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Seconda Università di Napoli
II° Anno II° Semestre A.A. 2012/2013 Sbobinatura Patologia Generale Prof. Banfi
Gruppo di studio “La Sbobba”
A cura di dodo e Ely24e
1) Introduzione alla Genetica Medica Pag. 2
2) Malattie Auto. Reces. Patol. Molecolare Complic. Pag. 22
3) Complicazioni rispetto ai principali modelli di eredit. mendel. Aberr. cromos. Pag. 44
4) Tipi di anomalie cromosomiche Anomalie strutturali cromosomiche Pag. 64
5) Test genetico I Micro Rna e il loro ruolo nelle malattie genetiche Pag. 86
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Banfi 1.1 (Venerdì 15 Marzo 2013)
Introduzione alla genetica medica
Oggi faremo una breve introduzione sul genoma, la struttura dei
geni e poi diremo qualcosa sulla trasmissione delle malattie
genetiche e diremo brevemente qualcosa sulle mutazioni puntiformi
e sull’effetto delle mutazioni.
La genetica studia quale è la variabilità biologica degli organismi
viventi, quindi studia perché tutte le varie specie e che cosa rende
diverse le varie specie e anche all’interno di una stessa specie cosa
è che causa la diversità che c’è tra individuo e individuo, secondo si
occupa di studiare come da un organismo all’altro nella stessa
specie si possono trasmettere dei caratteri che vengono ereditati
appunto da un organismo all’altro e da una cellula all’altra, quindi la
variabilità biologica è la trasmissione dei caratteri e in ultimo, cosa
più recente, quale è il ruolo del genoma e in particolare dei geni che
sono le unità principali del nostro genoma nella regolazione dei
processi fondamentali della vita e in particolare lo sviluppo di un
organismo e la funzione dei vari organi e l’attività dei vari organi
una volta formati. Quindi variabilità biologica, trasmissione dei
caratteri, ruolo dei genoma, ruolo del patrimonio ereditario nel
funzionamento di una cellula o di un organismo.
Nella storia della genetica c’è stata una grossa rivoluzione negli
ultimi due secoli, all’inizio l’argomento principale era lo studio
dell’ereditarietà e della variabilità tra individui, le prime due funzioni
di cui abbiamo parlato prima, poi successivamente quando si sono
effettuati studi del genoma quindi studi più molecolari, quindi
all’inizio la genetica era soprattutto formale, poi quando la genetica
è diventata più molecolare quindi sullo studio del DNA, lo studio si è
incentrato sullo studio dei geni, le funzioni dei geni e nell’ambito
della genetica medica quali erano i geni responsabili di malattia e
come le variazioni di questi geni, le mutazioni, possono determinare
malattia, quindi la funzione dei vari geni in condizioni normali e
patologiche e come queste mutazioni possono portare al processo
patologico quindi alla malattia. Questo all’inizio era effettuato su
base singola gene per gene poi questi studio è stato esteso al
genoma intero c’è proprio una branca della genetica che si occupa
proprio di genomi interi, la genomica, ed essendo la genetica
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medica una disciplina prettamente medica non solo vogliamo
riconoscere i meccanismi e quali sono le cause delle malattie ma
vogliamo arrivare in ultima analisi anche a curarle; oltre alle normali
procedure terapeutiche che sono comuni a tutte le discipline
mediche ci sono dei tipi di terapie che sono specifiche delle malattie
genetiche in particolare la terapia genica.
