qualit carne geni genotyping

Geni e
qualità della carne
Genotyping
“alimento costituito da tessuti di
vari animali ricchi di proteine,
ferro e altri principi nutritivi”
Dal punto di vista nutrizionale, la carne è
costituita principalmente da:
• ~ 75% di H2O (variabile da 50 a 80%);
• ~ 15% di proteine (variabile da 12 a 18%);
• ~ 3 -7 % di grassi;
• ~ 2-4 % di sali minerali (K, P, Fe, Zn).
Fattori che influenzano la qualità della carne
-
specie animale e razza
tipo genetico intraspecifico
sesso
sistema di allevamento
alimentazione
età e peso alla macellazione
tecnica di macellazione
tecnica di preparazione della carcassa
manipolazioni, conservazione e sezionatura della carcassa
conservazione e commercializzazione del taglio commerciale
preparazione domestica
Diverse proprietà gastronomiche e nutrizionali della
carne, quali la tenerezza, l'attitudine ai diversi metodi
di cottura, la perdita di "succhi", sono legate alla
struttura del sistema proteico muscolare e alle reazioni
biochimiche
che
si verificano.
Di
conseguenza,
la
conoscenza delle fibre muscolari, di alcune proteine di
questa
presenta
struttura,
un
nonostante
sicuro
interesse
la
dal
loro
complessità,
punto
di
vista
tecnologico, per favorire l'ottenimento di prodotti di
maggiore qualità
GENE
myostatin, MSTN
EFFETTO
GENE
EFFETTO
muscolo, tenerezza
IGF1
accrescimento
Insulin-like growth
factor-binding protein3
IGF-BP3
accrescimento
Myf5
accrescimento
calpastatin
tenerezza
calpain
tenerezza
A FABP
Grasso, trigliceridi
Lysyl oxidase
tenerezza
SCD
tipo di grassi
leptin
grasso, assunzione
PRKAG3
GHR
tenerezza, colore, drip los
peso
TG
marezzatura
NPY
marezzatura, peso,
accrescimento
UCPx
accrescimento, resa, peso
GHRL ghrelin/obestatin
preprohormone
Assunzione, conversione
MYOD1
tenerezza (muscle dev)
CALCA
tenerezza (calcium level reg)
HEM1
carcass fat
PDE1B
carcass fat
NAOL1
tenerezza
CDH4
tenerezza
DGAT1
grasso
Fetuin A
Potential regulator gene
tenerezza
MB
Potential target gene
PLN
Potential target gene
Troponin
Potential target gene
ZFHX1B
Potential target gene
FASN
Potential gene grasso
ACACA
Potential gene grasso
SLC2A4
Potential gene grasso
Fatty acid elongase
Potential gene grasso
LIPE
Potential gene grasso
FABP4
Potential gene grasso
AANAT
Potential gene grasso
tenerezza
tenerezza
tenerezza
tenerezza
La
Miostatina
è una proteina scoperta nel 1997 e risulta essere il gene
che limita la crescita muscolare negli esseri viventi.
La scoperta fu di un gruppo di scienziati guidati da Alexandra McPherron
e Se-Jin Lee che produssero topi nulli per il gene miostatina che
mostravano un drammatico incremento della massa muscolare scheletrica.
L'analisi istologica evidenziò un aumento sia della dimensione delle singole
cellule muscolari (ipertrofia) sia del loro numero (iperplasia).
Contemporaneamente si registrò una lieve diminuzione del tessuto adiposo
mentre fertilità e durata della vita rimasero pressochè invariate.
Iperplasia
Ipertrofia
Il preciso meccanismo della miostatina rimane ancora sconosciuto. Essa è
prodotta soprattutto dalle cellule del muscolo scheletrico e la sua attività
viene regolata da un inibitore chiamato follistatina.
Più è alto il livello di follistatina e maggiore sarà lo sviluppo muscolare.
Normalmente l'aumento della massa muscolare è dovuto al solo aumento della
dimensione delle cellule (ipertrofia), mentre una lieve iperplasia potrebbe
verificarsi solo in casi particolari (lesioni muscolari).
Sembra che la follistatina sia in grado di interagire con le cellule satellite
stimolando la proliferazione di nuove cellule muscolari (iperplasia).
Le
cellule
satellite
sono
cellule
mononucleate in grado di unirsi per
generare nuove cellule muscolari. A
differenza
delle
cellule
satellite
queste ultime non possiedono tale
caratteristica e, seppur soggette
ad un continuo turnover, possono
solamente aumentare di dimensioni
(ipertrofia)
ma
non
di
numero
(iperplasia).
La sua scoperta ha aperto nuovi orizzonti nella cura delle malattie muscolari e
cardiache, nello sport e nell'allevamento del bestiame.
Pensiamo per esempio alla possibile rigenerazione muscolare in seguito ad un
infortunio, oppure alla rigenerazione del miocardio in seguito ad un infarto.
Recentemente ha suscitato particolare interesse l'applicazione degli inibitori
della miostatina nella cura della distrofia muscolare.
Già nell’800 gli allevatori incrociavano selettivamente capi di
bestiame più muscolosi rispetto ad altri, sviluppando così razze
che hanno oggi un notevole incremento di massa muscolare rispetto
alle altre. Il carattere “doppia coscia” è presente con una
frequenza elevata in alcune razze bovine come nella Blu Belga,
nella Piemontese e nella Marchigiana mentre in altre razze è molto
bassa
Caratteristiche del fenotipo
“Doppia coscia”









