isole Canarie incluse), Svezia, Svizzera, Tunisia (non confermato),
Turchia, Ucraina, Ungheria e Yugoslavia. È stato debellato in Danimarca e Finlandia
(EPPO, 2001).
5
Fig. 1: Distribuzione geografica di TSWV (EPPO/CABI, 1998).
6
1.3. LA SITUAZIONE NEL CANTON TICINO
Nel 1997 si è verificato a Tenero (Fig. 2, azienda 1) il primo ritrovamento di TSWV in
Ticino, su pomodoro di provenienza olandese (Pedrinis, 1998).
Nel 1999 il virus è stato rilevato a Coldrerio (Fig. 2, azienda 2) su lattuga proveniente
dall’Italia.
Nel 2000 ha fatto la sua apparizione in tre aziende orticole. A Coldrerio è stato segnalato
su lattuga a cappuccio e su pomodoro provenienti dall’Italia. In un’azienda orticola di
Muzzano (Fig. 2, azienda 3) TSWV ha infettato una serra coltivata con pomodori di
provenienza olandese ed è stato rinvenuto anche su lattuga cappuccio, su batavia rossa e
su batavia verde. Il virus è stato ritrovato anche in un’azienda orticola di Stabio (Fig. 2,
azienda 4) in tunnel coltivati con pomodori di provenienza italiana (Pedrinis, 2001).
Nel 2001 sono state colpite quattro aziende: quelle a Stabio e Muzzano già colpite nel
2000 e due nuove aziende, una ad Iragna (Fig. 2, azienda 5) e l’altra a Novazzano (Fig. 2,
azienda 6). L’orticoltore dell’azienda di Coldrerio colpita nel 2000 ha abbandonato
l’attività orticola; non si hanno quindi informazioni sull’evoluzione della situazione in
quest’azienda. Nell’azienda di Stabio il virus è stato ritrovato in due tunnel su alcune
piante di lattuga e su quasi tutte quelle di pomodoro, proveniente dalla Sicila. A Muzzano
il virus è stato riscontrato su pomodoro, anche in questo caso proveniente dalla Sicilia,
ma fornito da una ditta diversa. Pure nelle aziende di Iragna e Novazzano il virus è stato
rilevato su pomodoro. Le piantine dell’azienda nel Sopraceneri provenivano dall’Olanda,
mentre quelle dell’azienda nel Sottoceneri dall’Italia. Nel 2002 il virus è stato rilevato in
una seconda azienda di Novazzano (Fig. 2, azienda 7) su colture di lattuga e lattuga foglia
di quercia provenienti dall’Olanda, nell’azienda di Muzzano già colpita negli anni
precedenti su una pianta di pomodoro proveniente dalla Sicilia, e su pomodoro
nell’azienda di Stabio (Matasci, 2002).
Fig. 2: Localizzazione delle aziende orticole colpite da TSWV nel canton Ticino, tra il 1997 ed il 2002
(Matasci, 2002).
1: Tenero, primo e unico rilevamento nel 1997. 2: Coldrerio, primo rilevamento nel 1999. 3: Muzzano,
primo rilevamento nel 2000. 4: Stabio, primo rilevamento nel 2000. 5: Iragna, primo rilevamento nel 2001.
6: Novazzano (Brusata), primo rilevamento nel 2001. 7: Novazzano, primo rilevamento nel 2002.
7
In Ticino è presente un’elevata variabilità genetica di TSWV: nei campioni prelevati in
cinque aziende nel corso di due anni (2001 e 2002) sono stati individuati 11 aplotipi. Gli
aplotipi rinvenuti nel materiale raccolto nel 2002 sono in alcuni casi identici a quelli
dell’anno precedente ed in altri casi variano per un numero ridotto di sostituzioni
nucleotidiche; ciò può indicare un’evoluzione degli aplotipi già presenti nel 2001 dai
quali deriverebbero quelli del 2001 (Matasci, 2002). In Tab. 1 sono presentati i diversi
aplotipi di TSWV trovati in Ticino nel 2002 ed è indicato in quanti campioni ed in quante
aziende essi sono stati rilevati. Il nome dei diversi aplotipi si compone della sigla del
canton Ticino (TI), dell’anno in cui l’aplotipo è stato trovato per la prima volta, della
coltura (TO = pomodoro, LE = lattuga) e di un’indicazione partendo dalla lettera A. Gli
aplotipi TI01TOA e TI01TOD risultano identici nel confronto di 518 nucleotidi;
considerando le sequenze più lunghe (638 nucleotidi) sono invece distinguibili. La
sequenza TI02LEL non è esattamente determinata data la presenza di tre sostituzioni
dubbie. La mutazione che rende l’aplotipo TI02LEM differente da TI01TOB non è
sicura.
Tab. 1: Aplotipi di TSWV presenti in Ticino, totale dei campioni e delle aziende in cui sono stati rilevati
nel 2002.
Aplotipo
Totale campioni
Totale aziende
TI01TOA
TI01TOB
TI01TOC
TI01TOD
TI01TOE
TI01TOF
TI01TOG
TI02TOH
TI02LEI
TI02LEL*
TI02LEM**
2 (0) 1
7 (8) 2
15
10 (12) 1
1
1
2
1
1
1
1 (0) 2
1
2
3
3
1
1
2
1
1
1
1
1
Tra parentesi il numero di campioni se si considera TI01TOD uguale a TI01TOA (identico nel confronto
di 518 nucleotidi)
2
Tra parentesi il numero di campioni se si considera inesistente la mutazione che rende TI02LEM diverso
da TI01TOB
* sequenza non esattamente determinata data la presenza di tre sostituzioni dubbie
** esistenza non certa dell’aplotipo data la presenza di una mutazione non certa
8
1.4. IMPORTANZA ECONOMICA
L’impatto economico di TSWV è enorme. La grave sintomatologia, l’elevato numero di
specie sensibili, la grande polifagia degli insetti vettori e i limiti della difesa sia chimica
sia biologica contro di essi, sono gli aspetti che rendono i tospovirus un problema di
difficile risoluzione (Vicchi, 1999). A questi fattori si aggiunge la vasta distribuzione
geografica della malattia. I danni arrecati alle colture sono ingenti e possono determinare
la perdita dell’intero raccolto, come riportato da Berling et al. (1992) per lattuga,
peperoni e melanzane (Fig. 3). Le perdite causate annualmente da TSWV a livello
mondiale superano il miliardo di dollari (Galitelli & Davino, 1998; Adkins, 2000). Esso è
reputato fra i dieci virus maggiormente distruttivi dal punto di vista economico (Adkins,
2000).
Fig. 3: Perdite dovute a TSWV in un tunnel di Muzzano (2002).
9
1.5. IL VIRUS
1.5.1. TASSONOMIA
TSWV appartiene al genere Tospovirus (famiglia Bunyaviridae) ed è un tipico esempio di
virus polifago. La famiglia Bunyaviridae comprende cinque generi: Bunyavirus,
Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus e Tospovirus. Quest’ultimo è l’unico a comprendere
patogeni di vegetali (Heinze et al., 2001); agli altri quattro generi appartengono infatti
solo virus animali. Il genere Tospovirus è suddiviso in due sierogruppi: Tomato spotted
wilt e Watermelon silver mottle; entrambi contengono tre specie. Non sono raggruppate in
nessun sierogruppo sette ulteriori specie (Tab. 2).
Tab. 2: Suddivisione del genere Tospovirus: specie ed abbreviazioni dei virus appartenenti ai diversi
sierogruppi (Moyer, 2000).
Sierogruppo
Tomato spotted wilt
Watermelon silver mottle
Ungrouped
Specie
Tomato spotted wilt virus
Groundnut ringspot virus
Tomato chlorotic spot virus
Watermelon silver mottle virus
Watermelon bud necrosis virus
Groundnut bud necrosis virus
Impatiens necrotic spot virus
Chrysanthemum stem necrosis virus
Iris yellow spot virus
Peanut chlorotic fan-spot virus
Peanut yellow spot virus
Physalis severe mottle virus
Zucchini lethal chlorosis virus
Abbreviazione
TSWV
GRSV
TCSV
WSMV
WBNV
GBNV
INSV
CNSV
IYSV
PCFV
PYSV
PSMV
ZLCV
10
1.5.2. BIOLOGIA
Le particelle virali di TSWV sono sferiche, con un diametro di 70-110 nm, e possiedono
una membrana lipidica coperta da glicoproteine, chiamate G1 (78K) e G2 (58K). Il
genoma virale consiste in tre segmenti lineari di RNA a singolo filamento (ssRNA),
chiamati in base alle loro dimensioni: S (small, 2,9 kb), M (medium, 4,8 kb) e L (large,
8,9 kb). I segmenti di RNA sono incapsulati da numerose copie della proteina N
(nucleocapside) (de Ávila et al., 1993). Il filamento L RNA, della lunghezza di 8897
nucleotidi, codifica la proteina L (331,5K), una trascrittasi inversa. I filamenti S e M
RNA hanno strategia codificante ambisense. S RNA (2916 nucleotidi) codifica la
proteina nucleocapsidica N (29K) in viral complementary sense ed una proteina non
strutturale (NSs, 52,4K) in viral sense (Kormelink et al., 1992). M RNA (4821
nucleotidi) codifica un precursore delle due glicoproteine G1 e G2 in viral
complementary sense ed un’altra proteina non strutturale (NSm, 34K) in viral sense (de
Ávila et al., 1993) (Fig. 4).
Fig.
4:
Rappresentazione
tridimensionale
di
una
particella
di
TSWV
(http://www.unb.br/ib/cel/nvme/linha1.htm). Il genoma consiste in tre segmenti a singolo filamento: S
(small), M (medium) e L (large). G1 e G2: glicoproteine; N: proteina nucleocapsidica; NSs: proteina non
strutturale codificata dal segmento S; NSm: proteina non strutturale codificata dal segmento M.
11
1.6. PIANTE OSPITI
Il virus, caratterizzato da elevata polifagia, infetta piante d’interesse orticolo e floricoloornamentale, siano esse dicotiledoni o monocotiledoni, tra cui solanacee, composite,
leguminose e crucifere (Vicchi, 1999) (Tab. 3). È capace di infettare più di 650 specie
vegetali appartenenti a 45 famiglie botaniche (Gallitelli & Davino, 1998).
Nell’epidemiologia di TSWV, le piante infestanti o appartenenti alla flora spontanea
possono avere un ruolo importante per la capacità di fungere da serbatoio di virus (Grieco
et al., 2000). Queste erbe giocano un ruolo fondamentale durante i mesi invernali, durante
i quali non sono disponibili colture sensibili al virus ed i tripidi vettori non sono
particolarmente attivi. Da un esperimento svolto da Groves et al. (2001) risulta che il
75% delle piante di Stellaria media e Sonchus annuus mantengono l’infezione di TSWV
durante l’inverno.
Tab. 3: Specie orticole ed industriali, piante infestanti ed appartenenti alla flora spontanea, e piante
ornamentali ospiti di TSWV.
Specie orticole ed industriali
Carciofo (Cynara scolymus) 1
Cavolo (Brassica oleracea) 2
Cavolo rapa
(B. oleracea var. gongyloides) 3
Cicoria (Cichorium spp.) 1
Cocomero, melone, anguria e altre
Cucurbitaceae 1
Costa (Beta vulgaris var cicla) 2
Fava (Vicia faba) 1
Formentino
(Valerianella locusta syn V. olitoria) 2
Lattuga (Lactuca sativa) 1
Melanzana (Solanum melongena) 1
Patata (Solanum tuberosum) 1
Peperone (Capsicum annuum) 1
Pomodoro (Lycopersicon esculentum) 1
Tabacco (Nicotiana tabacum) 1
Piante
infestanti
e
flora
spontanea
Amaranthus spp., Conyza
bonariensis, Galinsoga spp.,
Polygonum lapathifolium,
Portulaca oleracea, Senecio
vulgaris, Solanum nigrum,
Sonchus spp., Stellaria media,
Taraxacum officinale 1
Cardamine sp., Poa annua, Urtica
sp., Veronica sp. 2
Artemisia vulgaris, Capsella
bursa-pastoris, Chenopodium
album, Cirsium arvense,
Convolvulus arvense, Galium
aparine, Rumex sp. 3
Lamium sp., Trifolium sp. 4
Piante ornamentali
Alstroemeria, Anemone,
Antirrhinum, Araceae, Aster,
Begonia, Bouvardia,
Calceolaria, Callistephus,
Celosia, Cestrum, Columnea,
Cyclamen, Dahlia,
Dendranthema x
grandiflorum, Eustoma, Fatsia
japonica, Gazania, Gerbera,
Gladiolus, Hydrangea,
Impatiens, Iris, Kalanchoe,
Leucanthemum, Limonium,
Pelargonium, Ranunculus,
Saintpaulia, Senecio cruentus,
Sinningia, Tagetes, Verbena,
Vinca, Zinnia 1
1
EPPO, 2001
Marchoux et al., 2000
3
Mertelík et al., 1998
4
Chatzivassiliou et al., 2001
2
12
1.7. SINTOMATOLOGIA
I sintomi manifestati dalle numerose specie sensibili a TSWV sono estremamente vari e
diversificati e possono essere facilmente confusi con quelli provocati da funghi, batteri o
da fitotossicità. I sintomi consistono in nanismo, decolorazioni e mosaicature fogliari,
anulature spesso concentriche con necrosi su foglie e frutti, deformazioni e decolorazioni
dei petali, maculature necrotiche, malformazioni ed anulature concentriche sui frutti. Le
alterazioni descritte sono influenzate dal momento in cui avviene l’infezione, dalla specie
interessata e da fattori ambientali, in particolare dalla temperatura (Vicchi, 1999). Anche
l’isolato virale e lo stadio di sviluppo della pianta al momento dell’infezione
condizionano il decorso della malattia (Rosselló, 1996). La necrosi inizia, spesso sulle
foglie più giovani, sottoforma di piccolissime punteggiature che, allargandosi e
confluendo, interessano parti consistenti della foglia (Gallitelli, 1998).
1.7.1. SINTOMI SU POMODORO (Lycopersicon esculentum)
Su pomodoro la progressiva confluenza delle aree necrotiche porta alla formazione del
caratteristico sintomo definito “bronzatura” (Gallitelli, 1998) (Fig. 5). I sintomi, che
interessano foglie e frutti con relativa perdita della produzione, compaiono sulla parte
apicale della pianta con conseguente arresto di crescita ed accartocciamento, verso l’alto
o verso il basso, della foglia. Le più giovani assumono un tipico colore bronzeo mentre su
quelle basali appaiono tacche necrotiche. Se la pianta è giovane si assiste alla sua morte
precoce; se invece è più vecchia rimane avvizzita (Vicchi, 1999).
A
B
C
Fig. 5: A: Aree decolorate su frutti maturi. B e C: Sintomi di bronzatura su foglie di pomodoro
(Fonti: A e B: Servizio fitosanitario cantonale, 2001. C: www.clemson.edu/ipm/tswv.htm#symptoms).
13
1.7.2. SINTOMI SU MELANZANA (Solanum melongena)
I principali sintomi su melanzana sono delle macchie clorotiche sulla foglia e una forte
alterazione della crescita (Marchoux et al., 2000). I frutti appaiono malformati da
escrescenze di forma rotondeggiante, spesso circondate da aloni necrotici (Gallitelli &
Davino, 1998).
1.7.3. SINTOMI SU LATTUGA (Lactuca sativa)
La lattuga ed altre composite (indivia, cicoria, scarola, carciofo) presentano necrosi più o
meno estese sulla vegetazione giovane (Fig. 6). Le infezioni precoci uccidono la pianta in
poche settimane mentre quelle tardive, pur consentendo la crescita della pianta, portano a
produzioni di scarso valore commerciale (Gallitelli & Davino, 1998).
Fig. 6: Necrosi su foglie di lattuga.
1.7.4. SINTOMI SU MALERBE
Contrariamente alle specie coltivate, la maggior parte delle specie spontanee presenta
pochi sintomi o ne è totalmente priva (Marchoux et al., 2000; Chatzivassiliou et al.,
2001).
Stellaria media reagisce all’infezione di TSWV con leggere clorosi o mosaici, mentre
Galinsoga parviflora mostra importanti clorosi, necrosi e crescita ritardata (Mertelík et
al., 1998).
14
1.8. TRASMISSIONE DEL VIRUS
1.8.1. INSETTI VETTORI
La trasmissione del virus tramite tripidi (famiglia Thripidae, ordine Thysanoptera) fu
scoperta nel 1927 da Pittmann. In seguito molte ricerche hanno dimostrato il ruolo di
diverse specie di Thysanoptera quali vettori di TSWV. Nove specie sono state identificate
come capaci di trasmettere il virus; si tratta di Frankliniella occidentalis Pergande, F.
schultzei Trybom, F. fusca Hinds, F. tenuicornis Uzel, F. intonsa Trybom, Thrips tabaci
Linderman, T. palmi Karny, T. setosus Moulton e Scirtotrips dorsalis Hood (Rossellò,
1996).
I tripidi sono insetti che producono molte generazioni in un anno ed essendo favoriti da
temperature relativamente elevate si sviluppano bene nelle serre: il ciclo biologico è
continuo ed ogni stadio può venir trovato durante tutto l’anno.
Questi insetti vivono sulle parti tenere della pianta, e per nutrirsi lacerano fiori, foglie e
frutti, iniettando saliva e succhiando il contenuto delle cellule.
(30 - 45 giorni)
(2 - 5 giorni)
(4 - 11 giorni)
(4 - 9 giorni)
(1 giorno)
(2 - 3 giorni)
Fig. 7: Ciclo biologico dei tripidi vettori di TSWV (durata dei singoli stadi in giorni) (modificato da
www.discoverlife.org/nh/tx/Insecta/Thysanoptera/). Rettangolo punteggiato: stadio in cui l’insetto
acquisisce il virus. Rettangolo nero: stadi in cui l’insetto può trasmettere il virus. Prepupa e pupa si trovano
nel suolo.
Il virus è acquisito dai tripidi solamente allo stato larvale (neanide) e le pupe, che
maturano nel suolo, conservano il virus (Fig. 7). Gli adulti sono i principali responsabili
della trasmissione e diffusione del virus, potendosi facilmente spostare da una foglia
15
all’altra o da pianta a pianta, saltando o volando sospinti da correnti d’aria; possono
anche essere trasportati involontariamente dai coltivatori all’interno delle serre. Le larve
invece, non essendo dotate di grande mobilità, vivono quasi esclusivamente sulle foglie
dove sono nate.
Gli adulti rimangono infettivi per tutta la loro vita (della durata di alcune settimane)
mentre le uova deposte nei tessuti vegetali danno origine a larve sane (Vicchi, 1999).
T. tabaci era ritenuto in passato il principale vettore di TSWV. Attualmente è F.
occidentalis ad essere considerato il vettore più importante (Rossellò, 1996); ciò è dovuto
alla sua dispersione a livello mondiale avvenuta a partire dal 1980.
1.8.1.1. F. OCCIDENTALIS PERGANDE
Originaria del Nord America, F. occidentalis è presente dal livello del mare fino alle zone
sub-alpine. Questo insetto si è diffuso dalla California verso le isole Canarie, l’Europa, le
Hawaii, la Nuova Zelanda, l’isola Réunion e le zone settentrionali del Sud America
(Waterhouse and Norris, 1989).
Dal monitoraggio dei tripidi vettori di TSWV svolto nel 2001 in Ticino, è emerso che F.
occidentalis era presente nella maggior parte delle aziende controllate (14 su 20), sia nel
Sopraceneri sia nel Sottoceneri (Besomi, 2001).
Il ciclo biologico del tripide conta sei stadi che vanno dall’uovo all’adulto. I tempi di
sviluppo variano secondo la temperatura, come indicato in Tab. 4.
Tab. 4: Durata in giorni di diversi stadi di sviluppo di F. occidentalis su cetriolo, in relazione alla
temperatura (Nick, 1993).
Temperatura (°C)
15
20
25
Uovo (gg)
11.2
6.4
4.3
Larva (gg)
14.0
7.5
5.4
Da uovo a adulto(gg)
33.7
19.0
12.7
I maschi adulti misurano 0,9-1,1 mm di lunghezza, le femmine 1,3-1,4 mm. Il loro colore
varia dal giallo-rossastro al marrone (Fig. 8).
Fig. 8: Adulto di F. occidentalis Pergande (Pinot Y. / INRA Montpellier)
16
F. occidentalis è una specie polifaga, segnalata su oltre 250 piante ospiti; attacca alberi da
frutto, piante ortive, floricole e numerose piante erbacee infestanti (Pollini, 1998).