Cosa si intende per genoma? E’ l’intero patrimonio genetico di un
organismo vivente, paragonato a un enciclopedia in cui sono
contenute tutte le istruzioni che regolalo lo sviluppo e il
funzionamento di un organismo, e la lingua in cui è scritta questa
enciclopedia genomica è il DNA, il genoma all’interno di un
organismo è uguale in tutte le cellule ed è contenuto nel nucleo,
diverso invece se parliamo di come questo DNA si esprime,
funziona nelle varie cellule, tutte le cellule sono uguali per quanto
riguarda composizione dell’organismo, bene o male in buona
approssimazione sono uguali mentre non è uguale il corredo di geni
che è attivo in una cellula di un tessuto rispetto a un altro, quindi
l’espressione del genoma poi varia tra tessuto e tessuto e da cellula
a cellula. La grandezza totale del genoma umano è di circa di 3
miliardi e 70 milioni di basi di cui 2843mila sono costituiti da
eucromatina, per eucromatina si intende quella porzione del
genoma del DNA che non si presenta compatto ma si presenta
srotolato che può essere quindi trascritto e produrre RNA e poi in
ultima analisi proteine, a differenze dell’eterocromatina che è quella
porzione del genoma che per lo più costituita da sequenze ripetute
ma che non dà luogo, apparentemente, a nessun tipo di
trascrizione e produzione di proteine anche se questi concetti
schematici negli ultimi anni stanno mutando perché stanno uscendo
fuori un pò di sorprese. Parlando del genoma dobbiamo introdurre il
progetto del genoma umano che ha portato negli ultimi anni ad una
grossa rivoluzione sia nella genetica che nell’ambito di varie
discipline biologiche vere e proprie e l’ultima analisi di genoma
umano non è stato altro che la decodificazione di tutta la sequenza
del genoma umano; ma se vogliamo risalire più a monte il progetto
del genoma umano che è cominciato nel 1990 negli Usa non è
stato altro che la generazione di mappe ha provveduto a generare
altre mappe che hanno potuto portare alla codifica del genoma
umano in particolare vari tipi di mappe, se per mappe intendiamo lo
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stabilire di un ordine lineare di elementi noti, quindi prima di tutto si
è dovuto identificare questi elementi noti, che quando si è
cominciato il progetto genoma si sapeva davvero poco a parte un
pò la grandezza della molecola di DNA del genoma, non si avevano
dei punti di riferimento si conoscevano pochissime sequenze, prima
cosa si è dovuto identificare questi elementi noti e poi si è dovuto
posizionali in ordine ben precisi per identificare le mappe. Tra i vari
tipi di mappe, la mappa di tipo genetico che è una mappa distribuita
lungo tutto il genoma di elementi di DNA che sono variabili nella
popolazione, se un elemento non è variabile non ci consente di
stabilire una mappa genetica. Quindi sono quegli elementi che ci
permettono di seguire, di identificare i geni malattia perché i vari
marcatori che variano in una popolazione possono essere associati
alla trasmissione di un carattere patologico. Insieme alla mappa
genetica esiste una mappa fisica e stiamo parlando di elementi di
DNA noti che non necessariamente variano ma che ci servono per
aiutarci a posizionare i marcatori genetici, questi sono stati i primi
due grossi risultati del progetto genoma umano quindi lo stabilire di
una mappa genetica e di una mappa fisica. Altri tipi di mappe che
esistono possono aiutarci per identificare per identificare i genomi
erano già note come la mappa citogenetica. Invece la mappa dei
geni non era nota quindi l’identificazione di tutti i geni presenti nel
genoma e la loro localizzazione nei cromosomi che ci permette di
avere un mappa dei geni malattia cioè quali di questi geni si
associano a malattia e in ultima analisi la mappa di sequenza cioè
la sequenza completa di tutto il genoma. E come sapete nel 2001 è
stata pubblicata bozza del genoma umana e pubblicata da due
gruppi in contemporanea, un gruppo pubblico quello che ha
cominciato il progetto genoma e un gruppo privato quello diretto da
Kenneth Bender e un paio di anni dopo poi la decodifica del
genoma umano è stato decodificato anche il genoma di topo che ha
permesso di fare degli studi importanti evolutivi sulle varie funzioni
della sequenza di DNA contenuto nel genoma. Per arrivare a
questo primo abbozzo di genoma il progetto è cominciato nel 1990
e questa prima abbozza è stata pubblicata nel 2001 quindi sono
accorsi 10 anni e il costo totale è di 3 miliardi di dollari quindi un
dollaro per ogni base. Questi costi sono drasticamente ridotti ed è
possibile sequenziare un genoma a costi incredibilmente più bassi,
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il costo del sequenziamento è una delle poche cose ha avuto un
crollo verso il basso, e permette anche di avere sequenze personali
del genoma a costi più accessibili, naturalmente era un progetto
molto ambizioso per cui è stato un progetto pioneristico e questo
spiega il motivo per cui si è spesa una cifra così elevata perché non
c’erano ancora le tecnologie disponibili per arrivare a un processo
più rapido. Questo è un es di cosa consiste questa sequenza e
come questa pagina così densa dovete considerare 550mila di
queste pagine che costituiscono tutto il genoma umano a indicare la
complessità dei dati che sono stati ottenuti e l’interpretazione di
questi dati che ci terrà impegnati per un bel pò di tempo. Oltre al
genoma umano è stato sequenziato il genoma di topo ma questo
processo continua e continuamente vengono sequenziati altri
genomi di altre specie, alcuni es di specie che variano dai batteri
fino a mammiferi e primati vicino all’uomo e ormai centinaia e
centinaia i genomi che sono stati sequenziati e continuano ad
essere sequenziati. Ovviamente il sequenziamento di genomi delle
varie specie ci permette di fare degli studi evolutivi e ci permette di
identificare quali sono gli elementi più importanti che sono comuni
presenti durante l’evoluzione che svolgono un ruolo di base, ma ci
permettono anche di identificare quali sono gli elementi che
contraddistinguono una specie e che contribuiscono a rendere
quella specie diversa rispetto alle altre. Da un lato possiamo vedere
cosa ci accomuna anche a specie più distanti da noi fino al lievito
per es per vedere quali sono i geni che svolgono un ruolo di base e
quali sono i geni che contribuiscono a rendere l’uomo quella che
dovrebbe la specie più evoluta presente sul pianeta.