maggior sviluppo muscolare
minor proporzione delle ossa
minor contenuto in grasso
diminuzione della marezzatura
maggior tenerezza delle carni
tempi di gestazione più lunghi ed aumento del
peso alla nascita
aumento di distocia (85%)
problemi respiratori e cardiovascolari
problemi di “shelf life”
DA AUMENTATO ESERCIZIO
iperplasia
ipertrofia
DA
MUTAZIONE
DEL GENE PER LA
MIOSTATINA
Blue Belga
la delezione di 11bp nel terzo esone
(819-829) determina un codone di stop
e la proteina che ne risulta sarà tronca
e perciò funzionalmente inattiva
Marchigiana
transversione G-T alla base 874 nel terzo esone; cambiamento da acido
glutammico a codone di stop; sei dei nove residui di cisteina non vengono
tradotti.
TGAA->TTAA (MseI o Tru 91)
294, 67
 GG
294,188, 106, 67  TG
188 ,106, 67
 TT
Piemontese
mostra una mutazione di senso nel terzo esone (pos938), che porta alla
sostituzione di una tirosina con una cisteina, ne risulta una proteina
funzionalmente inattiva.
Meat from cattle having no copies
of the inactive myostatin gene.
Meat from cattle having one copy
of the inactive myostatin gene.
Meat from cattle having two copies
of the inactive myostatin gene.
Trasformazione del muscolo in carne
Il muscolo è formato da fibre, circondate da una membrana che prende il nome di
sarcolemma, a loro volta costituite da molte miofibrille immerse in un fluido
intracellulare, il sarcoplasma, contenente glicogeno, ATP, fosfocreatina ed enzimi
glicolitici.
La conversione del muscolo in carne si realizza attraverso cambiamenti fisici,
metabolici e strutturali del tessuto in cui il glicogeno, lo zucchero che si trova
sotto forma di riserva energetica nella cellula, svolge un ruolo importante.
Nel periodo post mortem incomincia, infatti, il processo degradativo a carico della
struttura muscolare nella quale si susseguono reazioni enzimatiche che provocano
un’attenuazione della durezza e altre reazioni quali l’ossidazione dei lipidi e la
formazione di nucleotidi quali l’ipoxantina, potenziatore dell’aroma. Si ha, inoltre,
la formazione di ammoniaca, idrogeno solforato, acetaldeide, acetile e acetone che
sono, entro certi limiti, favorevoli per il sapore.
calpaine e calpastatine,
sono molecole implicate nella proteolisi
delle proteine miofibrillari e sono i principali responsabili del cambiamento
ultrastrutturale dei muscoli scheletrici, associato all'intenerimento della
carne.
Le tre principali isoforme della calpaina note nel muscolo scheletrico sono la
μ-calpaina (calpaina I), la m-calpaina (calpaina II) e la p94 (calpaina III,
calcio indipendente). La calpastatina, invece, inibisce l'azione proteolitica
delle calpaine, per evitare la degradazione delle proteine miofibrillari.
Dopo la morte dell'animale, nei muscoli scheletrici la concentrazione degli
ioni calcio aumenta, mentre diminuisce il pH (maggiore attività delle calpaine
e minore attività delle calpastatine).
Tale situazione può provocare la graduale inattivazione della calpastatina (a
causa della riduzione di pH) ed una forte attività delle calpaine (dovuta
all'incremento di calcio).
Ciò conduce alla degradazione delle proteine miofibrillari, causa
determinante dell'intenerimento del muscolo. Le calpaine giocano, quindi, un
ruolo importante nell'intenerimento della carne.
Stearoyl-CoA desaturase SCD
e il metabolismo degli acidi grassi
Il termine lipide deriva dal greco lipos che significa appunto grasso
Lipidi semplici, costituiti principalmente dai trigliceridi, la
principale forma di deposito di grasso nelle
cellule adipose; ma anche da monogliceridi e
digliceridi
Lipidi composti, trigliceridi combinati con altre sostanze
chimiche (fosfolipidi,glicolipidi…)
Lipidi derivati, si formano dai lipidi semplici e dai lipidi
complessi (colesterolo, steroidi, vitamina D)
Trigliceridi
glicerolo
glicerolo esterificato con 3 acidi grassi
acido grasso
acido grasso
acido grasso
Gli acidi grassi sono acidi carbossilici a lunga catena a numero pari
di atomi di C (14 - 24 C)