Le piccole uova sono opache e reniformi; vengono normalmente deposte singolarmente,
ma a volte si possono trovare posate in fila lungo una vena della foglia (Lewis, 1973). Le
uova, molto sensibili al disseccamento, si schiudono dopo 4-11 giorni. L’insetto si nutre
attivamente solo durante gli stadi larvali e da adulto. Le larve del primo stadio sono
bianche o trasparenti e si colorano in seguito di giallo-arancione. Questo stadio dura 2-5
giorni. Durante il secondo stadio, le larve hanno un colore giallo pallido e dopo 4-9 giorni
sono pronte per mutare allo stadio ninfale (o pupa). Durante i due stadi tra la larva e
l’adulto (prepupa e pupa) gli individui non si nutrono (Nick, 1993).
La riproduzione avviene normalmente senza fecondazione (partenogenesi); i maschi sono
rari (Waterhouse and Norris, 1989). Se la femmina è stata fecondata, le uova daranno
origine ad altre femmine. Una femmina produce circa 40 uova durante la sua vita. La
lunghezza della vita di un adulto varia secondo il clima ed è di 30-45 giorni.
L’acquisizione del virus avviene durante il primo stadio larvale con l’alimentazione su
piante infette (Wijkamp et al., 1996). L’insetto diventa vettore del virus dopo un periodo
di latenza durante il quale raggiunge il secondo stadio larvale; in questo periodo il virus si
moltiplica nelle cellule dell’epitelio del canale alimentare, nei muscoli che lo circondano
e nelle ghiandole salivari (Bandla et al., 1998). Nei due stadi che seguono (prepupa e
pupa) l’insetto si trova nel suolo e non trasmette il virus. L’adulto non lo può acquisire
neanche nutrendosi di piante infette, data una particolare conformazione del canale
alimentare; può trasmettere il virus unicamente se lo ha acquisito durante il primo stadio
larvale.
1.8.1.2. T. TABACI LINDERMAN
T. tabaci, originario della regione Mediterranea, è un insetto diffuso mondialmente che
attacca piante appartenenti a 25 famiglie, tra cui cavoli, cipolle, melanzane, patate,
pomodori, peperoni, porri e tabacco.
Il ciclo biologico di quest’insetto è molto simile a quello di F. occidentalis: conta sei
stadi dall’uovo all’adulto. Il ciclo di sviluppo, da adulto ad adulto, richiede in genere 2530 giorni. La riproduzione avviene quasi esclusivamente per partenogenesi (Pollini,
1998).
1.8.2. ALTRI MODI DI TRASMISSIONE
Il virus può essere trasmesso attraverso la propagazione di parti di pianta (bulbi, tuberi,
talee). Non molto rilevante dovrebbe invece essere la trasmissione tramite strumenti di
lavoro (Pedrinis, 2001).
I risultati di un esperimento di Antignus et al. (1997) indicano che i semi raccolti da
piante contaminate con TSWV non sono infetti. La trasmissione di TSWV tramite seme è
considerata possibile da alcuni autori (Gebre-Selassie et al., 1989; Marchoux et al.,
2000), mentre viene esclusa da altri (Reddy, 1988).
Pottorff und Newman (2001) segnalano la possibilità che TSWV venga trasmesso tramite
seme di Petunia x hybrida e Lycopersicon esulentum.
17
Molti fattori, tra cui il ceppo virale, la specie ospite e la varietà, come pure le condizioni
ambientali durante la produzione dei semi, influenzano l’eventuale trasmissione tramite
seme. Questo potrebbe spiegare i risultati contradditori ottenuti dai diversi ricercatori
(Antignus et al., 1997).
1.9. METODI DI LOTTA
I possibili metodi per controllare TSWV sono: la riduzione dell’inoculo, il controllo dei
vettori tramite lotta fisica, chimica e biologica, e l’utilizzo di varietà resistenti o tolleranti.
1.9.1. RIDUZIONE DELL’INOCULO
Le seguenti misure possono essere adottate per ridurre l’inoculo:
- controllo del trasporto di materiale vegetale, per evitare la diffusione del focolaio
di infezione, nonché l’introduzione di piante infette in un campo sano;
- utilizzo di piantine da trapianto esenti da virus;
- eliminazione di piante infestanti che possono fungere da serbatoio per il virus;
- eliminazione dei residui della coltura precedente;
- controllo protettivo della coltura e rimozione immediata delle prime piante infette;
- rimozione dell’intera coltura se l’incidenza della malattia è molto elevata
(Rosselló et al., 1996).
1.9.2. CONTROLLO DEI VETTORI
Il controllo della trasmissione tramite tripidi vettori, può essere effettuato con metodi
fisici, chimici e biologici.
I metodi fisici consistono nell’uso di reti a maglie molto fini su porte e finestre nel caso di
colture in serra, oppure nell’utilizzo di pacciamatura riflettente per ridurre l’immigrazione
degli insetti. Questo metodo perde la sua efficacia a partire dal momento in cui la coltura
copre interamente il suolo. Infine l’uso di trappole cromotropiche blu o gialle per
attestare preventivamente la presenza degli insetti, si rivela molto utile e permette
l’adozione immediata di misure di controllo (Rosselló et al., 1996).
L’impiego di insetticidi è consigliabile, anche se diverse popolazioni di F. occidentalis
hanno già acquisito elevati livelli di resistenza contro alcuni principi attivi (Rosselló et
al., 1996). A questo problema si aggiunge quello del particolare comportamento dei
tripidi sulle piante; essi generalmente si riparano in profondità nei fiori o nelle gemme ed
inoltre gli stadi quiescenti di uovo e di pupa non hanno possibilità di ingerire l’insetticida
(Gallitelli & Davino, 1998). La difesa chimica va dunque utilizzata non per eliminare i
tripidi, bensì per controllarne la diffusione.
La lotta biologica sfrutta antagonisti naturali, quali acari predatori (Amblyseius spp.) e
cimici predatrici (Orius spp.). Le cimici predano i tripidi in ogni stadio dello sviluppo,
mentre gli acari non attaccano gli adulti e sono inefficaci contro le larve del secondo
stadio (Rosselló et al., 1996). Per un controllo adeguato bisogna introdurre un numero
18
elevato di predatori; bisogna inoltre rilasciare gli agenti di controllo prima che la
popolazione di tripidi raggiunga proporzioni elevate (Besomi, 2001).
1.9.3. PIANTE RESISTENTI A TSWV
Il metodo più efficace per proteggere le colture dalla malattia è la selezione di piante
resistenti; molti sforzi sono stati fatti per sviluppare varietà resistenti al virus
(Brommonschenkel et al., 2000).
La prima resistenza transgenica a TSWV è stata ottenuta con l’introduzione in Nicotiana
tabacum (tabacco) del gene N; sono seguite l’introduzione dello stesso gene in lattuga,
pomodoro e crisantemo (Hoffmann et al., 2001).
In seguito sono stati identificati sette geni per la resistenza a TSWV in diverse specie del
genere Lycopersicon. Il gene Sw-5, individuato in Lycopersicon peruvianum (Spassova et
al., 2001), conferisce ad individui omozigoti un elevato livello di resistenza nel caso di
inoculazioni meccaniche effettuate con alcuni isolati di TSWV ed anche con altri
Tospovirus (GRSV, TCSV, GBNV). La resistenza non è però buona nel caso di
trasmissione tramite tripidi vettori (Roselló et al., 2001). Su pomodori appartenenti a
varietà resistenti ed infettati tramite tripidi, sono stati osservati sintomi di TSWV;
probabilmente la presenza del gene Sw-5 causa una risposta ipersensitiva insufficiente
(Aramburu et al., 2000).
1.10.
EVOLUZIONE DEI VIRUS
I virus RNA presentano un’enorme variabilità genetica, se paragonati a tutti gli altri
organismi viventi. I meccanismi responsabili delle variazioni nei virus sono
essenzialmente gli stessi che agiscono nell’evoluzione di tutti gli organismi: mutazioni,
riassortimenti e ricombinazioni (Moyer,?).
Le mutazioni sono generate da errori commessi dall’enzima polimerase durante la
replicazione, che risultano in sostituzioni, delezioni o addizioni (Astier, 2001). A causa
dell’assenza di un meccanismo di riparazione di questi errori, i virus RNA presentano il
tasso di mutazione più elevato di tutti gli esseri viventi (Moya et al., 2000); questo tasso
di mutazione è stato stimato a circa 10-4 mutazioni per nucleotide e per replicazione
(Astier, 2001).
I virus RNA con genoma segmentato sono soggetti anche al riassortimento, ossia allo
scambio di segmenti di genoma fra individui (Moyer,?).
La ricombinazione, infine, determina la formazione di molecole di acido nucleico da
materiale genetico proveniente da segmenti diversi di DNA o RNA, producendo così
nuove strutture (Astier, 2001).
19
1.11.
EVOLUZIONE DI TSWV
Il genoma tripartito dei virus della famiglia Bunyaviridae permette lo scambio di
informazioni genetiche fra individui, grazie al meccanismo di riassortimento (Qiu et al.,
1998). La capacità di TSWV di replicarsi sia nella pianta sia nell’insetto vettore e la
presenza di ceppi virali o di Tospovirus diversi in infezione mista nella stessa pianta o in
replicazione nello stesso vettore, possono facilmente favorire la comparsa proprio di
riassortanti o di ricombinanti (Gallitello & Davino, 1998).
1.12.
ANALISI FILOGENETICHE
Analizzando le diversità a livello delle sequenze di acidi nucleici è possibile paragonare e
differenziare più organismi fra loro. Un’unica base mutata in un intero genoma basta
come elemento distintivo. Esistono diversi tipi di marcatori molecolari con cui sondare le
differenze genomiche, ad esempio RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism),
AFLP (Amplified Fragment-Length Polymorphism), RAPD (Random Amplification of
Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeats) oppure si può sequenziare una
parte di un gene, come è il caso in questa ricerca.
La distanza genetica esprime la divergenza tra unità tassonomiche (operational
taxonomic unit, OTU). Le distanze tra OTU sono rappresentate graficamente sottoforma
di alberi filogenetici o dendogrammi. I nodi rappresentano le unità tassonomiche e i rami
che li connettono ne riassumono il percorso evolutivo. Un albero è in scala quando la
lunghezza dei rami è proporzionale alla distanza genetica.
Le distanze tra OTU possono essere calcolate con diversi algoritmi, in grado anche di
rappresentare gli alberi. Questi algoritmi possono essere classificati in distance methods
(Neighbor Joining, UPGMA) e discrete-character methods (Maximum Parsimony,
Maximum likelihood). L’algoritmo Neighbor Joining è basato sul principio di minimum
evolution, il quale assume che l’albero migliore sia quello con la minor somma della
lunghezza dei rami. Neighbor Joining non esamina tutte le possibili topologie, ma ad ogni
stadio del cladeing applica il principio di minimum evolution (Nei & Kumar, 2000). Una
tipologia è definita come l’insieme degli elementi che definiscono la struttura di un
dendogramma (posizione dei nodi, lunghezza dei rami, …). L’algoritmo Maximum
Parsimony assume che ogni OTU evolve indipendentemente e calcola il minor numero di
sostituzioni che spiegano l’intero processo evolutivo; la topologia che richiede il minor
numero di sostituzioni è poi mantenuta come migliore albero.
Vi sono due classi di metodi di ricerca per ottenere gli alberi migliori: metodi esatti
(branch and bound search) e metodi euristici (heuristic search). Con un numero di OTU
maggiore di nove è consigliabile utilizzare il metodo euristico per evitare tempi di calcolo
troppo elevati. Non è garantito che l’albero corretto sia effettivamente generato, poiché
unicamente una piccola parte degli alberi possibili è esaminata.
Felsenstein (1985) ha sviluppato l’algoritmo bootstrap per accordare una sicurezza
statistica all’ipotesi di relazione (Nei & Kumar, 2000).
Il programma MEGA esegue una campionatura dei dati iniziali e genera una serie di
replicati casuali che inserisce nelle sequenze originali, generandone un nuovo set che è
utilizzato per creare un nuovo albero. La topologia dell’albero così ottenuto è paragonata
20
a quello iniziale. Ad ogni ramo che coincide è assegnato il valore 1 (identity value)
mentre agli altri è assegnato il valore 0. Questo processo è ripetuto più volte
(generalmente 1000). In seguito è calcolata la percentuale dei casi in cui il ramo ha valore
1: questo valore è indicato come bootstrap confidence value o semplicemente bootstrap
value. Un clade, definito come gruppo comprendente un antenato comune (rappresentato
dal nodo da cui dipartono i rami) e tutti i suoi discendenti, è generalmente considerato
significativo quando il valore bootstrap è superiore a 50%.
1.13.
SCOPI DEL LAVORO
La malattia causata da TSWV provoca ingenti danni alle numerose colture orticole ospiti
del virus. In Ticino è divenuto un grave problema nel corso degli ultimi anni. In una
ricerca precedente (Matasci, 2002) è stato testato un metodo (RT-PCR) che ha permesso
di diagnosticare la presenza di TSWV su piante di pomodoro e di lattuga senza sintomi.
Era stata inoltre segnalata la possibile funzione delle piante infestanti presenti nei tunnel
come serbatoio per il virus tra una coltura e la successiva, ed era infine stata ipotizzata la
possibile origine degli aplotipi presenti in Ticino.
Per sviluppare una strategia di lotta è importante conoscere ancora meglio il modo di
diffusione del virus, sapere in quali colture è presente, come viene importato e dove
sverna. Gli scopi di questo lavoro sono di stabilire l’incidenza di TSWV in varie colture
orticole, di testarne la presenza in una coltura messa a dimora durante l’inverno, di
analizzare l’importanza delle malerbe come serbatoio del virus e di valutare l’evoluzione
di TSWV in Ticino, determinando tramite sequenziamento quanti e quali aplotipi del
virus sono presenti.
21
2. MATERIALE E METODI
2.1. PRELIEVO DEI CAMPIONI
Il materiale analizzato è stato raccolto presso l’Azienda orticola All’Orto di Muzzano. In
quest’azienda era già stata accertata la presenza del virus nel 2000, nel 2001 e nella prima
parte del 2002. Nelle serre non è stata eseguita alcuna sterilizzazione del suolo e al
momento della prima, della seconda e della terza campionatura si notava una forte
presenza di malerbe e piantine di pomodoro infestanti, nate da semi restati nel terreno.
Sono state eseguite cinque campionature ad intervalli mensili. I campioni raccolti sono
stati posti singolarmente in sacchetti di plastica e conservati a -80°C.
Una visione generale delle colture presenti nell’azienda e della raccolta dei campioni è
presentata in Tab. 5.
La prima campionatura è stata realizzata da Mauro Jermini il 18 ed il 21.10.’02. Sono
stati raccolti 40 campioni ciascuno di nove colture, cercando di averne, dove possibile, 20
con sintomi e 20 senza sintomi. Le colture erano: lattuga foglia di quercia verde e lattuga
foglia di quercia rossa, lattuga cappuccio, lattughino lollo rosso e lattughino lollo verde,
lattuga batavia, melanzane, formentino e cavolo rapa. Il lattughino lollo verde non è stato
analizzato. Al momento della campionatura erano presenti sull’azienda anche rapanelli e
cicoria verde. Non sono stati raccolti campioni di rapanelli poiché non sono state trovate
informazioni riguardo alla sensibilità di questa coltura al virus; la cicoria invece era
coltivata su una piccola superficie ed era in parte già stata raccolta.
La seconda campionatura è stata eseguita il 14.11.’02. Sono stati raccolti alcuni campioni
di piante infestanti (Galinsoga sp., Stellaria media e semenzali spontanei di pomodoro) e
40 campioni di coste.
Il 13.12.’02 sono stati raccolti 20 campioni di S. media ed è stata fatta una valutazione
della situazione riguardante le malerbe. A causa della loro abbondanza ci si è limitati a
determinare le piante infestanti presenti, senza valutazione quantitativa.
Il 20.01.’03 sono stati prelevati 48 campioni da piantine di lattuga foglia di quercia verde
e rossa, appena trapiantate in serra. Le piantine da cui sono stati raccolti i campioni sono
state contrassegnate in modo da poterle ritrovare. Lo stesso giorno sono stati raccolti otto
campioni (due campioni ciascuno per quattro varietà) da piantine di lattuga non ancora
trapiantate, appena arrivate sull’Azienda.
Il 24.02.’03 è stata eseguita la quinta ed ultima campionatura dalle stesse 48 piantine di
lattuga foglia di quercia del mese precedente.
22
Tab. 5: Colture presenti presso l’Azienda All’Orto di Muzzano tra il 18.10.’02 e il 24.02.’03, sensibilità a
TSWV, data di raccolta dei campioni (numero di campioni prelevati) ed osservazioni.
Coltura
Cavolo rapa (CR)
Cicoria verde 1
Coste (CO)
Formentino (FO)
Lattuga batavia (LB)
Lattuga cappuccio (LC)
Lattuga foglia di quercia rossa (LQ)
Ospite di TSWV
si
si
si
si
si
si
si
Lattuga foglia di quercia verde (LQ)
si
Lattuga (4 varietà) 2
Lattughino lollo rosso (LR)
Lattughino lollo verde
Melanzana (ME)
Rapanelli 3
Malerbe 4
Galinsoga sp. (GA)
Stellaria media (SM)
si
si
si
si
?
Lycopersicon esculentum (TO)
si
si
si
Campioni raccolti
18.10.2002 (40)
no
14.11.2002 (40)
21.10.2002 (40)
18.10.2002 (40)
18.10.2002 (40)
18.10.2002 (40)
20.01.2003 (24)
24.02.2003 (24)
18.10.2002 (40)
20.01.2003 (24)
24.02.2003 (24)
20.01.2003 (2X4)
21.10.2002 (40)
18.10.2002 (40)
21.10.2002 (40)
no
Osservazioni
senza sintomi
piccola superficie
sintomi alla raccolta
senza sintomi
sintomi non sempre tipici
sintomi alla raccolta
sintomi non sempre tipici
senza sintomi
senza sintomi
sintomi non sempre tipici
senza sintomi
senza sintomi
non ancora trapiantata
senza sintomi
sintomi alla raccolta
senza sintomi
14.11.2002 (17)
14.11.2002 (2)
13.12.2002 (21)
14.11.2002 (12)
sintomi alla raccolta
senza sintomi
senza sintomi
sintomi alla raccolta
1
Non sono stati raccolti campioni di cicoria verde, poiché coltivata su una piccola superficie
Lattuga appena arrivata nell’azienda e non ancora trapiantata in serra
3
Non sono state trovate informazioni sulla suscettibilità dei rapanelli a TSWV
4
Sono stati raccolti campioni delle malerbe ritenute determinanti come possibile serbatoio per il virus
?
Informazioni mancanti
2
23
2.2. ESTRAZIONE DI RNA
Per estrarre RNA è stato utilizzato il Kit NucleoSpin® Multi-96 Plant (Macherey Nagel,
Oensingen, Svizzera). È stato seguito il protocollo annesso applicando alcune modifiche:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Polverizzare in un omogeneizzatore 50 mg di foglia contenuti in un eppendorf da
2 ml con biglie di vetro di 2,5 mm (Biospec). Aggiungere 400 µl di lysis buffer.
Centrifugare per 30 sec a 1500 g (5415 D Eppendorf). Incubare a 56°C per 30
min. Non aggiungere RNase.
Centrifugare per 10 min a 6000 g (5415 D Eppendorf).
Trasferire 300 µl di supernatante in eppendorf da 1,5 ml e aggiungere 300 µl di
buffer C4 e 200 µl di etanolo. Mescolare pipettando e centrifugare per 30 sec a
1500 g (5415 D Eppendorf).
Trasferire i campioni in una piastra NucleoSpin® Multi-96 Plant. Chiudere la
piastra con un foglio PE autoadesivo.
Sistemare la piastra NucleoSpin® Multi-96 Plant su uno Square-well block e
centrifugare per 2 min a 6000g (Sigma 4-15 C Qiagen).
Togliere il foglio PE autoadesivo e aggiungere 500 µl di wash buffer. Richiudere
la piastra con un nuovo foglio PE autoadesivo e centrifugare nuovamente per 2
min a 6000g. Togliere il foglio PE autoadesivo e aggiungere 900 µl di buffer C5.
Centrifugare per 5 min a 6000g.
Sistemare la piastra NucleoSpin ® Multi-96 Plant su un Round-well block.
Aggiungere 100 µl di elution buffer, anticipatamente riscaldato a 70°C,
direttamente sulla membrana. Incubare a temperatura ambiente per 2-3 min e
centrifugare per 2 min a 6000g.
Al fine di ridurre il pericolo di contaminazioni, sono stati utilizzati puntali con filtri
(Eppendorf) per l’estrazione di RNA, la sintesi di cDNA e le amplificazioni PCR e nested
PCR.
24
2.3. SINTESI DI cDNA
Per la sintesi di cDNA è stata utilizzata la retrotrascrittasi derivata da Avian
Myeloblastisis Virus (AMV) (Roche, Mannheim, Germania).