Quali sono stati i risultati principali di questo progetto genoma
umano, e anche quello che è venuto dopo nei 10 anni che si sono
seguiti alla sequenze del genoma umano. In questi 4 punti si
riassume: innanzitutto il progetto del sequenziamento del genoma
ci ha permesso di identificare quali sono le fonti di variabilità intra
individuale quindi all’interno della specie tra individuo e individuo.
Quindi per quanto riguarda la variabilità sono stati identificati due
principali fonti di variabilità nel genoma che sono comuni nella
popolazione normale, la prima fonte di variabilità è rappresentata
dai polimorfismi di singoli nucleotidi nominati Snp o Snip e in cosa
consistono questi Snip? Praticamente consistono in variazioni di
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sequenza che avvengono a livello di una particolare base del
genoma nell’ambito della popolazione quindi in un certo nucleotide,
in questa particolare zona nella popolazione possono esistere basi
diverse non tutti gli individui presentano la stessa sequenza ad es a
quella base la potremmo avere individui che presentano una A e
individui che presentano la T o individui che presentano sia la A che
la T se si tratta di un locus autosomico che è presente in due copie,
queste variazioni coinvolgono un solo nucleotide per questo si
chiamano Snp se invece coinvolgono altre regioni più grandi si
chiameranno in un altro modo che vediamo dopo. Quindi
sequenziando un singolo individuo per quella regione per quel locus
noi possiamo trovare sequenze diverse e quindi potremmo avere il
caso di un individuo che avrà in questo locus una doppia T sarà
omoziogote per la T o omozigote per la C o sarà eterozigote e
quindi presenterà la T e la C, per parlare di polimorfismo nella
genetica formale quella variazione particolare di sequenza deve
essere presente almeno nel 1% della popolazione, al di sotto del
1% è più incerto il significato di polimorfismo oppure di mutazione
quindi frequenza al di sopra del 1%, osservando una tabella, questo
più o meno dice la stessa cosa però il numero di Snp (polimorfismo
singolo nucleotide) è molto alto nel genoma ne sono stati identificati
almeno una decina di milioni e il loro numero continua ad
aumentare perché poi ogni popolazione può avere un certo numero
diverso di polimorfismi, addirittura anche un individuo può avere
nell’ambito di una stessa popolazione della stessa zona potrebbe
esserci variazioni diverse; quindi, in media, ogni individuo presenta
un Snp ogni mille basi quindi se consideriamo due individui c’è la
probabilità che abbiano una variazione di singola base è di 1 su
ogni 1000 basi quindi ognuno di noi presenta una variazione
rispetto ad un altro individuo. Questi Snp hanno un grossa
importanza perché possono essere usati come markers genetici e
costituiscono a formare la mappa genetica e hanno una grossa
importanza per la ricerca biomedica, infatti questo è solo un es
dell’informazione che ci può dare un Snp se noi consideriamo una
certa mutazione che è responsabile per una malattia genetica e se
consideriamo questi Snp che hanno una diversa composizione
vediamo che questa mutazione può essere presente in individui che
presentano corredo diverso di Snp e possiamo dire che questa
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mutazione ha avuto una diversa origine perché tutti i genotipi di
questi individui sono praticamente diversi tra loro, in un altra
situazione tutti gli individui che portano questa mutazione
presentano lo stesso corredo di Snp per cui ipotizziamo che la
origine di questa mutazione è comune quindi questa mutazione è
derivato da un singolo individuo mutato che poi l’ha trasmessa alla
sua discendenza che ha conservato lo stesso genotipo in quella
regione. Invece una l’altra fonte di variabilità riguarda non singoli
nucleotidi ma regioni più grandi e questo per i singolo nucleotidi
sapevamo che esistevano questi polimorfismi questa è stata una
sorpresa perché parliamo di regioni più grandi e parliamo di
variazioni del numero di copie Cnv e la variazione è determinata da
grossi segmenti di DNA qui non parliamo di singola base ma di
centinaia, migliaia, milioni di basi che possono variare nel loro
numero di copie da un individuo all’altro e varie migliaia di queste
