Studio dello svernamento di Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) e della sua incidenza su diverse colture orticole in una serra del Canton Ticino Lavoro di diploma Dafne Gianettoni Novembre 2002 – Aprile 2003 Institute of Plant Sciences Referente: Plant Pathology Group Supervisori scientifici: Swiss Federal Institute of Technology Zurich Dr. Cesare Gessler Dr. Andrea Patocchi Giovanni Broggini RIASSUNTO ..................................................................................................................... 3 ABSTRACT....................................................................................................................... 4 1. INTRODUZIONE..................................................................................................... 5 1.1. CENNI STORICI ................................................................................................ 5 1.2. DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA.................................................................... 5 1.3. LA SITUAZIONE NEL CANTON TICINO ...................................................... 7 1.4. IMPORTANZA ECONOMICA ......................................................................... 9 1.5. IL VIRUS .......................................................................................................... 10 1.5.1. TASSONOMIA ............................................................................................ 10 1.5.2. BIOLOGIA ................................................................................................... 11 1.6. PIANTE OSPITI ............................................................................................... 12 1.7. SINTOMATOLOGIA....................................................................................... 13 1.7.1. SINTOMI SU POMODORO (Lycopersicon esculentum)............................ 13 1.7.2. SINTOMI SU MELANZANA (Solanum melongena) ................................. 14 1.7.3. SINTOMI SU LATTUGA (Lactuca sativa)................................................. 14 1.7.4. SINTOMI SU MALERBE............................................................................ 14 1.8. TRASMISSIONE DEL VIRUS ........................................................................ 15 1.8.1. INSETTI VETTORI ..................................................................................... 15 1.8.1.1. F. OCCIDENTALIS PERGANDE....................................................... 16 1.8.1.2. T. TABACI LINDERMAN.................................................................... 17 1.8.2. ALTRI MODI DI TRASMISSIONE............................................................ 17 1.9. METODI DI LOTTA ........................................................................................ 18 1.9.1. RIDUZIONE DELL’INOCULO .................................................................. 18 1.9.2. CONTROLLO DEI VETTORI..................................................................... 18 1.9.3. PIANTE RESISTENTI A TSWV................................................................. 19 1.10. EVOLUZIONE DEI VIRUS............................................................................. 19 1.11. EVOLUZIONE DI TSWV................................................................................ 20 1.12. ANALISI FILOGENETICHE .......................................................................... 20 1.13. SCOPI DEL LAVORO ..................................................................................... 21 2. MATERIALE E METODI..................................................................................... 22 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 2.6. 2.7. 2.8. 2.9. 2.10. 2.11. 2.12. 2.13. 2.14. PRELIEVO DEI CAMPIONI ........................................................................... 22 ESTRAZIONE DI RNA.................................................................................... 24 SINTESI DI CDNA ........................................................................................... 25 AMPLIFICAZIONE SPECIFICA TRAMITE PCR ......................................... 26 NESTED PCR.................................................................................................... 27 GEL ELETTROFORESI DEL PRODOTTO PCR ........................................... 27 PURIFICAZIONE DEL PRODOTTO PCR ..................................................... 28 QUANTIFICAZIONE DEL PRODOTTO PCR ............................................... 28 CYCLE SEQUENCING..................................................................................... 28 PURIFICAZIONE DEI PRODOTTI DI CYCLE SEQUENCING..................... 29 SEQUENZIAMENTO...................................................................................... 29 ELABORAZIONE DEGLI ELETTROFEROGRAMMI ................................. 29 ALLINEAMENTO DELLE SEQUENZE ........................................................ 30 ANALISI FILOGENETICHE .......................................................................... 30 1 3. RISULTATI............................................................................................................. 31 3.1. INCIDENZA DI TSWV IN OTTO COLTURE ORTICOLE ........................... 31 3.2. INCIDENZA DI TSWV IN UNA COLTURA INVERNALE.......................... 33 3.3. PIANTE INFESTANTI .................................................................................... 34 3.4. SEQUENZE DEI CAMPIONI ANALIZZATI ................................................. 36 3.5. APLOTIPI......................................................................................................... 37 3.6. ANALISI FILOGENETICHE .......................................................................... 40 3.6.1. VARIABILITÀ DELLE SEQUENZE ......................................................... 41 3.6.1.1. SEQUENZE TROVATE DURANTE QUESTA RICERCA ............... 41 3.6.1.2. SEQUENZE DI TUTTI GLI ISOLATI TICINESI .............................. 42 3.6.1.3. CONFRONTO TRA SEQUENZE TICINESI E SEQUENZE PUBBLICATE...................................................................................................... 43 3.6.2. DENDOGRAMMI BASATI SULLE SEQUENZE NUCLEOTIDICHE.... 46 3.6.2.1. SEQUENZE TROVATE DURANTE QUESTA RICERCA ............... 46 3.6.2.2. SEQUENZE DI TUTTI GLI ISOLATI TICINESI .............................. 46 3.6.2.3. CONFRONTO TRA SEQUENZE TICINESI E SEQUENZE PUBBLICATE...................................................................................................... 46 3.6.3. DENDOGRAMMI BASATI SULLE SEQUENZE AMINOACIDICHE ... 50 3.6.3.1. SEQUENZE TROVATE DURANTE QUESTA RICERCA ............... 50 3.6.3.2. SEQUENZE DI TUTTI GLI ISOLATI TICINESI .............................. 50 3.6.3.3. CONFRONTO TRA SEQUENZE TICINESI E SEQUENZE PUBBLICATE...................................................................................................... 50 3.6.4. APLOTIPI PARTICOLARI ......................................................................... 54 4. DISCUSSIONE ....................................................................................................... 56 4.1. INCIDENZA DI TSWV IN OTTO COLTURE ORTICOLE ........................... 56 4.2. TSWV IN UNA COLTURA INVERNALE ..................................................... 57 4.3. PIANTE INFESTANTI COME SERBATOIO DI TSWV................................ 58 4.4. FREQUENZA E DISTRIBUZIONE DEGLI APLOTIPI DI TSWV................ 59 4.5. EVOLUZIONE DI TSWV IN TICINO............................................................. 60 4.6. APLOTIPI PARTICOLARI.............................................................................. 62 4.7. CONCLUSIONI ............................................................................................... 62 4.8. OUTLOOK ....................................................................................................... 63 4.8.1. COLTURA INVERNALE............................................................................ 63 4.8.2. EVOLUZIONE DI TSWV ........................................................................... 63 4.8.3. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) ............................................ 63 5. RINGRAZIAMENTI.............................................................................................. 64 6. LETTERATURA .................................................................................................... 65 7. APPENDICE ........................................................................................................... 68 2 RIASSUNTO La malattia causata da Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) provoca ingenti danni alle numerose colture sensibili. In Ticino i sintomi dell’avvizzimento maculato del pomodoro sono stati osservati per la prima volta nel 1997. Da allora il virus è stato rilevato in diverse aziende ed è divenuto un grave problema nelle colture orticole del Cantone. Per sviluppare una strategia di lotta basata su una miglior conoscenza della diffusione del patogeno, della sua presenza in diverse colture, del suo luogo di svernamento e del modo con cui è importato nelle colture, e basandosi su una ricerca svolta nel 2002 (Matasci, 2002) sono stati fissati gli scopi seguenti per questo lavoro: stabilire l’incidenza di TSWV in otto colture orticole, testarne la presenza in una coltura invernale, valutare l’importanza delle malerbe come serbatoio del virus e valutare l’evoluzione di TSWV in Ticino. Sono stati analizzati 263 campioni di foglia di undici specie ospiti del virus: cavolo rapa, coste, formentino, Galinsoga sp., lattuga batavia, lattuga cappuccio, lattuga foglia di quercia, lattughino lollo rosso, melanzane, pomodori e Stellaria media; tutti i campioni sono stati prelevati in un’azienda di Muzzano presso la quale era stata accertata in precedenza la presenza del virus. Cavolo rapa, formentino, lattughino lollo rosso, melanzane, S. media e lattuga foglia di quercia (messa a dimora durante l’inverno) non presentavano sintomi. Le analisi sono state eseguite tramite estrazione di RNA, sintesi di cDNA e successiva amplificazione tramite nested PCR del gene NP, il gene virale che codifica la proteina nucleocapsidica. L’incidenza del virus nelle colture orticole prese in considerazione si è rivelata elevata; nessuna ne era esente, a conferma dell’elevata polifagia di TSWV. Le percentuali di infezioni variano dal 25 % al 100 %. Anche nella coltura messa a dimora durante il periodo invernale, ovvero quando i tripidi vettori del virus sono attivi in misura ridotta, è stata rilevata la presenza di TSWV (19,5 % di campioni infetti). Pure le piante infestanti analizzate si sono rivelate infette, a riprova della loro possibile funzione come serbatoio per il virus; le percentuali di campioni positivi variano dal 63,6 % al 100 %. Tramite il sequenziamento di 154 prodotti RT-PCR sono stati individuati 30 aplotipi di TSWV: in Ticino è presente un’elevata diversità genetica. 29 aplotipi sono nuovi; uno, il più frequente in tutte le specie, era già stato trovato nell’azienda di Muzzano ed in altre due aziende ticinesi (a Stabio e a Novazzano). Eseguendo le analisi filogenetiche si è potuta osservare una probabile evoluzione dall’aplotipo più frequente che potrebbe aver generato tutti i nuovi aplotipi, con un numero ridotto di sostituzioni nucleotidiche e aminoacidiche. Il confronto degli aplotipi presenti sul territorio cantonale con le sequenze pubblicate in GenBank (confronto effettuato con sequenze di 513 nucleotidi), ha permesso di situare gli aplotipi ticinesi in due gruppi: uno è simile ad isolati provenienti dall’Olanda e dalla Repubblica Ceca; l’altro è vicino ad un isolato italiano. Questo lascia ipotizzare una correlazione tra il Paese di provenienza delle piantine acquistate (Olanda ed Italia) e gli aplotipi presenti in origine, dai quali sarebbero stati generati tutti gli altri presenti nell’azienda considerata. 3 ABSTRACT Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) has become an increasing problem as a result of significant economic losses in many agronomic and ornamental crops worldwide. The virus was detected in Ticino for the first time in 1997 and has become an important problem in many horticultural cultures. The aims of this study were to investigate the incidence of TSWV in eight cultures, to verify its presence in a winter cultivated culture, to test the importance of infesting weeds as reservoirs of virus and to determine the genetic diversity of TSWV in Ticino. Cabbage, eggplant, lettuce (four varieties), swiss chard, Valerianella locusta, tomato (as infesting weed in other cultures), Galinsoga sp. and Stellaria media leafs were sampled from October 2002 to February 2003. The samples were taken from a greenhouse in Muzzano where the virus was present during 2000 and 2001. Total RNA of 263 samples was extracted and the nucleoprotein gene (NP) was amplified by nested RT-PCR with specific primers. RT-PCR products were sequenced. Nested RT-PCR testing showed that TSWV was present in all the species, infecting a high percentage of plants (166 samples): 68,2 % of the samples of eight cultures, 19,5 % of the plants cultivated during the winter and 82,6 % of the weeds were infected. Plants without symptoms were also infected. The infected plants were randomly distributed in the field; it is hypothesized that vector insects coming from outside were responsible for the primary infection. The infesting weeds can act as reservoirs from which the virus can spread to susceptible crops. 30 haplotypes were detected by sequencing 154 RT-PCR products; 29 haplotypes are new, one was previously discovered on the same greenhouse. This one is the more frequent in all the species. Strong similarities were found between the 30 haplotypes by comparison of the nucleotide sequences. The 29 new haplotypes could have been generated by mutation from the haplotype which was previously present. Comparison of amino acid sequences showed lower variability: the most substitutions are synonymous. 4 1. INTRODUZIONE 1.1. CENNI STORICI I sintomi della malattia causata da Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) furono osservati per la prima volta nel 1915 su piante di pomodoro nello stato di Victoria, in Australia (Brittlebank, 1919). L’autore denominò la malattia spotted wilt of tomato. La prima indicazione di un virus quale agente causale della malattia, fu riportata da Samuel et al. (1930) che diede alla malattia il nome tomato spotted wilt virus. In Europa il virus fu osservato per la prima volta nel 1931 in Gran Bretagna (Smith, 1932). Dopo la seconda guerra mondiale TSWV perse d’importanza in Europa, probabilmente perché il vettore Thrips tabaci era presente in quantità relativamente debole. Il tripide californiano Frankliniella occidentalis, vettore molto efficiente del virus, iniziò a diffondersi verso il 1980 ed è attualmente presente in tutte le zone europee e del mediterraneo. La diffusione di TSWV in Europa è associata all’introduzione ed in seguito all’espansione di questo vettore (EPPO, 2001). Nel 1987 la malattia riapparve quindi in Francia su peperone (Gebre-Selassie et al., 1989) e nei Paesi Bassi su pomodoro (Stijger et al., 1989). In seguito fu segnalata in Inghilterra (Barker, 1989), in Italia (Bellardi & Vicchi, 1990), in Portogallo (Louro, 1990) ed in Spagna (Jordá & Osca, 1991). Nel 1994, nel Canton Vaud, fu fatta la prima osservazione del virus in Svizzera (OCVCM, 1996). Il TSWV o virus della bronzatura del pomodoro, detto anche avvizzimento maculato del pomodoro, è dichiarato dall’EPPO (European and Mediterranean Plant Protection Organization) organismo di quarantena. 1.2. DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA Il virus TSWV è presente in tutte le regioni temperate e subtropicali del pianeta (Fig. 1); è stato segnalato in Asia, Africa, America, Europa ed Oceania. Prima della seconda guerra mondiale era considerato in molte regioni il virus più pericoloso, in particolare per quel che riguarda i pomodori (Gebre-Selassie, 1989). Nelle zone europee e mediterranee è presente in Algeria, Austria, Belgio, Bulgaria, Cechia, Croazia, Cipro, Egitto, Francia, Germania, Gran Bretagna, Grecia, Irlanda, Israele, Italia (Sicilia inclusa), Libia, Lituania, Malta, Marocco (non confermato), Moldavia, Norvegia (in via d’eradicazione), Polonia, Portogallo, Romania, Russia, Slovacchia, Spagna (Isole Canarie incluse), Svezia, Svizzera, Tunisia (non confermato), Turchia, Ucraina, Ungheria e Yugoslavia. È stato debellato in Danimarca e Finlandia (EPPO, 2001). 5 Fig. 1: Distribuzione geografica di TSWV (EPPO/CABI, 1998). 6 1.3. LA SITUAZIONE NEL CANTON TICINO Nel 1997 si è verificato a Tenero (Fig. 2, azienda 1) il primo ritrovamento di TSWV in Ticino, su pomodoro di provenienza olandese (Pedrinis, 1998). Nel 1999 il virus è stato rilevato a Coldrerio (Fig. 2, azienda 2) su lattuga proveniente dall’Italia. Nel 2000 ha fatto la sua apparizione in tre aziende orticole. A Coldrerio è stato segnalato su lattuga a cappuccio e su pomodoro provenienti dall’Italia. In un’azienda orticola di Muzzano (Fig. 2, azienda 3) TSWV ha infettato una serra coltivata con pomodori di provenienza olandese ed è stato rinvenuto anche su lattuga cappuccio, su batavia rossa e su batavia verde. Il virus è stato ritrovato anche in un’azienda orticola di Stabio (Fig. 2, azienda 4) in tunnel coltivati con pomodori di provenienza italiana (Pedrinis, 2001). Nel 2001 sono state colpite quattro aziende: quelle a Stabio e Muzzano già colpite nel 2000 e due nuove aziende, una ad Iragna (Fig. 2, azienda 5) e l’altra a Novazzano (Fig. 2, azienda 6). L’orticoltore dell’azienda di Coldrerio colpita nel 2000 ha abbandonato l’attività orticola; non si hanno quindi informazioni sull’evoluzione della situazione in quest’azienda. Nell’azienda di Stabio il virus è stato ritrovato in due tunnel su alcune piante di lattuga e su quasi tutte quelle di pomodoro, proveniente dalla Sicila. A Muzzano il virus è stato riscontrato su pomodoro, anche in questo caso proveniente dalla Sicilia, ma fornito da una ditta diversa. Pure nelle aziende di Iragna e Novazzano il virus è stato rilevato su pomodoro. Le piantine dell’azienda nel Sopraceneri provenivano dall’Olanda, mentre quelle dell’azienda nel Sottoceneri dall’Italia. Nel 2002 il virus è stato rilevato in una seconda azienda di Novazzano (Fig. 2, azienda 7) su colture di lattuga e lattuga foglia di quercia provenienti dall’Olanda, nell’azienda di Muzzano già colpita negli anni precedenti su una pianta di pomodoro proveniente dalla Sicilia, e su pomodoro nell’azienda di Stabio (Matasci, 2002). Fig. 2: Localizzazione delle aziende orticole colpite da TSWV nel canton Ticino, tra il 1997 ed il 2002 (Matasci, 2002). 