Sono stati aggiunti al mix di reazione (Tab. 6) 5 µl di RNA totale. La sintesi è stata
effettuata in un termocycler Gene Amp 9600 PCR System (Perkin Elmer Cetus), alle
condizioni descritte in Tab. 7. È stato utilizzato il primer NP rev indicato in Tab. 8.
Tab. 6: Mix di reazione per sintesi di cDNA con primer NP.
Reagenti
5x Incubation Buffer
dNTP Mix
Primer NP rev (10 µM)
AMV Reverse Transcriptase (5u/µl)
RNA totale
Volume totale
Mix
4 µl
10 µl
0,5 µl
0,5 µl
5 µl
20 µl
Tab. 7: Condizioni per la sintesi di cDNA (1 ciclo) (Dewey et al., 1996).
Sintesi di cDNA
AMV RT inactivation
Temperatura Durata
42°C
60 min
94°C
2,5 min
Tab. 8: Primers specifici per il gene NP di TSWV (sintetizzati da Mycrosynth, Belgach, Svizzera).
Primer
Coordinate1
Sequenza
Referenza
NP for
154 - 171
5’- ATGTCTAAGGTTAAGCTC - 3’
Jain et al., 1998
NP rev
912 - 930
5’- TTAAGCAAGTTCTGTGAG - 3’
Jain et al., 1998
1
Coordinate sulla mappa dei nucleotidi dell’isolato BR-01 (De Haan et al., 1991)
25
2.4. AMPLIFICAZIONE SPECIFICA TRAMITE PCR
Per l’amplificazione tramite PCR sono stati aggiunti 5 µl di soluzione di sintesi di cDNA
al mix di reazione (Tab. 9). L’amplificazione è stata eseguita in un termocycler Gene
Amp 9600 PCR System (Perkin Elmer Cetus) alle condizioni descritte in Tab. 10.
Tab. 9: Mix di reazione per PCR specifica.
Reagenti
ddH2O
10 x Buffer
dNTP Mix
Primer NP for (10 µM)
Primer NP rev (10 µM)
Taq
cDna
Volume totale
Mix
6,94 µl
1,50 µl
0,75 µl
0,30 µl
0,30 µl
0,21 µl
5 µl
15 µl
Concentrazione finale
0,10 mM
0,20 µM
0,20 µM
0,07 U/µl
Tab. 10: Condizioni per PCR specifica (40 cicli).
Denaturazione
Annealing
Estensione
Estensione finale
Temperatura Durata
94°C
30 s
53°C
30 s
72°C
1 min
72°C
7 min
26
2.5. NESTED PCR
Per effettuare l’amplificazione tramite nested PCR sono stati aggiunti 2 µl di prodotto
PCR della prima amplificazione al mix di reazione (Tab. 11). L’amplificazione è stata
eseguita in un termocycler Gene Amp 9600 PCR System (Perkin Elmer Cetus) alle
condizioni descritte in Tab. 12. Sono stati utilizzati i primers NPnest sviluppati da
Matasci, 2002 (Tab. 13).
Tab. 11: Mix di reazione per PCR specifica.
Reagenti
ddH2O
10 x Buffer
dNTP Mix
Primer NPnest for (10 µM)
Primer NPnest rev (10 µM)
Taq
Template DNA
Volume totale
Mix
Concentrazione finale
21,88 µl
3,00 µl
0,10 mM
1,50 µl
0,60 µl
0,20 µM
0,60 µl
0,20 µM
0,42 µl
0,07 U/µl
2 µl
30 µl
Tab. 12: Condizioni per PCR specifica (35 cicli).
Denaturazione
Annealing
Estensione
Estensione finale
Temperatura
94°C
55°C
72°C
72°C
Durata
30 s
30 s
1 min
7 min
Tab. 13: Primers per nested PCR (sintetizzati da Mycrosynth, Belgach, Svizzera).
Primer
Coordinate1
Sequenza
NPnest for
213 - 235
5’- CCTTGAGTTTGAGGAAGATCAGA - 3’
NPnest rev
823 - 836
5’- CCTTTAGCATTAGGATTGCTGG - 3’
1
Coordinate sulla mappa dei nucleotidi dell’isolato BR-01 (De Haan et al., 1991)
Referenza
Matasci, 2002
Matasci, 2002
2.6. GEL ELETTROFORESI DEL PRODOTTO PCR
Per verificare la presenza di TSWV nei campioni, 5 µl di prodotto nested PCR, a cui è
stato aggiunto 1 µl di blue juice, sono stati separati su gel di agarosio 0,8% (Gibco) in
0,5xTBE contenente tracce di bromuro di etidio.
27
2.7. PURIFICAZIONE DEL PRODOTTO PCR
Per la purificazione è stato utilizzato il QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden,
Germania) seguendo il protocollo annesso ed applicando la seguente modifica:
- punto 6: I campioni sono stati centrifugati alla massima velocità durante 2 minuti
invece di 1 minuto.
2.8. QUANTIFICAZIONE DEL PRODOTTO PCR
La stima della quantità di DNA purificato è stata effettuata confrontando la luminosità
delle bande di DNA con le bande degli standard 5 ng, 25 ng e 50 ng su gel di agarosio
0,8% (Gibco) in 0,5xTBE contenente tracce di bromuro di etidio.
2.9. CYCLE SEQUENCING
Per determinare le sequenze dei prodotti nested PCR è stato utilizzato ABI PRISM® Big
DyeTM Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems,
2001).
Ogni amplicone è stato sequenziato nelle due direzioni utilizzando i primers NPnest for e
NPnest rev (Tab. 13).
Le reazioni di sequenziamento sono state eseguite in un termocycler Gene Amp 9600
PCR System (Perkin Elmer Cetus) come descritto in Tab. 14, alle condizioni descritte in
Tab. 15.
Tab. 14: Mix di reazione per cycle sequencing.
Big dye
5x rxn buffer1
Primer NPnest for o NPnest rev o L1 o L2 (1,6 µΜ)
ddH2O
DNA (5-20 ng per NP; 3-10 ng per L)
Volume totale
1
5x rxn buffer: 400 mM Tris HCl, 10mM MgCl2, pH 9,0
Mix
1 µl
1,5 µl
1 µl
Y
X
10 µl
Tab. 15: Condizioni per cycle sequencing (35 cicli).
Denaturazione
Annealing
Estensione
Temperatura
96°C
50°C
60°C
Durata
10 s
5s
4 min
28
2.10.
PURIFICAZIONE DEI PRODOTTI DI CYCLE SEQUENCING
Con questa procedura si eliminano sali, primers, ddNTPs e dNTP non integrati.
1. Aggiungere 290 µl di ddH2O ad un volume di 45 µl di DNA Grade Sephadex G-50
Fine (Amersham Pharmacia Biotech), in una piastra per filtrazione MAHVN 45 (ABI
PRISM). Lasciar equilibrare per 3 ore a temperatura ambiente oppure più a lungo in
frigorifero. Le piastre equilibrate possono venir sigillate con una pellicola per
alimenti (Saran) e conservate a 4°C in frigorifero per diverse settimane.
2. Porre la piastra per filtrazione su una piastra per titolazione (microtiter plate) e
centrifugare a 900 g per 5 min (Sigma 4-15 C Qiagen). Gettare il tampone raccolto
nella piastra per titolazione.
3. Aggiungere 145 µl di ddH2O per purificare il Sephadex e centrifugare a 900 g per 5
min (Sigma 4-15 C Qiagen).
4. Aggiungere 10 µl di acqua e 2 µl di SDS 2,2% al prodotto di reazione. Incubare in un
termocycler durante 5 minuti a 98°C e durante 10 minuti a 25°C. Pipettare il tutto
nella colonna di Sephadex.
5. Porre la piastra per filtrazione su una piastra (MicroAmp, Reaction Plate) e
centrifugare a 900 g per 5 min (Sigma 4-15 C Qiagen).
6. Ricoprire il prodotto purificato con 20 µl di olio minerale.
2.11.
SEQUENZIAMENTO
Il sequenziamento del prodotto PCR è stato eseguito con il sequenziatore 3100 Genetic
Analyzer (ABI PRISM) secondo i parametri descritti in Tab. 16.
Tab. 16: Parametri di lettura delle sequenze.
Lunghezza dei capillari
Run
Run temperature
Run voltage
Injection
Injection voltage
2.12.
50 mm
6500 s
50°C
12,2 kV
15 s
1,5 kV
ELABORAZIONE DEGLI ELETTROFEROGRAMMI
Per ogni campione sono state ottenute le sequenze forward e reverse. Sono stati utilizzati
i programmi Sequencher 4.1 e Chromas per allineare le sequenze della matrice e quella
del suo complementare. Dal confronto delle sequenze forward e reverse viene creata la
sequenza consensus, dopo aver apportato eventuali correzioni ad incongruenze risaltate
grazie al confronto delle stesse.
29
2.13.
ALLINEAMENTO DELLE SEQUENZE
Le sequenze sono state allineate utilizzando il programma Clustal W (Thompson et al.,
1994) messo a disposizione sul sito http://crick.genes.nig.ac.jp/homology/welcomee.shtml.
2.14.
ANALISI FILOGENETICHE
Le analisi filogenetiche sono state eseguite con il programma MEGA (Molecular
Evolutionary Genetics Analysis), versione 2.1 (Kumar et al., 2001).
I dendogrammi sono stati generati con l’algoritmo Neighbour Joining (NJ). Per le
sequenze di 513 nucleotidi è stato scelto il modello Jukes-Cantor mentre per le sequenze
di 171 aminoacidi è stato utilizzato il modello Gamma Distance.
Per l’analisi statistica bootstrap sono state effettuate 1000 ripetizioni. Le biforcazioni con
valore bootstrap inferiore a 50 % sono state eliminate poiché non significative e i rami
sono stati fusi.
Le analisi di distanza sono state eseguite con Compute Pairwise, modello Nucleotide, N°
of differences. Il numero di sostituzioni sinonime e non sinonime è stato calcolato con il
metodo di Nei-Gojobori, N° of differences.
Sono state eseguite analisi su tre livelli: sono state dapprima considerate unicamente le
sequenze trovate durante questa ricerca, in seguito sono state prese in considerazione tutte
le sequenze ticinesi (comprese quindi quelle rilevate da Matasci, 2002) ed infine è stato
effettuato un confronto delle sequenze trovate in Ticino con quelle pubblicate in
GenBank.
30
3. RISULTATI
3.1. INCIDENZA DI TSWV IN OTTO COLTURE ORTICOLE
Per stabilire l’incidenza di TSWV sono stati analizzati 176 campioni prelevati da otto
colture presso l’Azienda All’Orto di Muzzano, durante l’autunno 2002. Sono state presi
in considerazione: cavolo rapa, coste, formentino, lattuga batavia, lattuga cappuccio,
lattuga foglia di quercia verde e rossa, lattughino lollo rosso e melanzane.
Quattro di queste colture (cavolo rapa, formentino, lattughino lollo rosso e melanzane)
non presentavano sintomi al momento della raccolta dei campioni. Per le altre colture
sono stati prelevati campioni da piante apparentemente sane e da piante con sintomi,
distribuite omogeneamente nelle campate. Le colture lattuga batavia e lattuga foglia di
quercia presentavano dei sintomi non attribuibili con certezza a TSWV. Le restanti
colture (coste e lattuga cappuccio) mostravano invece dei sintomi evidenti della presenza
del virus.
Il 68,2 % dei campioni analizzati, scelti casualmente tra quelli raccolti, si è rivelato essere
infetto, vale a dire che 120 campioni sono risultati positivi all’analisi molecolare (nested
RT-PCR) (Tab. 17).
Tab. 17: Incidenza di TSWV in otto colture orticole. Campioni raccolti presso l’Azienda All’Orto di
Muzzano in ottobre-novembre 2002.
Coltura
CR
FO
LR
ME
LB
FQ
Presenza di sintomi1
no
no
no
no
?
?
Campioni analizzati (di cui con sintomi) 24 (0) 16 (0) 24 (0) 24 (0) 16 (7) 24 (5)
Campioni infetti (di cui con sintomi)
6 (0) 9 (0) 16 (0) 13 (0) 13 (6) 23 (5)
Campioni infetti (%)
25.0 56.3 66.7 54.2 81.3 95.8
CO
LC
Totale
si
si
24 (6) 24 (16) 176 (34)
16 (5) 24 (16) 120 (32)
66.7 100.0
68.2
CR: cavolo rapa; FO: formentino; LR: lattughino lollo rosso; ME: melanzane; LB: lattuga batavia; FQ:
lattuga foglia di quercia; CO: coste; LC: lattuga cappuccio.
1
no: nessun sintomo visibile; ?: sintomi non attribuibili con certezza a TSWV; si: sintomi evidenti della
presenza di TSWV.
In tutte le colture analizzate è stata rilevata la presenza del virus. La distribuzione delle
piante infette nelle campate è rappresentata in appendice in Fig. 1A.
34 campioni analizzati (su 176) presentavano sintomi al momento del prelievo. 32 di
questi sono risultati effettivamente infetti. Un campione di lattuga batavia e un campione
di coste che presentavano sintomi non sono risultati positivi all’analisi (Tab. 17).
Le colture che mostravano in una parte delle piante dei sintomi evidenti della presenza di
TSWV, presentano la percentuale maggiore di campioni risultati infetti (66,7 % nel caso
delle coste e 100 % nel caso di lattuga cappuccio). Le colture su cui non erano visibili
tracce del virus, hanno una percentuale di campioni infetti che varia dal 25 % (cavoli
rapa) al 66,7 % (lattughino lollo rosso). Le due colture con sintomi non tipici si situano in
31
una posizione intermedia tra i due gruppi precedenti, con percentuali di 81,3 % (lattuga
batavia) e di 95,8 % (lattuga foglia di quercia) (Fig. 9).
Percentuale di campioni infetti
Campioni senza sintomi
Sintomi non certi
Con sintomi
100.0
95.8
100.0.
81.3
80.0
60.0
40.0
66.7
66.7
54.2
56.3
25.0
20.0
0.0
CR
FO
LR
ME
LB
FQ
CO
LC
Coltura
Fig. 9: Percentuale di campioni infetti da TSWV nelle diverse colture. Campioni raccolti presso l’Azienda
All’Orto di Muzzano in ottobre-novembre 2002.
CR: cavolo rapa; FO: formentino; LR: lattughino lollo rosso; ME: melanzane; LB: lattuga batavia; FQ:
lattuga foglia di quercia; CO: coste; LC: lattuga cappuccio.
32
3.2. INCIDENZA DI TSWV IN UNA COLTURA INVERNALE
Per testare l’eventuale presenza di TSWV in una coltura messa a dimora e coltivata
durante il periodo in cui i tripidi vettori del virus non sono attivi o sono attivi in misura
ridotta, sono stati analizzati 41 campioni di lattuga foglia di quercia, prelevati il 24
febbraio 2003 nell’azienda orticola di Muzzano. Le piante erano state messe a dimora il
15 gennaio. La coltura non presentava sintomi al momento del prelievo e non ne ha
mostrati fino alla raccolta (02.04.’03). Il 19,5 % dei campioni è risultato positivo
all’analisi tramite nested RT-PCR (Tab. 18). Per mancanza di tempo non è stato possibile
analizzare i campioni prelevati dalle stesse piante il 20.01.’03.
Tab. 18: Incidenza di TSWV in una coltura invernale. Campioni raccolti presso l’Azienda All’Orto di
Muzzano in febbraio 2003.
Coltura
Presenza di sintomi
Campioni analizzati
Campioni infetti
Campioni infetti (%)
Lattuga foglia di quercia
nessun sintomo visibile
41
8
19.5
La distribuzione delle piante infette nelle campate è rappresentata in appendice in Fig.
2A.
33
3.3. PIANTE INFESTANTI
Data l’importanza, indicata nella letteratura, delle piante infestanti presenti nei tunnel
quale serbatoio per TSWV, è stata fatta una valutazione della situazione riguardante le
malerbe nell’azienda orticola di Muzzano dove sono stati raccolti i campioni per gli
esperimenti descritti precedentemente (vedi 3.1 e 3.2).
Nei settori della serra presi in considerazione, il terreno era quasi totalmente coperto da
Galinsoga sp. e S. media (Fig. 10).
A
B
C
Fig. 10: Azienda all’Orto, Muzzano: tunnel coltivato con lattughino lollo verde (situazione al 13.12.’02).
A: Terreno quasi totalmente coperto da malerbe. B: Stellaria media. C: Galinsoga sp.
Data l’abbondanza di malerbe non è stato possibile eseguire una valutazione quantitativa
e ci si è limitati a determinare le piante infestanti presenti (Tab. 19). Sono considerate
malerbe anche i pomodori ed i formentini presenti in campate coltivate con altre specie.
34
Tab. 19: Piante infestanti presenti presso l’Azienda All’Orto di Muzzano il 13.12.’02 e loro suscettibilità a
TSWV.
Nome
Ospite di TSWV
Fragaria sp.
?
Galinsoga sp.
si
Galium sp.
si
Lycopersicon esculentum 1
si
Oxalis acetosella
si
Polygonum sp.
si
Potentilla reptans
?
Rumex sp.
si
Stellaria media
si
Urtica dioica
si
1
Valerianella locusta syn V. olitoria
si
Veronica filiformis
si
1
presenti come malerbe in altre colture
? informazioni mancanti
Quasi tutte le malerbe presenti sono ospiti di TSWV e potrebbero quindi effettivamente
fungere da serbatoio per il virus.
Per confermare quest’ipotesi sono stati analizzati 46 campioni prelevati durante l’autunno
2002 dai tre ospiti di TSWV presenti in quantità maggiore e quindi particolarmente
importanti come potenziali serbatoi. S. media non mostrava sintomi al momento del
prelievo; Galinsoga sp. e le piantine di pomodoro presentavano delle leggere necrosi.
L’82,6 % dei campioni analizzati sono risultati positivi all’analisi molecolare (Tab. 20).
Tab. 20: Incidenza di TSWV nelle piante infestanti. Campioni raccolti presso l’Azienda All’Orto di
Muzzano in novembre-dicembre 2002.
Ospite
Presenza di sintomi1
Campioni analizzati
Campioni infetti
Campioni infetti (%)
1
S. media Galinsoga sp. Pomodoro Totale
no
?
?
22
16
8
46
14
16
8
38
63.6
100.0
100.0
82.6
no: nessun sintomo visibile; ?: sintomi non attribuibili con certezza a TSWV.
In tutte le specie è stata osservata la presenza del virus. Per Galinsoga sp. e pomodoro
l’incidenza di TSWV era del 100 %; per S. media del 63,6 % (Fig. 11).
35
Sintomi non certi
Percentuale di campioni infetti
Campioni senza sintomi
100.0
100.0
100.0
80.0
63.6
60.0
40.0
20.0
0.0
S. media
Galinsoga sp.
Pomodoro
Ospite
Fig. 11: Percentuale di campioni infetti da TSWV nelle diverse piante infestanti. Campioni raccolti presso
l’Azienda All’Orto di Muzzano in novembre-dicembre 2002.
3.4. SEQUENZE DEI CAMPIONI ANALIZZATI
Tramite sequenziamento dei prodotti PCR, sono state ottenute le sequenze nucleotidiche
di 154 campioni, così ripartiti: 112 campioni prelevati da otto colture per stabilire
l’incidenza di TSWV (3.1.), sei campioni raccolti dalla coltura invernale (3.2.) e 36
campioni di piante infestanti (3.3.) (Tab. 21).
Tab. 21: Numero di sequenze nucleotidiche di TSWV ottenute per i diversi ospiti del virus.
Ospite
Sequenze ottenute
CR
6
FO
6
LR
15
ME
13
LB
13
FQ
28
CO
14
LC
23
SM
12
GA
16
TO
8
Totale
154
CR: cavolo rapa; FO: formentino; LR: lattughino lollo rosso; ME: melanzane; LB: lattuga batavia; FQ:
lattuga foglia di quercia; CO: coste; LC: lattuga cappuccio; SM: S. media; GA: Galinsoga sp.; TO:
pomodoro.
In totale 166 campioni su 263 analizzati erano risultati infetti dal virus (120 campioni
prelevati dalle otto colture, otto campioni della coltura invernale e 38 di piante infestanti).
I 12 campioni di cui non si hanno a disposizione le sequenze nucleotidiche sono i
seguenti: quattro campioni che presentano su gel bande doppie e otto campioni le cui
sequenze non sono risultate leggibili, pur avendo ripetuto il sequenziamento. Per i
campioni con bande doppie è stata fatta un’estrazione da gel per il sequenziamento che
non ha dato risultati soddisfacenti; per mancanza di tempo non si è potuto ripetere
l’esperimento.