variazioni, Cnv, sono state identificate nel genoma e la stima è
ancora abbastanza bassa ma sembra che sia più elevato è che il
12 % del genoma è costituito da regioni variabili e che il numero di
copie può variare da individuo a individuo, così come le Snp anche
le Cnv costituiscono una sorgente di variabilità interindividuale e
addirittura parliamo del 12% del genoma e questi Cnv possono
essere o polimorfismi come nel caso delle Snip o secondo alcuni
possono essere associati a suscettibilità e a malattie in particolare è
stato ipotizzato il loro ruolo nella patogenesi di malattie
psichiatriche. Per darvi un es di cosa consistono questi Cnv, se in
una condizione normale e queste sono due copie di un certo locus
sul genoma e questa è una regione di centinaia, migliaia di basi che
è presente in numero normale all’interno di questo individuo quindi
su entrambi i cromosomi c’è la stessa copia di DNA, invece poi ci
sono individui che presenteranno una singola copia di questi due
quindi un cromosoma che presenterà questa regione e l’altro
cromosoma in cui questa copia non sarà presente o altri individui in
cui oltre alla singola copia normale sarà presente una copia
addizionale quindi ci saranno due copie di questo frammento più o
meno grande di DNA quindi variazioni del numero di frammenti
grandi, queste sono le sorgenti principali di variabilità. Altri due
punti importanti che costituiscono il risultato del progetto del
genoma umani sono l’identificazione dei geni e dei trascritti che
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possono essere codificanti e non codificanti e la comprensione del
ruolo biologico di sequenze che non sono geniche.
La prima domanda che si è posti prima ancora di arrivare alla
sequenza completa del genoma era quanti geni sono presenti nel
genoma umano e qui la risposta era molto incerta, solo un es. di un
paio di lavori che sono stati pubblicati nel 2000 quindi a un anno
prima del completamento del genoma in cui diversi gruppi di
ricercatori scommettevano sul numero di geni presenti nel genoma
e un gruppo ipotizzava la presenza di 120.000 geni e quest’altro
che ipotizzava la presenza di 35.000 geni e alla fine nessuno dei
due aveva ragione. Il gene sul genoma umano è organizzato in
modo abbastanza complesso, è organizzato in un alternanza di
esoni ipotiziamoli come rettangoli rossi che sono separati da
sequenze genomiche chiamate introni e quando viene trascritto il
gene viene trascritto nella sua interezza quindi verrà fatto un primo
RNA eterogene nucleare in cui saranno contenuti all’inizio della
trascrizione sia gli esoni che gli introni, questo RNA immaturo
subirà il processo di splicing in cui ci sarà la rimozione degli introni
e rimaranno solamente le sequenze esoniche, oltre alle sequenze
esoniche ed introniche dobbiamo tener conto che esiste una
sequenza regolatrice a monte del sito di inizio della trascrizione
chiamata promotore e in un prima porzione della sequenza
trascritta esiste il 5′ non tradotto che viene a far parte delle RNA
messaggero ma non viene a far parte della proteina che comincia al
codone di inizio, meteonina di inizio e termina la sequenza
codificante per proteina a livello del codone di stop e a valle del
codone di stop c’è un’altra porzione non tradotta, che entra a far
parte dell’rna messaggero, 3′ non tradotto che poi termina con il
segnale di poliadeninazione, poli A, tutta questa regione 5′ non
tradotto sequenze esoniche codificanti e 3′ non tradotto vengono a
far parte dell’RNA messaggero. Quindi per dare un informazione
sulle dimensioni di queste regioni la grandezza normale,media di un
gene sul genoma può essere di 60 Kb (kilobasi) la porzione
intronica in genere è molto più grande di quella esonica, quindi
abbiamo queste grosse porzioni intervallari che occupano molto
spazio quindi questa è una grandezza media di 60 kb che viene
trascritta completamente a partire dal sito di inizio della trascrizione
rna immaturo, RNA eterogeneo nucleare, che poi una volta
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processato tramite il processo di splicing dà luogo a un RNA
messaggero maturo se vedete la differenza di dimensione è molto
marcato, la dimensione media di un gene su un genoma è di 60 kb