1: Tenero, primo e unico rilevamento nel 1997. 2: Coldrerio, primo rilevamento nel 1999. 3: Muzzano, primo rilevamento nel 2000. 4: Stabio, primo rilevamento nel 2000. 5: Iragna, primo rilevamento nel 2001. 6: Novazzano (Brusata), primo rilevamento nel 2001. 7: Novazzano, primo rilevamento nel 2002. 7 In Ticino è presente un’elevata variabilità genetica di TSWV: nei campioni prelevati in cinque aziende nel corso di due anni (2001 e 2002) sono stati individuati 11 aplotipi. Gli aplotipi rinvenuti nel materiale raccolto nel 2002 sono in alcuni casi identici a quelli dell’anno precedente ed in altri casi variano per un numero ridotto di sostituzioni nucleotidiche; ciò può indicare un’evoluzione degli aplotipi già presenti nel 2001 dai quali deriverebbero quelli del 2001 (Matasci, 2002). In Tab. 1 sono presentati i diversi aplotipi di TSWV trovati in Ticino nel 2002 ed è indicato in quanti campioni ed in quante aziende essi sono stati rilevati. Il nome dei diversi aplotipi si compone della sigla del canton Ticino (TI), dell’anno in cui l’aplotipo è stato trovato per la prima volta, della coltura (TO = pomodoro, LE = lattuga) e di un’indicazione partendo dalla lettera A. Gli aplotipi TI01TOA e TI01TOD risultano identici nel confronto di 518 nucleotidi; considerando le sequenze più lunghe (638 nucleotidi) sono invece distinguibili. La sequenza TI02LEL non è esattamente determinata data la presenza di tre sostituzioni dubbie. La mutazione che rende l’aplotipo TI02LEM differente da TI01TOB non è sicura. Tab. 1: Aplotipi di TSWV presenti in Ticino, totale dei campioni e delle aziende in cui sono stati rilevati nel 2002. Aplotipo Totale campioni Totale aziende TI01TOA TI01TOB TI01TOC TI01TOD TI01TOE TI01TOF TI01TOG TI02TOH TI02LEI TI02LEL* TI02LEM** 2 (0) 1 7 (8) 2 15 10 (12) 1 1 1 2 1 1 1 1 (0) 2 1 2 3 3 1 1 2 1 1 1 1 1 Tra parentesi il numero di campioni se si considera TI01TOD uguale a TI01TOA (identico nel confronto di 518 nucleotidi) 2 Tra parentesi il numero di campioni se si considera inesistente la mutazione che rende TI02LEM diverso da TI01TOB * sequenza non esattamente determinata data la presenza di tre sostituzioni dubbie ** esistenza non certa dell’aplotipo data la presenza di una mutazione non certa 8 1.4. IMPORTANZA ECONOMICA L’impatto economico di TSWV è enorme. La grave sintomatologia, l’elevato numero di specie sensibili, la grande polifagia degli insetti vettori e i limiti della difesa sia chimica sia biologica contro di essi, sono gli aspetti che rendono i tospovirus un problema di difficile risoluzione (Vicchi, 1999). A questi fattori si aggiunge la vasta distribuzione geografica della malattia. I danni arrecati alle colture sono ingenti e possono determinare la perdita dell’intero raccolto, come riportato da Berling et al. (1992) per lattuga, peperoni e melanzane (Fig. 3). Le perdite causate annualmente da TSWV a livello mondiale superano il miliardo di dollari (Galitelli & Davino, 1998; Adkins, 2000). Esso è reputato fra i dieci virus maggiormente distruttivi dal punto di vista economico (Adkins, 2000). Fig. 3: Perdite dovute a TSWV in un tunnel di Muzzano (2002). 9 1.5. IL VIRUS 1.5.1. TASSONOMIA TSWV appartiene al genere Tospovirus (famiglia Bunyaviridae) ed è un tipico esempio di virus polifago. La famiglia Bunyaviridae comprende cinque generi: Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus e Tospovirus. Quest’ultimo è l’unico a comprendere patogeni di vegetali (Heinze et al., 2001); agli altri quattro generi appartengono infatti solo virus animali. Il genere Tospovirus è suddiviso in due sierogruppi: Tomato spotted wilt e Watermelon silver mottle; entrambi contengono tre specie. Non sono raggruppate in nessun sierogruppo sette ulteriori specie (Tab. 2). Tab. 2: Suddivisione del genere Tospovirus: specie ed abbreviazioni dei virus appartenenti ai diversi sierogruppi (Moyer, 2000). Sierogruppo Tomato spotted wilt Watermelon silver mottle Ungrouped Specie Tomato spotted wilt virus Groundnut ringspot virus Tomato chlorotic spot virus Watermelon silver mottle virus Watermelon bud necrosis virus Groundnut bud necrosis virus Impatiens necrotic spot virus Chrysanthemum stem necrosis virus Iris yellow spot virus Peanut chlorotic fan-spot virus Peanut yellow spot virus Physalis severe mottle virus Zucchini lethal chlorosis virus Abbreviazione TSWV GRSV TCSV WSMV WBNV GBNV INSV CNSV IYSV PCFV PYSV PSMV ZLCV 10 1.5.2. BIOLOGIA Le particelle virali di TSWV sono sferiche, con un diametro di 70-110 nm, e possiedono una membrana lipidica coperta da glicoproteine, chiamate G1 (78K) e G2 (58K). Il genoma virale consiste in tre segmenti lineari di RNA a singolo filamento (ssRNA), chiamati in base alle loro dimensioni: S (small, 2,9 kb), M (medium, 4,8 kb) e L (large, 8,9 kb). I segmenti di RNA sono incapsulati da numerose copie della proteina N (nucleocapside) (de Ávila et al., 1993). Il filamento L RNA, della lunghezza di 8897 nucleotidi, codifica la proteina L (331,5K), una trascrittasi inversa. I filamenti S e M RNA hanno strategia codificante ambisense. S RNA (2916 nucleotidi) codifica la proteina nucleocapsidica N (29K) in viral complementary sense ed una proteina non strutturale (NSs, 52,4K) in viral sense (Kormelink et al., 1992). M RNA (4821 nucleotidi) codifica un precursore delle due glicoproteine G1 e G2 in viral complementary sense ed un’altra proteina non strutturale (NSm, 34K) in viral sense (de Ávila et al., 1993) (Fig. 4). Fig. 4: Rappresentazione tridimensionale di una particella di TSWV (http://www.unb.br/ib/cel/nvme/linha1.htm). Il genoma consiste in tre segmenti a singolo filamento: S (small), M (medium) e L (large). G1 e G2: glicoproteine; N: proteina nucleocapsidica; NSs: proteina non strutturale codificata dal segmento S; NSm: proteina non strutturale codificata dal segmento M. 11 1.6. PIANTE OSPITI Il virus, caratterizzato da elevata polifagia, infetta piante d’interesse orticolo e floricoloornamentale, siano esse dicotiledoni o monocotiledoni, tra cui solanacee, composite, leguminose e crucifere (Vicchi, 1999) (Tab. 3). È capace di infettare più di 650 specie vegetali appartenenti a 45 famiglie botaniche (Gallitelli & Davino, 1998). Nell’epidemiologia di TSWV, le piante infestanti o appartenenti alla flora spontanea possono avere un ruolo importante per la capacità di fungere da serbatoio di virus (Grieco et al., 2000). Queste erbe giocano un ruolo fondamentale durante i mesi invernali, durante i quali non sono disponibili colture sensibili al virus ed i tripidi vettori non sono particolarmente attivi. Da un esperimento svolto da Groves et al. (2001) risulta che il 75% delle piante di Stellaria media e Sonchus annuus mantengono l’infezione di TSWV durante l’inverno. Tab. 3: Specie orticole ed industriali, piante infestanti ed appartenenti alla flora spontanea, e piante ornamentali ospiti di TSWV. Specie orticole ed industriali Carciofo (Cynara scolymus) 1 Cavolo (Brassica oleracea) 2 Cavolo rapa (B. oleracea var. gongyloides) 3 Cicoria (Cichorium spp.) 1 Cocomero, melone, anguria e altre Cucurbitaceae 1 Costa (Beta vulgaris var cicla) 2 Fava (Vicia faba) 1 Formentino (Valerianella locusta syn V. olitoria) 2 Lattuga (Lactuca sativa) 1 Melanzana (Solanum melongena) 1 Patata (Solanum tuberosum) 1 Peperone (Capsicum annuum) 1 Pomodoro (Lycopersicon esculentum) 1 Tabacco (Nicotiana tabacum) 1 Piante infestanti e flora spontanea Amaranthus spp., Conyza bonariensis, Galinsoga spp., Polygonum lapathifolium, Portulaca oleracea, Senecio vulgaris, Solanum nigrum, Sonchus spp., Stellaria media, Taraxacum officinale 1 Cardamine sp., Poa annua, Urtica sp., Veronica sp. 2 Artemisia vulgaris, Capsella bursa-pastoris, Chenopodium album, Cirsium arvense, Convolvulus arvense, Galium aparine, Rumex sp. 3 Lamium sp., Trifolium sp. 4 Piante ornamentali Alstroemeria, Anemone, Antirrhinum, Araceae, Aster, Begonia, Bouvardia, Calceolaria, Callistephus, Celosia, Cestrum, Columnea, Cyclamen, Dahlia, Dendranthema x grandiflorum, Eustoma, Fatsia japonica, Gazania, Gerbera, Gladiolus, Hydrangea, Impatiens, Iris, Kalanchoe, Leucanthemum, Limonium, Pelargonium, Ranunculus, Saintpaulia, Senecio cruentus, Sinningia, Tagetes, Verbena, Vinca, Zinnia 1 1 EPPO, 2001 Marchoux et al., 2000 3 Mertelík et al., 1998 4 Chatzivassiliou et al., 2001 2 12 1.7. SINTOMATOLOGIA I sintomi manifestati dalle numerose specie sensibili a TSWV sono estremamente vari e diversificati e possono essere facilmente confusi con quelli provocati da funghi, batteri o da fitotossicità. I sintomi consistono in nanismo, decolorazioni e mosaicature fogliari, anulature spesso concentriche con necrosi su foglie e frutti, deformazioni e decolorazioni dei petali, maculature necrotiche, malformazioni ed anulature concentriche sui frutti. Le alterazioni descritte sono influenzate dal momento in cui avviene l’infezione, dalla specie interessata e da fattori ambientali, in particolare dalla temperatura (Vicchi, 1999). Anche l’isolato virale e lo stadio di sviluppo della pianta al momento dell’infezione condizionano il decorso della malattia (Rosselló, 1996). La necrosi inizia, spesso sulle foglie più giovani, sottoforma di piccolissime punteggiature che, allargandosi e confluendo, interessano parti consistenti della foglia (Gallitelli, 1998). 1.7.1. SINTOMI SU POMODORO (Lycopersicon esculentum) Su pomodoro la progressiva confluenza delle aree necrotiche porta alla formazione del caratteristico sintomo definito “bronzatura” (Gallitelli, 1998) (Fig. 5). I sintomi, che interessano foglie e frutti con relativa perdita della produzione, compaiono sulla parte apicale della pianta con conseguente arresto di crescita ed accartocciamento, verso l’alto o verso il basso, della foglia. Le più giovani assumono un tipico colore bronzeo mentre su quelle basali appaiono tacche necrotiche. Se la pianta è giovane si assiste alla sua morte precoce; se invece è più vecchia rimane avvizzita (Vicchi, 1999). A B C Fig. 5: A: Aree decolorate su frutti maturi. B e C: Sintomi di bronzatura su foglie di pomodoro (Fonti: A e B: Servizio fitosanitario cantonale, 2001. C: www.clemson.edu/ipm/tswv.htm#symptoms). 13 1.7.2. SINTOMI SU MELANZANA (Solanum melongena) I principali sintomi su melanzana sono delle macchie clorotiche sulla foglia e una forte alterazione della crescita (Marchoux et al., 2000). I frutti appaiono malformati da escrescenze di forma rotondeggiante, spesso circondate da aloni necrotici (Gallitelli & Davino, 1998). 1.7.3. SINTOMI SU LATTUGA (Lactuca sativa) La lattuga ed altre composite (indivia, cicoria, scarola, carciofo) presentano necrosi più o meno estese sulla vegetazione giovane (Fig. 6). Le infezioni precoci uccidono la pianta in poche settimane mentre quelle tardive, pur consentendo la crescita della pianta, portano a produzioni di scarso valore commerciale (Gallitelli & Davino, 1998). Fig. 6: Necrosi su foglie di lattuga. 1.7.4. SINTOMI SU MALERBE Contrariamente alle specie coltivate, la maggior parte delle specie spontanee presenta pochi sintomi o ne è totalmente priva (Marchoux et al., 2000; Chatzivassiliou et al., 2001). Stellaria media reagisce all’infezione di TSWV con leggere clorosi o mosaici, mentre Galinsoga parviflora mostra importanti clorosi, necrosi e crescita ritardata (Mertelík et al., 1998). 14 1.8. TRASMISSIONE DEL VIRUS 1.8.1. INSETTI VETTORI La trasmissione del virus tramite tripidi (famiglia Thripidae, ordine Thysanoptera) fu scoperta nel 1927 da Pittmann. In seguito molte ricerche hanno dimostrato il ruolo di diverse specie di Thysanoptera quali vettori di TSWV. Nove specie sono state identificate come capaci di trasmettere il virus; si tratta di Frankliniella occidentalis Pergande, F. schultzei Trybom, F. fusca Hinds, F. tenuicornis Uzel, F. intonsa Trybom, Thrips tabaci Linderman, T. palmi Karny, T. setosus Moulton e Scirtotrips dorsalis Hood (Rossellò, 1996). I tripidi sono insetti che producono molte generazioni in un anno ed essendo favoriti da temperature relativamente elevate si sviluppano bene nelle serre: il ciclo biologico è continuo ed ogni stadio può venir trovato durante tutto l’anno. Questi insetti vivono sulle parti tenere della pianta, e per nutrirsi lacerano fiori, foglie e frutti, iniettando saliva e succhiando il contenuto delle cellule. (30 - 45 giorni) (2 - 5 giorni) (4 - 11 giorni) (4 - 9 giorni) (1 giorno) (2 - 3 giorni) Fig. 7: Ciclo biologico dei tripidi vettori di TSWV (durata dei singoli stadi in giorni) (modificato da www.discoverlife.org/nh/tx/Insecta/Thysanoptera/). Rettangolo punteggiato: stadio in cui l’insetto acquisisce il virus. Rettangolo nero: stadi in cui l’insetto può trasmettere il virus. Prepupa e pupa si trovano nel suolo. Il virus è acquisito dai tripidi solamente allo stato larvale (neanide) e le pupe, che maturano nel suolo, conservano il virus (Fig. 7). Gli adulti sono i principali responsabili della trasmissione e diffusione del virus, potendosi facilmente spostare da una foglia 15 all’altra o da pianta a pianta, saltando o volando sospinti da correnti d’aria; possono anche essere trasportati involontariamente dai coltivatori all’interno delle serre. Le larve invece, non essendo dotate di grande mobilità, vivono quasi esclusivamente sulle foglie dove sono nate. Gli adulti rimangono infettivi per tutta la loro vita (della durata di alcune settimane) mentre le uova deposte nei tessuti vegetali danno origine a larve sane (Vicchi, 1999). T. tabaci era ritenuto in passato il principale vettore di TSWV. Attualmente è F. occidentalis ad essere considerato il vettore più importante (Rossellò, 1996); ciò è dovuto alla sua dispersione a livello mondiale avvenuta a partire dal 1980. 1.8.1.1. F. OCCIDENTALIS PERGANDE Originaria del Nord America, F. occidentalis è presente dal livello del mare fino alle zone sub-alpine. Questo insetto si è diffuso dalla California verso le isole Canarie, l’Europa, le Hawaii, la Nuova Zelanda, l’isola Réunion e le zone settentrionali del Sud America (Waterhouse and Norris, 1989). Dal monitoraggio dei tripidi vettori di TSWV svolto nel 2001 in Ticino, è emerso che F. occidentalis era presente nella maggior parte delle aziende controllate (14 su 20), sia nel Sopraceneri sia nel Sottoceneri (Besomi, 2001). Il ciclo biologico del tripide conta sei stadi che vanno dall’uovo all’adulto. I tempi di sviluppo variano secondo la temperatura, come indicato in Tab. 4. Tab. 4: Durata in giorni di diversi stadi di sviluppo di F. occidentalis su cetriolo, in relazione alla temperatura (Nick, 1993). Temperatura (°C) 15 20 25 Uovo (gg) 11.2 6.4 4.3 Larva (gg) 14.0 7.5 5.4 Da uovo a adulto(gg) 33.7 19.0 12.7 I maschi adulti misurano 0,9-1,1 mm di lunghezza, le femmine 1,3-1,4 mm. Il loro colore varia dal giallo-rossastro al marrone (Fig. 8). Fig. 8: Adulto di F. occidentalis Pergande (Pinot Y. / INRA Montpellier) 16 F. occidentalis è una specie polifaga, segnalata su oltre 250 piante ospiti; attacca alberi da frutto, piante ortive, floricole e numerose piante erbacee infestanti (Pollini, 1998). Le piccole uova sono opache e reniformi; vengono normalmente deposte singolarmente, ma a volte si possono trovare posate in fila lungo una vena della foglia (Lewis, 1973). Le uova, molto sensibili al disseccamento, si schiudono dopo 4-11 giorni. L’insetto si nutre attivamente solo durante gli stadi larvali e da adulto. Le larve del primo stadio sono bianche o trasparenti e si colorano in seguito di giallo-arancione. Questo stadio dura 2-5 giorni. Durante il secondo stadio, le larve hanno un colore giallo pallido e dopo 4-9 giorni sono pronte per mutare allo stadio ninfale (o pupa). Durante i due stadi tra la larva e l’adulto (prepupa e pupa) gli individui non si nutrono (Nick, 1993). La riproduzione avviene normalmente senza fecondazione (partenogenesi); i maschi sono rari (Waterhouse and Norris, 1989). Se la femmina è stata fecondata, le uova daranno origine ad altre femmine. Una femmina produce circa 40 uova durante la sua vita. La lunghezza della vita di un adulto varia secondo il clima ed è di 30-45 giorni. L’acquisizione del virus avviene durante il primo stadio larvale con l’alimentazione su piante infette (Wijkamp et al., 1996). L’insetto diventa vettore del virus dopo un periodo di latenza durante il quale raggiunge il secondo stadio larvale; in questo periodo il virus si moltiplica nelle cellule dell’epitelio del canale alimentare, nei muscoli che lo circondano e nelle ghiandole salivari (Bandla et al., 1998). Nei due stadi che seguono (prepupa e pupa) l’insetto si trova nel suolo e non trasmette il virus. L’adulto non lo può acquisire neanche nutrendosi di piante infette, data una particolare conformazione del canale alimentare; può trasmettere il virus unicamente se lo ha acquisito durante il primo stadio larvale. 1.8.1.2. T. TABACI LINDERMAN T. tabaci, originario della regione Mediterranea, è un insetto diffuso mondialmente che attacca piante appartenenti a 25 famiglie, tra cui cavoli, cipolle, melanzane, patate, pomodori, peperoni, porri e tabacco. Il ciclo biologico di quest’insetto è molto simile a quello di F. occidentalis: conta sei stadi dall’uovo all’adulto. Il ciclo di sviluppo, da adulto ad adulto, richiede in genere 2530 giorni. La riproduzione avviene quasi esclusivamente per partenogenesi (Pollini, 1998). 1.8.2. ALTRI MODI DI TRASMISSIONE Il virus può essere trasmesso attraverso la propagazione di parti di pianta (bulbi, tuberi, talee). Non molto rilevante dovrebbe invece essere la trasmissione tramite strumenti di lavoro (Pedrinis, 2001). I risultati di un esperimento di Antignus et al. (1997) indicano che i semi raccolti da piante contaminate con TSWV non sono infetti. La trasmissione di TSWV tramite seme è considerata possibile da alcuni autori (Gebre-Selassie et al., 1989; Marchoux et al., 2000), mentre viene esclusa da altri (Reddy, 1988). Pottorff und Newman (2001) segnalano la possibilità che TSWV venga trasmesso tramite seme di Petunia x hybrida e Lycopersicon esulentum. 