36
Le sequenze ottenute dai campioni analizzati hanno una lunghezza comune di 513
nucleotidi, che corrisponde al 66 % del gene NP (777nt). Due sequenze hanno lunghezze
ridotte di 431 (TI01ME03), rispettivamente 196 nucleotidi (TI02LR21) (Fig. 12).
M
TO01
ME03 CR05
LR21 FQ29
M
Fig. 12: Gel elettroforesi di prodotti nested PCR di TSWV, sintetizzati da RNA estratto da campioni di
foglia, prelevati il 21.10.’02 presso l’Azienda All’Orto di Muzzano.
M: 100 bp ladder. TO01, ME03, CR05, LR21, FQ29: campioni di pomodoro, melanzana, cavolo rapa,
lattughino lollo rosso e lattuga foglia di quercia.
3.5. APLOTIPI
Sui campioni di foglia prelevati dalle undici specie ospiti di TSWV sono stati trovati 30
diversi aplotipi del virus.
I nomi da assegnare agli aplotipi sono stati composti sull’esempio di quanto fatto da
Matasci (2002): si compongono della sigla del canton Ticino (TI), dell’anno in cui è stato
rinvenuto la prima volta l’aplotipo, di un’abbreviazione relativa alla coltura su cui è stato
trovato per la prima volta e, diversamente da Matasci che assegnava delle lettere, di un
numero a due cifre (da 01 fino a 30). Le abbreviazioni relative alla coltura sono: CR:
cavolo rapa; FO: formentino; LR: lattughino lollo rosso; ME: melanzane; LB: lattuga
batavia; FQ: lattuga foglia di quercia; CO: coste; LC: lattuga cappuccio; SM: S. media;
GA: Galinsoga sp.; TO: pomodoro.
29 dei 30 aplotipi risultano nuovi; uno (il più frequente) è invece identico agli aplotipi
TI01TOA e TI01TOD indicati da Matasci (2002). Questi due aplotipi si differenziavano
nel confronto delle sequenze di 638 nucleotidi, ottenute con primers NP, mentre
risultavano identici confrontando le sequenze più corte ottenute con nested primers NP.
Agli aplotipi in questione è stato assegnato in questo studio un nome comune
(TI01TO01) per poter seguire un ordine crescente nei nomi da assegnare ai diversi
aplotipi.
In Tab. 22 sono elencati i 30 aplotipi, il numero di campioni in cui sono stati trovati in
ogni specie, il totale di campioni per ogni aplotipo, il totale di campioni per specie e il
totale di aplotipi per specie. Non avendo a disposizione lo stesso numero di campioni per
ogni ospite e per poterne comunque paragonare i dati, è stato calcolato il rapporto
aplotipi/campione, che informa sulla variabilità genetica incontrata nelle diverse specie.
37
Tab. 22: Specie ospiti di TSWV: totale di campioni per ogni aplotipo, di campioni per specie, di aplotipi
per specie, e rapporto aplotipi/campioni. Campioni raccolti presso l’Azienda All’Orto di Muzzano nel 2002
e nel 2003.
Specie
Aplotipo
CR
FO
LR
ME
LB
FQ
CO
LC
SM
GA
TO
Campioni/aplotipo
TI01TO01
3
3
9
8
12
22
9
22
11
15
8
122
TI02ME02
3
3
TI02ME03
1
1
TI02ME04
1
1
TI02CR05
1
1
TI02CR06
1
1
TI02CR07
1
1
TI02FO08
1
TI02FO09
1
TI02FO10
1
1
2
1
1
TI02SM11
1
1
TI02CO12
1
1
TI02CO13
1
1
TI02CO14
1
1
TI02CO15
1
1
TI02CO16
1
1
TI02LR17
1
1
TI02LR18
1
1
TI02LR19
1
1
TI02LR20
1
1
TI02LR21
1
1
TI02LR22
1
1
TI02LB23
1
1
TI02FQ24
1
1
TI02FQ25
1
1
TI02FQ26
1
1
TI02FQ27
1
1
TI02LC28
1
TI02FQ29
TI02FQ30
Campioni/specie
Aplotipi/specie
Aplotipi/campioni*
1
1
1
1
1
6
6
15
13
13
28
14
23
12
16
8
4
4
7
4
2
7
6
2
2
2
1
0.67 0.67 0.47 0.31 0.15 0.25 0.43 0.09 0.17 0.13 0.13
154
0.19
CR: cavolo rapa; FO: formentino; LR: lattughino lollo rosso; ME: melanzane; LB: lattuga batavia; FQ:
lattuga foglia di quercia; CO: coste; LC: lattuga cappuccio; SM: S. media; GA: Galinsoga sp.; TO:
pomodoro.
* Aplotipi/campioni=(Aplotipi/specie)/(Campioni/specie); informa sulla variabilità genetica.
Tre aplotipi sono stati rinvenuti in più di un campione: TI01TO01, TI02ME02 e
TI02FO08. L’aplotipo TI01TO01 è il più frequente: è stato trovato più volte in tutte le
colture analizzate, per un totale di 122 campioni. L’aplotipo TI02ME02 è stato rilevato in
tre campioni di foglie di melanzana. L’aplotipo TI02FO08 è presente in un campione di
formentino ed in uno di Galinsoga sp. Gli altri 27 aplotipi sono stati trovati una volta
38
sola. In appendice sono elencati i nomi dei campioni in cui sono stati trovati i diversi
aplotipi (Tab. 1A e 2A).
I valori più alti del rapporto aplotipi/campioni sono quelli di cavolo rapa e formentino,
che sono quindi le colture che presentano una maggiore variabilità: in entrambi i casi
sono stati rinvenuti quattro aplotipi in sei campioni, per un rapporto di 0,67
aplotipi/campione. Nelle colture lattughino lollo rosso e lattuga foglia di quercia sono
stati trovati sette aplotipi in 15 rispettivamente 28 campioni; si ottengono rapporti di 0,47
rispettivamente 0,25 aplotipi/campione. Seguono le colture coste e melanzane con sei
aplotipi in 14 campioni (0,43 aplotipi/campione), rispettivamente quattro aplotipi in 13
campioni (0,31 aplotipi/campione). Sono stati trovati due aplotipi in ognuna delle specie
seguenti: S. media (12 campioni, ossia 0,17 aplotipi/campione), lattuga batavia (13
campioni, 0,15 aplotipi/campione), Galinsoga sp. (16 campioni, 0,13 aplotipi/campione)
e lattuga cappuccio (23 campioni, 0,09 aplotipi/campione). Infine i pomodori, con un solo
aplotipo in otto campioni, hanno un rapporto di 0,13 aplotipi/campione. Il valore più
basso è quello della coltura lattuga cappuccio che presenta la minor variabilità genetica. Il
totale di 30 aplotipi in 154 campioni sequenziati dà un valore di 0,19 aplotipi/campione.
39
3.6. ANALISI FILOGENETICHE
Per svolgere le analisi considerando tutte le sequenze trovate in Ticino (comprese quelle
rilevate da Matasci, 2002) è stata verificata l’esistenza degli aplotipi TI02LEL e
TI02LEM. La loro presenza non era ritenuta certa a causa di mutazioni dubbie (vedi 1.3.).
Ripetendo il sequenziamento del prodotto purificato si è potuta dimostrare l’esistenza di
queste sostituzioni.
Il collocamento delle sequenze ticinesi a livello mondiale è stato effettuato tenendo conto
di 30 sequenze depositate in GenBank (Tab. 23).
Tab. 23: Sequenze del gene NP di TSWV depositate in GenBank (modificato da Matasci, 2002).
Nome
LE 98527
TSWVBL
TSWV10W
TSWVH
TSWVHI 2
TSWVIT
Spain3
TSWV10
TSWVGACC
TSWVGAPP
TSWVGAWC
TSWVGAGC
TSWVGAMC
TSWVGAPT
TSWVGATC
TSWVGAAC
TSWVGATO
TSWVBR01
Nazione
Germania
Hawaii
Hawaii
Hawaii
Hawaii
Italia
Spagna
USA4
Georgia
Georgia
Georgia
Georgia
Georgia
Georgia
Georgia
Georgia
Georgia
Brasile
Ceppo
TSWV
TSWVBL
TSWV10W
TSWVD
C27084
Olanda
Cechia
TSWVD
TOSPOG
TOSPOC
JAP
8Hip9612
20 Da961
TSWVL3
Taiwan
Taiwan
Giappone
Bulgaria
Bulgaria
Bulgaria
GD98
Bulg975
BS97
980472
Bulgaria
Bulgaria
Bulgaria
Sud Africa
Italy
Isolato
LE 98/527
CC
WC
GC
MC
TC
AC
CPNH9
Ospite
Lysimachia
Lattuga
?
?
?
Pomodoro
?
Arachide
Tabacco
Peperone
Tabacco
Tabacco
Tabacco
Arachide
Tabacco
Tabacco
Pomodoro
Tabacco
C27084
Dalia
Zantdeschia
L
T304
LC
TSWV10
TSWV
TSWV
TOSPOG
TOSPOC
8Hip 96 12
20 Da 96/1
?
?
?
Hippeastrum
Dalia
Tabacco
GD98
97
BS97
98 / 0472
Tabacco
Pomodoro
Tabacco
Patata
Referenza
Heinze et al., 2001
Jain et al., 1998
Jain et al., 1998
Gubba, 20001
Jain et al., 1998
Vaira et al., 1995
Guerra-Sanz1
Qiu et al., 1998
Pappu et al ,1998
Jain et al., 1998
Pappu et al ,1998
Pappu et al ,1998
Pappu et al ,1998
Jain et al., 1998
Pappu et al ,1998
Pappu et al ,1998
Jain et al., 1998
de Haan et al., 1991
de Haan 1989, 1990
Qiu et al., 1998
Adam et al., 1996
Heinze et al., 2001
Kato, 20001
Kato, 20001
Tsuda et al., 1994
Heinze et al., 2001
Heinze et al., 2001
Maiss et al., 1991
de Haan et al.,1990
Heinze et al., 2001
Heinze et al., 2001
Heinze et al., 2001
Heinze et al., 2001
Accession number
AJ297611
L20953
L20887
AF306490
X61799
Z 36882
X94550
AF 020669
AF 064470
AF 048716
AF 064474
AF 064471
AF 064472
AF 048715
AF 064473
AF 064469
AF 048714
D 00645
AF 020660
AJ296599
AB038342
AB038341
AB 010997
AJ296601
AJ297602
D 13926
AJ297609
AJ296598
AJ297610
AJ296600
1
Non pubblicato
Citato anche come hiL e TSWVL
3
Anonimo in GenBank
4
Nessuna indicazione ulteriore
5
Citato anche come 97To97
? Dati mancanti
2
40
Le analisi filogenetiche sono state effettuate senza prendere in considerazione gli aplotipi
TI02ME03 e TI02LR21, considerevolmente più corti (Fig. 12), poiché rendono meno
visibili le differenze fra gli altri aplotipi. In appendice sono rappresentati i dendogrammi
basati sulle sequenze nucleotidiche e aminoacidiche di tutti gli aplotipi ticinesi, compresi
TI02ME03 e TI02LR21e di 30 sequenze pubblicate in GenBank (Fig. 3A e Fig. 4A).
La sequenza TI02LC28 contiene una N alla 60esima base della sequenza forward,
rispettivamente base numero 502 della sequenza reverse, a causa della presenza di due
segnali sovrapposti (Fig. 13). Per mancanza di tempo non è stato possibile risequenziare
il prodotto per stabilire quale delle due basi (C o T) è effettivamente presente o per
eventualmente confermare l’esistenza di un’infezione mista nell’isolato in questione. Se
ci fosse solo la base T, l’aplotipo sarebbe identico a TI01TO01; se ci fosse invece solo la
base C, l’aplotipo non sarebbe identico a nessuno di quelli trovati finora.
Il programma MEGA considera uguali le sequenze TI02LC28 e TI01TO01 a causa della
presenza di questa N e non segnala quindi nessuna differenze fra le due sequenze (Tab.
24 e Tab. 27).
Fig. 13: Cromatogramma della sequenza reverse di TSWV dell’aplotipo TI02LC28, rilevato in un
campione di lattuga cappuccio prelevato a Muzzano nel 2002. N indica la presenza di due segnali
sovrapposti (C e T).
3.6.1. VARIABILITÀ DELLE SEQUENZE
3.6.1.1. SEQUENZE TROVATE DURANTE QUESTA RICERCA
Paragonando fra loro i 28 aplotipi trovati nel 2002 e 2003 si arriva ad un massimo di sette
nucleotidi diversi (Tab. 24) e di cinque aminoacidi diversi (Tab. 25). La sequenza
TI02LC28 risulta identica a TI01TO01 a causa della presenza di una N (vedi 3.6.).
La maggior parte delle sostituzioni sono sinonime; non portano quindi ad un
cambiamento dell’aminoacido codificato (Tab. 26).
41
3.6.1.2. SEQUENZE DI TUTTI GLI ISOLATI TICINESI
Prendendo in considerazione tutti gli aplotipi trovati in Ticino, quindi anche i nove
rinvenuti da Matasci (2002) e non più ritrovati in questa ricerca, si ottengono i risultati
seguenti: confrontando a due a due i 37 aplotipi si raggiungono un massimo di 21
nucleotidi diversi (Tab. 24) e di sette aminoacidi diversi (Tab. 25).
La maggior parte delle sostituzioni sono sinonime e non portano ad un cambiamento
dell’aminoacido codificato (Tab. 26). In appendice sono indicate le posizioni degli
aminoacidi sostituiti rispetto a quelli presenti in TI01TO01 (Tab. 3A).
TI02ME02
TI02LEL
TI02LEI
TI02TOH
TI01TOG
TI01TOF
TI01TOE
TI01TOC
TI01TOB
TI03FQ30
TI03FQ29
TI02LC28
TI02FQ27
TI02FQ26
TI02FQ25
TI02FQ24
TI02LB23
TI02LR22
TI02LR20
TI02LR19
TI02LR18
TI02LR17
TI02CO16
TI02CO15
TI02CO14
TI02CO13
TI02CO12
TI02SM11
TI02FO10
TI02FO09
TI02FO08
TI02CR07
TI02CR06
TI02CR05
TI02ME04
TI02ME02
TI01TO01
Tab. 24: Numero di nucleotidi diversi tra tutti gli aplotipi di TSWV rilevati in Ticino.
1
TI02ME04
1
2
TI02CR05
1
2
2
TI02CR06
1
2
2
TI02CR07
2
3
3
3
3
TI02FO08
1
2
2
2
2
3
TI02FO09
1
2
2
2
2
3
2
TI02FO10
1
2
2
2
2
3
2
2
TI02SM11
1
2
2
2
2
3
2
2
2
TI02CO12
4
5
5
5
5
6
5
5
5
5
TI02CO13
1
2
2
2
2
3
2
2
2
2
3
TI02CO14
2
3
3
3
3
4
3
3
3
3
6
3
TI02CO15
3
4
4
4
4
5
4
4
4
4
7
4
5
TI02CO16
1
2
2
2
2
3
2
2
2
2
5
2
3
4
TI02LR17
1
2
2
2
2
3
2
2
2
2
5
2
3
4
2
TI02LR18
1
2
2
2
2
3
2
2
2
2
5
2
3
4
2
2
TI02LR19
1
2
2
2
2
3
2
2
2
2
5
2
3
4
2
2
2
TI02LR20
2
1
3
3
3
4
3
3
3
3
6
3
4
5
3
3
3
3
TI02LR22
2
3
3
3
3
4
3
3
3
3
6
3
4
5
3
3
3
3
TI02LB23
2
3
3
3
3
4
3
3
3
1
6
3
4
5
3
3
3
3
4
4
TI02FQ24
1
2
2
2
2
3
2
2
2
2
5
2
3
4
2
2
2
2
3
3
3
TI02FQ25
1
2
2
2
2
3
2
2
2
2
5
2
3
4
2
2
2
2
3
3
3
2
TI02FQ26
1
2
2
2
2
3
2
2
2
2
5
2
3
4
2
2
2
2
3
3
3
2
2
TI02FQ27
1
2
2
2
2
3
2
2
2
2
5
2
3
4
2
2
2
2
3
3
3
2
2
TI02LC28
0*
1
1
1
1
2
1
1
1
1
4
1
2
3
1
1
1
1
2
2
2
1
1
1
1
TI03FQ29
1
2
2
2
2
3
2
2
2
2
5
2
3
4
2
2
2
2
3
3
3
2
2
2
2
TI03FQ30
1
2
2
2
2
3
2
2
2
2
5
2
3
4
2
2
2
2
3
3
3
2
1
2
2
1
2
TI01TOB
16
17
17
17
17
18
17
17
17
17
20
17
18
17
17
17
17
17
18
16
18
17
17
17
17
15
17
TI01TOC
3
4
4
4
4
5
4
4
4
4
7
4
5
6
4
4
4
4
5
5
5
4
4
4
4
3
4
4
TI01TOE
16
17
17
17
17
18
17
17
17
17
20
17
18
17
17
17
17
17
18
16
18
15
17
17
17
15
17
17
10
17
TI01TOF
2
3
3
3
3
4
3
3
3
3
6
3
4
5
3
3
3
3
4
4
4
3
3
3
3
2
3
3
16
1
TI01TOG
3
4
4
4
4
5
4
4
4
4
7
4
5
6
4
4
4
4
5
5
5
4
4
4
4
3
4
4
17
2
17
1
TI02TOH
3
4
4
4
4
5
4
4
4
4
7
4
5
6
4
4
4
4
5
5
5
4
4
4
4
3
4
4
19
6
19
5
6
TI02LEI
4
5
5
5
5
6
5
5
5
5
8
5
6
7
5
5
5
5
6
6
6
5
5
5
5
4
5
5
18
1
18
2
3
TI02LEL
4
3
5
5
5
6
5
5
4
5
8
5
6
7
5
5
5
5
4
6
6
5
5
5
5
4
5
5
20
7
20
6
7
7
8
TI02LEM
17
18
18
18
18
19
18
18
18
18
21
18
19
18
18
18
18
18
19
15
19
18
18
18
18
16
18
18
1
18
11
17
18
20
19
2
4
2
1
17
17
16
7
21
* La sequenza TI02LC28 non è esattamente determinata. Se la base incerta non è presa in considerazione,
risulta identica a TI01TO01.
42
TI02ME02
TI02LEL
TI02LEI
TI02TOH
TI01TOG
TI01TOF
TI01TOE
TI01TOC
TI01TOB
TI03FQ30
TI03FQ29
TI02LC28
TI02FQ27
TI02FQ26
TI02FQ25
TI02FQ24
TI02LB23
TI02LR22
TI02LR20
TI02LR19
TI02LR18
TI02LR17
TI02CO16
TI02CO15
TI02CO14
TI02CO13
TI02CO12
TI02SM11
TI02FO10
TI02FO09
TI02FO08
TI02CR07
TI02CR06
TI02CR05
TI02ME04
TI02ME02
TI01TO01
Tab. 25: Numero di aminoacidi diversi tra tutti gli aplotipi di TSWV rilevati in Ticino.