la dimensione media di RNA messaggero è di 2.2 kb quindi c’è tutta
una seria di informazioni di regioni DNA che occupano molto spazio
e questo ha portato una grossa difficoltà nella predizione di geni e
quando noi sequenziamo il genoma non è facile capire dove
comincia un gene e dove finisce proprio perché ci sono tutte queste
informazioni intermedie. In ogni caso si è arrivati a una soluzione
finale e si è stimato che esistono dai 20 ai 25 mila geni codificanti
per proteine nel genoma umano quindi numero più basso rispetto
anche alle stime negative riportate precedentemente. Questa è
stata una grossa sorpresa, proprio perché parlavamo cosa rende
un organismo più complesso rispetto a un altro si ipotizzava che
l’uomo per definizione dovesse avere il numero maggiore di geni
nel genoma e questa è stata una grossa sorpresa perché se
guardiamo il numero di geni codificanti per proteine nei batteri come
nell’escherichia coli andando ai lieviti ai primi organismi pluricellulari
vediamo che il numero di geni nell’uomo non è molto più alto
rispetto alle altre specie innanzitutto è uguale a quello del topo è più
basso addirittura di altre specie come il pesce palla giapponese e
addirittura inferiore a quello di piante, quindi il numero di geni non
corrisponde con lo stato evolutivo e quindi non è il numero di geni
che rende una specie più complessa rispetto a un’altra. Cosa rende
una specie diversa da un’altra? Ci sono varie ipotesi ma si è
ipotizzata che la complessità non è data dal numero di geni ma dal
modo in cui questi geni sono usati e dal modo in cui interagiscono,
da quante forme alternative possiamo avere da questi geni e dalla
presenza di RNA non codificanti ma una risposta ancora precisa a
questa domanda non c’è.
La dimensione media di un gene adesso sulla base del
sequenziamento di tutto il genoma è di 10-15 kb, la dimensione, un
esone interno di un gene può avere la grandezza di 150 paia di
basi, vi sono geni che sono un pò agli estremi cioè che sono
abbastanza grandi ad es. il gene della distrofina che è responsabile
della distrofia muscolare ha la più grossa dimensione sul genoma e
occupa 2.5 milioni di basi sul genoma mentre invece un altro gene
della Titina che è responsabile di alcune forme di distrofia
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muscolare ha la più lunga sequenza codificante in questo caso il
più lungo RNA messaggero che è più di 80 mila basi, il più grande
numero di esone più di 178 esoni e l’esone singolo più grande più
di 17mila basi quindi ci sono varie diversità nella grandezza dei geni
però più o meno la grandezza media è quella di 10-15 kb sul
genoma e 2 kb come RNA messaggero.
I geni possono essere elementi singoli ma possono anche essere
organizzati in famiglie cioè ci sono dei geni che presentano varie
copie simili nel genoma e queste copie di geni simile tra loro
possono connotare una famiglia genica e di famiglie geniche ne
esistono varie nel genoma, possiamo avere famiglie cluster
raggruppate in cui tutti i geni che sono simili tra loro sono localizzati
nella stessa regione genomica e sono derivati da eventi di
duplicazione successiva e quindi sono localizzati tutti nello stesso
locus genomico, classico è l’es del gene delle globine localizzate
tutte nelle vicinanze oppure oppure degli omeobox che sono dei
cluster di omeobox e quindi sono vari membri di una stessa famiglia
che sono localizzate all’interno di una stessa regione genomica,
invece possiamo avere delle famiglie geniche che sono
interspersed sono localizzate in regioni diverse del genoma e
abbiamo vari es come i geni PAX che sono geni importanti per lo
sviluppo e che hanno almeno 9 membri ma che sono tutti localizzati
su cromosomi diversi quindi si pensa che siano derivati da una
iniziale duplicazione che però è stata seguita da una traslocazione
delle varie copie in varie regioni del genoma. Un es di una famiglia
clusterizzata che è il caso della alfa globine e beta globine che sono
tutti quanti posizionati in una stessa regione genomica e intervallate
da sequenze intergeniche. Sempre parlando del numero delle
sequenze codificanti il genoma umano è costituito da 46
cromosomi, 20.000-25.000 geni, 3 miliardi di nucleotidi, se
consideriamo tutte le sequenza codificanti di sequenze presenti in