17 Molti fattori, tra cui il ceppo virale, la specie ospite e la varietà, come pure le condizioni ambientali durante la produzione dei semi, influenzano l’eventuale trasmissione tramite seme. Questo potrebbe spiegare i risultati contradditori ottenuti dai diversi ricercatori (Antignus et al., 1997). 1.9. METODI DI LOTTA I possibili metodi per controllare TSWV sono: la riduzione dell’inoculo, il controllo dei vettori tramite lotta fisica, chimica e biologica, e l’utilizzo di varietà resistenti o tolleranti. 1.9.1. RIDUZIONE DELL’INOCULO Le seguenti misure possono essere adottate per ridurre l’inoculo: - controllo del trasporto di materiale vegetale, per evitare la diffusione del focolaio di infezione, nonché l’introduzione di piante infette in un campo sano; - utilizzo di piantine da trapianto esenti da virus; - eliminazione di piante infestanti che possono fungere da serbatoio per il virus; - eliminazione dei residui della coltura precedente; - controllo protettivo della coltura e rimozione immediata delle prime piante infette; - rimozione dell’intera coltura se l’incidenza della malattia è molto elevata (Rosselló et al., 1996). 1.9.2. CONTROLLO DEI VETTORI Il controllo della trasmissione tramite tripidi vettori, può essere effettuato con metodi fisici, chimici e biologici. I metodi fisici consistono nell’uso di reti a maglie molto fini su porte e finestre nel caso di colture in serra, oppure nell’utilizzo di pacciamatura riflettente per ridurre l’immigrazione degli insetti. Questo metodo perde la sua efficacia a partire dal momento in cui la coltura copre interamente il suolo. Infine l’uso di trappole cromotropiche blu o gialle per attestare preventivamente la presenza degli insetti, si rivela molto utile e permette l’adozione immediata di misure di controllo (Rosselló et al., 1996). L’impiego di insetticidi è consigliabile, anche se diverse popolazioni di F. occidentalis hanno già acquisito elevati livelli di resistenza contro alcuni principi attivi (Rosselló et al., 1996). A questo problema si aggiunge quello del particolare comportamento dei tripidi sulle piante; essi generalmente si riparano in profondità nei fiori o nelle gemme ed inoltre gli stadi quiescenti di uovo e di pupa non hanno possibilità di ingerire l’insetticida (Gallitelli & Davino, 1998). La difesa chimica va dunque utilizzata non per eliminare i tripidi, bensì per controllarne la diffusione. La lotta biologica sfrutta antagonisti naturali, quali acari predatori (Amblyseius spp.) e cimici predatrici (Orius spp.). Le cimici predano i tripidi in ogni stadio dello sviluppo, mentre gli acari non attaccano gli adulti e sono inefficaci contro le larve del secondo stadio (Rosselló et al., 1996). Per un controllo adeguato bisogna introdurre un numero 18 elevato di predatori; bisogna inoltre rilasciare gli agenti di controllo prima che la popolazione di tripidi raggiunga proporzioni elevate (Besomi, 2001). 1.9.3. PIANTE RESISTENTI A TSWV Il metodo più efficace per proteggere le colture dalla malattia è la selezione di piante resistenti; molti sforzi sono stati fatti per sviluppare varietà resistenti al virus (Brommonschenkel et al., 2000). La prima resistenza transgenica a TSWV è stata ottenuta con l’introduzione in Nicotiana tabacum (tabacco) del gene N; sono seguite l’introduzione dello stesso gene in lattuga, pomodoro e crisantemo (Hoffmann et al., 2001). In seguito sono stati identificati sette geni per la resistenza a TSWV in diverse specie del genere Lycopersicon. Il gene Sw-5, individuato in Lycopersicon peruvianum (Spassova et al., 2001), conferisce ad individui omozigoti un elevato livello di resistenza nel caso di inoculazioni meccaniche effettuate con alcuni isolati di TSWV ed anche con altri Tospovirus (GRSV, TCSV, GBNV). La resistenza non è però buona nel caso di trasmissione tramite tripidi vettori (Roselló et al., 2001). Su pomodori appartenenti a varietà resistenti ed infettati tramite tripidi, sono stati osservati sintomi di TSWV; probabilmente la presenza del gene Sw-5 causa una risposta ipersensitiva insufficiente (Aramburu et al., 2000). 1.10. EVOLUZIONE DEI VIRUS I virus RNA presentano un’enorme variabilità genetica, se paragonati a tutti gli altri organismi viventi. I meccanismi responsabili delle variazioni nei virus sono essenzialmente gli stessi che agiscono nell’evoluzione di tutti gli organismi: mutazioni, riassortimenti e ricombinazioni (Moyer,?). Le mutazioni sono generate da errori commessi dall’enzima polimerase durante la replicazione, che risultano in sostituzioni, delezioni o addizioni (Astier, 2001). A causa dell’assenza di un meccanismo di riparazione di questi errori, i virus RNA presentano il tasso di mutazione più elevato di tutti gli esseri viventi (Moya et al., 2000); questo tasso di mutazione è stato stimato a circa 10-4 mutazioni per nucleotide e per replicazione (Astier, 2001). I virus RNA con genoma segmentato sono soggetti anche al riassortimento, ossia allo scambio di segmenti di genoma fra individui (Moyer,?). La ricombinazione, infine, determina la formazione di molecole di acido nucleico da materiale genetico proveniente da segmenti diversi di DNA o RNA, producendo così nuove strutture (Astier, 2001). 19 1.11. EVOLUZIONE DI TSWV Il genoma tripartito dei virus della famiglia Bunyaviridae permette lo scambio di informazioni genetiche fra individui, grazie al meccanismo di riassortimento (Qiu et al., 1998). La capacità di TSWV di replicarsi sia nella pianta sia nell’insetto vettore e la presenza di ceppi virali o di Tospovirus diversi in infezione mista nella stessa pianta o in replicazione nello stesso vettore, possono facilmente favorire la comparsa proprio di riassortanti o di ricombinanti (Gallitello & Davino, 1998). 1.12. ANALISI FILOGENETICHE Analizzando le diversità a livello delle sequenze di acidi nucleici è possibile paragonare e differenziare più organismi fra loro. Un’unica base mutata in un intero genoma basta come elemento distintivo. Esistono diversi tipi di marcatori molecolari con cui sondare le differenze genomiche, ad esempio RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment-Length Polymorphism), RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeats) oppure si può sequenziare una parte di un gene, come è il caso in questa ricerca. La distanza genetica esprime la divergenza tra unità tassonomiche (operational taxonomic unit, OTU). Le distanze tra OTU sono rappresentate graficamente sottoforma di alberi filogenetici o dendogrammi. I nodi rappresentano le unità tassonomiche e i rami che li connettono ne riassumono il percorso evolutivo. Un albero è in scala quando la lunghezza dei rami è proporzionale alla distanza genetica. Le distanze tra OTU possono essere calcolate con diversi algoritmi, in grado anche di rappresentare gli alberi. Questi algoritmi possono essere classificati in distance methods (Neighbor Joining, UPGMA) e discrete-character methods (Maximum Parsimony, Maximum likelihood). L’algoritmo Neighbor Joining è basato sul principio di minimum evolution, il quale assume che l’albero migliore sia quello con la minor somma della lunghezza dei rami. Neighbor Joining non esamina tutte le possibili topologie, ma ad ogni stadio del cladeing applica il principio di minimum evolution (Nei & Kumar, 2000). Una tipologia è definita come l’insieme degli elementi che definiscono la struttura di un dendogramma (posizione dei nodi, lunghezza dei rami, …). L’algoritmo Maximum Parsimony assume che ogni OTU evolve indipendentemente e calcola il minor numero di sostituzioni che spiegano l’intero processo evolutivo; la topologia che richiede il minor numero di sostituzioni è poi mantenuta come migliore albero. Vi sono due classi di metodi di ricerca per ottenere gli alberi migliori: metodi esatti (branch and bound search) e metodi euristici (heuristic search). Con un numero di OTU maggiore di nove è consigliabile utilizzare il metodo euristico per evitare tempi di calcolo troppo elevati. Non è garantito che l’albero corretto sia effettivamente generato, poiché unicamente una piccola parte degli alberi possibili è esaminata. Felsenstein (1985) ha sviluppato l’algoritmo bootstrap per accordare una sicurezza statistica all’ipotesi di relazione (Nei & Kumar, 2000). Il programma MEGA esegue una campionatura dei dati iniziali e genera una serie di replicati casuali che inserisce nelle sequenze originali, generandone un nuovo set che è utilizzato per creare un nuovo albero. La topologia dell’albero così ottenuto è paragonata 20 a quello iniziale. Ad ogni ramo che coincide è assegnato il valore 1 (identity value) mentre agli altri è assegnato il valore 0. Questo processo è ripetuto più volte (generalmente 1000). In seguito è calcolata la percentuale dei casi in cui il ramo ha valore 1: questo valore è indicato come bootstrap confidence value o semplicemente bootstrap value. Un clade, definito come gruppo comprendente un antenato comune (rappresentato dal nodo da cui dipartono i rami) e tutti i suoi discendenti, è generalmente considerato significativo quando il valore bootstrap è superiore a 50%. 1.13. SCOPI DEL LAVORO La malattia causata da TSWV provoca ingenti danni alle numerose colture orticole ospiti del virus. In Ticino è divenuto un grave problema nel corso degli ultimi anni. In una ricerca precedente (Matasci, 2002) è stato testato un metodo (RT-PCR) che ha permesso di diagnosticare la presenza di TSWV su piante di pomodoro e di lattuga senza sintomi. Era stata inoltre segnalata la possibile funzione delle piante infestanti presenti nei tunnel come serbatoio per il virus tra una coltura e la successiva, ed era infine stata ipotizzata la possibile origine degli aplotipi presenti in Ticino. Per sviluppare una strategia di lotta è importante conoscere ancora meglio il modo di diffusione del virus, sapere in quali colture è presente, come viene importato e dove sverna. Gli scopi di questo lavoro sono di stabilire l’incidenza di TSWV in varie colture orticole, di testarne la presenza in una coltura messa a dimora durante l’inverno, di analizzare l’importanza delle malerbe come serbatoio del virus e di valutare l’evoluzione di TSWV in Ticino, determinando tramite sequenziamento quanti e quali aplotipi del virus sono presenti. 21 2. MATERIALE E METODI 2.1. PRELIEVO DEI CAMPIONI Il materiale analizzato è stato raccolto presso l’Azienda orticola All’Orto di Muzzano. In quest’azienda era già stata accertata la presenza del virus nel 2000, nel 2001 e nella prima parte del 2002. Nelle serre non è stata eseguita alcuna sterilizzazione del suolo e al momento della prima, della seconda e della terza campionatura si notava una forte presenza di malerbe e piantine di pomodoro infestanti, nate da semi restati nel terreno. Sono state eseguite cinque campionature ad intervalli mensili. I campioni raccolti sono stati posti singolarmente in sacchetti di plastica e conservati a -80°C. Una visione generale delle colture presenti nell’azienda e della raccolta dei campioni è presentata in Tab. 5. La prima campionatura è stata realizzata da Mauro Jermini il 18 ed il 21.10.’02. Sono stati raccolti 40 campioni ciascuno di nove colture, cercando di averne, dove possibile, 20 con sintomi e 20 senza sintomi. Le colture erano: lattuga foglia di quercia verde e lattuga foglia di quercia rossa, lattuga cappuccio, lattughino lollo rosso e lattughino lollo verde, lattuga batavia, melanzane, formentino e cavolo rapa. Il lattughino lollo verde non è stato analizzato. Al momento della campionatura erano presenti sull’azienda anche rapanelli e cicoria verde. Non sono stati raccolti campioni di rapanelli poiché non sono state trovate informazioni riguardo alla sensibilità di questa coltura al virus; la cicoria invece era coltivata su una piccola superficie ed era in parte già stata raccolta. La seconda campionatura è stata eseguita il 14.11.’02. Sono stati raccolti alcuni campioni di piante infestanti (Galinsoga sp., Stellaria media e semenzali spontanei di pomodoro) e 40 campioni di coste. Il 13.12.’02 sono stati raccolti 20 campioni di S. media ed è stata fatta una valutazione della situazione riguardante le malerbe. A causa della loro abbondanza ci si è limitati a determinare le piante infestanti presenti, senza valutazione quantitativa. Il 20.01.’03 sono stati prelevati 48 campioni da piantine di lattuga foglia di quercia verde e rossa, appena trapiantate in serra. Le piantine da cui sono stati raccolti i campioni sono state contrassegnate in modo da poterle ritrovare. Lo stesso giorno sono stati raccolti otto campioni (due campioni ciascuno per quattro varietà) da piantine di lattuga non ancora trapiantate, appena arrivate sull’Azienda. Il 24.02.’03 è stata eseguita la quinta ed ultima campionatura dalle stesse 48 piantine di lattuga foglia di quercia del mese precedente. 22 Tab. 5: Colture presenti presso l’Azienda All’Orto di Muzzano tra il 18.10.’02 e il 24.02.’03, sensibilità a TSWV, data di raccolta dei campioni (numero di campioni prelevati) ed osservazioni. Coltura Cavolo rapa (CR) Cicoria verde 1 Coste (CO) Formentino (FO) Lattuga batavia (LB) Lattuga cappuccio (LC) Lattuga foglia di quercia rossa (LQ) Ospite di TSWV si si si si si si si Lattuga foglia di quercia verde (LQ) si Lattuga (4 varietà) 2 Lattughino lollo rosso (LR) Lattughino lollo verde Melanzana (ME) Rapanelli 3 Malerbe 4 Galinsoga sp. (GA) Stellaria media (SM) si si si si ? Lycopersicon esculentum (TO) si si si Campioni raccolti 18.10.2002 (40) no 14.11.2002 (40) 21.10.2002 (40) 18.10.2002 (40) 18.10.2002 (40) 18.10.2002 (40) 20.01.2003 (24) 24.02.2003 (24) 18.10.2002 (40) 20.01.2003 (24) 24.02.2003 (24) 20.01.2003 (2X4) 21.10.2002 (40) 18.10.2002 (40) 21.10.2002 (40) no Osservazioni senza sintomi piccola superficie sintomi alla raccolta senza sintomi sintomi non sempre tipici sintomi alla raccolta sintomi non sempre tipici senza sintomi senza sintomi sintomi non sempre tipici senza sintomi senza sintomi non ancora trapiantata senza sintomi sintomi alla raccolta senza sintomi 14.11.2002 (17) 14.11.2002 (2) 13.12.2002 (21) 14.11.2002 (12) sintomi alla raccolta senza sintomi senza sintomi sintomi alla raccolta 1 Non sono stati raccolti campioni di cicoria verde, poiché coltivata su una piccola superficie Lattuga appena arrivata nell’azienda e non ancora trapiantata in serra 3 Non sono state trovate informazioni sulla suscettibilità dei rapanelli a TSWV 4 Sono stati raccolti campioni delle malerbe ritenute determinanti come possibile serbatoio per il virus ? Informazioni mancanti 2 23 2.2. ESTRAZIONE DI RNA Per estrarre RNA è stato utilizzato il Kit NucleoSpin® Multi-96 Plant (Macherey Nagel, Oensingen, Svizzera). È stato seguito il protocollo annesso applicando alcune modifiche: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Polverizzare in un omogeneizzatore 50 mg di foglia contenuti in un eppendorf da 2 ml con biglie di vetro di 2,5 mm (Biospec). Aggiungere 400 µl di lysis buffer. Centrifugare per 30 sec a 1500 g (5415 D Eppendorf). Incubare a 56°C per 30 min. Non aggiungere RNase. Centrifugare per 10 min a 6000 g (5415 D Eppendorf). Trasferire 300 µl di supernatante in eppendorf da 1,5 ml e aggiungere 300 µl di buffer C4 e 200 µl di etanolo. Mescolare pipettando e centrifugare per 30 sec a 1500 g (5415 D Eppendorf). Trasferire i campioni in una piastra NucleoSpin® Multi-96 Plant. Chiudere la piastra con un foglio PE autoadesivo. Sistemare la piastra NucleoSpin® Multi-96 Plant su uno Square-well block e centrifugare per 2 min a 6000g (Sigma 4-15 C Qiagen). Togliere il foglio PE autoadesivo e aggiungere 500 µl di wash buffer. Richiudere la piastra con un nuovo foglio PE autoadesivo e centrifugare nuovamente per 2 min a 6000g. Togliere il foglio PE autoadesivo e aggiungere 900 µl di buffer C5. Centrifugare per 5 min a 6000g. Sistemare la piastra NucleoSpin ® Multi-96 Plant su un Round-well block. Aggiungere 100 µl di elution buffer, anticipatamente riscaldato a 70°C, direttamente sulla membrana. Incubare a temperatura ambiente per 2-3 min e centrifugare per 2 min a 6000g. Al fine di ridurre il pericolo di contaminazioni, sono stati utilizzati puntali con filtri (Eppendorf) per l’estrazione di RNA, la sintesi di cDNA e le amplificazioni PCR e nested PCR. 24 2.3. SINTESI DI cDNA Per la sintesi di cDNA è stata utilizzata la retrotrascrittasi derivata da Avian Myeloblastisis Virus (AMV) (Roche, Mannheim, Germania). Sono stati aggiunti al mix di reazione (Tab. 6) 5 µl di RNA totale. La sintesi è stata effettuata in un termocycler Gene Amp 9600 PCR System (Perkin Elmer Cetus), alle condizioni descritte in Tab. 7. È stato utilizzato il primer NP rev indicato in Tab. 8. Tab. 6: Mix di reazione per sintesi di cDNA con primer NP. Reagenti 5x Incubation Buffer dNTP Mix Primer NP rev (10 µM) AMV Reverse Transcriptase (5u/µl) RNA totale Volume totale Mix 4 µl 10 µl 0,5 µl 0,5 µl 5 µl 20 µl Tab. 7: Condizioni per la sintesi di cDNA (1 ciclo) (Dewey et al., 1996). Sintesi di cDNA AMV RT inactivation Temperatura Durata 42°C 60 min 94°C 2,5 min Tab. 8: Primers specifici per il gene NP di TSWV (sintetizzati da Mycrosynth, Belgach, Svizzera). Primer Coordinate1 Sequenza Referenza NP for 154 - 171 5’- ATGTCTAAGGTTAAGCTC - 3’ Jain et al., 1998 NP rev 912 - 930 5’- TTAAGCAAGTTCTGTGAG - 3’ Jain et al., 1998 1 Coordinate sulla mappa dei nucleotidi dell’isolato BR-01 (De Haan et al., 1991) 25 2.4. AMPLIFICAZIONE SPECIFICA TRAMITE PCR Per l’amplificazione tramite PCR sono stati aggiunti 5 µl di soluzione di sintesi di cDNA al mix di reazione (Tab. 9). L’amplificazione è stata eseguita in un termocycler Gene Amp 9600 PCR System (Perkin Elmer Cetus) alle condizioni descritte in Tab. 10. Tab. 9: Mix di reazione per PCR specifica. Reagenti ddH2O 10 x Buffer dNTP Mix Primer NP for (10 µM) Primer NP rev (10 µM) Taq cDna Volume totale Mix 6,94 µl 1,50 µl 0,75 µl 0,30 µl 0,30 µl 0,21 µl 5 µl 15 µl Concentrazione finale 0,10 mM 0,20 µM 0,20 µM 0,07 U/µl Tab. 10: Condizioni per PCR specifica (40 cicli). Denaturazione Annealing Estensione Estensione finale Temperatura Durata 94°C 30 s 53°C 30 s 72°C 1 min 72°C 7 min 26 2.5. NESTED PCR Per effettuare l’amplificazione tramite nested PCR sono stati aggiunti 2 µl di prodotto PCR della prima amplificazione al mix di reazione (Tab. 11). L’amplificazione è stata eseguita in un termocycler Gene Amp 9600 PCR System (Perkin Elmer Cetus) alle condizioni descritte in Tab. 12. Sono stati utilizzati i primers NPnest sviluppati da Matasci, 2002 (Tab. 13). Tab. 11: Mix di reazione per PCR specifica. Reagenti ddH2O 10 x Buffer dNTP Mix Primer NPnest for (10 µM) Primer NPnest rev (10 µM) Taq Template DNA Volume totale Mix Concentrazione finale 21,88 µl 3,00 µl 0,10 mM 1,50 µl 0,60 µl 0,20 µM 0,60 µl 0,20 µM 0,42 µl 0,07 U/µl 2 µl 30 µl Tab. 12: Condizioni per PCR specifica (35 cicli). Denaturazione Annealing Estensione Estensione finale Temperatura 94°C 55°C 72°C 72°C Durata 30 s 30 s 1 min 7 min Tab. 13: Primers per nested PCR (sintetizzati da Mycrosynth, Belgach, Svizzera). Primer Coordinate1 Sequenza NPnest for 213 - 235 5’- CCTTGAGTTTGAGGAAGATCAGA - 3’ NPnest rev 823 - 836 5’- CCTTTAGCATTAGGATTGCTGG - 3’ 1 Coordinate sulla mappa dei nucleotidi dell’isolato BR-01 (De Haan et al., 1991) Referenza Matasci, 2002 Matasci, 2002 2.6. GEL ELETTROFORESI DEL PRODOTTO PCR Per verificare la presenza di TSWV nei campioni, 5 µl di prodotto nested PCR, a cui è stato aggiunto 1 µl di blue juice, sono stati separati su gel di agarosio 0,8% (Gibco) in 0,5xTBE contenente tracce di bromuro di etidio. 