0
TI02ME04
0
0
TI02CR05
0
0
0
TI02CR06
1
1
1
TI02CR07
1
1
1
1
2
TI02FO08
0
0
0
0
1
1
TI02FO09
1
1
1
1
2
2
1
TI02FO10
1
1
1
1
2
2
1
2
TI02SM11
0
0
0
0
1
1
0
1
1
TI02CO12
4
4
4
4
5
5
4
5
5
4
TI02CO13
1
1
1
1
2
2
1
2
2
1
3
TI02CO14
1
1
1
1
2
2
1
2
2
1
5
2
TI02CO15
0
0
0
0
1
1
0
1
1
0
4
1
1
TI02CO16
1
1
1
1
2
2
1
2
2
1
5
2
2
1
TI02LR17
1
1
1
1
2
2
1
2
2
1
5
2
2
1
2
TI02LR18
0
0
0
0
1
1
0
1
1
0
4
1
1
0
1
1
TI02LR19
1
1
1
1
2
2
1
2
2
1
5
2
2
1
2
2
1
TI02LR20
1
1
1
1
2
2
1
2
2
1
5
2
2
1
2
2
1
2
TI02LR22
1
1
1
1
2
2
1
2
2
1
5
2
2
1
2
2
1
2
TI02LB23
0
0
0
0
1
1
0
1
1
0
4
1
1
0
1
1
0
1
1
1
TI02FQ24
0
0
0
0
1
1
0
1
1
0
4
1
1
0
1
1
0
1
1
1
0
TI02FQ25
0
0
0
0
1
1
0
1
1
0
4
1
1
0
1
1
0
1
1
1
0
0
TI02FQ26
1
1
1
1
2
2
1
2
2
1
5
2
2
1
2
2
1
2
2
2
1
1
1
TI02FQ27
0
0
0
0
1
1
0
1
1
0
4
1
1
0
1
1
0
1
1
1
0
0
0
TI02LC28
0
0
0
0
1
1
0
1
1
0
4
1
1
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1
1
0
1
1
1
0
0
0
1
0
TI03FQ29
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1
1
1
2
2
1
2
2
1
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2
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2
2
1
2
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1
1
2
1
1
TI03FQ30
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0
0
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1
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1
1
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4
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1
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0
1
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1
0
0
0
1
0
0
1
TI01TOB
1
1
1
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2
2
1
2
2
1
5
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1
2
2
1
2
2
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1
1
1
2
1
1
2
1
TI01TOC
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0
0
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TI01TOE
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TI01TOF
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TI01TOG
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1
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1
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1
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1
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1
2
1
1
1
TI02TOH
3
3
3
3
4
4
3
4
4
3
7
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4
3
4
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TI02LEI
1
1
1
1
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1
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1
2
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1
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1
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1
1
1
2
TI02LEL
1
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1
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1
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1
2
1
1
2
1
2
1
1
1
2
4
2
TI02LEM
2
2
2
2
3
3
2
3
3
2
6
3
3
2
3
3
2
3
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1
2
2
2
3
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3
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1
2
2
2
3
5
3
1
2
1
1
0
4
3
TI02CO12
TI02CO13
TI02CO14
TI02CO15
TI02CO16
TI02LR17
TI02LR18
TI02LR19
TI02LR20
TI02LR22
TI02LB23
TI02FQ24
TI02FQ25
TI02FQ26
TI02FQ27
TI02LC28
TI03FQ29
TI03FQ30
TI01TOB
TI01TOC
TI01TOE
TI02LEL
TI02LEM
1
2
1
1
1
1
4
1
2
3
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1
1
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2
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1
1
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0
1
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16
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16
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4
17
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1
1
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1
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0
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1
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1
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0
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1
0
0
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1
0
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0
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0
0
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1
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0
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0
1
1
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1
1
0
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0
1
15
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16
2
2
0
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3
15
TI02LEI
TI02SM11
1
0
TI02TOH
TI02FO10
1
0
TI01TOG
TI02FO09
1
TI01TOF
TI02FO08
3
TI02CR07
Sost. syn
TI02CR06
2
TI02CR05
1
TI02ME04
TI01TO01 nt
TI01TO01 aa
TI02ME02
Tab. 26: Sostituzioni sinonime tra tutti gli aplotipi di TSWV trovati in Ticino, calcolate con il metodo di
Nei-Gojobori.
1
Differenze nucleotidiche tra TI01TO01 e gli altri aplotipi
Differenze aminoacidiche tra TI01TO01 e gli altri aplotipi
3
Sostituzioni sinonime = differenze nucleotidiche - differenze aminoacidiche
2
3.6.1.3. CONFRONTO TRA SEQUENZE TICINESI E SEQUENZE PUBBLICATE
Prendendo in considerazione anche 30 sequenze del gene NP pubblicate in GenBank
(Tab. 23), per un totale quindi di 67 sequenze, si ottengono i risultati seguenti: le
differenze ottenute paragonando gli aplotipi sono al massimo di 27 nucleotidi (Tab. 27) e
di otto aminoacidi (Tab. 28).
43
TI02ME02
2
TI02CR07
TI02FO08
TI02FO09
TI02FO10
TI02SM11
TI02CO12
TI02CO13
TI02CO14
TI02CO15
3
4
4
17 18 18 18 18 19 18 18 18 18 21 18 19 18 18 18 18 18 19 15 19 18 18 18 18 16 18 18
TI02LEI
TI02LEL
TI02LEM
4
6
6
9
Bulg97
BS97
980472
5
7
7
7
7
6
8
8
8
6
5
7
7
7
5
5
7
7
7
5
5
7
7
7
5
5
7
7
7
5
10
10
8
8
10
5
7
7
7
5
6
8
8
8
6
9
9
7
7
9
7
7
7
5
5
7
5
7
7
5
5
7
5
7
7
5
5
7
5
7
7
5
5
7
5
1
8
8
6
6
8
6
2
8
8
6
6
8
6
2
8
8
6
6
8
6
2
7
7
5
5
7
5
1
7
7
5
5
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5
1
7
7
5
5
7
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1
7
7
5
5
7
5
1
9
6
6
4
4
6
4
0
0
7
7
5
5
7
5
1
1
20
18
18
18
20
18
16
16
9
9
7
7
9
7
3
3
20
18
18
18
20
18
16
16
10 10 21 10 23
7
7
5
5
7
5
1
1
9
8
8
6
6
8
6
2
2
9
9
7
7
9
7
3
3
8
4
4
8
8
10 10
10 10
8
8
10 10
8
4
4
10 12 11 13
9
9
7
7
9
7
3
3
22
21
19
19
19
21
19
20
23
23
17
17
9
12
9
9
5
9
5
8
4
8
2
8
4
8
2
8
8
4
8
12
6
14 16 12 11 14 15 20 15 16 16 15 15 15 19 13 15 16
14 16 12 11 14 15 20 15 16 16 15 15 15 19 13 15 16
0
18 20 16 13 18 19 24 19 20 20 19 19 19 23 17 19 18
18 20 16 15 16 19 22 17 18 18 17 17 17 21 15 17 18
16 18 14 13 16 17 22 17 18 18 17 17 17 21 15 17 16
16 18 14 13 16 17 22 17 18 18 17 17 17 21 15 17 16
18 20 16 15 18 19 24 19 20 20 19 19 19 23 17 19 18
16 18 14 13 16 17 22 17 18 18 17 17 17 21 15 17 16
11 21 23 19 18 21 22 27 22 21 21 22 22 22 26 20 22 21
8
8
6
6
8
6
9
6
6
4
4
6
4
9
6
6
4
4
6
4
6
20 20 19
17 17 16
17 17 16
15 15 14
13 13 14
17 17 16
15 15 14
12 15 17 13 12 17 18 21 18 17 17 16 16 16 20 16 20 19 12 12 14 12
15 16 17 14 15 20 21 24 19 20 20 19 19 19 23 19 21 20 13 13
15 18 19 16 15 20 21 24 19 20 20 19 19 19 23 17 19 20 13 13
2
2
16 12 15 12 11 14 15 20 17 16 16 15 15 15 19 15 19
8
6
4
4
9
6
6
4
6
11
8
8
6
6
4
9
6
6
9
6
8
11 11
BS97
10 10 10 10 11 10 10 10 10 13 10 11 12 10 10 10 10 11 11 11 10 10 10 10
7
7
5
7
5
6
1
1
6
Bulg97
7
7
5
7
5
5
1
1
7
0
GD98
7
5
7
5
8
1
1
11
9
3
1
1
TSWVL3
5
5
3
1
6
4
5
2
2
9
17 13 15 11 10 13 16 13
13
9
3
20Da961
GD98
5
1
2
4
0
1
1
8Hip9612
TSWVL3
5
4
2
20Da961
6
1
1
3
2
2
C27084
5
1
1
7
5
3
JAP
5
1
1
12
6
5
TOSPOC
5
1
1
9
12
12
TOSPOG
5
2
3
4
1
2
12 13 13 13 13 14 13 13 13 11 16 13 14 13 13 13 13 13 14 12 12 13 13 13 12 12 13 13 19 13 19 12 11 15 14 16
1
1
8Hip9612
1
4
JAP
1
1
0
1
13 14 14 14 14 15 14 14 14 12 17 14 15 14 14 14 14 14 15 13 13 14 14 14 12 13 14 14 22 16 22 15 14 16 17 17
1
13 14 14 14 14 15 14 14 14 12 17 14 15 16 14 14 14 14 15 13 13 14 14 14 12 13 14 14 22 16 22 15 14 16 17 17
1
TOSPOC
2
TOSPOG
1
6
9
9
TSWVD
C27084
1
7
6
6
7
6
TSWVBR01
1
0
TSWVD
17
11
7
7
10 13
10 13
TSWVGAAC
16
11
11 14
TSWVGATC
12
9
11
11
7
7
8
19 13 15 11 10 11 16 13 10
15
9
9
8
8
9
TSWVGAPT
16
12
15
15
16 10 12
16 10 12
17 11 13
TSWVGAGC
12
12
8
7
TSWVGAPP
13
9
8
3
20 14 16 12 11 14 17
15 11 13
TSWVGACC
13
4
7
TSWV10
14
6
2
5
14 10 12
11
Spain
17
16
14
12
TSWVIT
14
9
10
11
TSWVGAWC
15 14 18 17 19
14 15 17 16 18
17
15
13
TSWVGATO
1
16 17 17 17 17 18 17 17 17 17 20 17 18 17 17 17 17 17 18 16 18 17 17 17 17 15 17 17 16 17 16 16 17 19 18 20
TSWVBR01
6
LETTERATURA
TSWVGAMC
9
2
4
15 16 16 16 16 17 16 16 16 16 19 16 17 18 16 16 16 16 17 15 17 16 16 16 16 14 16 16 15 18 15 17 16 18 19 19
15
5
TSWVHI
8
3
LE98/257
11 10 14 13 15
2
TSWVBL
9
16
TSWVH
12
3
TSWV10W
9
16
TSWVGATO
3
13 14 14 14 14 15 14 14 14 14 17 14 15 16 14 14 14 14 15 13 15 14 14 14 14 12 14 14 11 14 11 13 12 16 15 17
3
8
TSWVGAAC
2
7
7
19 20 20 20 20 21 20 20 20 20 23 20 21 20 20 20 20 20 21 19 21 20 20 20 20 18 20 20 15 20 11 19 18 22 21 23
3
7
3
6
TSWVGATC
3
6
2
5
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3
20
1
18 11 17 18 20 19 21
7
18
19
17
TSWVGAPT
3
1
20
1
16
15 16 16 16 16 17 16 16 16 16 19 16 17 16 16 16 16 16 17 15 17 16 16 16 16 14 16 16 11 16 11 15 14 18 17 19
4
5
18
6
2
TSWVGAMC
4
5
5
19
17
15 16 16 16 16 17 16 16 16 16 19 16 17 16 16 16 16 16 17 15 17 16 16 16 16 14 16 16 11 16 11 15 14 18 17 19
4
4
5
4
4
TSWVGAGC
3
5
4
4
4
16 17 17 17 17 18 17 17 17 17 20 17 18 17 17 17 17 17 18 16 18 17 17 17 17 15 17 17 12 17 12 16 15 19 18 20
3
5
5
3
3
16 17 17 17 17 18 17 17 17 17 20 17 18 17 17 17 17 17 18 16 18 17 17 17 17 15 17 17 12 17 12 16 15 19 18 20
3
5
5
4
4
TSWVGAWC
3
5
5
4
4
3
TSWVGAPP
5
6
5
4
4
3
15 16 16 16 16 17 16 16 16 16 19 16 17 16 16 16 16 16 17 15 17 16 16 16 16 14 16 16 13 18 13 17 16 18 19 19
4
6
6
4
4
2
TSWVGACC
3
4
6
5
5
3
3
20 21 21 21 21 22 21 21 21 21 24 21 22 21 21 21 21 21 22 20 22 21 21 21 21 19 21 21 16 21 16 20 19 23 22 24
6
5
6
5
5
3
4
TSWV10
3
5
5
5
5
3
4
15 16 16 16 16 17 16 16 16 16 19 16 17 16 16 16 16 16 17 15 17 16 16 16 16 14 16 16 13 16 13 15 16 18 17 19
3
5
5
4
4
3
4
Spain
3
5
5
4
4
4
4
2
14 15 15 15 15 16 15 15 15 15 18 15 16 15 15 15 15 15 16 14 16 13 15 15 15 13 15 15
3
7
5
4
4
4
5
2
2
TSWVIT
4
6
7
4
4
4
5
1
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3
5
6
6
6
3
5
2
2
1
TSWVHI
3
8
5
5
5
3
4
3
2
12 13 13 13 13 14 13 13 13 13 16 13 14 13 13 13 13 13 14 12 14 13 13 13 13 11 13 13 10 13 10 12 11 15 14 16
3
5
8
4
4
3
4
3
3
1
2
TSWVH
3
4
5
7
7
3
4
3
3
2
2
5
5
4
4
5
4
2
3
2
3
3
14 15 15 15 15 16 15 15 15 15 18 15 16 15 15 15 15 15 16 14 16 15 15 15 15 13 15 15 12 15 12 14 13 17 16 18
5
5
4
4
4
6
2
2
2
3
3
16 17 17 17 17 18 17 17 17 17 20 17 18 17 17 17 17 17 18 16 18 17 17 17 17 15 17 17 14 17 14 16 15 19 18 20
6
5
4
4
3
5
2
2
1
3
3
TSWV10W
5
6
4
4
6
4
2
2
1
2
2
3
TI02LEL
TSWVBL
5
5
5
5
3
7
4
2
1
2
2
3
TI02LEM
LE98/257
5
5
4
4
3
4
3
4
1
2
2
2
3
TI02LEI
3
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4
2
3
3
2
2
2
3
2
TI02TOH
5
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4
3
4
5
2
2
4
4
2
2
TI01TOG
4
4
4
2
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1
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3
2
2
3
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TI01TOF
4
3
5
2
2
4
2
2
4
2
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1
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17
TI02TOH
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2
1
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5
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16
TI01TOG
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2
2
1
2
2
2
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TI01TOE
3
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1
2
2
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4
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2
5
3
4
5
4
16 17 17 17 17 18 17 17 17 17 20 17 18 17 17 17 17 17 18 16 18 15 17 17 17 15 17 17 10 17
TI01TOF
2
TI01TOE
1
3
2
2
2
2
2
2
2
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3
4
4
4
1
TI01TOC
2
2
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2
2
1
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3
3
2
16 17 17 17 17 18 17 17 17 17 20 17 18 17 17 17 17 17 18 16 18 17 17 17 17 15 17 17
1
TI01TOB
2
2
1
2
2
2
2
3
3
6
2
1
1
2
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2
1
2
2
3
2
3
3
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2
1
2
TI03FQ29
1
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
0*
2
TI02LC28
2
2
2
2
4
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TI02FQ27
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2
3
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2
2
2
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TI02FQ26
2
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2
2
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TI02CO15
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2
2
2
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2
TI02LR17
1
2
TI02LR18
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4
TI02CO16
4
5
TI02LR19
TI02CO12
3
TI02LR20
1
3
TI02LR22
TI02SM11
5
TI02LB23
1
2
TI02FQ24
TI02FO10
2
TI02FQ25
1
2
TI02FQ26
TI02FO09
3
TI02FQ27
1
3
TI02LC28
TI02FO08
2
TI02CR06
3
2
TI01TOB
2
2
TI02CR05
2
TI02ME04
2
TI03FQ29
TI02CR07
1
TI03FQ30
1
TI02CR05
TI01TOC
TI02CR06
1
1
TI02ME04
TI01TO01
TI02ME02
TICINO
Tab. 27: Numero di nucleotidi diversi tra tutti gli aplotipi di TSWV rilevati in Ticino e quelli pubblicati in
GenBank.
* La sequenza TI02LC28 non è esattamente determinata. Se la base incerta non è presa in considerazione,
risulta identica a TI01TO01.
44
2
1
0
1
4
3
2
2
2
2
2
3
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3
2
0
0
2
3
1
2
3
1
2
4
TSWVH
TSWVHI
TSWVIT
Spain
TSWV10
TSWVGACC
TSWVGAPP
TSWVGAWC
TSWVGAGC
TSWVGAMC
TSWVGAPT
TSWVGATC
TSWVGAAC
TSWVGATO
TSWVBR01
TSWVD
C27084
TOSPOG
TOSPOC
JAP
8Hip9612
20Da961
TSWVL3
GD98
Bulg97
3
2
4
2
3
2
4
2
1
3
4
3
5
3
2
4
3
4
3
5
3
2
4
3
2
3
2
4
2
1
3
2
1
3
4
3
5
3
2
4
3
2
4
3
4
3
5
3
2
4
3
2
4
3
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4
2
1
3
2
1
3
2
0
0
7
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8
6
5
7
6
5
7
6
4
4
6
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3
5
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2
4
3
2
4
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1
1
3
4
4
3
5
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2
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1
3
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4
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3
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1
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0
2
3
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1
1
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3
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2
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4
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0
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2
1
3
2
2
4
2
1
1
2
7
3
4
2
3
3
2
3
4
5
1
0
1
3
4
4
1
2
1
1
3
20Da961
1
3
2
1
4
3
0
1
3
3
6
4
3
2
3
3
2
4
5
2
0
1
2
5
3
0
2
1
1
JAP
2
1
3
3
1
0
3
4
2
7
3
3
2
3
3
3
5
2
1
1
2
4
3
1
1
1
1
TOSPOC
1
3
2
1
1
2
4
3
3
6
3
3
2
3
4
4
2
1
2
2
4
4
0
2
2
1
0
3
1
TOSPOG
3
2
0
1
3
3
3
4
2
6
3
3
2
4
5
1
1
2
3
4
3
0
3
1
2
3
C27084
2
0
0
3
4
2
4
3
2
6
3
3
3
5
2
0
2
3
5
3
1
2
2
1
4
0
0
1
TSWVD
0
0
2
4
3
3
3
3
2
6
3
4
4
2
1
1
3
5
3
0
2
1
2
3
1
2
TSWVBR01
0
2
3
3
4
2
3
3
2
6
4
5
1
1
2
2
5
4
0
3
1
1
4
1
1
1
TSWVGATO
2
3
2
4
3
2
3
3
2
7
5
2
0
2
3
4
4
0
2
2
1
3
2
0
0
0
TSWVGAAC
3
2
3
3
3
2
3
3
3
8
2
1
1
3
5
4
1
2
1
2
3
1
1
1
TSWVGATC
2
3
2
3
3
2
3
4
4
5
1
2
2
5
3
1
2
1
1
4
1
0
1
1
2
TSWVGAPT
3
2
2
3
3
2
4
5
1
4
2
3
4
4
1
1
1
1
3
2
0
0
1
TSWVGAMC
2
2
2
3
3
3
5
2
0
5
3
5
4
0
3
2
1
3
1
1
0
0
1
0
1
TSWVGAGC
2
2
2
3
4
4
2
1
1
6
5
3
1
3
2
2
3
1
0
1
0
1
TSWVGAWC
2
2
2
4
5
1
1
2
2
8
4
1
2
2
2
4
1
0
0
1
0
0
1
TSWVGAPP
2
2
3
5
2
0
2
3
4
4
0
3
1
2
4
2
0
0
0
2
1
2
1
1
TSWVGACC
2
3
4
2
1
1
3
5
7
1
3
2
1
4
2
1
0
0
1
0
1
0
0
1
TSWV10
3
4
1
1
2
2
5
3
1
2
2
2
3
2
1
1
0
1
0
1
0
0
1
0
Spain
4
1
0
2
3
4
4
4
3
1
2
4
1
1
1
1
1
0
1
0
0
1
0
0
TSWVIT
1
0
1
3
5
4
0
3
2
1
4
2
0
1
1
2
1
2
1
1
2
TSWVHI
0
1
2
5
3
1
6
2
2
3
2
1
0
1
2
1
1
1
TSWVH
1
2
4
4
1
2
5
2
4
1
1
1
0
2
1
2
1
1
2
1
TSWV10W
2
4
4
0
3
1
5
4
2
0
1
1
1
1
1
2
1
TSWVBL
4
3
1
3
1
1
7
2
1
0
1
2
0
2
1
1
2
1
1
1
2
2
8Hip9612
3
4
TSWV10W
3
1
2
2
2
3
5
1
1
0
2
1
1
0
0
1
0
0
0
1
1
1
LE98/257
3
0
3
1
2
4
1
4
1
1
1
1
2
1
1
2
1
1
1
2
2
2
1
TSWVL3
980472
3
TSWVBL
0
3
2
1
4
2
0
4
1
2
0
2
1
1
2
1
1
1
2
2
2
1
2
TI02LEM
0
2
2
2
3
2
1
0
4
2
1
1
0
0
1
0
0
0
1
1
1
0
1
1
GD98
2
0
LE98/257
2
1
2
4
1
1
1
0
5
1
2
1
1
2
1
1
1
2
2
2
1
2
2
1
TI02LEL
2
1
1
4
2
0
1
1
1
4
2
1
1
2
1
1
1
2
2
2
1
2
2
1
2
TI02LEI
1
1
3
2
1
0
1
2
0
5
4
4
5
4
4
4
5
5
5
4
5
5
4
5
TI02TOH
1
3
1
1
1
0
2
1
1
0
0
1
0
0
0
1
1
1
0
1
1
3
TI01TOG
3
1
0
1
1
1
1
2
1
1
2
1
1
1
2
2
2
1
2
2
0
1
1
TI01TOF
1
0
0
1
2
0
2
1
1
2
1
1
1
2
2
2
1
2
2
1
TI01TOE
0
0
0
2
1
1
0
0
1
0
0
0
1
1
1
0
1
1
1
4
TI01TOC
0
0
1
1
2
1
1
2
1
1
1
2
2
2
1
2
2
0
2
2
5
TI01TOB
0
1
0
2
1
1
2
1
1
1
2
2
2
1
2
2
1
2
TI03FQ30
1
0
1
0
0
1
0
0
0
1
1
1
0
1
1
1
1
1
TI03FQ29
0
1
0
0
1
0
0
0
1
1
1
0
1
1
0
2
2
5
1
TI02LC28
1
0
0
1
0
0
0
1
1
1
0
1
1
0
2
1
LETTERATURA
Bulg97
BS97
2
0
TI02FQ27
TI02LEM
1
TI02FQ26
1
0
TI02FQ25
TI02LEL
0
TI02FQ24
1
0
TI02LB23
TI02LEI
1
TI02LR22
3
1
TI02LR20
TI02TOH
1
TI02LR19
1
0
TI02LR18
TI01TOG
1
TI02LR17
0
1
TI02CO16
0
1
2
2
TI02CO14
TI01TOF
0
TI02CO15
1
2
4
0
1
TI02CO13
1
1
5
TI02CO15
0
1
TI02CO14
1
5
1
TI02CO12
1
4
1
2
2
TI02LR17
TI01TOE
1
TI02CO13
4
1
TI02SM11
4
0
1
TI02CO16
0
4
TI02CO12
0
2
TI02FO10
0
1
TI02LR18
TI01TOC
0
TI02SM11
1
2
2
1
TI02FO09
1
1
1
TI02LR19
1
1
TI02FO10
1
TI02FO08
1
1
0
TI02LR20
TI01TOB
1
TI02FO09
1
1
0
TI02CR07
0
TI02LR22
0
0
TI02FO08
0
TI02CR06
1
TI02CR05
1
TI02ME04
0
TI02LB23
TI03FQ30
1
TI02CR07
TI02ME02
0
TI02FQ24
0
1
TI02FQ25
1
0
TI02CR06
TI02FQ26
TI03FQ29
0
TI02CR05
TI02FQ27
TI02LC28
0
TI02ME04
TI01TO01
TI02ME02
TICINO
Tab. 28: Numero di aminoacidi diversi tra tutti gli aplotipi di TSWV rilevati in Ticino e quelli pubblicati in
GenBank.