saturi: hanno tutti legami semplici C-C, a temp. amb. sono solidi
prevalgono negli animali

insaturi hanno uno o più doppi legami C=C, a temp. amb. sono liquidi
prevalgono nei vegetali
La sintesi degli acidi grassi AG
avviene principalmente nel fegato e
nella ghiandola mammaria durante
l’allattamento, meno nel tessuto
adiposo dove invece si accumulano
e
costituiscono
la
riserva
energetica dell’organismo
La sintesi inizia dall’acetyl CoA
derivato da eccesso di proteine e
carboidrati.
O
CH3
CoA
S
Acetyl CoA
Acetyl CoA
Carboxylase
CO2, Biotin
O
HO
O
CH2
Malonyl CoA
CoA
S
L’organismo può sintetizzare gli AG a partire dall’acetilCoA, ad eccezione degli AGE
(acidi grassi essenziali), cosiddetti poiché necessari alle funzioni vitali e disponibili
esclusivamente se introdotti mediante la dieta. Gli acidi grassi essenziali sono l’acido
linoleico (ω-6) e l’acido palmoleico (ω-3).
Per sintetizzare gli acidi grassi insaturi, bisogna deidrogenare gli acidi grassi saturi con
formazione di doppi legami. Gli AG possono essere desaturati grazie a degli enzimi
detti
desaturasi che trasformano gli AG SATURI
AG saturi
desaturasi
in AG INSATURI
AG insaturi (MUFA)
Stearoyl-CoA desaturase (SCD)
Palmitoyl-CoA
Stearoyl-CoA
Palmitoleoyl-CoA
Oleoyl-CoA
Uomo
sindromi metaboliche (obesitò,
iperinsulinemia, arteriosclerosi)
Bestiame
I lipidi costituiti da acidi grassi insaturi hanno un melting point più basso,
e contribuiscono positivamente al sapore e alla tenerezza della carne
SCD è associata con la qualità della carne bovina, per quanto riguarda la
composizione in acidi grassi
Molti caratteri di importanza economica nella produzione della
carne sono sotto controllo genetico
GENE
EFFETTO
myostatin, MSTN
muscolo, tenerezza
calpastatin
tenerezza
calpain
tenerezza
A FABP
grasso, trigliceridi
Lysyl oxidase
tenerezza
SCD
tipo di grassi
leptin
grasso, assunzione
PRKAG3
tenerezza, colore, drip loss
GHR
peso
SELEZIONE
La disponibilità di varianti genetiche nei loci associati a particolari caratteri di
rilevanza economica (qualità carne) aiuta la selezione.
Le variazioni trovate in qualsiasi punto del genoma sono alleli alternativi di una
particolare posizione cromosomica o locus
locus = qualsiasi sequenza identificabile nel genoma (2bp -->106bp). Un gene è un
locus codificante
Quando in un locus di DNA esistono due o più alleli, il locus è detto polimorfico e le
variazioni sono detti polimorfismi del DNA
I polimorfismi del DNA si suddividono in 4 classi:
1.
Polimorfismi di singoli nucleotidi SNP. Sostiuzione di una singola coppia di
nucleotidi (transizioni o transversioni)
2.
Microsatelliti. Elementi di DNA composti da sequenze di 1, 2, 3 basi ripetute
15-100 volte (AAAAAAA…… CACACACA…. GCTGCTGCTGCT…….). Altamente
polimorfico
3.
Minisatelliti. Elementi di DNA composti da sequenze di 20-100bp ripetute
migliaia di volte
4.
Delezioni, duplicazioni, inserzioni
Molti caratteri importanti in agricoltura come il peso, il contenuto in grasso del latte o il grasso
intramuscolare nei bovini sono caratteri quantitativi e vengono misurati su una scala lineare
quantitativa
Un Quantitative Trait Locus (QTL) descrive una regione cromosomale che contiene uno o più geni
coinvolti nell’espressione di un carattere quantitativo. I caratteri quantitativi sono generalmente
controllati da più geni ed influenzati anche dall’ambiente.
La ricerca per i loci responsabili della variabilità genetica quantitativa (QTL) è stata
particolarmente produttiva nell’identificare regioni cromosomiche statisticamente
associate alle variazioni di un carattere di rilevanza economica in diverse specie
domestiche.
I QTL possono essere identificati dall’associazione tra marcatori genetici (SNP) e
la segregazione del carattere studiato.
Gli SNP hanno un’importanza sempre maggiore nella
mappatura e nell’identificazione dei loci dei caratteri
quantitativi (QTL), cioè loci che contribuiscono alla
variazione fenotipica poligenica.
La stragande maggioranza degli
effetti dei QTL sono quasi
certamente dovuti a SNP non
ancora identificati
Caratterizzare
la distribuzione degli SNP
GENOTYPING
Che cosa significare genotipizzare?