27 2.7. PURIFICAZIONE DEL PRODOTTO PCR Per la purificazione è stato utilizzato il QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden, Germania) seguendo il protocollo annesso ed applicando la seguente modifica: - punto 6: I campioni sono stati centrifugati alla massima velocità durante 2 minuti invece di 1 minuto. 2.8. QUANTIFICAZIONE DEL PRODOTTO PCR La stima della quantità di DNA purificato è stata effettuata confrontando la luminosità delle bande di DNA con le bande degli standard 5 ng, 25 ng e 50 ng su gel di agarosio 0,8% (Gibco) in 0,5xTBE contenente tracce di bromuro di etidio. 2.9. CYCLE SEQUENCING Per determinare le sequenze dei prodotti nested PCR è stato utilizzato ABI PRISM® Big DyeTM Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, 2001). Ogni amplicone è stato sequenziato nelle due direzioni utilizzando i primers NPnest for e NPnest rev (Tab. 13). Le reazioni di sequenziamento sono state eseguite in un termocycler Gene Amp 9600 PCR System (Perkin Elmer Cetus) come descritto in Tab. 14, alle condizioni descritte in Tab. 15. Tab. 14: Mix di reazione per cycle sequencing. Big dye 5x rxn buffer1 Primer NPnest for o NPnest rev o L1 o L2 (1,6 µΜ) ddH2O DNA (5-20 ng per NP; 3-10 ng per L) Volume totale 1 5x rxn buffer: 400 mM Tris HCl, 10mM MgCl2, pH 9,0 Mix 1 µl 1,5 µl 1 µl Y X 10 µl Tab. 15: Condizioni per cycle sequencing (35 cicli). Denaturazione Annealing Estensione Temperatura 96°C 50°C 60°C Durata 10 s 5s 4 min 28 2.10. PURIFICAZIONE DEI PRODOTTI DI CYCLE SEQUENCING Con questa procedura si eliminano sali, primers, ddNTPs e dNTP non integrati. 1. Aggiungere 290 µl di ddH2O ad un volume di 45 µl di DNA Grade Sephadex G-50 Fine (Amersham Pharmacia Biotech), in una piastra per filtrazione MAHVN 45 (ABI PRISM). Lasciar equilibrare per 3 ore a temperatura ambiente oppure più a lungo in frigorifero. Le piastre equilibrate possono venir sigillate con una pellicola per alimenti (Saran) e conservate a 4°C in frigorifero per diverse settimane. 2. Porre la piastra per filtrazione su una piastra per titolazione (microtiter plate) e centrifugare a 900 g per 5 min (Sigma 4-15 C Qiagen). Gettare il tampone raccolto nella piastra per titolazione. 3. Aggiungere 145 µl di ddH2O per purificare il Sephadex e centrifugare a 900 g per 5 min (Sigma 4-15 C Qiagen). 4. Aggiungere 10 µl di acqua e 2 µl di SDS 2,2% al prodotto di reazione. Incubare in un termocycler durante 5 minuti a 98°C e durante 10 minuti a 25°C. Pipettare il tutto nella colonna di Sephadex. 5. Porre la piastra per filtrazione su una piastra (MicroAmp, Reaction Plate) e centrifugare a 900 g per 5 min (Sigma 4-15 C Qiagen). 6. Ricoprire il prodotto purificato con 20 µl di olio minerale. 2.11. SEQUENZIAMENTO Il sequenziamento del prodotto PCR è stato eseguito con il sequenziatore 3100 Genetic Analyzer (ABI PRISM) secondo i parametri descritti in Tab. 16. Tab. 16: Parametri di lettura delle sequenze. Lunghezza dei capillari Run Run temperature Run voltage Injection Injection voltage 2.12. 50 mm 6500 s 50°C 12,2 kV 15 s 1,5 kV ELABORAZIONE DEGLI ELETTROFEROGRAMMI Per ogni campione sono state ottenute le sequenze forward e reverse. Sono stati utilizzati i programmi Sequencher 4.1 e Chromas per allineare le sequenze della matrice e quella del suo complementare. Dal confronto delle sequenze forward e reverse viene creata la sequenza consensus, dopo aver apportato eventuali correzioni ad incongruenze risaltate grazie al confronto delle stesse. 29 2.13. ALLINEAMENTO DELLE SEQUENZE Le sequenze sono state allineate utilizzando il programma Clustal W (Thompson et al., 1994) messo a disposizione sul sito http://crick.genes.nig.ac.jp/homology/welcomee.shtml. 2.14. ANALISI FILOGENETICHE Le analisi filogenetiche sono state eseguite con il programma MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis), versione 2.1 (Kumar et al., 2001). I dendogrammi sono stati generati con l’algoritmo Neighbour Joining (NJ). Per le sequenze di 513 nucleotidi è stato scelto il modello Jukes-Cantor mentre per le sequenze di 171 aminoacidi è stato utilizzato il modello Gamma Distance. Per l’analisi statistica bootstrap sono state effettuate 1000 ripetizioni. Le biforcazioni con valore bootstrap inferiore a 50 % sono state eliminate poiché non significative e i rami sono stati fusi. Le analisi di distanza sono state eseguite con Compute Pairwise, modello Nucleotide, N° of differences. Il numero di sostituzioni sinonime e non sinonime è stato calcolato con il metodo di Nei-Gojobori, N° of differences. Sono state eseguite analisi su tre livelli: sono state dapprima considerate unicamente le sequenze trovate durante questa ricerca, in seguito sono state prese in considerazione tutte le sequenze ticinesi (comprese quindi quelle rilevate da Matasci, 2002) ed infine è stato effettuato un confronto delle sequenze trovate in Ticino con quelle pubblicate in GenBank. 30 3. RISULTATI 3.1. INCIDENZA DI TSWV IN OTTO COLTURE ORTICOLE Per stabilire l’incidenza di TSWV sono stati analizzati 176 campioni prelevati da otto colture presso l’Azienda All’Orto di Muzzano, durante l’autunno 2002. Sono state presi in considerazione: cavolo rapa, coste, formentino, lattuga batavia, lattuga cappuccio, lattuga foglia di quercia verde e rossa, lattughino lollo rosso e melanzane. Quattro di queste colture (cavolo rapa, formentino, lattughino lollo rosso e melanzane) non presentavano sintomi al momento della raccolta dei campioni. Per le altre colture sono stati prelevati campioni da piante apparentemente sane e da piante con sintomi, distribuite omogeneamente nelle campate. Le colture lattuga batavia e lattuga foglia di quercia presentavano dei sintomi non attribuibili con certezza a TSWV. Le restanti colture (coste e lattuga cappuccio) mostravano invece dei sintomi evidenti della presenza del virus. Il 68,2 % dei campioni analizzati, scelti casualmente tra quelli raccolti, si è rivelato essere infetto, vale a dire che 120 campioni sono risultati positivi all’analisi molecolare (nested RT-PCR) (Tab. 17). Tab. 17: Incidenza di TSWV in otto colture orticole. Campioni raccolti presso l’Azienda All’Orto di Muzzano in ottobre-novembre 2002. Coltura CR FO LR ME LB FQ Presenza di sintomi1 no no no no ? ? Campioni analizzati (di cui con sintomi) 24 (0) 16 (0) 24 (0) 24 (0) 16 (7) 24 (5) Campioni infetti (di cui con sintomi) 6 (0) 9 (0) 16 (0) 13 (0) 13 (6) 23 (5) Campioni infetti (%) 25.0 56.3 66.7 54.2 81.3 95.8 CO LC Totale si si 24 (6) 24 (16) 176 (34) 16 (5) 24 (16) 120 (32) 66.7 100.0 68.2 CR: cavolo rapa; FO: formentino; LR: lattughino lollo rosso; ME: melanzane; LB: lattuga batavia; FQ: lattuga foglia di quercia; CO: coste; LC: lattuga cappuccio. 1 no: nessun sintomo visibile; ?: sintomi non attribuibili con certezza a TSWV; si: sintomi evidenti della presenza di TSWV. In tutte le colture analizzate è stata rilevata la presenza del virus. La distribuzione delle piante infette nelle campate è rappresentata in appendice in Fig. 1A. 34 campioni analizzati (su 176) presentavano sintomi al momento del prelievo. 32 di questi sono risultati effettivamente infetti. Un campione di lattuga batavia e un campione di coste che presentavano sintomi non sono risultati positivi all’analisi (Tab. 17). Le colture che mostravano in una parte delle piante dei sintomi evidenti della presenza di TSWV, presentano la percentuale maggiore di campioni risultati infetti (66,7 % nel caso delle coste e 100 % nel caso di lattuga cappuccio). Le colture su cui non erano visibili tracce del virus, hanno una percentuale di campioni infetti che varia dal 25 % (cavoli rapa) al 66,7 % (lattughino lollo rosso). Le due colture con sintomi non tipici si situano in 31 una posizione intermedia tra i due gruppi precedenti, con percentuali di 81,3 % (lattuga batavia) e di 95,8 % (lattuga foglia di quercia) (Fig. 9). Percentuale di campioni infetti Campioni senza sintomi Sintomi non certi Con sintomi 100.0 95.8 100.0. 81.3 80.0 60.0 40.0 66.7 66.7 54.2 56.3 25.0 20.0 0.0 CR FO LR ME LB FQ CO LC Coltura Fig. 9: Percentuale di campioni infetti da TSWV nelle diverse colture. Campioni raccolti presso l’Azienda All’Orto di Muzzano in ottobre-novembre 2002. CR: cavolo rapa; FO: formentino; LR: lattughino lollo rosso; ME: melanzane; LB: lattuga batavia; FQ: lattuga foglia di quercia; CO: coste; LC: lattuga cappuccio. 32 3.2. INCIDENZA DI TSWV IN UNA COLTURA INVERNALE Per testare l’eventuale presenza di TSWV in una coltura messa a dimora e coltivata durante il periodo in cui i tripidi vettori del virus non sono attivi o sono attivi in misura ridotta, sono stati analizzati 41 campioni di lattuga foglia di quercia, prelevati il 24 febbraio 2003 nell’azienda orticola di Muzzano. Le piante erano state messe a dimora il 15 gennaio. La coltura non presentava sintomi al momento del prelievo e non ne ha mostrati fino alla raccolta (02.04.’03). Il 19,5 % dei campioni è risultato positivo all’analisi tramite nested RT-PCR (Tab. 18). Per mancanza di tempo non è stato possibile analizzare i campioni prelevati dalle stesse piante il 20.01.’03. Tab. 18: Incidenza di TSWV in una coltura invernale. Campioni raccolti presso l’Azienda All’Orto di Muzzano in febbraio 2003. Coltura Presenza di sintomi Campioni analizzati Campioni infetti Campioni infetti (%) Lattuga foglia di quercia nessun sintomo visibile 41 8 19.5 La distribuzione delle piante infette nelle campate è rappresentata in appendice in Fig. 2A. 33 3.3. PIANTE INFESTANTI Data l’importanza, indicata nella letteratura, delle piante infestanti presenti nei tunnel quale serbatoio per TSWV, è stata fatta una valutazione della situazione riguardante le malerbe nell’azienda orticola di Muzzano dove sono stati raccolti i campioni per gli esperimenti descritti precedentemente (vedi 3.1 e 3.2). Nei settori della serra presi in considerazione, il terreno era quasi totalmente coperto da Galinsoga sp. e S. media (Fig. 10). A B C Fig. 10: Azienda all’Orto, Muzzano: tunnel coltivato con lattughino lollo verde (situazione al 13.12.’02). A: Terreno quasi totalmente coperto da malerbe. B: Stellaria media. C: Galinsoga sp. Data l’abbondanza di malerbe non è stato possibile eseguire una valutazione quantitativa e ci si è limitati a determinare le piante infestanti presenti (Tab. 19). Sono considerate malerbe anche i pomodori ed i formentini presenti in campate coltivate con altre specie. 34 Tab. 19: Piante infestanti presenti presso l’Azienda All’Orto di Muzzano il 13.12.’02 e loro suscettibilità a TSWV. Nome Ospite di TSWV Fragaria sp. ? Galinsoga sp. si Galium sp. si Lycopersicon esculentum 1 si Oxalis acetosella si Polygonum sp. si Potentilla reptans ? Rumex sp. si Stellaria media si Urtica dioica si 1 Valerianella locusta syn V. olitoria si Veronica filiformis si 1 presenti come malerbe in altre colture ? informazioni mancanti Quasi tutte le malerbe presenti sono ospiti di TSWV e potrebbero quindi effettivamente fungere da serbatoio per il virus. Per confermare quest’ipotesi sono stati analizzati 46 campioni prelevati durante l’autunno 2002 dai tre ospiti di TSWV presenti in quantità maggiore e quindi particolarmente importanti come potenziali serbatoi. S. media non mostrava sintomi al momento del prelievo; Galinsoga sp. e le piantine di pomodoro presentavano delle leggere necrosi. L’82,6 % dei campioni analizzati sono risultati positivi all’analisi molecolare (Tab. 20). Tab. 20: Incidenza di TSWV nelle piante infestanti. Campioni raccolti presso l’Azienda All’Orto di Muzzano in novembre-dicembre 2002. Ospite Presenza di sintomi1 Campioni analizzati Campioni infetti Campioni infetti (%) 1 S. media Galinsoga sp. Pomodoro Totale no ? ? 22 16 8 46 14 16 8 38 63.6 100.0 100.0 82.6 no: nessun sintomo visibile; ?: sintomi non attribuibili con certezza a TSWV. In tutte le specie è stata osservata la presenza del virus. Per Galinsoga sp. e pomodoro l’incidenza di TSWV era del 100 %; per S. media del 63,6 % (Fig. 11). 35 Sintomi non certi Percentuale di campioni infetti Campioni senza sintomi 100.0 100.0 100.0 80.0 63.6 60.0 40.0 20.0 0.0 S. media Galinsoga sp. Pomodoro Ospite Fig. 11: Percentuale di campioni infetti da TSWV nelle diverse piante infestanti. Campioni raccolti presso l’Azienda All’Orto di Muzzano in novembre-dicembre 2002. 3.4. SEQUENZE DEI CAMPIONI ANALIZZATI Tramite sequenziamento dei prodotti PCR, sono state ottenute le sequenze nucleotidiche di 154 campioni, così ripartiti: 112 campioni prelevati da otto colture per stabilire l’incidenza di TSWV (3.1.), sei campioni raccolti dalla coltura invernale (3.2.) e 36 campioni di piante infestanti (3.3.) (Tab. 21). Tab. 21: Numero di sequenze nucleotidiche di TSWV ottenute per i diversi ospiti del virus. Ospite Sequenze ottenute CR 6 FO 6 LR 15 ME 13 LB 13 FQ 28 CO 14 LC 23 SM 12 GA 16 TO 8 Totale 154 CR: cavolo rapa; FO: formentino; LR: lattughino lollo rosso; ME: melanzane; LB: lattuga batavia; FQ: lattuga foglia di quercia; CO: coste; LC: lattuga cappuccio; SM: S. media; GA: Galinsoga sp.; TO: pomodoro. In totale 166 campioni su 263 analizzati erano risultati infetti dal virus (120 campioni prelevati dalle otto colture, otto campioni della coltura invernale e 38 di piante infestanti). I 12 campioni di cui non si hanno a disposizione le sequenze nucleotidiche sono i seguenti: quattro campioni che presentano su gel bande doppie e otto campioni le cui sequenze non sono risultate leggibili, pur avendo ripetuto il sequenziamento. Per i campioni con bande doppie è stata fatta un’estrazione da gel per il sequenziamento che non ha dato risultati soddisfacenti; per mancanza di tempo non si è potuto ripetere l’esperimento. 36 Le sequenze ottenute dai campioni analizzati hanno una lunghezza comune di 513 nucleotidi, che corrisponde al 66 % del gene NP (777nt). Due sequenze hanno lunghezze ridotte di 431 (TI01ME03), rispettivamente 196 nucleotidi (TI02LR21) (Fig. 12). M TO01 ME03 CR05 LR21 FQ29 M Fig. 12: Gel elettroforesi di prodotti nested PCR di TSWV, sintetizzati da RNA estratto da campioni di foglia, prelevati il 21.10.’02 presso l’Azienda All’Orto di Muzzano. M: 100 bp ladder. TO01, ME03, CR05, LR21, FQ29: campioni di pomodoro, melanzana, cavolo rapa, lattughino lollo rosso e lattuga foglia di quercia. 3.5. APLOTIPI Sui campioni di foglia prelevati dalle undici specie ospiti di TSWV sono stati trovati 30 diversi aplotipi del virus. I nomi da assegnare agli aplotipi sono stati composti sull’esempio di quanto fatto da Matasci (2002): si compongono della sigla del canton Ticino (TI), dell’anno in cui è stato rinvenuto la prima volta l’aplotipo, di un’abbreviazione relativa alla coltura su cui è stato trovato per la prima volta e, diversamente da Matasci che assegnava delle lettere, di un numero a due cifre (da 01 fino a 30). Le abbreviazioni relative alla coltura sono: CR: cavolo rapa; FO: formentino; LR: lattughino lollo rosso; ME: melanzane; LB: lattuga batavia; FQ: lattuga foglia di quercia; CO: coste; LC: lattuga cappuccio; SM: S. media; GA: Galinsoga sp.; TO: pomodoro. 29 dei 30 aplotipi risultano nuovi; uno (il più frequente) è invece identico agli aplotipi TI01TOA e TI01TOD indicati da Matasci (2002). Questi due aplotipi si differenziavano nel confronto delle sequenze di 638 nucleotidi, ottenute con primers NP, mentre risultavano identici confrontando le sequenze più corte ottenute con nested primers NP. Agli aplotipi in questione è stato assegnato in questo studio un nome comune (TI01TO01) per poter seguire un ordine crescente nei nomi da assegnare ai diversi aplotipi. In Tab. 22 sono elencati i 30 aplotipi, il numero di campioni in cui sono stati trovati in ogni specie, il totale di campioni per ogni aplotipo, il totale di campioni per specie e il totale di aplotipi per specie. Non avendo a disposizione lo stesso numero di campioni per ogni ospite e per poterne comunque paragonare i dati, è stato calcolato il rapporto aplotipi/campione, che informa sulla variabilità genetica incontrata nelle diverse specie. 