45
3.6.2. DENDOGRAMMI BASATI SULLE SEQUENZE
NUCLEOTIDICHE
3.6.2.1. SEQUENZE TROVATE DURANTE QUESTA RICERCA
Il dendogramma ottenuto con 28 sequenze della lunghezza di 513 nucleotidi si suddivide
in due gruppi principali; il valore bootstrap di questa suddivisione è del 68 %. Un gruppo
racchiude le sequenze TI02CO12 e TI02CO13; l’altro comprende 26 sequenze. Due
sequenze risultano uguali tra loro (TI01TO01 e TI02LC28) (Fig. 14).
3.6.2.2. SEQUENZE DI TUTTI GLI ISOLATI TICINESI
Gli aplotipi di TSWV presenti in Ticino possono essere suddivisi in due gruppi principali.
La suddivisione è supportata da un valore bootstrap del 99 %. Il primo gruppo, chiamato
TICINO 1, comprende 34 aplotipi: i 28 trovati presso l’Azienda All’Orto durante questa
ricerca più TI02TOH, TI02LEL, TI01TOF, TI01TOG, TI02LEI e TI01TOC. Il secondo
gruppo, TICINO 2, racchiude gli aplotipi TI01TOE, TI02LEM e TI01TOB (Fig. 15).
Presso l’Azienda All’Orto erano stati trovati in precedenza anche gli aplotipi TI01TOE,
TI01TOF e TI01TOG (Matasci, 2002).
3.6.2.3. CONFRONTO TRA SEQUENZE TICINESI E SEQUENZE PUBBLICATE
Confrontando 67 sequenze di TSWV (37 rilevate in Ticino e 30 disponibili in GenBank)
si ottiene un dendogramma suddiviso in due gruppi principali. L’isolato brasiliano
TSWVBR01 non appartiene a nessuno dei due. Uno dei due gruppi (valore bootstrap 91
%) può essere ulteriormente diviso in due sottogruppi; il primo (valore bootstrap 84 %)
racchiude gli aplotipi del gruppo TICINO 1, l’isolato olandese TSWVD e quello ceco
C27084 che risultano identici all’aplotipo ticinese TI01TO01 sul confronto di 513
nucleotidi, uno proveniente dalla Germania (LE98/257), sei dalla Bulgaria (8Hip9612,
20Da961, GD98, BS97, Bulg 97 e TSWVL3) e uno dal Sud Africa (980472). Il secondo
sottogruppo (valore bootstrap 78 %) comprende due isolati provenienti da Taiwan
(TOSPOG e TOSPOC) e uno dal Giappone (JAP).
L’altro gruppo principale, supportato da un valore bootstrap relativamente basso (51 %),
si divide in tre sottogruppi. Uno di questi (valore bootstrap 60 %) racchiude 10 isolati
provenienti dagli Stati Uniti (TSWV10, TSWVGAMC, TSWVGAGC, TSWVGAPP,
TSWVGAWC, TSWVGACC, TSWVGAPT, TSWVGATC, TSWVGAAC e
TSWVGATO); un altro sottogruppo (valore bootstrap 52 %) contiene quattro isolati
hawaiani (TSWVBL, TSWV10W, TSWVH e TSWVHI) e l’ultimo (valore bootstrap 63
%) raggruppa tre isolati ticinesi (TI01TOE, TI02LEM e TI01TOB) ed uno italiano
(TSWVIT). L’isolato spagnolo non è associato a nessun sottogruppo (Fig. 16).
46
TI01TO01
TI02LC28
TI02CO15
TI02FQ25
63
TI03FQ30
TI02FO08
TI02ME04
TI02SM11
TI02LB23
TI02LR22
64
TI02CO16
TI02FO10
TI02LR18
TI02FQ24
TI02CR07
TI02FO09
TI02CO14
TI02CR06
TI02LR17
TI02FQ27
TI03FQ29
TI02LR20
65
TI02ME02
TI02CR05
TI02FQ26
TI02LR19
68
TI02CO12
TI02CO13
0.001 mutazioni/nucleotide
1 nucleotide
Fig. 14: Dendogramma basato sulla sequenza di 513 nucleotidi del gene NP di TSWV degli aplotipi
ticinesi trovati in questa ricerca. I valori posti sopra i rami sono percentuali generate dalla statistica
bootstrap su un totale di 1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza filogenetica.
47
TI02CO12
67
TI02CO13
TI02CR05
TI02LR19
TI02FQ26
TI02ME04
TI01TO01, TI02LC28
TI02TOH
TI02FO09
TI02SM11
64
TI02LB23
TI02LR17
TI03FQ29
TI02CR07
TI02LR18
TI02CO14
TICINO 1
TI02FQ25
64
TI03FQ30
TI02CO16
TI02CR06
TI02FO10
TI02LEL
53
TI02LR20
TI02ME02
TI02FQ27
TI02FO08
TI02FQ24
TI02LR22
TI02CO15
TI01TOF
99
85
52
TI01TOG
TI02LEI
68
TI01TOC
TI01TOE
TI02LEM
TICINO 2
99 TI01TOB
0.005 mutazioni/nucleotide
1 nucleotide
Fig. 15: Dendogramma basato sulla sequenza di 513 nucleotidi del gene NP di TSWV di tutti gli aplotipi
ticinesi. I valori posti sopra i rami sono percentuali generate dalla statistica bootstrap su un totale di 1000
replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza filogenetica.
48
TI02LR20
TI02ME02
TI02LEL
TI02FO10
TI02CR05
TI02LR17
TI02LR19
TI02CR06
TI02FO09
TI02CO16
TI02TOH
TI01TO01
TI02ME04
TI02FQ26
C27084
TI02CO12
67 TI02CO13
TI02CR07
TSWVD
TI03FQ29
TI02FO08
TI02CO14
TI02FQ25
64
TI03FQ30
TI02LR18
TI02FQ24
TI02LC28
TI02FQ27
TI02SM11
64
TI02LB23
TI02CO15
TI02LR22
LE98/257
TI01TOG
58 TI01TOF
TI02LEI
53
73 TI01TOC
53
84
TSWVL3
60
91
TICINO 1
REP. CECA
TICINO 1
OLANDA
TICINO 1
GERMANIA
TICINO 1
980472
Bulg97
8Hip9612
69
20Da961
GD98
78
96
87
TSWVHI
TSWVH
85
51
51
60
54
TSWVBR01
TSWVGAPT
TSWVGACC
62 TSWVGAPP
TSWVGAWC
TSWVGAMC
TSWVGAGC
BULGARIA
GIAPPONE
TAIWAN
ITALIA
TICINO 2
SPAGNA
TSWVBL
TSWV10W
TSWVGATO
TSWVGAAC
60
0.005 mutazioni/nucleotide
BS97
JAP
TOSPOG
TOSPOC
TI01TOE
TI02LEM
99 TI01TOB
Spain
63
52
TSWVIT
S. AFRICA
HAWAII
TSWVGATC
USA
TSWV10
BRASILE
1 nucleotide
Fig. 16: Dendogramma basato sulla sequenza di 513 nucleotidi del gene NP di TSWV di tutti gli aplotipi
ticinesi e di 30 sequenze pubblicate in GenBank. I valori posti sopra i rami sono percentuali generate dalla
statistica bootstrap su un totale di 1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza
filogenetica.
49
3.6.3. DENDOGRAMMI BASATI SULLE SEQUENZE
AMINOACIDICHE
3.6.3.1. SEQUENZE TROVATE DURANTE QUESTA RICERCA
La traslazione delle sequenze riduce il numero di aplotipi diversi da 28 (basati sulle
sequenze di 513 nucleotidi) a 15 (basati sulle sequenze di 171 aminoacidi). Le sequenze
di aminoacidi codificati sono identiche per gli aplotipi TI01TO01, TI02ME02,
TI02ME04, TI02CR05, TI02FO08, TI02SM11, TI02CO15, TI02LR18, TI02LB23,
TI02FQ24, TI02FQ25, TI02FQ27, TI02LC28 e TI03FQ30 (Fig. 17).
3.6.3.2. SEQUENZE DI TUTTI GLI ISOLATI TICINESI
Per effetto della traslazione il numero di aplotipi diversi si riduce da 37 (basati sulle
sequenze nucleotidiche) a 21 (basati sulle sequenze aminoacidiche) (Fig. 18). Le
sequenze di aminoacidi codificati sono identiche anche per gli aplotipi TI01TOC,
TI01TOE e TI01TOF, oltre a quelli già indicati in precedenza (3.6.3.1).
3.6.3.3. CONFRONTO TRA SEQUENZE TICINESI E SEQUENZE PUBBLICATE
La traslazione delle 67 sequenze (37 rilevate in Ticino e 30 disponibili in GenBank)
riduce il numero di aplotipi a 40. Le sequenze di aminoacidi codificati sono identiche,
oltre che per quelli già indicati in precedenza (3.6.3.1 e 3.6.3.2), anche per l’aplotipo
olandese TSWVD, l’aplotipo italiano TSWVIT, l’aplotipo ceco C27084 e l’aplotipo
germanico LE98/257. Il dendogramma è suddiviso in cinque gruppi principali: uno
(valore bootstrap 64 %) racchiude gli isolati provenienti dalla Bulgaria (8Hip9612,
20Da961, GD98, BS97, Bulg 97 e TSWVL3), l’isolato brasiliano TSWVBR01 e quello
proveniente dal Sud Africa (980472). Il secondo gruppo (valore bootstrap 53 %) contiene
i due aplotipi ticinesi TI01TOB e TI02LEM. Un terzo racchiude gli aplotipi TI02CO12 e
TI02CO13 (valore bootstrap 61 %). Il quarto raggruppa TI02LEL e TI02FO10 (valore
bootstrap 62 %) e l’ultimo gruppo (valore bootstrap 61 %) può essere ulteriormente
suddiviso in tre sottogruppi: uno con gli isolati provenienti da Taiwan (TOSPOC e
TOSPOG) con un valore bootstrap del 62 %; un secondo sottogruppo (valore bootstrap
63 %) contenente tre isolati provenenti dalle Hawai ed un terzo (valore bootstrap 64 %)
che contiene gli isolati americani TSWV10, TSWVGAMC, TSWVGAGC, TSWVGAPP,
TSWVGAWC, TSWVGACC, TSWVGAPT, TSWVGATC, TSWVGAAC e
TSWVGATO. Gli isolati TSWVGAMC, TSWVGAPP, TSWVGAPT, TSWVGAAC,
TSWVGAWC e TSWVGAGC hanno la stessa composizione aminoacidica. Sono inoltre
identiche fra loro le sequenze aminoacidiche degli aplotipi TI01TOG, JAP (proveniente
dal Giappone) e TSWVHI (proveniente dalle Hawaii) che appartengono al quinto gruppo
ma a nessun sottogruppo. Tutti gli altri aplotipi non sono associati a nessuno dei gruppi
principali (Fig. 19).
50
TI02LC28
TI02CO15
TI02LR18
TI02ME02
TI03FQ30
TI02FQ24
TI02FO08
TI02ME04
TI01TO01
TI02FQ25
TI02SM11
TI02LB23
TI02CR05
TI02FQ27
TI02LR19
TI02CR07
TI02LR17
TI02FO09
TI02CO16
TI03FQ29
TI02FQ26
TI02CR06
TI02FO10
TI02LR20
65
TI02LR22
TI02CO14
TI02CO13
65
0.005 mutazioni/aminoacido
TI02CO12
1 aminoacido
Fig. 17: Dendogramma basato sulla sequenza di 171 aminoacidi del gene NP di TSWV degli aplotipi
ticinesi trovati in questa ricerca. I valori posti sopra i rami sono percentuali generate dalla statistica
bootstrap su un totale di 1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza filogenetica.
51
TI02TOH
TI02LR18
TI02LB23
TI02CR05
TI01TO01
TI02ME02
TI03FQ30
TI02LC28
TI02CO15
TI02FQ27
TI02FQ24
TI02ME04
TI02FQ25
TI02FO08
TI02SM11
TI01TOF
TI01TOE
TI01TOC
TI02LR17
TI01TOG
TI02LEI
TI02LR20
TI02FO09
TI02CO14
TI02LR22
TI02FQ26
TI02CO16
TI02CR07
TI03FQ29
TI02LR19
TI02CR06
TI02LEL
66
64
TI02FO10
TI02LEM
52
TI01TOB
TI02CO12
TI02CO13
0.005 mutazioni/aminoacido
1 aminoacido
Fig. 18: Dendogramma basato sulla sequenza di 171 aminoacidi del gene NP di TSWV di tutti gli aplotipi
ticinesi. I valori posti sopra i rami sono percentuali generate dalla statistica bootstrap su un totale di 1000
replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza filogenetica.
52
8Hip9612
Bulg97
64
20Da961
BULGARIA
980472
S. AFRICA
TSWVL3
BS97
GD98
BRASILE
TSWVBR01
TI02LEM
53
TI01TOB
61
TI02CO12
TICINO
TI02CO13
TI02TOH
SPAGNA
Spain
TI02CO14
TI02LR22
TI02CR07
TI02LR17
TI02FO09
TI02LEI
TICINO
TI03FQ29
TI02LR20
TI02FQ26
TI02CO16
TI02LR19
TI02CR06
62
TI02LEL
LE98/257
TI02FO10
GERMANIA
ITALIA
OLANDA
REP.CECA
TSWVIT
TSWVD
C27084
TI01TOC
TI01TOF
TI01TOE
TI02CR05
TI02LB23
TI01TO01
TI02FO08
TI02ME02
TICINO
TI02FQ27
TI02FQ24
TI02FQ25
TI03FQ30
TI02ME04
TI02LR18
TI02CO15
TI02SM11
TI02LC28
61
TOSPOG
TAIWAN
62
TOSPOC
63
TSWVBL
TSWV10W
TICINO
GIAPPONE
TSWVHI
HAWAII
TSWVH
TI01TOG
JAP
TSWVGAAC
64
TSWVGAPP
TSWVGAGC
USA
TSWVGAMC
TSWVGAPT
TSWVGAWC
TSWVGATC
TSWVGATO
TSWVGACC
TSWV10
0.005 mutazioni/aminoacido
1 aminoacido
Fig. 19: Dendogramma basato sulla sequenza di 171 aminoacidi del gene NP di TSWV degli aplotipi
ticinesi e di 30 sequenze pubblicate in GenBank. I valori posti sopra i rami sono percentuali generate dalla
statistica bootstrap su un totale di 1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza
filogenetica.
53
3.6.4. APLOTIPI PARTICOLARI
Gli aplotipi TI02ME03 e TI02LR21 hanno una lunghezza di 431 rispettivamente 196
nucleotidi e sono quindi considerevolmente più corti rispetto a tutte le altre sequenze.
L’allineamento di TI02ME03 e TI02LR21 con l’aplotipo più frequente in Ticino
(TI01TO01) mostra che si potrebbe essere in presenza di delezioni di pezzi di genoma
(Fig. 20 e Fig. 22). L’allineamento delle sequenze aminoacidiche di TI02ME03 e
TI01TO01 conferma la delezione (Fig. 21), mentre quello di TI02LR21 e TI01TO01 è
discutibile e lascia dubitare dell’effettiva esistenza dell’aplotipo.
TI01TO01
TI02ME03
GAGTTTGAGGAAGATCAGAATCTGGTAGCATTCAACTTCAAGACTTTTTGTCTGGAAAAC
GAGTTTGAGGAAGATCAGAATCCGGTAGCATTCAACTTCAAGACTTTTTGTCTGGAAAAC
********************** *************************************
TI01TO01
TI02ME03
CTCGACCAGATCAAGAAGATGAGCGTTATTTCATGTCTGACATTCCTGAAGAATCGTCAG
CTCGACCAGATCAAGAAGATGAGCGTTATTTCATGTCTGACATTCCTGAAGAATCGTCAG
************************************************************
TI01TO01
TI02ME03
AGTATAATGAAGGTTATTAAACAAAGTGATTTTACTTTTGGTAAAATTACCATAAAGAAA
AGTATAATGAAGGTTATTAAACAAAGTGATTTTACTTTTGGTAAAATTACCATAA----*******************************************************
TI01TO01
TI02ME03
ACTTCAGACAGGATTGGAGCCACTGACATGACCTTCAGAAGGCTTGATAGCTTGATCAGG
------------------------------------------------------------
TI01TO01
TI02ME03
GTCAGGCTTGTAGAGGAAACTGGGAATTCTGAGAATCTCAATACTATCAAATCTAAGATT
------------------------------------------------------------
TI01TO01
TI02ME03
GCTTCCCACCCTTTGATTCAAGCCTATGGATTACCTCTTGATGATGCAAAGTCTGTGAGG
------------------------------------------------------------
TI01TO01
TI02ME03
CTTGCCATAATGCTGGGAGGTAGCTTACCTCTTATTGCTTCAGTTGATAGCTTTGAGATG
----------TGCTGGGAGGTAGCTTACCTCTTATTGCTTCAGTTGATAGCTTTGAGATG
**************************************************
TI01TO01
TI02ME03
ATCAGTGTTGTCTTGGCTATATATCAGGATGCAAAATACAAAGACCTCGGGATTGACCCA
ACCAGTGTTGTCTTGGCTATATATCAGGATGCAAAATACAAAGACCTCGGGATTGACCCA
* **********************************************************
TI01TO01
TI02ME03
AAGAAGTATGACACCAGAGAAGCCTTAGGAAAAGTTTGCACTGTGCTGAAAAGCAAAGCA
AAGAAGTATGACACCAGAGAAGCCTTAGGAAAAGTTTGCACTGTGCTGAAAAGCAAAGCA
************************************************************
TI01TO01
TI02ME03
TTTGAAATGAATGAAGATCAGGTGAAGAAAGGAAAAGAGTATGCTGCTATACTCAGCTCC
TTTGAAATGAATGAAGATCAGGTGAAGAAAGGAAAAGAGTATGCTGCTATACTCAGCTCC
************************************************************
TI01TO01
TI02ME03
AGCAATCCTAATGCTAA
AGCAATCCTAATGCTAA
*****************
Fig. 20: Allineamento (Clustal W) delle sequenze nucleotidiche di TI01TO01 e TI02ME03.