Analizzare le variazioni nella sequenza di DNA

genotipo = la costituzione genetica di un individuo
Allele

forma alternativa di un gene o sequenza di DNA,
in una determinata posizione cromosomica (locus)

in ciascun locus un individuo possiede 2 alleli, uno
ereditato dal padre, uno dalla madre
→ genotipo: è la somma dei due alleli in tutte le
posizioni
POLIMORFISMO GENETICO
Un sito viene definito polimorfico se di esso si
conoscono almeno due forme alleliche la più rara
delle quali ha una frequenza di almeno l’1%
SNP markers
Single Nucleotide Polymorphism
GTGGACGTGCTT[G/C]TCGATTTACG
... SNP markers

È il polimorfismo più semplice

Altamente abbondante; uno SNP ogni 1000 bp nel
genoma mammifero

La maggior parte non alterano le funzioni cellulari

Largamente usati come marcatori
A) Metodiche classiche per l’identificazione di Polimorfismi
Metodi enzimatici
• Sequenziamento del DNA (metodo Sanger)
• Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
• Flap endonucleasi (FEN)
• Primer extension
• Oligonucleotide ligase assay (OLA)
Metodi basati sulle proprietà fisiche del DNA
• Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
• Single Stranded Conformation Polymorphism (SSCP)
• Denaturing high performance liquid chromatography
(DHPLC)
B) High-throughput SNP genotyping
Sequenziamento del DNA
Restriction Fragment Lenght Polymorphism RFLP
Elettroforesi su gel a gradiente denaturante DGGE
Analisi del polimorfismo di conformazione del
filamento singolo - SSCP
Cromatografia liquida denaturante ad alta
risoluzione - DHPLC
A) Metodiche classiche per l’identificazione di Polimorfismi
Metodi enzimatici
• Sequenziamento del DNA (metodo Sanger)
• Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
• Flap endonucleasi (FEN)
• Primer extension
• Oligonucleotide ligase assay (OLA)
Metodi basati sulle proprietà fisiche del DNA
• Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
• Single Stranded Conformation Polymorphism (SSCP)
• Denaturing high performance liquid chromatography
(DHPLC)
B) High-throughput SNP genotyping
JOE SUTLIFF
“A prerequisite to understanding the complete biology of an
organism is the determination of its entire genome sequence”
Fleischmann et al. 1995
Affymetrix
Allele-Specific
Hybridization
C
target
C
G
Hybridize
A
Fails to hybridize
Oligonucleotide
Ligation
Illumina
C
target
C
G
Ligate
Single Base
Extension
+ddGTP
+ddTTP
A
Fails to ligate
+ddATP
+ddCTP
target
dC
G
C incorporated
A
C fails to incorporate
Single base extension
Single base extension
Infinium II
Infinium I
Illumina Genotyping
Infinium (Single Base Extension or Primer Extension)
 6000 - 1 Million SNPs
 for standard SNP projects
association study
GoldenGate (Allele Specifc Primer Extension)
 96 - 1536 SNPs
 for custom and standard SNP projects
standard panel: mouse, linkage, MHC panels
custom panel: cancer SNP panel
BeadArray Reader

Confocal laser scanning system

Resolution, 0.8 micron

Two lasers 532, 635 nm
 Supports Cy3 & Cy5 imaging

Sentrix Arrays (96 bundle) and Slides
for 100k fixed formats
Affymetrix Genotyping
SNP-Genotyping Arrays
Affymetrix
(10K, 100K, 500K, 5.0, 1M)
affymetrix.com
Illumina
(100K,320K, 230S, 550K,650K, 1M)
illumina.com
Genome-wide association study