37 Tab. 22: Specie ospiti di TSWV: totale di campioni per ogni aplotipo, di campioni per specie, di aplotipi per specie, e rapporto aplotipi/campioni. Campioni raccolti presso l’Azienda All’Orto di Muzzano nel 2002 e nel 2003. Specie Aplotipo CR FO LR ME LB FQ CO LC SM GA TO Campioni/aplotipo TI01TO01 3 3 9 8 12 22 9 22 11 15 8 122 TI02ME02 3 3 TI02ME03 1 1 TI02ME04 1 1 TI02CR05 1 1 TI02CR06 1 1 TI02CR07 1 1 TI02FO08 1 TI02FO09 1 TI02FO10 1 1 2 1 1 TI02SM11 1 1 TI02CO12 1 1 TI02CO13 1 1 TI02CO14 1 1 TI02CO15 1 1 TI02CO16 1 1 TI02LR17 1 1 TI02LR18 1 1 TI02LR19 1 1 TI02LR20 1 1 TI02LR21 1 1 TI02LR22 1 1 TI02LB23 1 1 TI02FQ24 1 1 TI02FQ25 1 1 TI02FQ26 1 1 TI02FQ27 1 1 TI02LC28 1 TI02FQ29 TI02FQ30 Campioni/specie Aplotipi/specie Aplotipi/campioni* 1 1 1 1 1 6 6 15 13 13 28 14 23 12 16 8 4 4 7 4 2 7 6 2 2 2 1 0.67 0.67 0.47 0.31 0.15 0.25 0.43 0.09 0.17 0.13 0.13 154 0.19 CR: cavolo rapa; FO: formentino; LR: lattughino lollo rosso; ME: melanzane; LB: lattuga batavia; FQ: lattuga foglia di quercia; CO: coste; LC: lattuga cappuccio; SM: S. media; GA: Galinsoga sp.; TO: pomodoro. * Aplotipi/campioni=(Aplotipi/specie)/(Campioni/specie); informa sulla variabilità genetica. Tre aplotipi sono stati rinvenuti in più di un campione: TI01TO01, TI02ME02 e TI02FO08. L’aplotipo TI01TO01 è il più frequente: è stato trovato più volte in tutte le colture analizzate, per un totale di 122 campioni. L’aplotipo TI02ME02 è stato rilevato in tre campioni di foglie di melanzana. L’aplotipo TI02FO08 è presente in un campione di formentino ed in uno di Galinsoga sp. Gli altri 27 aplotipi sono stati trovati una volta 38 sola. In appendice sono elencati i nomi dei campioni in cui sono stati trovati i diversi aplotipi (Tab. 1A e 2A). I valori più alti del rapporto aplotipi/campioni sono quelli di cavolo rapa e formentino, che sono quindi le colture che presentano una maggiore variabilità: in entrambi i casi sono stati rinvenuti quattro aplotipi in sei campioni, per un rapporto di 0,67 aplotipi/campione. Nelle colture lattughino lollo rosso e lattuga foglia di quercia sono stati trovati sette aplotipi in 15 rispettivamente 28 campioni; si ottengono rapporti di 0,47 rispettivamente 0,25 aplotipi/campione. Seguono le colture coste e melanzane con sei aplotipi in 14 campioni (0,43 aplotipi/campione), rispettivamente quattro aplotipi in 13 campioni (0,31 aplotipi/campione). Sono stati trovati due aplotipi in ognuna delle specie seguenti: S. media (12 campioni, ossia 0,17 aplotipi/campione), lattuga batavia (13 campioni, 0,15 aplotipi/campione), Galinsoga sp. (16 campioni, 0,13 aplotipi/campione) e lattuga cappuccio (23 campioni, 0,09 aplotipi/campione). Infine i pomodori, con un solo aplotipo in otto campioni, hanno un rapporto di 0,13 aplotipi/campione. Il valore più basso è quello della coltura lattuga cappuccio che presenta la minor variabilità genetica. Il totale di 30 aplotipi in 154 campioni sequenziati dà un valore di 0,19 aplotipi/campione. 39 3.6. ANALISI FILOGENETICHE Per svolgere le analisi considerando tutte le sequenze trovate in Ticino (comprese quelle rilevate da Matasci, 2002) è stata verificata l’esistenza degli aplotipi TI02LEL e TI02LEM. La loro presenza non era ritenuta certa a causa di mutazioni dubbie (vedi 1.3.). Ripetendo il sequenziamento del prodotto purificato si è potuta dimostrare l’esistenza di queste sostituzioni. Il collocamento delle sequenze ticinesi a livello mondiale è stato effettuato tenendo conto di 30 sequenze depositate in GenBank (Tab. 23). Tab. 23: Sequenze del gene NP di TSWV depositate in GenBank (modificato da Matasci, 2002). Nome LE 98527 TSWVBL TSWV10W TSWVH TSWVHI 2 TSWVIT Spain3 TSWV10 TSWVGACC TSWVGAPP TSWVGAWC TSWVGAGC TSWVGAMC TSWVGAPT TSWVGATC TSWVGAAC TSWVGATO TSWVBR01 Nazione Germania Hawaii Hawaii Hawaii Hawaii Italia Spagna USA4 Georgia Georgia Georgia Georgia Georgia Georgia Georgia Georgia Georgia Brasile Ceppo TSWV TSWVBL TSWV10W TSWVD C27084 Olanda Cechia TSWVD TOSPOG TOSPOC JAP 8Hip9612 20 Da961 TSWVL3 Taiwan Taiwan Giappone Bulgaria Bulgaria Bulgaria GD98 Bulg975 BS97 980472 Bulgaria Bulgaria Bulgaria Sud Africa Italy Isolato LE 98/527 CC WC GC MC TC AC CPNH9 Ospite Lysimachia Lattuga ? ? ? Pomodoro ? Arachide Tabacco Peperone Tabacco Tabacco Tabacco Arachide Tabacco Tabacco Pomodoro Tabacco C27084 Dalia Zantdeschia L T304 LC TSWV10 TSWV TSWV TOSPOG TOSPOC 8Hip 96 12 20 Da 96/1 ? ? ? Hippeastrum Dalia Tabacco GD98 97 BS97 98 / 0472 Tabacco Pomodoro Tabacco Patata Referenza Heinze et al., 2001 Jain et al., 1998 Jain et al., 1998 Gubba, 20001 Jain et al., 1998 Vaira et al., 1995 Guerra-Sanz1 Qiu et al., 1998 Pappu et al ,1998 Jain et al., 1998 Pappu et al ,1998 Pappu et al ,1998 Pappu et al ,1998 Jain et al., 1998 Pappu et al ,1998 Pappu et al ,1998 Jain et al., 1998 de Haan et al., 1991 de Haan 1989, 1990 Qiu et al., 1998 Adam et al., 1996 Heinze et al., 2001 Kato, 20001 Kato, 20001 Tsuda et al., 1994 Heinze et al., 2001 Heinze et al., 2001 Maiss et al., 1991 de Haan et al.,1990 Heinze et al., 2001 Heinze et al., 2001 Heinze et al., 2001 Heinze et al., 2001 Accession number AJ297611 L20953 L20887 AF306490 X61799 Z 36882 X94550 AF 020669 AF 064470 AF 048716 AF 064474 AF 064471 AF 064472 AF 048715 AF 064473 AF 064469 AF 048714 D 00645 AF 020660 AJ296599 AB038342 AB038341 AB 010997 AJ296601 AJ297602 D 13926 AJ297609 AJ296598 AJ297610 AJ296600 1 Non pubblicato Citato anche come hiL e TSWVL 3 Anonimo in GenBank 4 Nessuna indicazione ulteriore 5 Citato anche come 97To97 ? Dati mancanti 2 40 Le analisi filogenetiche sono state effettuate senza prendere in considerazione gli aplotipi TI02ME03 e TI02LR21, considerevolmente più corti (Fig. 12), poiché rendono meno visibili le differenze fra gli altri aplotipi. In appendice sono rappresentati i dendogrammi basati sulle sequenze nucleotidiche e aminoacidiche di tutti gli aplotipi ticinesi, compresi TI02ME03 e TI02LR21e di 30 sequenze pubblicate in GenBank (Fig. 3A e Fig. 4A). La sequenza TI02LC28 contiene una N alla 60esima base della sequenza forward, rispettivamente base numero 502 della sequenza reverse, a causa della presenza di due segnali sovrapposti (Fig. 13). Per mancanza di tempo non è stato possibile risequenziare il prodotto per stabilire quale delle due basi (C o T) è effettivamente presente o per eventualmente confermare l’esistenza di un’infezione mista nell’isolato in questione. Se ci fosse solo la base T, l’aplotipo sarebbe identico a TI01TO01; se ci fosse invece solo la base C, l’aplotipo non sarebbe identico a nessuno di quelli trovati finora. Il programma MEGA considera uguali le sequenze TI02LC28 e TI01TO01 a causa della presenza di questa N e non segnala quindi nessuna differenze fra le due sequenze (Tab. 24 e Tab. 27). Fig. 13: Cromatogramma della sequenza reverse di TSWV dell’aplotipo TI02LC28, rilevato in un campione di lattuga cappuccio prelevato a Muzzano nel 2002. N indica la presenza di due segnali sovrapposti (C e T). 3.6.1. VARIABILITÀ DELLE SEQUENZE 3.6.1.1. SEQUENZE TROVATE DURANTE QUESTA RICERCA Paragonando fra loro i 28 aplotipi trovati nel 2002 e 2003 si arriva ad un massimo di sette nucleotidi diversi (Tab. 24) e di cinque aminoacidi diversi (Tab. 25). La sequenza TI02LC28 risulta identica a TI01TO01 a causa della presenza di una N (vedi 3.6.). La maggior parte delle sostituzioni sono sinonime; non portano quindi ad un cambiamento dell’aminoacido codificato (Tab. 26). 41 3.6.1.2. SEQUENZE DI TUTTI GLI ISOLATI TICINESI Prendendo in considerazione tutti gli aplotipi trovati in Ticino, quindi anche i nove rinvenuti da Matasci (2002) e non più ritrovati in questa ricerca, si ottengono i risultati seguenti: confrontando a due a due i 37 aplotipi si raggiungono un massimo di 21 nucleotidi diversi (Tab. 24) e di sette aminoacidi diversi (Tab. 25). La maggior parte delle sostituzioni sono sinonime e non portano ad un cambiamento dell’aminoacido codificato (Tab. 26). In appendice sono indicate le posizioni degli aminoacidi sostituiti rispetto a quelli presenti in TI01TO01 (Tab. 3A). TI02ME02 TI02LEL TI02LEI TI02TOH TI01TOG TI01TOF TI01TOE TI01TOC TI01TOB TI03FQ30 TI03FQ29 TI02LC28 TI02FQ27 TI02FQ26 TI02FQ25 TI02FQ24 TI02LB23 TI02LR22 TI02LR20 TI02LR19 TI02LR18 TI02LR17 TI02CO16 TI02CO15 TI02CO14 TI02CO13 TI02CO12 TI02SM11 TI02FO10 TI02FO09 TI02FO08 TI02CR07 TI02CR06 TI02CR05 TI02ME04 TI02ME02 TI01TO01 Tab. 24: Numero di nucleotidi diversi tra tutti gli aplotipi di TSWV rilevati in Ticino. 1 TI02ME04 1 2 TI02CR05 1 2 2 TI02CR06 1 2 2 TI02CR07 2 3 3 3 3 TI02FO08 1 2 2 2 2 3 TI02FO09 1 2 2 2 2 3 2 TI02FO10 1 2 2 2 2 3 2 2 TI02SM11 1 2 2 2 2 3 2 2 2 TI02CO12 4 5 5 5 5 6 5 5 5 5 TI02CO13 1 2 2 2 2 3 2 2 2 2 3 TI02CO14 2 3 3 3 3 4 3 3 3 3 6 3 TI02CO15 3 4 4 4 4 5 4 4 4 4 7 4 5 TI02CO16 1 2 2 2 2 3 2 2 2 2 5 2 3 4 TI02LR17 1 2 2 2 2 3 2 2 2 2 5 2 3 4 2 TI02LR18 1 2 2 2 2 3 2 2 2 2 5 2 3 4 2 2 TI02LR19 1 2 2 2 2 3 2 2 2 2 5 2 3 4 2 2 2 TI02LR20 2 1 3 3 3 4 3 3 3 3 6 3 4 5 3 3 3 3 TI02LR22 2 3 3 3 3 4 3 3 3 3 6 3 4 5 3 3 3 3 TI02LB23 2 3 3 3 3 4 3 3 3 1 6 3 4 5 3 3 3 3 4 4 TI02FQ24 1 2 2 2 2 3 2 2 2 2 5 2 3 4 2 2 2 2 3 3 3 TI02FQ25 1 2 2 2 2 3 2 2 2 2 5 2 3 4 2 2 2 2 3 3 3 2 TI02FQ26 1 2 2 2 2 3 2 2 2 2 5 2 3 4 2 2 2 2 3 3 3 2 2 TI02FQ27 1 2 2 2 2 3 2 2 2 2 5 2 3 4 2 2 2 2 3 3 3 2 2 TI02LC28 0* 1 1 1 1 2 1 1 1 1 4 1 2 3 1 1 1 1 2 2 2 1 1 1 1 TI03FQ29 1 2 2 2 2 3 2 2 2 2 5 2 3 4 2 2 2 2 3 3 3 2 2 2 2 TI03FQ30 1 2 2 2 2 3 2 2 2 2 5 2 3 4 2 2 2 2 3 3 3 2 1 2 2 1 2 TI01TOB 16 17 17 17 17 18 17 17 17 17 20 17 18 17 17 17 17 17 18 16 18 17 17 17 17 15 17 TI01TOC 3 4 4 4 4 5 4 4 4 4 7 4 5 6 4 4 4 4 5 5 5 4 4 4 4 3 4 4 TI01TOE 16 17 17 17 17 18 17 17 17 17 20 17 18 17 17 17 17 17 18 16 18 15 17 17 17 15 17 17 10 17 TI01TOF 2 3 3 3 3 4 3 3 3 3 6 3 4 5 3 3 3 3 4 4 4 3 3 3 3 2 3 3 16 1 TI01TOG 3 4 4 4 4 5 4 4 4 4 7 4 5 6 4 4 4 4 5 5 5 4 4 4 4 3 4 4 17 2 17 1 TI02TOH 3 4 4 4 4 5 4 4 4 4 7 4 5 6 4 4 4 4 5 5 5 4 4 4 4 3 4 4 19 6 19 5 6 TI02LEI 4 5 5 5 5 6 5 5 5 5 8 5 6 7 5 5 5 5 6 6 6 5 5 5 5 4 5 5 18 1 18 2 3 TI02LEL 4 3 5 5 5 6 5 5 4 5 8 5 6 7 5 5 5 5 4 6 6 5 5 5 5 4 5 5 20 7 20 6 7 7 8 TI02LEM 17 18 18 18 18 19 18 18 18 18 21 18 19 18 18 18 18 18 19 15 19 18 18 18 18 16 18 18 1 18 11 17 18 20 19 2 4 2 1 17 17 16 7 21 * La sequenza TI02LC28 non è esattamente determinata. Se la base incerta non è presa in considerazione, risulta identica a TI01TO01. 42 TI02ME02 TI02LEL TI02LEI TI02TOH TI01TOG TI01TOF TI01TOE TI01TOC TI01TOB TI03FQ30 TI03FQ29 TI02LC28 TI02FQ27 TI02FQ26 TI02FQ25 TI02FQ24 TI02LB23 TI02LR22 TI02LR20 TI02LR19 TI02LR18 TI02LR17 TI02CO16 TI02CO15 TI02CO14 TI02CO13 TI02CO12 TI02SM11 TI02FO10 TI02FO09 TI02FO08 TI02CR07 TI02CR06 TI02CR05 TI02ME04 TI02ME02 TI01TO01 Tab. 25: Numero di aminoacidi diversi tra tutti gli aplotipi di TSWV rilevati in Ticino. 0 TI02ME04 0 0 TI02CR05 0 0 0 TI02CR06 1 1 1 TI02CR07 1 1 1 1 2 TI02FO08 0 0 0 0 1 1 TI02FO09 1 1 1 1 2 2 1 TI02FO10 1 1 1 1 2 2 1 2 TI02SM11 0 0 0 0 1 1 0 1 1 TI02CO12 4 4 4 4 5 5 4 5 5 4 TI02CO13 1 1 1 1 2 2 1 2 2 1 3 TI02CO14 1 1 1 1 2 2 1 2 2 1 5 2 TI02CO15 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 4 1 1 TI02CO16 1 1 1 1 2 2 1 2 2 1 5 2 2 1 TI02LR17 1 1 1 1 2 2 1 2 2 1 5 2 2 1 2 TI02LR18 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 4 1 1 0 1 1 TI02LR19 1 1 1 1 2 2 1 2 2 1 5 2 2 1 2 2 1 TI02LR20 1 1 1 1 2 2 1 2 2 1 5 2 2 1 2 2 1 2 TI02LR22 1 1 1 1 2 2 1 2 2 1 5 2 2 1 2 2 1 2 TI02LB23 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 4 1 1 0 1 1 0 1 1 1 TI02FQ24 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 4 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 TI02FQ25 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 4 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 TI02FQ26 1 1 1 1 2 2 1 2 2 1 5 2 2 1 2 2 1 2 2 2 1 1 1 TI02FQ27 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 4 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 TI02LC28 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 4 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 TI03FQ29 1 1 1 1 2 2 1 2 2 1 5 2 2 1 2 2 1 2 2 2 1 1 1 2 1 1 TI03FQ30 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 4 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 TI01TOB 1 1 1 1 2 2 1 2 2 1 5 2 2 1 2 2 1 2 2 2 1 1 1 2 1 1 2 1 TI01TOC 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 4 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 TI01TOE 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 4 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 TI01TOF 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 4 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 TI01TOG 1 1 1 1 2 2 1 2 2 1 5 2 2 1 2 2 1 2 2 2 1 1 1 2 1 1 2 1 2 1 1 1 TI02TOH 3 3 3 3 4 4 3 4 4 3 7 4 4 3 4 4 3 4 4 4 3 3 3 4 3 3 4 3 4 3 3 3 4 TI02LEI 1 1 1 1 2 2 1 2 2 1 5 2 2 1 2 2 1 2 2 2 1 1 1 2 1 1 2 1 2 1 1 1 2 TI02LEL 1 1 1 1 2 2 1 2 1 1 5 2 2 1 2 2 1 2 2 2 1 1 1 2 1 1 2 1 2 1 1 1 2 4 2 TI02LEM 2 2 2 2 3 3 2 3 3 2 6 3 3 2 3 3 2 3 3 1 2 2 2 3 2 2 3 2 1 2 2 2 3 5 3 1 2 1 1 0 4 3 TI02CO12 TI02CO13 TI02CO14 TI02CO15 TI02CO16 TI02LR17 TI02LR18 TI02LR19 TI02LR20 TI02LR22 TI02LB23 TI02FQ24 TI02FQ25 TI02FQ26 TI02FQ27 TI02LC28 TI03FQ29 TI03FQ30 TI01TOB TI01TOC TI01TOE TI02LEL TI02LEM 1 2 1 1 1 1 4 1 2 3 1 1 1 1 2 2 2 1 1 1 1 0 1 1 16 3 16 2 3 3 4 4 17 0 1 1 0 1 1 0 4 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 3 1 1 2 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 0 1 3 0 0 1 0 1 1 2 1 1 0 1 0 0 1 15 3 16 2 2 0 3 3 15 TI02LEI TI02SM11 1 0 TI02TOH TI02FO10 1 0 TI01TOG TI02FO09 1 TI01TOF TI02FO08 3 TI02CR07 Sost. syn TI02CR06 2 TI02CR05 1 TI02ME04 TI01TO01 nt TI01TO01 aa TI02ME02 Tab. 26: Sostituzioni sinonime tra tutti gli aplotipi di TSWV trovati in Ticino, calcolate con il metodo di Nei-Gojobori. 1 Differenze nucleotidiche tra TI01TO01 e gli altri aplotipi Differenze aminoacidiche tra TI01TO01 e gli altri aplotipi 3 Sostituzioni sinonime = differenze nucleotidiche - differenze aminoacidiche 2 3.6.1.3. CONFRONTO TRA SEQUENZE TICINESI E SEQUENZE PUBBLICATE Prendendo in considerazione anche 30 sequenze del gene NP pubblicate in GenBank (Tab. 23), per un totale quindi di 67 sequenze, si ottengono i risultati seguenti: le differenze ottenute paragonando gli aplotipi sono al massimo di 27 nucleotidi (Tab. 27) e di otto aminoacidi (Tab. 28). 43 TI02ME02 2 TI02CR07 TI02FO08 TI02FO09 TI02FO10 TI02SM11 TI02CO12 TI02CO13 TI02CO14 TI02CO15 3 4 4 17 18 18 18 18 19 18 18 18 18 21 18 19 18 18 18 18 18 19 15 19 18 18 18 18 16 18 18 TI02LEI TI02LEL TI02LEM 4 6 6 9 Bulg97 BS97 980472 5 7 7 7 7 6 8 8 8 6 5 7 7 7 5 5 7 7 7 5 5 7 7 7 5 5 7 7 7 5 10 10 8 8 10 5 7 7 7 5 6 8 8 8 6 9 9 7 7 9 7 7 7 5 5 7 5 7 7 5 5 7 5 7 7 5 5 7 5 7 7 5 5 7 5 1 8 8 6 6 8 6 2 8 8 6 6 8 6 2 8 8 6 6 8 6 2 7 7 5 5 7 5 1 7 7 5 5 7 5 1 7 7 5 5 7 5 1 7 7 5 5 7 5 1 9 6 6 4 4 6 4 0 0 7 7 5 5 7 5 1 1 20 18 18 18 20 18 16 16 9 9 7 7 9 7 3 3 20 18 18 18 20 18 16 16 10 10 21 10 23 7 7 5 5 7 5 1 1 9 8 8 6 6 8 6 2 2 9 9 7 7 9 7 3 3 8 4 4 8 8 10 10 10 10 8 8 10 10 8 4 4 10 12 11 13 9 9 7 7 9 7 3 3 22 21 19 19 19 21 19 20 23 23 17 17 9 12 9 9 5 9 5 8 4 8 2 8 4 8 2 8 8 4 8 12 6 14 16 12 11 14 15 20 15 16 16 15 15 15 19 13 15 16 14 16 12 11 14 15 20 15 16 16 15 15 15 19 13 15 16 0 18 20 16 13 18 19 24 19 20 20 19 19 19 23 17 19 18 18 20 16 15 16 19 22 17 18 18 17 17 17 21 15 17 18 16 18 14 13 16 17 22 17 18 18 17 17 17 21 15 17 16 16 18 14 13 16 17 22 17 18 18 17 17 17 21 15 17 16 18 20 16 15 18 19 24 19 20 20 19 19 19 23 17 19 18 16 18 14 13 16 17 22 17 18 18 17 17 17 21 15 17 16 11 21 23 19 18 21 22 27 22 21 21 22 22 22 26 20 22 21 8 8 6 6 8 6 9 6 6 4 4 6 4 9 6 6 4 4 6 4 6 20 20 19 17 17 16 17 17 16 15 15 14 13 13 14 17 17 16 15 15 14 12 15 17 13 12 17 18 21 18 17 17 16 16 16 20 16 20 19 12 12 14 12 15 16 17 14 15 20 21 24 19 20 20 19 19 19 23 19 21 20 13 13 15 18 19 16 15 20 21 24 19 20 20 19 19 19 23 17 19 20 13 13 2 2 16 12 15 12 11 14 15 20 17 16 16 15 15 15 19 15 19 8 6 4 4 9 6 6 4 6 11 8 8 6 6 4 9 6 6 9 6 8 11 11 BS97 10 10 10 10 11 10 10 10 10 13 10 11 12 10 10 10 10 11 11 11 10 10 10 10 7 7 5 7 5 6 1 1 6 Bulg97 7 7 5 7 5 5 1 1 7 0 GD98 7 5 7 5 8 1 1 11 9 3 1 1 TSWVL3 5 5 3 1 6 4 5 2 2 9 17 13 15 11 10 13 16 13 13 9 3 20Da961 GD98 5 1 2 4 0 1 1 8Hip9612 TSWVL3 5 4 2 20Da961 6 1 1 3 2 2 C27084 5 1 1 7 5 3 JAP 5 1 1 12 6 5 TOSPOC 5 1 1 9 12 12 TOSPOG 5 2 3 4 1 2 12 13 13 13 13 14 13 13 13 11 16 13 14 13 13 13 13 13 14 12 12 13 13 13 12 12 13 13 19 13 19 12 11 15 14 16 1 1 8Hip9612 1 4 JAP 1 1 0 1 13 14 14 14 14 15 14 14 14 12 17 14 15 14 14 14 14 14 15 13 13 14 14 14 12 13 14 14 22 16 22 15 14 16 17 17 1 13 14 14 14 14 15 14 14 14 12 17 14 15 16 14 14 14 14 15 13 13 14 14 14 12 13 14 14 22 16 22 15 14 16 17 17 1 TOSPOC 2 TOSPOG 1 6 9 9 TSWVD C27084 1 7 6 6 7 6 TSWVBR01 1 0 TSWVD 17 11 7 7 10 13 10 13 TSWVGAAC 16 11 11 14 TSWVGATC 12 9 11 11 7 7 8 19 13 15 11 10 11 16 13 10 15 9 9 8 8 9 TSWVGAPT 16 12 15 15 16 10 12 16 10 12 17 11 13 TSWVGAGC 12 12 8 7 TSWVGAPP 13 9 8 3 20 14 16 12 11 14 17 15 11 13 TSWVGACC 13 4 7 TSWV10 14 6 2 5 14 10 12 11 Spain 17 16 14 12 TSWVIT 14 9 10 11 TSWVGAWC 15 14 18 17 19 14 15 17 16 18 17 15 13 TSWVGATO 1 16 17 17 17 17 18 17 17 17 17 20 17 18 17 17 17 17 17 18 16 18 17 17 17 17 15 17 17 16 17 16 16 17 19 18 20 TSWVBR01 6 LETTERATURA TSWVGAMC 9 2 4 15 16 16 16 16 17 16 16 16 16 19 16 17 18 16 16 16 16 17 15 17 16 16 16 16 14 16 16 15 18 15 17 16 18 19 19 15 5 TSWVHI 8 3 LE98/257 11 10 14 13 15 2 TSWVBL 9 16 TSWVH 12 3 TSWV10W 9 16 TSWVGATO 3 13 14 14 14 14 15 14 14 14 14 17 14 15 16 14 14 14 14 15 13 15 14 14 14 14 12 14 14 11 14 11 13 12 16 15 17 3 8 TSWVGAAC 2 7 7 19 20 20 20 20 21 20 20 20 20 23 20 21 20 20 20 20 20 21 19 21 20 20 20 20 18 20 20 15 20 11 19 18 22 21 23 3 7 3 6 TSWVGATC 3 6 2 5 15 16 16 16 16 17 16 16 16 16 19 16 17 16 16 16 16 16 17 15 17 16 16 16 16 14 16 16 11 16 3 20 1 18 11 17 18 20 19 21 7 18 19 17 TSWVGAPT 3 1 20 1 16 15 16 16 16 16 17 16 16 16 16 19 16 17 16 16 16 16 16 17 15 17 16 16 16 16 14 16 16 11 16 11 15 14 18 17 19 4 5 18 6 2 TSWVGAMC 4 5 5 19 17 15 16 16 16 16 17 16 16 16 16 19 16 17 16 16 16 16 16 17 15 17 16 16 16 16 14 16 16 11 16 11 15 14 18 17 19 4 4 5 4 4 TSWVGAGC 3 5 4 4 4 16 17 17 17 17 18 17 17 17 17 20 17 18 17 17 17 17 17 18 16 18 17 17 17 17 15 17 17 12 17 12 16 15 19 18 20 3 5 5 3 3 16 17 17 17 17 18 17 17 17 17 20 17 18 17 17 17 17 17 18 16 18 17 17 17 17 15 17 17 12 17 12 16 15 19 18 20 3 5 5 4 4 TSWVGAWC 3 5 5 4 4 3 TSWVGAPP 5 6 5 4 4 3 15 16 16 16 16 17 16 16 16 16 19 16 17 16 16 16 16 16 17 15 17 16 16 16 16 14 16 16 13 18 13 17 16 18 19 19 4 6 6 4 4 2 TSWVGACC 3 4 6 5 5 3 3 20 21 21 21 21 22 21 21 21 21 24 21 22 21 21 21 21 21 22 20 22 21 21 21 21 19 21 21 16 21 16 20 19 23 22 24 6 5 6 5 5 3 4 TSWV10 3 5 5 5 5 3 4 15 16 16 16 16 17 16 16 16 16 19 16 17 16 16 16 16 16 17 15 17 16 16 16 16 14 16 16 13 16 13 15 16 18 17 19 3 5 5 4 4 3 4 Spain 3 5 5 4 4 4 4 2 14 15 15 15 15 16 15 15 15 15 18 15 16 15 15 15 15 15 16 14 16 13 15 15 15 13 15 15 3 7 5 4 4 4 5 2 2 TSWVIT 4 6 7 4 4 4 5 1 11 12 12 12 12 13 12 12 12 12 15 12 13 12 12 12 12 12 13 11 13 12 12 12 12 10 12 12 3 5 6 6 6 3 5 2 2 1 TSWVHI 3 8 5 5 5 3 4 3 2 12 13 13 13 13 14 13 13 13 13 16 13 14 13 13 13 13 13 14 12 14 13 13 13 13 11 13 13 10 13 10 12 11 15 14 16 3 5 8 4 4 3 4 3 3 1 2 TSWVH 3 4 5 7 7 3 4 3 3 2 2 5 5 4 4 5 4 2 3 2 3 3 14 15 15 15 15 16 15 15 15 15 18 15 16 15 15 15 15 15 16 14 16 15 15 15 15 13 15 15 12 15 12 14 13 17 16 18 5 5 4 4 4 6 2 2 2 3 3 16 17 17 17 17 18 17 17 17 17 20 17 18 17 17 17 17 17 18 16 18 17 17 17 17 15 17 17 14 17 14 16 15 19 18 20 6 5 4 4 3 5 2 2 1 3 3 TSWV10W 5 6 4 4 6 4 2 2 1 2 2 3 TI02LEL TSWVBL 5 5 5 5 3 7 4 2 1 2 2 3 TI02LEM LE98/257 5 5 4 4 3 4 3 4 1 2 2 2 3 TI02LEI 3 5 4 4 3 4 2 3 3 2 2 2 3 2 TI02TOH 5 4 4 3 4 5 2 2 4 4 2 2 TI01TOG 4 4 4 2 5 1 3 3 2 2 3 3 TI01TOF 4 3 5 2 2 4 2 2 4 2 3 1 3 17 TI02TOH 3 4 2 2 1 5 5 3 4 3 3 3 16 TI01TOG 3 4 2 2 1 2 2 2 3 5 3 TI01TOE 3 4 3 2 1 2 2 5 2 4 5 3 2 4 2 4 2 3 1 2 2 2 5 3 4 5 4 16 17 17 17 17 18 17 17 17 17 20 17 18 17 17 17 17 17 18 16 18 15 17 17 17 15 17 17 10 17 TI01TOF 2 TI01TOE 1 3 2 2 2 2 2 2 2 6 3 4 4 4 1 TI01TOC 2 2 1 3 3 2 2 1 6 3 3 2 16 17 17 17 17 18 17 17 17 17 20 17 18 17 17 17 17 17 18 16 18 17 17 17 17 15 17 17 1 TI01TOB 2 2 1 2 2 2 2 3 3 6 2 1 1 2 TI03FQ30 2 1 2 2 3 2 3 3 3 5 3 3 2 1 2 TI03FQ29 1 2 2 2 3 3 3 3 2 2 2 0* 2 TI02LC28 2 2 2 2 4 3 3 2 5 3 1 3 TI02FQ27 4 1 2 2 3 4 3 2 2 2 2 3 TI02FQ26 2 2 3 3 4 2 2 5 4 1 4 TI02FQ25 2 3 3 3 3 2 2 3 1 3 TI02FQ24 3 3 3 2 2 2 5 7 3 2 2 TI02LB23 3 3 2 3 2 2 2 2 TI02LR22 1 2 2 2 2 2 2 TI02LR20 2 2 3 2 4 3 4 1 2 2 2 4 3 TI02LR19 2 2 3 4 4 1 2 2 4 3 2 6 TI02LR18 2 2 5 3 2 5 2 1 2 4 3 2 5 5 TI02LR17 2 4 4 3 6 2 2 1 4 3 3 3 2 TI02CO16 4 3 2 5 2 2 2 3 3 3 2 5 2 2 2 2 2 TI02CO15 3 2 5 2 2 2 2 3 2 2 5 2 2 2 2 3 TI02CO14 2 TI02LR17 1 2 TI02LR18 TI02CO13 4 TI02CO16 4 5 TI02LR19 TI02CO12 3 TI02LR20 1 3 TI02LR22 TI02SM11 5 TI02LB23 1 2 TI02FQ24 TI02FO10 2 TI02FQ25 1 2 TI02FQ26 TI02FO09 3 TI02FQ27 1 3 TI02LC28 TI02FO08 2 TI02CR06 3 2 TI01TOB 2 2 TI02CR05 2 TI02ME04 2 TI03FQ29 TI02CR07 1 TI03FQ30 1 TI02CR05 TI01TOC TI02CR06 1 1 TI02ME04 TI01TO01 TI02ME02 TICINO Tab. 27: Numero di nucleotidi diversi tra tutti gli aplotipi di TSWV rilevati in Ticino e quelli pubblicati in GenBank. * La sequenza TI02LC28 non è esattamente determinata. Se la base incerta non è presa in considerazione, risulta identica a TI01TO01. 