* identità; - delezione
54
TI01TO01
TI02ME03
EFEEDQNLVAFNFKTFCLENLDQIKKMSVISCLTFLKNRQSIMKVIKQSDFTFGKITIKK
EFEEDQNPVAFNFKTFCLENLDQIKKMSVISCLTFLKNRQSIMKVIKQSDFTFGKITI-******* **************************************************
TI01TO01
TI02ME03
TSDRIGATDMTFRRLDSLIRVRLVEETGNSENLNTIKSKIASHPLIQAYGLPLDDAKSVR
------------------------------------------------------------
TI01TO01
TI02ME03
LAIMLGGSLPLIASVDSFEMISVVLAIYQDAKYKDLGIDPKKYDTREALGKVCTVLKSKA
----LGGSLPLIASVDSFEMTSVVLAIYQDAKYKDLGIDPKKYDTREALGKVCTVLKSKA
**************** ***************************************
TI01TO01
TI02ME03
FEMNEDQVKKGKEYAAILSSSNPNA
FEMNEDQVKKGKEYAAILSSSNPNA
*************************
Fig. 21: Allineamento (Clustal W) delle sequenze aminoacidiche di TI01TO01 e TI02ME03.
* identità; - delezione
TI01TO01
TI02LR21
GAGTTTGAGGAAGATCAGAATCTGGTAGCATTCAACTTCAAGACTTTTTGTCTGGAAAAC
GAGTTTGAGGAAGATCAGAATCTGGTAGCATTCAACTTCAAGACTTTTTGTCTG-----******************************************************
TI01TO01
TI02LR21
CTCGACCAGATCAAGAAGATGAGCGTTATTTCATGTCTGACATTCCTGAAGAATCGTCAG
------------------------------------------------------------
TI01TO01
TI02LR21
AGTATAATGAAGGTTATTAAACAAAGTGATTTTACTTTTGGTAAAATTACCATAAAGAAA
------------------------------------------------------------
TI01TO01
TI02LR21
ACTTCAGACAGGATTGGAGCCACTGACATGACCTTCAGAAGGCTTGATAGCTTGATCAGG
------------------------------------------------------------
TI01TO01
TI02LR21
GTCAGGCTTGTAGAGGAAACTGGGAATTCTGAGAATCTCAATACTATCAAATCTAAGATT
------------------------------------------------------------
TI01TO01
TI02LR21
GCTTCCCACCCTTTGATTCAAGCCTATGGATTACCTCTTGATGATGCAAAGTCTGTGAGG
------------------------------------------------------------
TI01TO01
TI02LR21
CTTGCCATAATGCTGGGAGGTAGCTTACCTCTTATTGCTTCAGTTGATAGCTTTGAGATG
------------------------------------------------------------
TI01TO01
TI02LR21
ATCAGTGTTGTCTTGGCTATATATCAGGATGCAAAATACAAAGACCTCGGGATTGACCCA
------------------------------------------------------------
TI01TO01
TI02LR21
AAGAAGTATGACACCAGAGAAGCCTTAGGAAAAGTTTGCACTGTG-CTGAAAAGCAAAGC
---CTGCTATACTCAGCTCCAGCAATCGTAAT-GCTTGCACTGTGTCTGAAGAGCAAAGC
* *
** *
*** * * ** * ********** ***** ********
TI01TO01
TI02LR21
ATTTGAAATGAATGAAGATCAGGTGAAGAAAGGAAAAGAGTATGCTGCTATACTCAGCTC
ATTTGAAATGAATGAAGATCAGGTGAAGAAAGGAAAAGAGTATGCTGCTATACTCAGCTC
************************************************************
TI01TO01
TI02LR21
CAGCAATCCTAATGCTAA
CAGCAATCCTAATGCTAA
******************
Fig. 22: Allineamento (Clustal W) delle sequenze nucleotidiche di TI01TO01 e TI02LR21.
* identità; - delezione
55
4. DISCUSSIONE
4.1. INCIDENZA DI TSWV IN OTTO COLTURE ORTICOLE
L’incidenza di TSWV nelle otto colture analizzate è elevata: il 68,2 % dei campioni
prelevati presso l’Azienda All’Orto di Muzzano è risultato infetto. Nessuna delle colture
prese in considerazione (cavolo rapa, coste, formentino, lattuga batavia, lattuga
cappuccio, lattuga foglia di quercia verde e rossa, lattughino lollo rosso e melanzane) è
esente dal virus. Le percentuali di infezioni variano dal 25 % (per cavolo rapa) al 100 %
(per lattuga cappuccio). Questo conferma l’elevata polifagia del virus.
Le piante da cui prelevare i campioni sono state selezionate omogeneamente all’interno
delle campate cercando di averne, dove possibile, una parte con sintomi e una senza
sintomi. I campioni da analizzare sono stati a loro volta scelti a caso tra i campioni
prelevati. Si nota una correlazione tra la presenza di sintomi di TSWV al momento del
prelievo dei campioni e la percentuale di campioni infetti. Le percentuali sono le più
basse per le colture che non mostravano sintomi, ovvero cavolo rapa (25 % di campioni
infetti), formentino (56,3 %), lattughino lollo rosso (66,7 %) e melanzane (54,2 %). Per le
colture coste e lattuga cappuccio, che mostravano segni evidenti della presenza del virus,
si hanno percentuali di campioni infetti del 66,7 % e del 100 %, vale a dire le più elevate.
Le colture lattuga batavia (81,3 %) e lattuga foglia di quercia (95,8 %) manifestavano
sintomi che, data la possibilità di confusione con quelli provocati da funghi, batteri o
fitotossicità, non potevano essere attribuiti con certezza a TSWV; le percentuali si situano
in una posizione intermedia fra i due gruppi precedenti (Tab. 17).
32 campioni su 34 che mostravano sintomi si sono rivelati effettivamente infetti. Il fatto
che due campioni non sono risultati positivi all’analisi pur presentando dei sintomi (nel
caso del campione di costa erano sintomi considerati certi, nel caso del campione di
lattuga batavia erano invece sintomi non sicuri) potrebbe essere dovuto ad errori nelle
analisi (ad esempio imprecisioni nel pipettare) oppure è possibile che i campioni fossero
effettivamente sani; ciò è plausibile in particolare per il campione di lattuga batavia.
Melanzane e lattughino non presentavano sintomi al momento del prelievo, pur essendo
piante sintomatiche; presumibilmente le piante infette hanno mostrato dei sintomi con
l’evolversi della malattia. Per cavolo rapa e formentino non sono state trovate
informazioni nella letteratura riguardo alla sintomatologia. Le percentuali importanti di
piante infette in colture che non mostrano sintomi, rivelano l’importanza di un
monitoraggio degli insetti vettori che permetta di attestarne la presenza e di intervenire
per tempo con metodi di lotta appropriati. Per sorvegliare la presenza di insetti viruliferi
si potrebbe far ricorso a piante spia, quali le varietà di Petunia x hybrida “Summer
Madness”, “Super Magic Coral” e “Red Cloud” segnalate da Gallitelli & Davino (1998).
La disposizione delle piante infette all’interno delle campate non sembra seguire alcuna
logica: per tutte le colture si hanno delle distribuzioni casuali (Fig. 1A). Questo lascia
supporre che non ci sia stato un focolaio che si è esteso nel tempo ma che si tratti di
singole infezioni dovute a insetti vettori provenienti dall’esterno oppure a materiale
vegetale infetto al momento della messa a dimora delle piante.
56
4.2. TSWV IN UNA COLTURA INVERNALE
La coltura lattuga foglia di quercia, messa a dimora durante il mese di gennaio, è risultata
essere infetta da TSWV. Il 19,5 % dei campioni (8 su 41) prelevati un mese dopo il
trapianto in serra delle piante, è risultato positivo all’analisi. La distribuzione delle piante
infette all’interno delle campate (settori 8S e 9S) sembra casuale (Fig. 2A), non si tratta
quindi di un focolaio che si è esteso nel tempo, bensì di singole infezioni.
Durante l’inverno i tripidi vettori del virus hanno un’attività ridotta; grazie al
monitoraggio tramite trappole cromotropiche blu si è potuto stabilire che nel periodo tra il
20.01.’03 ed il 24.02.’03 è iniziato il periodo di attività di F. occidentalis. Un insetto è
stato infatti trovato in una trappola collocata nella serra il 20.01.’03 e lasciata fino al
24.02.’03. Prendendo in considerazione la durata dei diversi stadi di sviluppo dell’insetto
a temperature relativamente basse (Tab. 4) e sapendo quali colture e quali malerbe erano
presenti nella serra nel periodo in questione, si può tentare di ricostruire la storia
dell’insetto e formulare l’ipotesi seguente: le uova potrebbero essere state deposte ad
inizio dicembre ’02; una decina di giorni dopo si sarebbero schiuse e le larve del primo
stadio, l’unico in grado di acquisire il virus, si potrebbero essere nutrite sulle colture o
sulle malerbe presenti in abbondanza in quel momento (Fig. 10), infettandosi. La larva
del primo stadio ha una durata di vita di cinque giorni circa. Dal 15.12.’02 e per la durata
di nove giorni circa, sarebbero quindi state attive le larve del secondo stadio, le quali si
nutrono attivamente e possono trasmettere il virus. Non essendo stata effettuata alcuna
sterilizzazione del terreno, le pupe sono sopravvissute ed hanno continuato il loro
sviluppo. La durata dello sviluppo da uovo a adulto è di 34 giorni, a basse temperature;
all’incirca dal 05.01.’03 si era dunque presumibilmente in presenza di insetti adulti in
grado di infettare nuove piante. Un adulto vive da 30 a 45 giorni; ciò significa che da
inizio gennaio e fino alla metà di febbraio potevano essere presenti nella serra degli adulti
che si sono alimentati sulla coltura invernale, infettandola. Uno di questi è poi stato
catturato nella trappola. Le malerbe, estirpate prima della messa a dimora della lattuga
foglia di quercia (metà gennaio), non rappresentavano più in quel momento una fonte di
cibo per i tripidi. L’ipotesi precedente può essere differita nel tempo: le uova potrebbero
essere state deposte ad esempio 20 giorni dopo quanto supposto in precedenza; le larve
del primo stadio sarebbero così state attive ad inizio gennaio ed esse sarebbero state
obbligate a nutrirsi sulle malerbe, data l’assenza di colture a quel momento. Gli adulti
sarebbero stati presenti a partire dal 25.01.’03 e potrebbero anche in questo caso aver
infettato la lattuga foglia di quercia.
Da questa ricostruzione si nota l’importanza di un intervento volto ad interrompere il
ciclo di infezione; se i tripidi non avessero trovato fonte di cibo, rappresentata durante i
mesi invernali prevalentemente dalle piante infestanti, non avrebbero potuto continuare il
loro sviluppo. Anche una sterilizzazione del terreno si può rivelare utile per eliminare
eventuali pupe presenti nel terreno.
Un’altra ipotesi per spiegare la presenza di materiale infetto nella coltura invernale, è che
le piante fossero già colpite da TSWV al momento della loro messa a dimora. L’analisi
dei campioni del primo prelievo, effettuato poco dopo il trapianto delle piante in serra, e
l’analisi dei campioni prelevati da piantine non ancora trapiantate, permetterebbero di
confermare o smentire quest’ipotesi.
57
4.3. PIANTE INFESTANTI COME SERBATOIO DI TSWV
Dall’analisi di 46 campioni prelevati dalle malerbe presenti in quantità maggiore, risulta
che l’82,6 % delle piante prese in considerazione sono infette; il 63,6 % dei campioni di
S. media e il 100 % dei campioni di Galinsoga sp. e di pomodoro, sono risultati positivi.
Queste percentuali elevate e la grande quantità di malerbe presenti nei tunnel,
confermano la loro probabile importanza come serbatoio di TSWV nel periodo che
trascorre tra due colture.
Tramite il sequenziamento dei prodotti PCR, sono state ottenute le sequenze
nucleotidiche di 36 campioni di malerbe; è stato trovato 34 volte l’aplotipo TI01TO01,
ossia il più frequente (vedi 4.4.). Sono poi stati trovati gli aplotipi TI02FO08 in un
campione di Galinsoga sp. e TI02SM11 in un campione di S. media. I campioni di
malerbe erano stati prelevati in vari settori della serra. Sono state ottenute anche le
sequenze di sei degli otto campioni di lattuga foglia di quercia risultati infetti. In quattro
campioni è stato trovato l’aplotipo TI01TO01; sono stati inoltre trovati due nuovi
aplotipi: TI03FQ29 e TI03FQ30. Il ritrovamento, nei campioni di lattuga foglia di
quercia, dell’aplotipo maggiormente presente nelle malerbe rafforza l’ipotesi del
passaggio dell’infezione dalle piante infestanti alla coltura.
Nella campata 9S si trovava in autunno cicoria verde (non analizzata) e nella campata 8S
era coltivata lattuga cappuccio; sono stati analizzati 14 campioni di lattuga cappuccio
prelevati in questa campata (altri 10 sono stati prelevati nella campata 10N, per un totale
di 24 campioni di lattuga cappuccio). In 12 dei 14 campioni è stato trovato l’aplotipo
TI01TO01. Questo fatto lascia ipotizzare un passaggio dell’infezione dalla lattuga alle
malerbe e dalle malerbe alla coltura successiva. Purtroppo, essendo TI01TO01 l’aplotipo
più frequente in tutte colture, non è possibile dimostrare con certezza questo passaggio.
Le malerbe giocano un ruolo molto importante sia come ospite alternativo del virus, sia
come serbatoio di vettori. Mantenere i tunnel completamente liberi dalle piante infestanti
ospiti di TSWV è una misura indispensabile per prevenire la diffusione della malattia da
una coltura alla successiva.
58
4.4. FREQUENZA E DISTRIBUZIONE DEGLI APLOTIPI DI TSWV
L’elevata variabilità di TSWV presente in Ticino e segnalata da Matasci (2002), è stata
confermata anche in questo studio. In 154 campioni provenienti da un’unica azienda
ticinese, prelevati da undici ospiti sull’arco di cinque mesi (ottobre ’02 - febbraio ’03),
sono stati rilevati 30 aplotipi di cui 29 risultano nuovi (Tab. 22). L’unico aplotipo già
trovato in precedenza è stato chiamato TI01TO01 e corrisponde agli aplotipi TI01TOA e
TI01TOD (Matasci, 2002) che si differenziavano nel confronto delle sequenze di 638
nucleotidi, ottenute utilizzando primers NP, ma che risultano identici nel confronto delle
sequenze più corte, ottenute con l’uso di nested primers (utilizzati in questa ricerca).
Questo aplotipo era già stato trovato nell’azienda in questione in campioni raccolti nel
2001 e nella prima metà del 2002. Esso è stato rinvenuto più di una volta in ognuna delle
undici specie, per un totale di 122 campioni. Altri due aplotipi sono stati trovati in più di
un campione: TI02ME02 in tre campioni di foglia di melanzana e TI02FO08 in un
campione di formentino ed in uno di Galinsoga sp.. I restanti 27 aplotipi sono stati trovati
una sola volta. L’elevata frequenza con cui è stato incontrato TI01TO01, l’aplotipo
presente più di frequente in tutte le specie, segnala l’assenza di specializzazione di un
determinato aplotipo per un determinato ospite, perlomeno sulla base della sequenza
analizzata. Le mutazioni nelle sequenze non sembrano quindi avere come conseguenza
diretta la capacità di infettare altre specie orticole.
L’importante variabilità del virus e l’assenza di specializzazione degli aplotipi per
determinate specie è confermata anche dall’osservazione individuale di ogni ospite:
solamente nei pomodori (presenti come malerbe in altre colture) è stato trovato un unico
aplotipo; nelle altre 10 specie sono stati individuati da due a sette aplotipi.
L’aplotipo TI01TO01 è stato trovato su piante sparse omogeneamente nelle campate.
TI02ME02 è stato trovato in tre campioni di foglie di melanzane vicine tra loro: le piante
20, 35 e 38 (Fig. 1A); questo potrebbe indicare che un tripide vettore di questo aplotipo si
sia nutrito successivamente sulle tre piante in questione, infettandole. L’ultimo dei tre
aplotipi trovati in più di un campione (TI02FO08) è stato trovato una volta nella parte B
della serra, in un campione di formentino, ed una volta nella parte A in uno di Galinsoga.
È possibile che il tripide sia passato da una serra all’altra, oppure che più insetti fossero
vettori di questo aplotipo.
59
4.5. EVOLUZIONE DI TSWV IN TICINO
Dalla verifica della nazione di provenienza delle piantine colpite dal virus in Ticino, era
stato notato da Matasci (2002) un legame con l’aplotipo presente. Presso le aziende
orticole che avevano acquistato piantine dall’Italia e dall’Olanda, erano stati trovati
aplotipi simili a quelli rinvenuti nelle nazioni di provenienza delle piantine stesse. In
particolare era stato trovato un aplotipo identico a TSWVD (olandese) presso un’azienda
che acquistava piantine di pomodoro dall’Olanda ed era stato rinvenuto l’aplotipo
TI01TOE, molto simile a TSWVIT (italiano), presso l’Azienda All’Orto che si riforniva
in Italia. Da ciò risultava l’ipotesi che il virus fosse stato importato proprio con le
piantine e si fosse poi evoluto dando origine agli altri aplotipi presenti sul territorio
cantonale. Dai risultati ottenuti in questa ricerca si rafforza l’ipotesi dell’evoluzione
continua di TSWV a partire da un aplotipo presente molto di frequente (TI01TO01) per
dare origine ad un gran numero di nuovi aplotipi.
Gli aplotipi di TSWV presenti in Ticino si suddividono in due gruppi: TICINO 1 e
TICINO 2 (Fig. 15). Le differenze nelle 37 sequenze di 513 nucleotidi prese in
considerazione per effettuare le analisi filogenetiche (escluse quindi TI02ME03 e
TI02LR21 che hanno una lunghezza di 431 rispettivamente 196 nucleotidi) raggiungono
un massimo di sette basi mutate. Le sequenze traslate variano da zero a cinque
aminoacidi.
TICINO 1 racchiude 34 aplotipi: tutti gli aplotipi (28) trovati durante questa ricerca e altri
sei aplotipi trovati in precedenza su pomodoro e su lattuga (TI01TOC, TI01TOF,
TI01TOG, TI02TOH, TI02LEL e TI02LEI). Data la somiglianza di tutti gli aplotipi di
questo gruppo con TI01TO01 (le differenze maggiori sono di quattro nucleotidi e
altrettanti aminoacidi, Tab. 24 e Tab. 25) si può supporre che essi siano stati generati da
mutazioni dell’aplotipo in questione. 20 aplotipi (includendo TI02LC28) si differenziano
da TI01TO01 per un solo nucleotide (aplotipi TI02MEO2, TI02ME04, TI02CR05,
TI02CR06, TI02FO08, TI02FO09, TI02FO10, TI02SM11, TI02CR13, TI02CO16,
TI02LR17, TI02LR18, TI02LR19, TI02FQ24, TI02FQ25, TI02FQ26, TI02FQ27,
TI02FQ28, TI03FQ29 e TI03FQ30). 11 di questi aplotipi (TI02MEO2, TI02ME04,
TI02CR05, TI02FO08, TI02SM11, TI02LR18, TI02FQ24, TI02FQ25, TI02FQ27,
TI02FQ28 e TI03FQ30) hanno la stessa composizione aminoacidica di TI01TO01. Gli
altri nove aplotipi si differenziano per un aminoacido. Si può supporre che ulteriori
mutazioni degli aplotipi generati da TI01TO01, abbiano a loro volta originato i restanti
aplotipi rilevati durante questa ricerca. In particolare è probabile che TI02CO12 sia stato
generato da tre mutazioni di TI02CO13, dato che i due aplotipi si differenziano per tre
nucleotidi; anche le sequenze traslate contengono tre differenze. TI02LB23 è
probabilmente il risultato di una mutazione di TI02SM11: le sequenze nucleotidiche
differiscono per una base, mentre le sequenze aminoacidiche di questi due aplotipi sono
identiche. TI02LR20 è invece il risultato di una mutazione di TI02ME02. Anche
TI02LEL deriva da TI02ME02, che ha subito in questo caso tre mutazioni. Entrambi gli
aplotipi (TI02LR20 e TI02LEL) si differenziano da TI02ME02 per un solo aminoacido.
Altri tre aplotipi (oltre a TI02LR20 e TI02LB23) si differenziano da TI01TO01 per due
nucleotidi: si tratta di TI02CR07, TI02CO14 e TI02LR22. Per questi aplotipi non è stato
rinvenuto nessun passaggio intermedio. Tutti e tre contengono un aminoacido diverso da
60
TI01TO01 nelle sequenze traslate. Gli aplotipi TI02TOH e TI02CO15 risultano da tre
mutazioni di TI01TO01. TI02TOH mantiene tre differenze anche nella sequenza traslata,
mentre TI02CO15 ha la stessa composizione aminoacidica di TI01TO01. Si suppone che
anche gli altri aplotipi trovati in precedenza in Ticino e appartenenti a questo gruppo,
siano il risultato di mutazioni di TI01TO01: è stato dapprima generato TI01TOF che si
differenzia da TI01TO01 in due nucleotidi ma in nessun aminoacido. Da qui hanno avuto
origine TI01TOG e TI01TOC, tramite una mutazione ciascuno. TI02LEI risulta da
un’ulteriore mutazione di TI01TOC.