44 2 1 0 1 4 3 2 2 2 2 2 3 2 3 2 0 0 2 3 1 2 3 1 2 4 TSWVH TSWVHI TSWVIT Spain TSWV10 TSWVGACC TSWVGAPP TSWVGAWC TSWVGAGC TSWVGAMC TSWVGAPT TSWVGATC TSWVGAAC TSWVGATO TSWVBR01 TSWVD C27084 TOSPOG TOSPOC JAP 8Hip9612 20Da961 TSWVL3 GD98 Bulg97 3 2 4 2 3 2 4 2 1 3 4 3 5 3 2 4 3 4 3 5 3 2 4 3 2 3 2 4 2 1 3 2 1 3 4 3 5 3 2 4 3 2 4 3 4 3 5 3 2 4 3 2 4 3 1 3 2 4 2 1 3 2 1 3 2 0 0 7 6 8 6 5 7 6 5 7 6 4 4 6 4 3 5 3 2 4 3 2 4 3 1 1 3 4 4 3 5 3 2 4 3 2 4 3 1 1 3 4 3 3 2 4 2 1 3 2 1 3 2 0 0 2 3 2 3 4 3 5 3 2 4 3 2 4 3 1 1 3 4 3 4 3 4 3 5 3 2 4 3 2 4 3 1 1 3 4 3 4 3 3 3 2 4 2 1 3 2 1 3 2 0 0 2 3 2 3 2 2 2 4 3 5 3 2 4 3 2 4 3 1 1 3 4 3 4 3 3 3 3 4 3 5 3 2 4 3 2 4 3 1 1 3 4 3 4 3 3 3 3 3 4 3 5 3 2 4 3 2 4 3 1 1 3 4 3 4 3 3 3 3 3 4 3 2 4 2 1 3 2 1 3 2 0 0 2 3 2 3 2 2 2 2 2 3 4 3 2 4 2 1 3 2 1 3 2 0 0 2 3 2 3 2 2 2 2 2 3 4 1 3 2 4 2 1 3 2 1 3 2 0 0 2 3 2 3 2 2 2 2 2 3 4 1 0 4 3 5 3 2 4 3 2 4 3 1 1 3 4 3 4 3 3 3 3 3 4 5 2 1 2 3 2 4 2 1 3 2 1 3 2 0 0 2 3 2 3 2 2 2 2 2 3 4 1 0 1 2 3 2 4 2 1 3 2 1 2 2 0 0 2 3 2 3 2 2 2 2 2 3 4 1 0 1 2 4 4 3 5 3 2 4 3 2 4 3 1 1 3 4 3 4 3 3 3 3 3 4 5 2 1 2 3 5 3 2 4 2 1 3 2 1 3 2 0 0 2 3 2 3 2 2 2 2 2 3 4 1 0 1 2 4 3 4 3 5 3 2 4 3 2 4 3 1 1 3 4 3 4 3 3 3 3 3 4 5 2 1 2 3 5 4 3 2 4 2 1 3 2 1 3 2 0 0 2 3 2 3 2 2 2 2 2 3 4 1 0 1 2 4 3 0 3 2 4 2 1 3 2 1 3 2 0 0 2 3 2 3 2 2 2 2 2 3 4 1 0 1 2 4 3 0 3 2 4 2 1 3 2 1 3 2 0 0 2 3 2 3 2 2 2 2 2 3 4 1 0 1 2 4 3 0 2 4 3 5 3 2 4 3 0 2 1 1 1 3 2 1 2 1 1 1 1 1 2 3 2 1 0 1 3 2 1 3 2 2 4 4 4 6 5 7 5 4 6 5 4 6 5 3 3 5 6 5 6 5 5 5 5 5 6 7 4 3 4 5 7 6 3 5 2 4 3 5 3 2 4 3 2 4 3 1 1 3 4 3 4 3 3 3 3 3 4 5 2 1 2 3 5 4 1 3 1 3 4 3 5 3 2 4 3 2 4 3 1 1 3 4 3 4 3 3 3 3 3 4 5 2 1 2 3 5 4 2 5 5 4 6 4 3 5 4 3 5 4 2 2 4 5 4 5 4 4 4 4 4 5 6 3 2 3 4 6 3 4 3 2 4 2 1 3 2 1 3 2 0 0 2 3 2 3 2 2 2 2 2 3 4 1 0 1 2 3 6 5 7 5 4 6 5 2 4 3 3 3 5 4 3 4 3 3 3 3 3 4 5 4 3 2 1 7 6 8 6 5 7 6 3 5 4 4 4 6 5 4 5 4 4 4 4 4 5 6 5 4 3 2 5 4 6 4 3 5 4 1 3 2 2 2 4 3 2 3 2 2 2 2 2 3 4 3 2 1 1 2 4 3 5 3 2 4 3 0 2 1 1 1 3 2 1 2 1 1 1 1 1 2 3 1 4 3 2 4 2 1 3 2 1 3 2 0 0 2 3 2 3 2 2 2 2 2 3 5 4 4 3 5 3 2 4 3 2 4 3 1 1 3 4 3 4 3 3 3 3 3 3 7 6 8 6 5 7 6 3 5 4 4 4 6 3 2 3 2 2 2 2 2 6 5 7 5 4 6 5 2 4 3 3 3 5 2 1 2 1 1 1 1 1 0 5 4 6 4 3 5 4 1 3 2 2 2 4 1 0 1 0 0 0 5 4 6 4 3 5 4 1 3 2 2 2 4 1 0 1 0 0 0 5 4 6 4 3 5 4 1 3 2 2 2 4 1 0 1 0 0 1 0 5 4 6 4 3 5 4 1 3 2 2 2 4 1 0 1 5 4 6 4 3 5 4 1 3 2 2 2 4 1 0 6 5 7 5 4 6 5 2 4 3 3 3 5 2 1 5 4 6 4 3 5 4 1 3 2 2 2 4 1 5 6 5 7 5 4 6 5 2 4 3 3 3 2 2 3 2 4 2 1 3 2 3 5 4 0 3 2 4 2 1 3 2 1 3 2 3 2 4 2 1 3 2 1 3 2 5 4 6 4 3 5 4 1 1 6 5 7 5 4 6 5 2 5 3 5 3 2 4 3 1 3 3 2 4 2 2 4 3 5 3 2 1 3 1 4 3 2 5 4 3 BS97 3 2 4 2 1 3 2 2 4 2 1 1 2 7 3 4 2 3 3 2 3 4 5 1 0 1 3 4 4 1 2 1 1 3 20Da961 1 3 2 1 4 3 0 1 3 3 6 4 3 2 3 3 2 4 5 2 0 1 2 5 3 0 2 1 1 JAP 2 1 3 3 1 0 3 4 2 7 3 3 2 3 3 3 5 2 1 1 2 4 3 1 1 1 1 TOSPOC 1 3 2 1 1 2 4 3 3 6 3 3 2 3 4 4 2 1 2 2 4 4 0 2 2 1 0 3 1 TOSPOG 3 2 0 1 3 3 3 4 2 6 3 3 2 4 5 1 1 2 3 4 3 0 3 1 2 3 C27084 2 0 0 3 4 2 4 3 2 6 3 3 3 5 2 0 2 3 5 3 1 2 2 1 4 0 0 1 TSWVD 0 0 2 4 3 3 3 3 2 6 3 4 4 2 1 1 3 5 3 0 2 1 2 3 1 2 TSWVBR01 0 2 3 3 4 2 3 3 2 6 4 5 1 1 2 2 5 4 0 3 1 1 4 1 1 1 TSWVGATO 2 3 2 4 3 2 3 3 2 7 5 2 0 2 3 4 4 0 2 2 1 3 2 0 0 0 TSWVGAAC 3 2 3 3 3 2 3 3 3 8 2 1 1 3 5 4 1 2 1 2 3 1 1 1 TSWVGATC 2 3 2 3 3 2 3 4 4 5 1 2 2 5 3 1 2 1 1 4 1 0 1 1 2 TSWVGAPT 3 2 2 3 3 2 4 5 1 4 2 3 4 4 1 1 1 1 3 2 0 0 1 TSWVGAMC 2 2 2 3 3 3 5 2 0 5 3 5 4 0 3 2 1 3 1 1 0 0 1 0 1 TSWVGAGC 2 2 2 3 4 4 2 1 1 6 5 3 1 3 2 2 3 1 0 1 0 1 TSWVGAWC 2 2 2 4 5 1 1 2 2 8 4 1 2 2 2 4 1 0 0 1 0 0 1 TSWVGAPP 2 2 3 5 2 0 2 3 4 4 0 3 1 2 4 2 0 0 0 2 1 2 1 1 TSWVGACC 2 3 4 2 1 1 3 5 7 1 3 2 1 4 2 1 0 0 1 0 1 0 0 1 TSWV10 3 4 1 1 2 2 5 3 1 2 2 2 3 2 1 1 0 1 0 1 0 0 1 0 Spain 4 1 0 2 3 4 4 4 3 1 2 4 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 TSWVIT 1 0 1 3 5 4 0 3 2 1 4 2 0 1 1 2 1 2 1 1 2 TSWVHI 0 1 2 5 3 1 6 2 2 3 2 1 0 1 2 1 1 1 TSWVH 1 2 4 4 1 2 5 2 4 1 1 1 0 2 1 2 1 1 2 1 TSWV10W 2 4 4 0 3 1 5 4 2 0 1 1 1 1 1 2 1 TSWVBL 4 3 1 3 1 1 7 2 1 0 1 2 0 2 1 1 2 1 1 1 2 2 8Hip9612 3 4 TSWV10W 3 1 2 2 2 3 5 1 1 0 2 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 LE98/257 3 0 3 1 2 4 1 4 1 1 1 1 2 1 1 2 1 1 1 2 2 2 1 TSWVL3 980472 3 TSWVBL 0 3 2 1 4 2 0 4 1 2 0 2 1 1 2 1 1 1 2 2 2 1 2 TI02LEM 0 2 2 2 3 2 1 0 4 2 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 GD98 2 0 LE98/257 2 1 2 4 1 1 1 0 5 1 2 1 1 2 1 1 1 2 2 2 1 2 2 1 TI02LEL 2 1 1 4 2 0 1 1 1 4 2 1 1 2 1 1 1 2 2 2 1 2 2 1 2 TI02LEI 1 1 3 2 1 0 1 2 0 5 4 4 5 4 4 4 5 5 5 4 5 5 4 5 TI02TOH 1 3 1 1 1 0 2 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 3 TI01TOG 3 1 0 1 1 1 1 2 1 1 2 1 1 1 2 2 2 1 2 2 0 1 1 TI01TOF 1 0 0 1 2 0 2 1 1 2 1 1 1 2 2 2 1 2 2 1 TI01TOE 0 0 0 2 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 4 TI01TOC 0 0 1 1 2 1 1 2 1 1 1 2 2 2 1 2 2 0 2 2 5 TI01TOB 0 1 0 2 1 1 2 1 1 1 2 2 2 1 2 2 1 2 TI03FQ30 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 TI03FQ29 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 2 2 5 1 TI02LC28 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 2 1 LETTERATURA Bulg97 BS97 2 0 TI02FQ27 TI02LEM 1 TI02FQ26 1 0 TI02FQ25 TI02LEL 0 TI02FQ24 1 0 TI02LB23 TI02LEI 1 TI02LR22 3 1 TI02LR20 TI02TOH 1 TI02LR19 1 0 TI02LR18 TI01TOG 1 TI02LR17 0 1 TI02CO16 0 1 2 2 TI02CO14 TI01TOF 0 TI02CO15 1 2 4 0 1 TI02CO13 1 1 5 TI02CO15 0 1 TI02CO14 1 5 1 TI02CO12 1 4 1 2 2 TI02LR17 TI01TOE 1 TI02CO13 4 1 TI02SM11 4 0 1 TI02CO16 0 4 TI02CO12 0 2 TI02FO10 0 1 TI02LR18 TI01TOC 0 TI02SM11 1 2 2 1 TI02FO09 1 1 1 TI02LR19 1 1 TI02FO10 1 TI02FO08 1 1 0 TI02LR20 TI01TOB 1 TI02FO09 1 1 0 TI02CR07 0 TI02LR22 0 0 TI02FO08 0 TI02CR06 1 TI02CR05 1 TI02ME04 0 TI02LB23 TI03FQ30 1 TI02CR07 TI02ME02 0 TI02FQ24 0 1 TI02FQ25 1 0 TI02CR06 TI02FQ26 TI03FQ29 0 TI02CR05 TI02FQ27 TI02LC28 0 TI02ME04 TI01TO01 TI02ME02 TICINO Tab. 28: Numero di aminoacidi diversi tra tutti gli aplotipi di TSWV rilevati in Ticino e quelli pubblicati in GenBank. 45 3.6.2. DENDOGRAMMI BASATI SULLE SEQUENZE NUCLEOTIDICHE 3.6.2.1. SEQUENZE TROVATE DURANTE QUESTA RICERCA Il dendogramma ottenuto con 28 sequenze della lunghezza di 513 nucleotidi si suddivide in due gruppi principali; il valore bootstrap di questa suddivisione è del 68 %. Un gruppo racchiude le sequenze TI02CO12 e TI02CO13; l’altro comprende 26 sequenze. Due sequenze risultano uguali tra loro (TI01TO01 e TI02LC28) (Fig. 14). 3.6.2.2. SEQUENZE DI TUTTI GLI ISOLATI TICINESI Gli aplotipi di TSWV presenti in Ticino possono essere suddivisi in due gruppi principali. La suddivisione è supportata da un valore bootstrap del 99 %. Il primo gruppo, chiamato TICINO 1, comprende 34 aplotipi: i 28 trovati presso l’Azienda All’Orto durante questa ricerca più TI02TOH, TI02LEL, TI01TOF, TI01TOG, TI02LEI e TI01TOC. Il secondo gruppo, TICINO 2, racchiude gli aplotipi TI01TOE, TI02LEM e TI01TOB (Fig. 15). Presso l’Azienda All’Orto erano stati trovati in precedenza anche gli aplotipi TI01TOE, TI01TOF e TI01TOG (Matasci, 2002). 3.6.2.3. CONFRONTO TRA SEQUENZE TICINESI E SEQUENZE PUBBLICATE Confrontando 67 sequenze di TSWV (37 rilevate in Ticino e 30 disponibili in GenBank) si ottiene un dendogramma suddiviso in due gruppi principali. L’isolato brasiliano TSWVBR01 non appartiene a nessuno dei due. Uno dei due gruppi (valore bootstrap 91 %) può essere ulteriormente diviso in due sottogruppi; il primo (valore bootstrap 84 %) racchiude gli aplotipi del gruppo TICINO 1, l’isolato olandese TSWVD e quello ceco C27084 che risultano identici all’aplotipo ticinese TI01TO01 sul confronto di 513 nucleotidi, uno proveniente dalla Germania (LE98/257), sei dalla Bulgaria (8Hip9612, 20Da961, GD98, BS97, Bulg 97 e TSWVL3) e uno dal Sud Africa (980472). Il secondo sottogruppo (valore bootstrap 78 %) comprende due isolati provenienti da Taiwan (TOSPOG e TOSPOC) e uno dal Giappone (JAP). L’altro gruppo principale, supportato da un valore bootstrap relativamente basso (51 %), si divide in tre sottogruppi. Uno di questi (valore bootstrap 60 %) racchiude 10 isolati provenienti dagli Stati Uniti (TSWV10, TSWVGAMC, TSWVGAGC, TSWVGAPP, TSWVGAWC, TSWVGACC, TSWVGAPT, TSWVGATC, TSWVGAAC e TSWVGATO); un altro sottogruppo (valore bootstrap 52 %) contiene quattro isolati hawaiani (TSWVBL, TSWV10W, TSWVH e TSWVHI) e l’ultimo (valore bootstrap 63 %) raggruppa tre isolati ticinesi (TI01TOE, TI02LEM e TI01TOB) ed uno italiano (TSWVIT). L’isolato spagnolo non è associato a nessun sottogruppo (Fig. 16). 46 TI01TO01 TI02LC28 TI02CO15 TI02FQ25 63 TI03FQ30 TI02FO08 TI02ME04 TI02SM11 TI02LB23 TI02LR22 64 TI02CO16 TI02FO10 TI02LR18 TI02FQ24 TI02CR07 TI02FO09 TI02CO14 TI02CR06 TI02LR17 TI02FQ27 TI03FQ29 TI02LR20 65 TI02ME02 TI02CR05 TI02FQ26 TI02LR19 68 TI02CO12 TI02CO13 0.001 mutazioni/nucleotide 1 nucleotide Fig. 14: Dendogramma basato sulla sequenza di 513 nucleotidi del gene NP di TSWV degli aplotipi ticinesi trovati in questa ricerca. I valori posti sopra i rami sono percentuali generate dalla statistica bootstrap su un totale di 1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza filogenetica. 47 TI02CO12 67 TI02CO13 TI02CR05 TI02LR19 TI02FQ26 TI02ME04 TI01TO01, TI02LC28 TI02TOH TI02FO09 TI02SM11 64 TI02LB23 TI02LR17 TI03FQ29 TI02CR07 TI02LR18 TI02CO14 TICINO 1 TI02FQ25 64 TI03FQ30 TI02CO16 TI02CR06 TI02FO10 TI02LEL 53 TI02LR20 TI02ME02 TI02FQ27 TI02FO08 TI02FQ24 TI02LR22 TI02CO15 TI01TOF 99 85 52 TI01TOG TI02LEI 68 TI01TOC TI01TOE TI02LEM TICINO 2 99 TI01TOB 0.005 mutazioni/nucleotide 1 nucleotide Fig. 15: Dendogramma basato sulla sequenza di 513 nucleotidi del gene NP di TSWV di tutti gli aplotipi ticinesi. I valori posti sopra i rami sono percentuali generate dalla statistica bootstrap su un totale di 1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza filogenetica. 48 TI02LR20 TI02ME02 TI02LEL TI02FO10 TI02CR05 TI02LR17 TI02LR19 TI02CR06 TI02FO09 TI02CO16 TI02TOH TI01TO01 TI02ME04 TI02FQ26 C27084 TI02CO12 67 TI02CO13 TI02CR07 TSWVD TI03FQ29 TI02FO08 TI02CO14 TI02FQ25 64 TI03FQ30 TI02LR18 TI02FQ24 TI02LC28 TI02FQ27 TI02SM11 64 TI02LB23 TI02CO15 TI02LR22 LE98/257 TI01TOG 58 TI01TOF TI02LEI 53 73 TI01TOC 53 84 TSWVL3 60 91 TICINO 1 REP. CECA TICINO 1 OLANDA TICINO 1 GERMANIA TICINO 1 980472 Bulg97 8Hip9612 69 20Da961 GD98 78 96 87 TSWVHI TSWVH 85 51 51 60 54 TSWVBR01 TSWVGAPT TSWVGACC 62 TSWVGAPP TSWVGAWC TSWVGAMC TSWVGAGC BULGARIA GIAPPONE TAIWAN ITALIA TICINO 2 SPAGNA TSWVBL TSWV10W TSWVGATO TSWVGAAC 60 0.005 mutazioni/nucleotide BS97 JAP TOSPOG TOSPOC TI01TOE TI02LEM 99 TI01TOB Spain 63 52 TSWVIT S. AFRICA HAWAII TSWVGATC USA TSWV10 BRASILE 1 nucleotide Fig. 16: Dendogramma basato sulla sequenza di 513 nucleotidi del gene NP di TSWV di tutti gli aplotipi ticinesi e di 30 sequenze pubblicate in GenBank. I valori posti sopra i rami sono percentuali generate dalla statistica bootstrap su un totale di 1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza filogenetica. 49 3.6.3. DENDOGRAMMI BASATI SULLE SEQUENZE AMINOACIDICHE 3.6.3.1. SEQUENZE TROVATE DURANTE QUESTA RICERCA La traslazione delle sequenze riduce il numero di aplotipi diversi da 28 (basati sulle sequenze di 513 nucleotidi) a 15 (basati sulle sequenze di 171 aminoacidi). Le sequenze di aminoacidi codificati sono identiche per gli aplotipi TI01TO01, TI02ME02, TI02ME04, TI02CR05, TI02FO08, TI02SM11, TI02CO15, TI02LR18, TI02LB23, TI02FQ24, TI02FQ25, TI02FQ27, TI02LC28 e TI03FQ30 (Fig. 17). 3.6.3.2. SEQUENZE DI TUTTI GLI ISOLATI TICINESI Per effetto della traslazione il numero di aplotipi diversi si riduce da 37 (basati sulle sequenze nucleotidiche) a 21 (basati sulle sequenze aminoacidiche) (Fig. 18). Le sequenze di aminoacidi codificati sono identiche anche per gli aplotipi TI01TOC, TI01TOE e TI01TOF, oltre a quelli già indicati in precedenza (3.6.3.1). 3.6.3.3. CONFRONTO TRA SEQUENZE TICINESI E SEQUENZE PUBBLICATE La traslazione delle 67 sequenze (37 rilevate in Ticino e 30 disponibili in GenBank) riduce il numero di aplotipi a 40. Le sequenze di aminoacidi codificati sono identiche, oltre che per quelli già indicati in precedenza (3.6.3.1 e 3.6.3.2), anche per l’aplotipo olandese TSWVD, l’aplotipo italiano TSWVIT, l’aplotipo ceco C27084 e l’aplotipo germanico LE98/257. Il dendogramma è suddiviso in cinque gruppi principali: uno (valore bootstrap 64 %) racchiude gli isolati provenienti dalla Bulgaria (8Hip9612, 20Da961, GD98, BS97, Bulg 97 e TSWVL3), l’isolato brasiliano TSWVBR01 e quello proveniente dal Sud Africa (980472). Il secondo gruppo (valore bootstrap 53 %) contiene i due aplotipi ticinesi TI01TOB e TI02LEM. Un terzo racchiude gli aplotipi TI02CO12 e TI02CO13 (valore bootstrap 61 %). Il quarto raggruppa TI02LEL e TI02FO10 (valore bootstrap 62 %) e l’ultimo gruppo (valore bootstrap 61 %) può essere ulteriormente suddiviso in tre sottogruppi: uno con gli isolati provenienti da Taiwan (TOSPOC e TOSPOG) con un valore bootstrap del 62 %; un secondo sottogruppo (valore bootstrap 63 %) contenente tre isolati provenenti dalle Hawai ed un terzo (valore bootstrap 64 %) che contiene gli isolati americani TSWV10, TSWVGAMC, TSWVGAGC, TSWVGAPP, TSWVGAWC, TSWVGACC, TSWVGAPT, TSWVGATC, TSWVGAAC e TSWVGATO. Gli isolati TSWVGAMC, TSWVGAPP, TSWVGAPT, TSWVGAAC, TSWVGAWC e TSWVGAGC hanno la stessa composizione aminoacidica. Sono inoltre identiche fra loro le sequenze aminoacidiche degli aplotipi TI01TOG, JAP (proveniente dal Giappone) e TSWVHI (proveniente dalle Hawaii) che appartengono al quinto gruppo ma a nessun sottogruppo. Tutti gli altri aplotipi non sono associati a nessuno dei gruppi principali (Fig. 19). 50 TI02LC28 TI02CO15 TI02LR18 TI02ME02 TI03FQ30 TI02FQ24 TI02FO08 TI02ME04 TI01TO01 TI02FQ25 TI02SM11 TI02LB23 TI02CR05 TI02FQ27 TI02LR19 TI02CR07 TI02LR17 TI02FO09 TI02CO16 TI03FQ29 TI02FQ26 TI02CR06 TI02FO10 TI02LR20 65 TI02LR22 TI02CO14 TI02CO13 65 0.005 mutazioni/aminoacido TI02CO12 1 aminoacido Fig. 17: Dendogramma basato sulla sequenza di 171 aminoacidi del gene NP di TSWV degli aplotipi ticinesi trovati in questa ricerca. I valori posti sopra i rami sono percentuali generate dalla statistica bootstrap su un totale di 1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza filogenetica. 51 TI02TOH TI02LR18 TI02LB23 TI02CR05 TI01TO01 TI02ME02 TI03FQ30 TI02LC28 TI02CO15 TI02FQ27 TI02FQ24 TI02ME04 TI02FQ25 TI02FO08 TI02SM11 TI01TOF TI01TOE TI01TOC TI02LR17 TI01TOG TI02LEI TI02LR20 TI02FO09 TI02CO14 TI02LR22 TI02FQ26 TI02CO16 TI02CR07 TI03FQ29 TI02LR19 TI02CR06 TI02LEL 66 64 TI02FO10 TI02LEM 52 TI01TOB TI02CO12 TI02CO13 0.005 mutazioni/aminoacido 1 aminoacido Fig. 18: Dendogramma basato sulla sequenza di 171 aminoacidi del gene NP di TSWV di tutti gli aplotipi ticinesi. I valori posti sopra i rami sono percentuali generate dalla statistica bootstrap su un totale di 1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza filogenetica. 52 8Hip9612 Bulg97 64 20Da961 BULGARIA 980472 S. AFRICA TSWVL3 BS97 GD98 BRASILE TSWVBR01 TI02LEM 53 TI01TOB 61 TI02CO12 TICINO TI02CO13 TI02TOH SPAGNA Spain TI02CO14 TI02LR22 TI02CR07 TI02LR17 TI02FO09 TI02LEI TICINO TI03FQ29 TI02LR20 TI02FQ26 TI02CO16 TI02LR19 TI02CR06 62 TI02LEL LE98/257 TI02FO10 GERMANIA ITALIA OLANDA REP.CECA TSWVIT TSWVD C27084 TI01TOC TI01TOF TI01TOE TI02CR05 TI02LB23 TI01TO01 TI02FO08 TI02ME02 TICINO TI02FQ27 TI02FQ24 TI02FQ25 TI03FQ30 TI02ME04 TI02LR18 TI02CO15 TI02SM11 TI02LC28 61 TOSPOG TAIWAN 62 TOSPOC 63 TSWVBL TSWV10W TICINO GIAPPONE TSWVHI HAWAII TSWVH TI01TOG JAP TSWVGAAC 64 TSWVGAPP TSWVGAGC USA TSWVGAMC TSWVGAPT TSWVGAWC TSWVGATC TSWVGATO TSWVGACC TSWV10 0.005 mutazioni/aminoacido 1 aminoacido Fig. 19: Dendogramma basato sulla sequenza di 171 aminoacidi del gene NP di TSWV degli aplotipi ticinesi e di 30 sequenze pubblicate in GenBank. I valori posti sopra i rami sono percentuali generate dalla statistica bootstrap su un totale di 1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza filogenetica. 53 3.6.4. APLOTIPI PARTICOLARI Gli aplotipi TI02ME03 e TI02LR21 hanno una lunghezza di 431 rispettivamente 196 nucleotidi e sono quindi considerevolmente più corti rispetto a tutte le altre sequenze. L’allineamento di TI02ME03 e TI02LR21 con l’aplotipo più frequente in Ticino (TI01TO01) mostra che si potrebbe essere in presenza di delezioni di pezzi di genoma (Fig. 20 e Fig. 22). L’allineamento delle sequenze aminoacidiche di TI02ME03 e TI01TO01 conferma la delezione (Fig. 21), mentre quello di TI02LR21 e TI01TO01 è discutibile e lascia dubitare dell’effettiva esistenza dell’aplotipo. TI01TO01 TI02ME03 GAGTTTGAGGAAGATCAGAATCTGGTAGCATTCAACTTCAAGACTTTTTGTCTGGAAAAC GAGTTTGAGGAAGATCAGAATCCGGTAGCATTCAACTTCAAGACTTTTTGTCTGGAAAAC ********************** ************************************* TI01TO01 TI02ME03 CTCGACCAGATCAAGAAGATGAGCGTTATTTCATGTCTGACATTCCTGAAGAATCGTCAG CTCGACCAGATCAAGAAGATGAGCGTTATTTCATGTCTGACATTCCTGAAGAATCGTCAG ************************************************************ TI01TO01 TI02ME03 AGTATAATGAAGGTTATTAAACAAAGTGATTTTACTTTTGGTAAAATTACCATAAAGAAA AGTATAATGAAGGTTATTAAACAAAGTGATTTTACTTTTGGTAAAATTACCATAA----******************************************************* TI01TO01 TI02ME03 ACTTCAGACAGGATTGGAGCCACTGACATGACCTTCAGAAGGCTTGATAGCTTGATCAGG ------------------------------------------------------------ TI01TO01 TI02ME03 GTCAGGCTTGTAGAGGAAACTGGGAATTCTGAGAATCTCAATACTATCAAATCTAAGATT ------------------------------------------------------------ TI01TO01 TI02ME03 GCTTCCCACCCTTTGATTCAAGCCTATGGATTACCTCTTGATGATGCAAAGTCTGTGAGG ------------------------------------------------------------ TI01TO01 TI02ME03 CTTGCCATAATGCTGGGAGGTAGCTTACCTCTTATTGCTTCAGTTGATAGCTTTGAGATG ----------TGCTGGGAGGTAGCTTACCTCTTATTGCTTCAGTTGATAGCTTTGAGATG ************************************************** TI01TO01 TI02ME03 ATCAGTGTTGTCTTGGCTATATATCAGGATGCAAAATACAAAGACCTCGGGATTGACCCA ACCAGTGTTGTCTTGGCTATATATCAGGATGCAAAATACAAAGACCTCGGGATTGACCCA * ********************************************************** TI01TO01 TI02ME03 AAGAAGTATGACACCAGAGAAGCCTTAGGAAAAGTTTGCACTGTGCTGAAAAGCAAAGCA AAGAAGTATGACACCAGAGAAGCCTTAGGAAAAGTTTGCACTGTGCTGAAAAGCAAAGCA ************************************************************ TI01TO01 TI02ME03 TTTGAAATGAATGAAGATCAGGTGAAGAAAGGAAAAGAGTATGCTGCTATACTCAGCTCC TTTGAAATGAATGAAGATCAGGTGAAGAAAGGAAAAGAGTATGCTGCTATACTCAGCTCC ************************************************************ TI01TO01 TI02ME03 AGCAATCCTAATGCTAA AGCAATCCTAATGCTAA ***************** Fig. 20: Allineamento (Clustal W) delle sequenze nucleotidiche di TI01TO01 e TI02ME03. * identità; - delezione 54 TI01TO01 TI02ME03 EFEEDQNLVAFNFKTFCLENLDQIKKMSVISCLTFLKNRQSIMKVIKQSDFTFGKITIKK EFEEDQNPVAFNFKTFCLENLDQIKKMSVISCLTFLKNRQSIMKVIKQSDFTFGKITI-******* ************************************************** TI01TO01 TI02ME03 TSDRIGATDMTFRRLDSLIRVRLVEETGNSENLNTIKSKIASHPLIQAYGLPLDDAKSVR ------------------------------------------------------------ TI01TO01 TI02ME03 LAIMLGGSLPLIASVDSFEMISVVLAIYQDAKYKDLGIDPKKYDTREALGKVCTVLKSKA ----LGGSLPLIASVDSFEMTSVVLAIYQDAKYKDLGIDPKKYDTREALGKVCTVLKSKA **************** *************************************** TI01TO01 TI02ME03 FEMNEDQVKKGKEYAAILSSSNPNA FEMNEDQVKKGKEYAAILSSSNPNA ************************* Fig. 21: Allineamento (Clustal W) delle sequenze aminoacidiche di TI01TO01 e TI02ME03. * identità; - delezione TI01TO01 TI02LR21 GAGTTTGAGGAAGATCAGAATCTGGTAGCATTCAACTTCAAGACTTTTTGTCTGGAAAAC GAGTTTGAGGAAGATCAGAATCTGGTAGCATTCAACTTCAAGACTTTTTGTCTG-----****************************************************** TI01TO01 TI02LR21 CTCGACCAGATCAAGAAGATGAGCGTTATTTCATGTCTGACATTCCTGAAGAATCGTCAG ------------------------------------------------------------ TI01TO01 TI02LR21 AGTATAATGAAGGTTATTAAACAAAGTGATTTTACTTTTGGTAAAATTACCATAAAGAAA ------------------------------------------------------------ TI01TO01 TI02LR21 ACTTCAGACAGGATTGGAGCCACTGACATGACCTTCAGAAGGCTTGATAGCTTGATCAGG ------------------------------------------------------------ TI01TO01 TI02LR21 GTCAGGCTTGTAGAGGAAACTGGGAATTCTGAGAATCTCAATACTATCAAATCTAAGATT ------------------------------------------------------------ TI01TO01 TI02LR21 GCTTCCCACCCTTTGATTCAAGCCTATGGATTACCTCTTGATGATGCAAAGTCTGTGAGG ------------------------------------------------------------ TI01TO01 TI02LR21 CTTGCCATAATGCTGGGAGGTAGCTTACCTCTTATTGCTTCAGTTGATAGCTTTGAGATG ------------------------------------------------------------ TI01TO01 TI02LR21 ATCAGTGTTGTCTTGGCTATATATCAGGATGCAAAATACAAAGACCTCGGGATTGACCCA ------------------------------------------------------------ TI01TO01 TI02LR21 AAGAAGTATGACACCAGAGAAGCCTTAGGAAAAGTTTGCACTGTG-CTGAAAAGCAAAGC ---CTGCTATACTCAGCTCCAGCAATCGTAAT-GCTTGCACTGTGTCTGAAGAGCAAAGC * * ** * *** * * ** * ********** ***** ******** TI01TO01 TI02LR21 ATTTGAAATGAATGAAGATCAGGTGAAGAAAGGAAAAGAGTATGCTGCTATACTCAGCTC ATTTGAAATGAATGAAGATCAGGTGAAGAAAGGAAAAGAGTATGCTGCTATACTCAGCTC ************************************************************ TI01TO01 TI02LR21 CAGCAATCCTAATGCTAA CAGCAATCCTAATGCTAA ****************** Fig. 22: Allineamento (Clustal W) delle sequenze nucleotidiche di TI01TO01 e TI02LR21. * identità; - delezione 55 4. DISCUSSIONE 4.1. INCIDENZA DI TSWV IN OTTO COLTURE ORTICOLE L’incidenza di TSWV nelle otto colture analizzate è elevata: il 68,2 % dei campioni prelevati presso l’Azienda All’Orto di Muzzano è risultato infetto. Nessuna delle colture prese in considerazione (cavolo rapa, coste, formentino, lattuga batavia, lattuga cappuccio, lattuga foglia di quercia verde e rossa, lattughino lollo rosso e melanzane) è esente dal virus. Le percentuali di infezioni variano dal 25 % (per cavolo rapa) al 100 % (per lattuga cappuccio). Questo conferma l’elevata polifagia del virus. Le piante da cui prelevare i campioni sono state selezionate omogeneamente all’interno delle campate cercando di averne, dove possibile, una parte con sintomi e una senza sintomi. I campioni da analizzare sono stati a loro volta scelti a caso tra i campioni prelevati. Si nota una correlazione tra la presenza di sintomi di TSWV al momento del prelievo dei campioni e la percentuale di campioni infetti. Le percentuali sono le più basse per le colture che non mostravano sintomi, ovvero cavolo rapa (25 % di campioni infetti), formentino (56,3 %), lattughino lollo rosso (66,7 %) e melanzane (54,2 %). Per le colture coste e lattuga cappuccio, che mostravano segni evidenti della presenza del virus, si hanno percentuali di campioni infetti del 66,7 % e del 100 %, vale a dire le più elevate. Le colture lattuga batavia (81,3 %) e lattuga foglia di quercia (95,8 %) manifestavano sintomi che, data la possibilità di confusione con quelli provocati da funghi, batteri o fitotossicità, non potevano essere attribuiti con certezza a TSWV; le percentuali si situano in una posizione intermedia fra i due gruppi precedenti (Tab. 17). 32 campioni su 34 che mostravano sintomi si sono rivelati effettivamente infetti. Il fatto che due campioni non sono risultati positivi all’analisi pur presentando dei sintomi (nel caso del campione di costa erano sintomi considerati certi, nel caso del campione di lattuga batavia erano invece sintomi non sicuri) potrebbe essere dovuto ad errori nelle analisi (ad esempio imprecisioni nel pipettare) oppure è possibile che i campioni fossero effettivamente sani; ciò è plausibile in particolare per il campione di lattuga batavia. Melanzane e lattughino non presentavano sintomi al momento del prelievo, pur essendo piante sintomatiche; presumibilmente le piante infette hanno mostrato dei sintomi con l’evolversi della malattia. Per cavolo rapa e formentino non sono state trovate informazioni nella letteratura riguardo alla sintomatologia. Le percentuali importanti di piante infette in colture che non mostrano sintomi, rivelano l’importanza di un monitoraggio degli insetti vettori che permetta di attestarne la presenza e di intervenire per tempo con metodi di lotta appropriati. Per sorvegliare la presenza di insetti viruliferi si potrebbe far ricorso a piante spia, quali le varietà di Petunia x hybrida “Summer Madness”, “Super Magic Coral” e “Red Cloud” segnalate da Gallitelli & Davino (1998). La disposizione delle piante infette all’interno delle campate non sembra seguire alcuna logica: per tutte le colture si hanno delle distribuzioni casuali (Fig. 1A). Questo lascia supporre che non ci sia stato un focolaio che si è esteso nel tempo ma che si tratti di singole infezioni dovute a insetti vettori provenienti dall’esterno oppure a materiale vegetale infetto al momento della messa a dimora delle piante. 56 4.2. TSWV IN UNA COLTURA INVERNALE La coltura lattuga foglia di quercia, messa a dimora durante il mese di gennaio, è risultata essere infetta da TSWV. Il 19,5 % dei campioni (8 su 41) prelevati un mese dopo il trapianto in serra delle piante, è risultato positivo all’analisi. La distribuzione delle piante infette all’interno delle campate (settori 8S e 9S) sembra casuale (Fig. 2A), non si tratta quindi di un focolaio che si è esteso nel tempo, bensì di singole infezioni. Durante l’inverno i tripidi vettori del virus hanno un’attività ridotta; grazie al monitoraggio tramite trappole cromotropiche blu si è potuto stabilire che nel periodo tra il 20.01.’03 ed il 24.02.’03 è iniziato il periodo di attività di F. occidentalis. Un insetto è stato infatti trovato in una trappola collocata nella serra il 20.01.’03 e lasciata fino al 24.02.’03. Prendendo in considerazione la durata dei diversi stadi di sviluppo dell’insetto a temperature relativamente basse (Tab. 4) e sapendo quali colture e quali malerbe erano presenti nella serra nel periodo in questione, si può tentare di ricostruire la storia dell’insetto e formulare l’ipotesi seguente: le uova potrebbero essere state deposte ad inizio dicembre ’02; una decina di giorni dopo si sarebbero schiuse e le larve del primo stadio, l’unico in grado di acquisire il virus, si potrebbero essere nutrite sulle colture o sulle malerbe presenti in abbondanza in quel momento (Fig. 10), infettandosi. La larva del primo stadio ha una durata di vita di cinque giorni circa. Dal 15.12.’02 e per la durata di nove giorni circa, sarebbero quindi state attive le larve del secondo stadio, le quali si nutrono attivamente e possono trasmettere il virus. Non essendo stata effettuata alcuna sterilizzazione del terreno, le pupe sono sopravvissute ed hanno continuato il loro sviluppo. La durata dello sviluppo da uovo a adulto è di 34 giorni, a basse temperature; all’incirca dal 05.01.’03 si era dunque presumibilmente in presenza di insetti adulti in grado di infettare nuove piante. Un adulto vive da 30 a 45 giorni; ciò significa che da inizio gennaio e fino alla metà di febbraio potevano essere presenti nella serra degli adulti che si sono alimentati sulla coltura invernale, infettandola. Uno di questi è poi stato catturato nella trappola. Le malerbe, estirpate prima della messa a dimora della lattuga foglia di quercia (metà gennaio), non rappresentavano più in quel momento una fonte di cibo per i tripidi. L’ipotesi precedente può essere differita nel tempo: le uova potrebbero essere state deposte ad esempio 20 giorni dopo quanto supposto in precedenza; le larve del primo stadio sarebbero così state attive ad inizio gennaio ed esse sarebbero state obbligate a nutrirsi sulle malerbe, data l’assenza di colture a quel momento. Gli adulti sarebbero stati presenti a partire dal 25.01.’03 e potrebbero anche in questo caso aver infettato la lattuga foglia di quercia. Da questa ricostruzione si nota l’importanza di un intervento volto ad interrompere il ciclo di infezione; se i tripidi non avessero trovato fonte di cibo, rappresentata durante i mesi invernali prevalentemente dalle piante infestanti, non avrebbero potuto continuare il loro sviluppo. Anche una sterilizzazione del terreno si può rivelare utile per eliminare eventuali pupe presenti nel terreno. Un’altra ipotesi per spiegare la presenza di materiale infetto nella coltura invernale, è che le piante fossero già colpite da TSWV al momento della loro messa a dimora. L’analisi dei campioni del primo prelievo, effettuato poco dopo il trapianto delle piante in serra, e l’analisi dei campioni prelevati da piantine non ancora trapiantate, permetterebbero di confermare o smentire quest’ipotesi. 57 4.3. PIANTE INFESTANTI COME SERBATOIO DI TSWV Dall’analisi di 46 campioni prelevati dalle malerbe presenti in quantità maggiore, risulta che l’82,6 % delle piante prese in considerazione sono infette; il 63,6 % dei campioni di S. media e il 100 % dei campioni di Galinsoga sp. e di pomodoro, sono risultati positivi. Queste percentuali elevate e la grande quantità di malerbe presenti nei tunnel, confermano la loro probabile importanza come serbatoio di TSWV nel periodo che trascorre tra due colture. Tramite il sequenziamento dei prodotti PCR, sono state ottenute le sequenze nucleotidiche di 36 campioni di malerbe; è stato trovato 34 volte l’aplotipo TI01TO01, ossia il più frequente (vedi 4.4.). Sono poi stati trovati gli aplotipi TI02FO08 in un campione di Galinsoga sp. e TI02SM11 in un campione di S. media. I campioni di malerbe erano stati prelevati in vari settori della serra. Sono state ottenute anche le sequenze di sei degli otto campioni di lattuga foglia di quercia risultati infetti. In quattro campioni è stato trovato l’aplotipo TI01TO01; sono stati inoltre trovati due nuovi aplotipi: TI03FQ29 e TI03FQ30. Il ritrovamento, nei campioni di lattuga foglia di quercia, dell’aplotipo maggiormente presente nelle malerbe rafforza l’ipotesi del passaggio dell’infezione dalle piante infestanti alla coltura. Nella campata 9S si trovava in autunno cicoria verde (non analizzata) e nella campata 8S era coltivata lattuga cappuccio; sono stati analizzati 14 campioni di lattuga cappuccio prelevati in questa campata (altri 10 sono stati prelevati nella campata 10N, per un totale di 24 campioni di lattuga cappuccio). In 12 dei 14 campioni è stato trovato l’aplotipo TI01TO01. Questo fatto lascia ipotizzare un passaggio dell’infezione dalla lattuga alle malerbe e dalle malerbe alla coltura successiva. Purtroppo, essendo TI01TO01 l’aplotipo più frequente in tutte colture, non è possibile dimostrare con certezza questo passaggio. Le malerbe giocano un ruolo molto importante sia come ospite alternativo del virus, sia come serbatoio di vettori. Mantenere i tunnel completamente liberi dalle piante infestanti ospiti di TSWV è una misura indispensabile per prevenire la diffusione della malattia da una coltura alla successiva. 58 4.4. FREQUENZA E DISTRIBUZIONE DEGLI APLOTIPI DI TSWV L’elevata variabilità di TSWV presente in Ticino e segnalata da Matasci (2002), è stata confermata anche in questo studio. In 154 campioni provenienti da un’unica azienda ticinese, prelevati da undici ospiti sull’arco di cinque mesi (ottobre ’02 - febbraio ’03), sono stati rilevati 30 aplotipi di cui 29 risultano nuovi (Tab. 22). L’unico aplotipo già trovato in precedenza è stato chiamato TI01TO01 e corrisponde agli aplotipi TI01TOA e TI01TOD (Matasci, 2002) che si differenziavano nel confronto delle sequenze di 638 nucleotidi, ottenute utilizzando primers NP, ma che risultano identici nel confronto delle sequenze più corte, ottenute con l’uso di nested primers (utilizzati in questa ricerca). Questo aplotipo era già stato trovato nell’azienda in questione in campioni raccolti nel 2001 e nella prima metà del 2002. Esso è stato rinvenuto più di una volta in ognuna delle undici specie, per un totale di 122 campioni. Altri due aplotipi sono stati trovati in più di un campione: TI02ME02 in tre campioni di foglia di melanzana e TI02FO08 in un campione di formentino ed in uno di Galinsoga sp.. I restanti 27 aplotipi sono stati trovati una sola volta. L’elevata frequenza con cui è stato incontrato TI01TO01, l’aplotipo presente più di frequente in tutte le specie, segnala l’assenza di specializzazione di un determinato aplotipo per un determinato ospite, perlomeno sulla base della sequenza analizzata. Le mutazioni nelle sequenze non sembrano quindi avere come conseguenza diretta la capacità di infettare altre specie orticole. L’importante variabilità del virus e l’assenza di specializzazione degli aplotipi per determinate specie è confermata anche dall’osservazione individuale di ogni ospite: solamente nei pomodori (presenti come malerbe in altre colture) è stato trovato un unico aplotipo; nelle altre 10 specie sono stati individuati da due a sette aplotipi. L’aplotipo TI01TO01 è stato trovato su piante sparse omogeneamente nelle campate. TI02ME02 è stato trovato in tre campioni di foglie di melanzane vicine tra loro: le piante 20, 35 e 38 (Fig. 1A); questo potrebbe indicare che un tripide vettore di questo aplotipo si sia nutrito successivamente sulle tre piante in questione, infettandole. L’ultimo dei tre aplotipi trovati in più di un campione (TI02FO08) è stato trovato una volta nella parte B della serra, in un campione di formentino, ed una volta nella parte A in uno di Galinsoga. È possibile che il tripide sia passato da una serra all’altra, oppure che più insetti fossero vettori di questo aplotipo. 59 4.5. EVOLUZIONE DI TSWV IN TICINO Dalla verifica della nazione di provenienza delle piantine colpite dal virus in Ticino, era stato notato da Matasci (2002) un legame con l’aplotipo presente. Presso le aziende orticole che avevano acquistato piantine dall’Italia e dall’Olanda, erano stati trovati aplotipi simili a quelli rinvenuti nelle nazioni di provenienza delle piantine stesse. In particolare era stato trovato un aplotipo identico a TSWVD (olandese) presso un’azienda che acquistava piantine di pomodoro dall’Olanda ed era stato rinvenuto l’aplotipo TI01TOE, molto simile a TSWVIT (italiano), presso l’Azienda All’Orto che si riforniva in Italia. Da ciò risultava l’ipotesi che il virus fosse stato importato proprio con le piantine e si fosse poi evoluto dando origine agli altri aplotipi presenti sul territorio cantonale. Dai risultati ottenuti in questa ricerca si rafforza l’ipotesi dell’evoluzione continua di TSWV a partire da un aplotipo presente molto di frequente (TI01TO01) per dare origine ad un gran numero di nuovi aplotipi. Gli aplotipi di TSWV presenti in Ticino si suddividono in due gruppi: TICINO 1 e TICINO 2 (Fig. 15). Le differenze nelle 37 sequenze di 513 nucleotidi prese in considerazione per effettuare le analisi filogenetiche (escluse quindi TI02ME03 e TI02LR21 che hanno una lunghezza di 431 rispettivamente 196 nucleotidi) raggiungono un massimo di sette basi mutate. Le sequenze traslate variano da zero a cinque aminoacidi. TICINO 1 racchiude 34 aplotipi: tutti gli aplotipi (28) trovati durante questa ricerca e altri sei aplotipi trovati in precedenza su pomodoro e su lattuga (TI01TOC, TI01TOF, TI01TOG, TI02TOH, TI02LEL e TI02LEI). Data la somiglianza di tutti gli aplotipi di questo gruppo con TI01TO01 (le differenze maggiori sono di quattro nucleotidi e altrettanti aminoacidi, Tab. 24 e Tab. 25) si può supporre che essi siano stati generati da mutazioni dell’aplotipo in questione. 