TICINO 2 racchiude tre aplotipi che contano da 16 a 17 nucleotidi diversi rispetto a
TI01TO01 ma solo da nessuno a due aminoacidi diversi. I tre aplotipi sono TI01TOE e
TI01TOB, trovati per la prima volta nel 2001 su pomodoro, e TI02LEM, trovato nel 2002
su lattuga. TI02LEM si differenzia da TI01TOB in una base ed un aminoacido, è quindi
ipotizzabile una sua origine proprio da una mutazione di questo aplotipo.
Nel dendogramma basato sulle sequenze aminoacidiche spiccano gli aplotipi TI02TOH e
TI02CO12, che si differenziano da TI01TO01 in tre rispettivamente quattro aminoacidi.
Solamente TI02LEM ha due aminoacidi diversi nella sequenza rispetto a TI01TO01.
Tutti gli altri aplotipi hanno da nessuna a una differenza.
Dal confronto delle sequenze di 513 nucleotidi degli aplotipi ticinesi con quelli pubblicati
in GenΒank (Fig. 16), risulta che l’aplotipo TI01TO01 è identico all’aplotipo della
Repubblica Ceca C27084 e all’aplotipo olandese TSWVD, isolati da calla rispettivamente
da dalia. È plausibile che tutti gli aplotipi del gruppo TICINO 1 si siano evoluti
dall’aplotipo olandese, importato assieme a materiale vegetale.
Gli aplotipi del gruppo TICINO 2 sono simili all’aplotipo italiano TSWVIT trovato su
pomodoro. TI01TOE potrebbe essere il risultato di due mutazioni dell’isolato italiano, da
cui si differenzia per due nucleotidi e per nessun aminoacido. Analogamente a quanto
detto per il gruppo precedente, è plausibile che tutti gli aplotipi del gruppo TICINO 2 si
siano evoluti da un aplotipo arrivato dall’Italia assieme a materiale vegetale infetto.
Gli aplotipi TI01TOE, TI01TOF e TI01TOG, trovati presso l’Azienda All’Orto nel 2001,
non sono stati rinvenuti in questa ricerca. Erano stati trovati tutti una volta sola in
campioni di pomodoro. Può darsi che essi siano ancora presenti poco frequentemente e
che non sono per questo stati rilevati, oppure è possibile che questi aplotipi siano
effettivamente spariti. Gli aplotipi in questione potrebbero essere scomparsi in seguito ad
un genetic bottleneck, ossia una riduzione improvvisa della densità di popolazione con
conseguente diminuzione della variabilità genetica. Questo fenomeno avviene ad esempio
quando la popolazione ospite è rimossa (raccolta di una coltura) oppure nel caso di eventi
atmosferici che uccidono il patogeno (periodi di gelo o siccità). È possibile che dopo la
raccolta delle colture sia rimasto solamente un aplotipo (TI01TO01) che si è evoluto,
mentre gli altri sono scomparsi o comunque non si sono potuti diffondere come il primo.
Il fatto che un aplotipo sia sopravvissuto mentre gli altri sono spariti può essere legato al
fatto che il primo era presente più frequentemente rispetto agli altri. Inoltre è possibile
che esso sia rimasto nelle malerbe che avrebbero funto da serbatoio mentre gli altri
aplotipi sono stati rimossi assieme alla coltura che li ospitava.
61
Quasi tutti gli aplotipi trovati in questa ricerca stati trovati in un solo campione e tutti si
differenziano fra loro in un numero relativamente basso di nucleotidi. Questo può
indicare che l’evoluzione di TSWV in Ticino è iniziata da poco e che ci si deve aspettare
in futuro una variabilità ancora maggiore nonché la propagazione degli aplotipi già
presenti.
Le sostituzioni nucleotidiche sono nella maggior parte dei casi sinonime (Tab. 26), non
portano quindi ad un cambiamento nell’aminoacido codificato; ciò è dovuto al fatto che il
gene NP codifica una proteina funzionale e non può quindi subire molte modifiche.
L’elevata conservazione di questo gene era stata osservata da Vaira et al. (1995) in isolati
provenienti da regioni geografiche lontane. La conservazione del gene N in altre specie
appartenenti al genere tospovirus era stata segnalata da De Avila et al. (1993).
4.6. APLOTIPI PARTICOLARI
L’evoluzione di cui si è discusso in precedenza è il risultato di sostituzioni di nucleotidi.
Ci sono però anche altri tipi di mutazioni che possono verificarsi nei virus RNA durante
la replicazione, ovvero delezioni ed addizioni. L’aplotipo TI02ME03 risulta dalla
delezione di un pezzo di genoma, come confermato dall’allineamento delle sequenze
nucleotidiche e di quelle aminoacidiche. Anche l’aplotipo TI02LR21 potrebbe essere il
risultato di una delezione di un pezzo più grande di genoma, oppure è possibile che si
tratti di un artefatto PCR.
L’esistenza dell’aplotipo TI02ME03 e quella eventuale di TI02LR21 incrementano la già
elevata variabilità di TSWV in Ticino.
La sequenza TI02LC28 non è esattamente determinata; contiene una N a causa della
presenza di due segnali sovrapposti (C e T) (Fig. 13). Si potrebbe trattare di un’infezione
mista con la presenza degli aplotipi TI01TO01 che contiene una T alla 60esima base e di
un altro aplotipo che non è stato trovato in nessun campione, contenente una C.
4.7. CONCLUSIONI
Il virus è presente in tutte le specie analizzate, piante infestanti e coltura invernale
comprese. L’interruzione nel ciclo delle colture e specialmente l’eliminazione delle
malerbe sono quindi delle misure indispensabili da adottare per ridurre l’inoculo; anche
l’utilizzo di piantine da trapianto sane, l’eliminazione di resti della coltura precedente, la
rimozione immediata di piante infette ed il controllo del trasporto di materiale vegetale
contribuiscono a diminuire l’inoculo. Le malerbe rappresentano, oltre ad un ospite
alternativo del virus, anche un serbatoio di vettori. La sterilizzazione del terreno può
rivelarsi molto utile per eliminare eventuali pupe infette. Le colture infette che non
presentano sintomi possono fungere da serbatoio di virus e rappresentare un’importante
fonte di diffusione del patogeno; da qui si deduce l’importanza del monitoraggio dei
tripidi vettori in modo da attestarne subito la presenza e poter intervenire con metodi di
lotta.
62
4.8. OUTLOOK
4.8.1. COLTURA INVERNALE
Tramite l’analisi dei campioni raccolti il 20.01.’03, vale a dire subito dopo la messa a
dimora della lattuga foglia di quercia, sarebbe possibile stabilire se le piantine erano
esenti dal virus al momento del trapianto o se è stato introdotto nell’Azienda materiale
vegetale infetto da TSWV.
4.8.2. EVOLUZIONE DI TSWV
Per meglio comprendere l’evoluzione di TSWV in Ticino, sarebbe interessante analizzare
dei campioni raccolti presso le altre aziende in cui è stata accertata la presenza del virus.
Questo consentirebbe di stabilire se gli aplotipi trovati a Muzzano sono presenti anche in
altri luoghi, e di trovare eventuali nuovi aplotipi. Ciò permetterebbe di comprendere in
maniera più precisa come avviene la loro distribuzione nelle aziende. In particolare
sarebbe possibile stabilire se c’è stata un’evoluzione anche negli aplotipi del gruppo
TICINO 2.
4.8.3. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
La tecnica ELISA è meno costosa e fornisce risultati più velocemente rispetto a nested
RT-PCR. Esistono dei test (ad esempio il kit AGRI-CHECK® Tospovirus, Bioreba) che
permettono di attestare la presenza di Tospovirus nello spazio di poche ore e sono
utilizzabili anche in campo. L’utilizzo di questa tecnica permetterebbe di stabilire
dapprima quali piante sono infette e di analizzare poi tramite nested RT-PCR solamente
quelle positive, con notevole risparmio di tempo e denaro. Il kit in questione ha lo
svantaggio di segnalare non solo la presenza di TSWV, ma anche di INSV (impatiens
necrotic spot virus), TCSV (tomato chlorotic spot virus) e GRSV (groundnut ringspot
virus). Ci sarebbero quindi dei campioni che risultano positivi tramite ELISA, ma non
tramite RT-PCR. Inoltre questa tecnica è meno sensitiva rispetto alla tecnica PCR; il kit
segnala la presenza del virus solo su piante con sintomi.
63
5. RINGRAZIAMENTI
La realizzazione del lavoro di diploma è stata possibile grazie alla collaborazione ed
all’aiuto di molte persone. Innanzitutto ringrazio Cesare Gessler per avermi proposto il
tema e per avermi offerto la possibilità di svolgere questa ricerca.
Ringrazio in seguito Andrea Patocchi che, in qualità di supervisore scientifico, mi ha
assistita e consigliata.
I motivi per ringraziare Giovanni Broggini sono numerosi: mi ha spiegato e rispiegato le
tecniche di laboratorio, aiutata durante la redazione del lavoro, dato un’infinità di consigli
e suggerimenti, il tutto con molta simpatia e non perdendo quasi mai la pazienza...
Anche la collaborazione di persone esterne al gruppo di fitopatologia è stata
fondamentale: una parte molto importante di campioni è stata raccolta da Mauro
Jermini, cui sono molto grata; ringrazio anche i responsabili dell’Azienda All’Orto, in
particolare Mauro Costantini, per averci permesso di prelevare tutto il materiale
necessario.
Mi sono rivolta spesso anche a Davide Gobbin e a Caterina Matasci alla ricerca di
indicazioni su come proseguire nelle analisi: i miei ringraziamenti vanno anche a loro.
Per concludere sono grata a tutti i componenti del gruppo di fitopatologia per l’ambiente
allegro sia in laboratorio sia fuori.
Evito di elencare le persone che con questo lavoro hanno avuto poco a che fare ma che mi
sono sempre vicine e le ringrazio implicitamente.
64
6. LETTERATURA
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67
7. APPENDICE
Fig. 1A: Azienda All’Orto, Muzzano. Distribuzione delle piante analizzate (grassetto) e delle piante
rivelatesi infette da TSWV (segnalate in rosso). CR: cavolo rapa; LR: lattughino lollo rosso; LB: lattuga
batavia; FQ: lattuga foglia di quercia; LC: lattuga cappuccio.
68
Fig. 2A: Azienda All’Orto, Muzzano. Distribuzione delle piante di lattuga foglia di quercia analizzate
(grassetto) e delle piante rivelatesi infette da TSWV (segnalate in rosso).
69
Tab. 1A: Campioni raccolti nel 2002 e nel 2003 in cui sono stati trovati gli aplotipi di TSWV rinvenuti più
di una volta, elencati secondo la specie. I nomi dei campioni si compongono di una sigla relativa
all’azienda di provenienza (ALL=All’Orto, Muzzano), della data del prelievo (giorno, mese, anno), di
un’abbreviazione della specie e di una numerazione progressiva relativa alla pianta da cui sono stati
raccolti.
Aplotipo/Specie
TI01TO01
CR
FO
LR
ME
LB
FQ
CO
LC
SM
GA
TO
ALL211002CR22
ALL211002FO15
ALL211002LR01
ALL211002 ME01
ALL211002LB01
ALL181002FQ01
ALL141102CO04
ALL181002LC02
ALL131202SM02
ALL141102GA01
ALL141102TO01
ALL211002CR36
ALL211002FO22
ALL211002LR02
ALL211002 ME09
ALL211002LB02
ALL181002FQ02
ALL141102CO08
ALL181002LC03
ALL131202SM03
ALL141102GA02
ALL141102TO03
ALL211002CR37
ALL211002FO24
ALL211002LR03
ALL211002 ME17
ALL211002LB03
ALL181002FQ06
ALL141102CO09
ALL181002LC04
ALL131202SM04
ALL141102GA03
ALL141102TO04
ALL211002LR04
ALL211002 ME19
ALL211002LB08
ALL181002FQ07
ALL141102CO10
ALL181002LC07
ALL131202SM07
ALL141102GA04
ALL141102TO05
ALL211002LR18
ALL211002 ME24
ALL211002LB09
ALL181002FQ14
ALL141102CO11
ALL181002LC08
ALL131202SM08
ALL141102GA05
ALL141102TO08
ALL211002LR23
ALL211002ME07
ALL211002LB10
ALL181002FQ15
ALL141102CO15
ALL181002LC09
ALL131202SM13
ALL141102GA06
ALL141102TO09
ALL211002LR24
ALL211002ME15
ALL211002LB11
ALL181002FQ18
ALL141102CO17
ALL181002LC10
ALL131202SM14
ALL141102GA07
ALL141102TO10
ALL211002LR31
ALL211002ME16
ALL211002LB15
ALL181002FQ19
ALL141102CO18
ALL181002LC14
ALL131202SM17
ALL141102GA04b
ALL141102TO12
ALL211002LB16
ALL181002FQ21
ALL141102CO23b
ALL181002LC15
ALL131202SM20
ALL141102GA10
ALL211002LB19
ALL181002FQ22
ALL181002LC17
ALL141102SM01
ALL141102GA11
ALL211002LB22
ALL181002FQ23
ALL181002LC19
ALL141102SM02
ALL141102GA12
ALL211002LB36
ALL181002FQ24
ALL181002LC20
ALL141102GA13
ALL181002FQ26
ALL181002LC21
ALL141102GA15
ALL181002FQ29
ALL181002LC22
ALL141102GA16
ALL181002FQ30
ALL181002LC23
ALL141102GA17
ALL181002FQ32
ALL181002LC24
ALL181002FQ33
ALL181002LC26
ALL181002FQ39
ALL181002LC27
ALL240203FQ01
ALL181002LC28
ALL240203FQ09
ALL181002LC30
ALL240203FQ31
ALL181002LC37
ALL240203FQ42
ALL181002LC40
ALL211002LR33
TI02ME02
ALL211002 ME20
ALL211002 ME35
ALL211002 ME38
TI02FO08
ALL211002FO11
ALL141102GA08
CR: cavolo rapa; FO: formentino; LR: lattughino lollo rosso; ME: melanzane; LB: lattuga batavia; FQ: lattuga foglia di quercia; CO:
coste; LC: lattuga cappuccio; SM: S. media; GA: Galinsoga sp.; TO: pomodoro
Tab. 2A: Campioni raccolti nel 2002 e nel 2003 in cui sono stati trovati gli aplotipi di TSWV rinvenuti una
volta sola. I nomi dei campioni si compongono di una sigla relativa all’azienda di provenienza
(ALL=All’Orto, Muzzano), della data del prelievo (giorno, mese, anno), di un’abbreviazione della specie e
di una numerazione progressiva relativa alla pianta da cui sono stati raccolti.
Aplotipo
TI02ME03
TI02ME04
TI02CR05
TI02CR06
TI02CR07
TI02FO09
TI02FO10
TI02SM11
TI02CO12
Campione
ALL211002ME23
ALL211002ME11
ALL211002CR26
ALL211002CR24
ALL211002CR28
ALL211002FO30
ALL211002FO13
ALL131202SM12
ALL141102CO05
Aplotipo
TI02CO13
TI02CO14
TI02CO15
TI02CO16
TI02LR17
TI02LR18
TI02LR19
TI02LR20
TI02LR21
Campione
ALL141102CO13
ALL141102CO07
ALL141102CO20
ALL141102CO21
ALL211002LR08
ALL211002LR07
ALL211002LR09
ALL211002LR20
ALL211002LR21
Aplotipo
TI02LR22
TI02LB23
TI02FQ24
TI02FQ25
TI02FQ26
TI02FQ27
TI02LC28
TI03FQ29
TI03FQ30
Campione
ALL211002LR22
ALL211002LB05
ALL181002FQ34
ALL181002FQ38
ALL181002FQ08
ALL181002FQ10
ALL181002LC05
ALL240203FQ14
ALL240203FQ19
CR: cavolo rapa; FO: formentino; LR: lattughino lollo rosso; ME: melanzane; LB: lattuga batavia; FQ: lattuga foglia di quercia; CO:
coste; LC: lattuga cappuccio; SM: S. media; GA: Galinsoga sp.; TO: pomodoro
70
TSW V10
TSW VGAGC
TSW VGAMC
53 TSW VGAPP
64 TSW VGAWC
61
TSWVGACC
TSW VGAPT
TSWVGATC
56
TSW VGAAC
TSWVGATO
TSWV10W
5383
TSWVH
56
TSWVBL
TSW VHI
Spain
84
86 TSW VIT
TI01TOE
TI02LEM
60 61
99 TI01TOB
TSW VBR01
JAP
TOSPOG
62
TOSPOC
95
980472
TSW VL3
GD98
Bulg97
55
BS97
8Hip9612
67 20Da961
LE98/257
TI01TOG
TI01TOF
60 TI02LEI
73 TI01TOC
TI02LR22
TI02SM11
60 TI02LB23
TI02FQ27
TI02LC28
TI02FQ24
TSWVD
TI02FO10
TI02LR20
TI02LEL
55 TI02ME02
TI02LR18
TI02ME04
TI01TO01
TI02CR07
TI02FO08
TI02CR05
TI03FQ29
TI02FQ25
64 TI03FQ30
TI02TOH
C27084
TI02CR06
TI02LR17
TI02CO16
TI02FO09
TI02LR19
TI02CO14
TI02FQ26
100 TI02CO13
TI02CO15
TI02CO12
TI02ME03
TI02LR21
0.05
Fig. 3A: Dendogramma basato sulle sequenze nucleotidiche del gene NP di TSWV di tutti gli aplotipi
ticinesi e di 30 sequenze pubblicate in GenBank. I valori posti sopra i rami sono percentuali generate dalla
statistica bootstrap su un totale di 1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza
filogenetica.
71
TSWVGAPT
TSWVGATC
TSWV10
TSW VGAPP
TSWVGAGC
TSWVGAAC
51 TSWVGAW C
TSWVGAMC
TSW VGACC
TSW VGATO
65
TSWVIT
TI01TOE
TI02LEM
95 TI01TOB
TSW VHI
54
TSWVH
89 TSW VBL
67 TSW V10W
Spain
TSW VBR01
JAP
TOSPOG
TOSPOC
51
Bulg97
BS97
8Hip9612
20Da961
TSWVL3
980472
GD98
LE98/257
TI01TOG
TI01TOF
TI02LEI
68 TI01TOC
TI02FO10
TI03FQ30
TI03FQ29
TI02FQ27
TI02ME04
TI02LR18
TI02FQ25
TI01TO01
TI02CO14
TI02CR07
TI02TOH
TSWVD
TI02FQ24
TI02FO08
TI02CR05
C27084
TI02LR20
TI02LEL
61 TI02ME02
TI02LR22
TI02LC28
TI02FQ26
TI02CO15
TI02CO16
TI02LR19
TI02FO09
TI02CR06
TI02LR17
TI02SM11
100
TI02LB23
TI02CO13
TI02CO12
TI02ME03
TI02LR21
0.05
Fig. 4A: Dendogramma basato sulle sequenze aminoacidiche del gene NP di TSWV degli aplotipi ticinesi
e di 30 sequenze pubblicate in GenBank. I valori posti sopra i rami sono percentuali generate dalla statistica
bootstrap su un totale di 1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza filogenetica.
72
Tab. 3A: Posizione e aminoacidi sostituiti negli aplotipi di TSWV trovati in Ticino.
Posizione dell'aminoacido sostituito/Aminoacido più frequente
Aplotipo
3
5
8
9
13
28
29
37
38
47
49
59
68
78
96
TI01TO01
I
K
V
I
T
S
D
I
K
T
M
R
N
K
K
112 119 137 145 158 170
A
M
I
R
K
G
TI02ME02
TI02ME04
TI02CR05
TI02CR06
T
TI02CR07
G
TI02FO08
TI02FO09
G
TI02FO10
E
TI02SM11
TI02CO12
A
R
TI02CO13
R
G
R
TI02CO14
R
TI02CO15
TI02CO16
V
TI02LR17
T
TI02LR18
TI02LR19
E
TI02LR20
G
TI02LR22
E
TI02LB23
TI02FQ24
TI02FQ25
TI02FQ26
A
TI02FQ27
TI02LC28*
TI03FQ29
N
TI03FQ30
TI01TOB
R
TI01TOC
TI01TOE
TI01TOF
TI01TOG
I
TI02TOH
D
S
V
R
TI02LEI
TI02LEL
TI02LEM
Q
R
E
*La base incerta di TI02LC28 non influisce sulla sua composizione aminoacidica, che resta in entrambi i
casi (base C o T) identica a quella di TI01TO01.
73