20 aplotipi (includendo TI02LC28) si differenziano da TI01TO01 per un solo nucleotide (aplotipi TI02MEO2, TI02ME04, TI02CR05, TI02CR06, TI02FO08, TI02FO09, TI02FO10, TI02SM11, TI02CR13, TI02CO16, TI02LR17, TI02LR18, TI02LR19, TI02FQ24, TI02FQ25, TI02FQ26, TI02FQ27, TI02FQ28, TI03FQ29 e TI03FQ30). 11 di questi aplotipi (TI02MEO2, TI02ME04, TI02CR05, TI02FO08, TI02SM11, TI02LR18, TI02FQ24, TI02FQ25, TI02FQ27, TI02FQ28 e TI03FQ30) hanno la stessa composizione aminoacidica di TI01TO01. Gli altri nove aplotipi si differenziano per un aminoacido. Si può supporre che ulteriori mutazioni degli aplotipi generati da TI01TO01, abbiano a loro volta originato i restanti aplotipi rilevati durante questa ricerca. In particolare è probabile che TI02CO12 sia stato generato da tre mutazioni di TI02CO13, dato che i due aplotipi si differenziano per tre nucleotidi; anche le sequenze traslate contengono tre differenze. TI02LB23 è probabilmente il risultato di una mutazione di TI02SM11: le sequenze nucleotidiche differiscono per una base, mentre le sequenze aminoacidiche di questi due aplotipi sono identiche. TI02LR20 è invece il risultato di una mutazione di TI02ME02. Anche TI02LEL deriva da TI02ME02, che ha subito in questo caso tre mutazioni. Entrambi gli aplotipi (TI02LR20 e TI02LEL) si differenziano da TI02ME02 per un solo aminoacido. Altri tre aplotipi (oltre a TI02LR20 e TI02LB23) si differenziano da TI01TO01 per due nucleotidi: si tratta di TI02CR07, TI02CO14 e TI02LR22. Per questi aplotipi non è stato rinvenuto nessun passaggio intermedio. Tutti e tre contengono un aminoacido diverso da 60 TI01TO01 nelle sequenze traslate. Gli aplotipi TI02TOH e TI02CO15 risultano da tre mutazioni di TI01TO01. TI02TOH mantiene tre differenze anche nella sequenza traslata, mentre TI02CO15 ha la stessa composizione aminoacidica di TI01TO01. Si suppone che anche gli altri aplotipi trovati in precedenza in Ticino e appartenenti a questo gruppo, siano il risultato di mutazioni di TI01TO01: è stato dapprima generato TI01TOF che si differenzia da TI01TO01 in due nucleotidi ma in nessun aminoacido. Da qui hanno avuto origine TI01TOG e TI01TOC, tramite una mutazione ciascuno. TI02LEI risulta da un’ulteriore mutazione di TI01TOC. TICINO 2 racchiude tre aplotipi che contano da 16 a 17 nucleotidi diversi rispetto a TI01TO01 ma solo da nessuno a due aminoacidi diversi. I tre aplotipi sono TI01TOE e TI01TOB, trovati per la prima volta nel 2001 su pomodoro, e TI02LEM, trovato nel 2002 su lattuga. TI02LEM si differenzia da TI01TOB in una base ed un aminoacido, è quindi ipotizzabile una sua origine proprio da una mutazione di questo aplotipo. Nel dendogramma basato sulle sequenze aminoacidiche spiccano gli aplotipi TI02TOH e TI02CO12, che si differenziano da TI01TO01 in tre rispettivamente quattro aminoacidi. Solamente TI02LEM ha due aminoacidi diversi nella sequenza rispetto a TI01TO01. Tutti gli altri aplotipi hanno da nessuna a una differenza. Dal confronto delle sequenze di 513 nucleotidi degli aplotipi ticinesi con quelli pubblicati in GenΒank (Fig. 16), risulta che l’aplotipo TI01TO01 è identico all’aplotipo della Repubblica Ceca C27084 e all’aplotipo olandese TSWVD, isolati da calla rispettivamente da dalia. È plausibile che tutti gli aplotipi del gruppo TICINO 1 si siano evoluti dall’aplotipo olandese, importato assieme a materiale vegetale. Gli aplotipi del gruppo TICINO 2 sono simili all’aplotipo italiano TSWVIT trovato su pomodoro. TI01TOE potrebbe essere il risultato di due mutazioni dell’isolato italiano, da cui si differenzia per due nucleotidi e per nessun aminoacido. Analogamente a quanto detto per il gruppo precedente, è plausibile che tutti gli aplotipi del gruppo TICINO 2 si siano evoluti da un aplotipo arrivato dall’Italia assieme a materiale vegetale infetto. Gli aplotipi TI01TOE, TI01TOF e TI01TOG, trovati presso l’Azienda All’Orto nel 2001, non sono stati rinvenuti in questa ricerca. Erano stati trovati tutti una volta sola in campioni di pomodoro. Può darsi che essi siano ancora presenti poco frequentemente e che non sono per questo stati rilevati, oppure è possibile che questi aplotipi siano effettivamente spariti. Gli aplotipi in questione potrebbero essere scomparsi in seguito ad un genetic bottleneck, ossia una riduzione improvvisa della densità di popolazione con conseguente diminuzione della variabilità genetica. Questo fenomeno avviene ad esempio quando la popolazione ospite è rimossa (raccolta di una coltura) oppure nel caso di eventi atmosferici che uccidono il patogeno (periodi di gelo o siccità). È possibile che dopo la raccolta delle colture sia rimasto solamente un aplotipo (TI01TO01) che si è evoluto, mentre gli altri sono scomparsi o comunque non si sono potuti diffondere come il primo. Il fatto che un aplotipo sia sopravvissuto mentre gli altri sono spariti può essere legato al fatto che il primo era presente più frequentemente rispetto agli altri. Inoltre è possibile che esso sia rimasto nelle malerbe che avrebbero funto da serbatoio mentre gli altri aplotipi sono stati rimossi assieme alla coltura che li ospitava. 61 Quasi tutti gli aplotipi trovati in questa ricerca stati trovati in un solo campione e tutti si differenziano fra loro in un numero relativamente basso di nucleotidi. Questo può indicare che l’evoluzione di TSWV in Ticino è iniziata da poco e che ci si deve aspettare in futuro una variabilità ancora maggiore nonché la propagazione degli aplotipi già presenti. Le sostituzioni nucleotidiche sono nella maggior parte dei casi sinonime (Tab. 26), non portano quindi ad un cambiamento nell’aminoacido codificato; ciò è dovuto al fatto che il gene NP codifica una proteina funzionale e non può quindi subire molte modifiche. L’elevata conservazione di questo gene era stata osservata da Vaira et al. (1995) in isolati provenienti da regioni geografiche lontane. La conservazione del gene N in altre specie appartenenti al genere tospovirus era stata segnalata da De Avila et al. (1993). 4.6. APLOTIPI PARTICOLARI L’evoluzione di cui si è discusso in precedenza è il risultato di sostituzioni di nucleotidi. Ci sono però anche altri tipi di mutazioni che possono verificarsi nei virus RNA durante la replicazione, ovvero delezioni ed addizioni. L’aplotipo TI02ME03 risulta dalla delezione di un pezzo di genoma, come confermato dall’allineamento delle sequenze nucleotidiche e di quelle aminoacidiche. Anche l’aplotipo TI02LR21 potrebbe essere il risultato di una delezione di un pezzo più grande di genoma, oppure è possibile che si tratti di un artefatto PCR. L’esistenza dell’aplotipo TI02ME03 e quella eventuale di TI02LR21 incrementano la già elevata variabilità di TSWV in Ticino. La sequenza TI02LC28 non è esattamente determinata; contiene una N a causa della presenza di due segnali sovrapposti (C e T) (Fig. 13). Si potrebbe trattare di un’infezione mista con la presenza degli aplotipi TI01TO01 che contiene una T alla 60esima base e di un altro aplotipo che non è stato trovato in nessun campione, contenente una C. 4.7. CONCLUSIONI Il virus è presente in tutte le specie analizzate, piante infestanti e coltura invernale comprese. L’interruzione nel ciclo delle colture e specialmente l’eliminazione delle malerbe sono quindi delle misure indispensabili da adottare per ridurre l’inoculo; anche l’utilizzo di piantine da trapianto sane, l’eliminazione di resti della coltura precedente, la rimozione immediata di piante infette ed il controllo del trasporto di materiale vegetale contribuiscono a diminuire l’inoculo. Le malerbe rappresentano, oltre ad un ospite alternativo del virus, anche un serbatoio di vettori. La sterilizzazione del terreno può rivelarsi molto utile per eliminare eventuali pupe infette. Le colture infette che non presentano sintomi possono fungere da serbatoio di virus e rappresentare un’importante fonte di diffusione del patogeno; da qui si deduce l’importanza del monitoraggio dei tripidi vettori in modo da attestarne subito la presenza e poter intervenire con metodi di lotta. 62 4.8. OUTLOOK 4.8.1. COLTURA INVERNALE Tramite l’analisi dei campioni raccolti il 20.01.’03, vale a dire subito dopo la messa a dimora della lattuga foglia di quercia, sarebbe possibile stabilire se le piantine erano esenti dal virus al momento del trapianto o se è stato introdotto nell’Azienda materiale vegetale infetto da TSWV. 4.8.2. EVOLUZIONE DI TSWV Per meglio comprendere l’evoluzione di TSWV in Ticino, sarebbe interessante analizzare dei campioni raccolti presso le altre aziende in cui è stata accertata la presenza del virus. Questo consentirebbe di stabilire se gli aplotipi trovati a Muzzano sono presenti anche in altri luoghi, e di trovare eventuali nuovi aplotipi. Ciò permetterebbe di comprendere in maniera più precisa come avviene la loro distribuzione nelle aziende. In particolare sarebbe possibile stabilire se c’è stata un’evoluzione anche negli aplotipi del gruppo TICINO 2. 4.8.3. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) La tecnica ELISA è meno costosa e fornisce risultati più velocemente rispetto a nested RT-PCR. Esistono dei test (ad esempio il kit AGRI-CHECK® Tospovirus, Bioreba) che permettono di attestare la presenza di Tospovirus nello spazio di poche ore e sono utilizzabili anche in campo. L’utilizzo di questa tecnica permetterebbe di stabilire dapprima quali piante sono infette e di analizzare poi tramite nested RT-PCR solamente quelle positive, con notevole risparmio di tempo e denaro. Il kit in questione ha lo svantaggio di segnalare non solo la presenza di TSWV, ma anche di INSV (impatiens necrotic spot virus), TCSV (tomato chlorotic spot virus) e GRSV (groundnut ringspot virus). Ci sarebbero quindi dei campioni che risultano positivi tramite ELISA, ma non tramite RT-PCR. Inoltre questa tecnica è meno sensitiva rispetto alla tecnica PCR; il kit segnala la presenza del virus solo su piante con sintomi. 63 5. RINGRAZIAMENTI La realizzazione del lavoro di diploma è stata possibile grazie alla collaborazione ed all’aiuto di molte persone. Innanzitutto ringrazio Cesare Gessler per avermi proposto il tema e per avermi offerto la possibilità di svolgere questa ricerca. Ringrazio in seguito Andrea Patocchi che, in qualità di supervisore scientifico, mi ha assistita e consigliata. I motivi per ringraziare Giovanni Broggini sono numerosi: mi ha spiegato e rispiegato le tecniche di laboratorio, aiutata durante la redazione del lavoro, dato un’infinità di consigli e suggerimenti, il tutto con molta simpatia e non perdendo quasi mai la pazienza... Anche la collaborazione di persone esterne al gruppo di fitopatologia è stata fondamentale: una parte molto importante di campioni è stata raccolta da Mauro Jermini, cui sono molto grata; ringrazio anche i responsabili dell’Azienda All’Orto, in particolare Mauro Costantini, per averci permesso di prelevare tutto il materiale necessario. Mi sono rivolta spesso anche a Davide Gobbin e a Caterina Matasci alla ricerca di indicazioni su come proseguire nelle analisi: i miei ringraziamenti vanno anche a loro. Per concludere sono grata a tutti i componenti del gruppo di fitopatologia per l’ambiente allegro sia in laboratorio sia fuori. Evito di elencare le persone che con questo lavoro hanno avuto poco a che fare ma che mi sono sempre vicine e le ringrazio implicitamente. 64 6. LETTERATURA - Adkins S., 2000. Tomato spotted wilt virus – positive steps towards negative success. Molecular plant pathology, 1:151-157. - Antignus Y., Lapidot M., Ganaim N., Cohen J., Lachman O., Pearlsman M., Raccah B., Gera A., 1997. Biological and molecular characterization of tomato spotted wilt virus in Israel. Phytoparasitica, 25:319-330. - Aramburu J., Rodriguez M., Ariño J., 2000. Effect of Tomato Spotted Wilt Tospovirus (TSWV) on the Fruits of Tomato (Lycopersicon esculentum) Plants of Cultivars Carrying the SW-5 gene. 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I nomi dei campioni si compongono di una sigla relativa all’azienda di provenienza (ALL=All’Orto, Muzzano), della data del prelievo (giorno, mese, anno), di un’abbreviazione della specie e di una numerazione progressiva relativa alla pianta da cui sono stati raccolti. Aplotipo/Specie TI01TO01 CR FO LR ME LB FQ CO LC SM GA TO ALL211002CR22 ALL211002FO15 ALL211002LR01 ALL211002 ME01 ALL211002LB01 ALL181002FQ01 ALL141102CO04 ALL181002LC02 ALL131202SM02 ALL141102GA01 ALL141102TO01 ALL211002CR36 ALL211002FO22 ALL211002LR02 ALL211002 ME09 ALL211002LB02 ALL181002FQ02 ALL141102CO08 ALL181002LC03 ALL131202SM03 ALL141102GA02 ALL141102TO03 ALL211002CR37 ALL211002FO24 ALL211002LR03 ALL211002 ME17 ALL211002LB03 ALL181002FQ06 ALL141102CO09 ALL181002LC04 ALL131202SM04 ALL141102GA03 ALL141102TO04 ALL211002LR04 ALL211002 ME19 ALL211002LB08 ALL181002FQ07 ALL141102CO10 ALL181002LC07 ALL131202SM07 ALL141102GA04 ALL141102TO05 ALL211002LR18 ALL211002 ME24 ALL211002LB09 ALL181002FQ14 ALL141102CO11 ALL181002LC08 ALL131202SM08 ALL141102GA05 ALL141102TO08 ALL211002LR23 ALL211002ME07 ALL211002LB10 ALL181002FQ15 ALL141102CO15 ALL181002LC09 ALL131202SM13 ALL141102GA06 ALL141102TO09 ALL211002LR24 ALL211002ME15 ALL211002LB11 ALL181002FQ18 ALL141102CO17 ALL181002LC10 ALL131202SM14 ALL141102GA07 ALL141102TO10 ALL211002LR31 ALL211002ME16 ALL211002LB15 ALL181002FQ19 ALL141102CO18 ALL181002LC14 ALL131202SM17 ALL141102GA04b ALL141102TO12 ALL211002LB16 ALL181002FQ21 ALL141102CO23b ALL181002LC15 ALL131202SM20 ALL141102GA10 ALL211002LB19 ALL181002FQ22 ALL181002LC17 ALL141102SM01 ALL141102GA11 ALL211002LB22 ALL181002FQ23 ALL181002LC19 ALL141102SM02 ALL141102GA12 ALL211002LB36 ALL181002FQ24 ALL181002LC20 ALL141102GA13 ALL181002FQ26 ALL181002LC21 ALL141102GA15 ALL181002FQ29 ALL181002LC22 ALL141102GA16 ALL181002FQ30 ALL181002LC23 ALL141102GA17 ALL181002FQ32 ALL181002LC24 ALL181002FQ33 ALL181002LC26 ALL181002FQ39 ALL181002LC27 ALL240203FQ01 ALL181002LC28 ALL240203FQ09 ALL181002LC30 ALL240203FQ31 ALL181002LC37 ALL240203FQ42 ALL181002LC40 ALL211002LR33 TI02ME02 ALL211002 ME20 ALL211002 ME35 ALL211002 ME38 TI02FO08 ALL211002FO11 ALL141102GA08 CR: cavolo rapa; FO: formentino; LR: lattughino lollo rosso; ME: melanzane; LB: lattuga batavia; FQ: lattuga foglia di quercia; CO: coste; LC: lattuga cappuccio; SM: S. media; GA: Galinsoga sp.; TO: pomodoro Tab. 2A: Campioni raccolti nel 2002 e nel 2003 in cui sono stati trovati gli aplotipi di TSWV rinvenuti una volta sola. I nomi dei campioni si compongono di una sigla relativa all’azienda di provenienza (ALL=All’Orto, Muzzano), della data del prelievo (giorno, mese, anno), di un’abbreviazione della specie e di una numerazione progressiva relativa alla pianta da cui sono stati raccolti. Aplotipo TI02ME03 TI02ME04 TI02CR05 TI02CR06 TI02CR07 TI02FO09 TI02FO10 TI02SM11 TI02CO12 Campione ALL211002ME23 ALL211002ME11 ALL211002CR26 ALL211002CR24 ALL211002CR28 ALL211002FO30 ALL211002FO13 ALL131202SM12 ALL141102CO05 Aplotipo TI02CO13 TI02CO14 TI02CO15 TI02CO16 TI02LR17 TI02LR18 TI02LR19 TI02LR20 TI02LR21 Campione ALL141102CO13 ALL141102CO07 ALL141102CO20 ALL141102CO21 ALL211002LR08 ALL211002LR07 ALL211002LR09 ALL211002LR20 ALL211002LR21 Aplotipo TI02LR22 TI02LB23 TI02FQ24 TI02FQ25 TI02FQ26 TI02FQ27 TI02LC28 TI03FQ29 TI03FQ30 Campione ALL211002LR22 ALL211002LB05 ALL181002FQ34 ALL181002FQ38 ALL181002FQ08 ALL181002FQ10 ALL181002LC05 ALL240203FQ14 ALL240203FQ19 CR: cavolo rapa; FO: formentino; LR: lattughino lollo rosso; ME: melanzane; LB: lattuga batavia; FQ: lattuga foglia di quercia; CO: coste; LC: lattuga cappuccio; SM: S. media; GA: Galinsoga sp.; TO: pomodoro 70 TSW V10 TSW VGAGC TSW VGAMC 53 TSW VGAPP 64 TSW VGAWC 61 TSWVGACC TSW VGAPT TSWVGATC 56 TSW VGAAC TSWVGATO TSWV10W 5383 TSWVH 56 TSWVBL TSW VHI Spain 84 86 TSW VIT TI01TOE TI02LEM 60 61 99 TI01TOB TSW VBR01 JAP TOSPOG 62 TOSPOC 95 980472 TSW VL3 GD98 Bulg97 55 BS97 8Hip9612 67 20Da961 LE98/257 TI01TOG TI01TOF 60 TI02LEI 73 TI01TOC TI02LR22 TI02SM11 60 TI02LB23 TI02FQ27 TI02LC28 TI02FQ24 TSWVD TI02FO10 TI02LR20 TI02LEL 55 TI02ME02 TI02LR18 TI02ME04 TI01TO01 TI02CR07 TI02FO08 TI02CR05 TI03FQ29 TI02FQ25 64 TI03FQ30 TI02TOH C27084 TI02CR06 TI02LR17 TI02CO16 TI02FO09 TI02LR19 TI02CO14 TI02FQ26 100 TI02CO13 TI02CO15 TI02CO12 TI02ME03 TI02LR21 0.05 Fig. 3A: Dendogramma basato sulle sequenze nucleotidiche del gene NP di TSWV di tutti gli aplotipi ticinesi e di 30 sequenze pubblicate in GenBank. I valori posti sopra i rami sono percentuali generate dalla statistica bootstrap su un totale di 1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza filogenetica. 71 TSWVGAPT TSWVGATC TSWV10 TSW VGAPP TSWVGAGC TSWVGAAC 51 TSWVGAW C TSWVGAMC TSW VGACC TSW VGATO 65 TSWVIT TI01TOE TI02LEM 95 TI01TOB TSW VHI 54 TSWVH 89 TSW VBL 67 TSW V10W Spain TSW VBR01 JAP TOSPOG TOSPOC 51 Bulg97 BS97 8Hip9612 20Da961 TSWVL3 980472 GD98 LE98/257 TI01TOG TI01TOF TI02LEI 68 TI01TOC TI02FO10 TI03FQ30 TI03FQ29 TI02FQ27 TI02ME04 TI02LR18 TI02FQ25 TI01TO01 TI02CO14 TI02CR07 TI02TOH TSWVD TI02FQ24 TI02FO08 TI02CR05 C27084 TI02LR20 TI02LEL 61 TI02ME02 TI02LR22 TI02LC28 TI02FQ26 TI02CO15 TI02CO16 TI02LR19 TI02FO09 TI02CR06 TI02LR17 TI02SM11 100 TI02LB23 TI02CO13 TI02CO12 TI02ME03 TI02LR21 0.05 Fig. 4A: Dendogramma basato sulle sequenze aminoacidiche del gene NP di TSWV degli aplotipi ticinesi e di 30 sequenze pubblicate in GenBank. I valori posti sopra i rami sono percentuali generate dalla statistica bootstrap su un totale di 1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza filogenetica. 72 Tab. 3A: Posizione e aminoacidi sostituiti negli aplotipi di TSWV trovati in Ticino. Posizione dell'aminoacido sostituito/Aminoacido più frequente Aplotipo 3 5 8 9 13 28 29 37 38 47 49 59 68 78 96 TI01TO01 I K V I T S D I K T M R N K K 112 119 137 145 158 170 A M I R K G TI02ME02 TI02ME04 TI02CR05 TI02CR06 T TI02CR07 G TI02FO08 TI02FO09 G TI02FO10 E TI02SM11 TI02CO12 A R TI02CO13 R G R TI02CO14 R TI02CO15 TI02CO16 V TI02LR17 T TI02LR18 TI02LR19 E TI02LR20 G TI02LR22 E TI02LB23 TI02FQ24 TI02FQ25 TI02FQ26 A TI02FQ27 TI02LC28* TI03FQ29 N TI03FQ30 TI01TOB R TI01TOC TI01TOE TI01TOF TI01TOG I TI02TOH D S V R TI02LEI TI02LEL TI02LEM Q R E *La base incerta di TI02LC28 non influisce sulla sua composizione aminoacidica, che resta in entrambi i casi (base C o T) identica a quella di TI01TO01. 73