questi 3 miliardi di nucleotidi arriviamo a dire che le sequenze
codificanti, quindi le sequenze che servono a codificare le proteine
e anche del 3′ e 5′ non tradotto ci troviamo di fronte a una % del
genoma che è davvero basso, quindi il 2% del genoma viene a far
parte di gene codificanti per proteine. La domanda è a che cosa
serve il restante 98%? Prima di questo riconoscimento del numero
così basso di geni questa porzione del genoma veniva chiamato
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genoma spazzatura, questa porzione del 98% del genoma è
costituito da 3 grossi gruppi, la prima porzione è costituita da
sequenze ripetute e queste costituiscono il 50% del genoma e sono
sequenze di DNA che sono ripetute in numero variabili di copie e ci
sono due grossi gruppi di sequenze ripetute, uno è costituito dal
DNA satellite che sono blocchi di sequenze ripetute presenti,
clusterizzate cioè regioni di DNA ripetute presenti in certe regioni
particolari del genoma, cioè in regioni cromosomiche specifiche
caratterizzate dalla presenza di eterocromatina, il DNA insieme ai
complessi proteici presenta una formazione altamente condensata
che è priva di geni e questi geni sono localizzate nelle regioni
telomeriche e in altre regioni del genoma e questo costituisce il
gruppo più sostanzioso di sequenze ripetute in cui apparentemente
non ci sono sequenze geniche. L’altro gruppo è costituito dalle
Repeats interspersed (disperse) nel genoma in cui abbiamo dei
moduli che sono presenti in multiple copie ma in regioni più svariate
del genoma e queste sono localizzate in genere nelle regioni
eucromatiniche, regioni che sono attivamente trascritte e addirittura
alcune di queste sequenze ripetute sono presenti all’interno del
RNA messaggero e in 5′ e 3′ non tradotto potremmo avere regioni
ripetute, quindi possono essere anche trascritti, in genere sono
derivati dai trasposoni che sono questi elementi che possono far
saltare una regione da una parte all’altra e possono migrare da
regione a regione del cromosoma per lo più sono derivati da
trasposoni. Un’altra parte è caratterizzata dalla presenza di
pseudogeni in cui c’è sempre un meccanismo di trasposizione
praticamente un gene può duplicarsi e dare luogo a un altro
membro di una famiglia genica ma questa duplicazione può dare
luogo a un gene che evolve in modo negativo, accumula mutazione
e viene a formare un pseudogene che non è più funzionante e non
è più in grado di dare luogo a una sequenza proteica perché
accumula varie mutazioni, questi sono pseudogeni non processati.
Alcune volte, RNA messaggero viene a fare parte di un trasposone
va a localizzarsi già processato in un’altra regione del genoma dove
accumula mutazione e viene a costituire una sorta di pseudogene
processato che non ha più una funzione e buona parte di queste
repeats interspersed sono caratterizzate da pseudogeni processati
che fino a pochi anni fa venivano considerati come una cosa inutili
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ma nell’ultima lezione vedremo che questi pseudogeni sono
importanti soprattutto quando vengono trascritti nel RNA; poi ci
sono semplici di multipli di nucleotidi poli A, poli T poli AC etc... e
duplicazioni segmentali ma l’importante è che sapete che esistono
sequenze di DNA satellite e repeats interspersed.
Invece gli altri gruppi di DNA non codificante presente nel genoma
abbiamo un vasto gruppo di DNA non trascritto e una funzione che
può essere ascritta a questa regione è quello di costituire elementi
di controllo dell’espressione dei geni quindi promotori, sequenze
Hans che servono ad aiutare la trascrizione di un gene a renderlo
tessuto specifico, oppure sequenze Silens che bloccano
l’espressione di un gene in un certo tessuto, e tra queste sequenze
regolatorie è curiosa la presenza di sequenze non codificanti non
conservate che è stata una grossa sorpresa del sequenziamento
dei vari genomi cosa sono queste sequenze Cnc, quando è stato
sequenziato il genoma di topo si è fatta una comparazione tra il
genoma di uomo e il genoma di topo e si è visto che il 5% dei due
genomi era altamente conservato tra le due specie e ovviamente si
pensava che queste sequenze conservate fossero costituite da
sequenze codificanti, da geni e la grossa sorpresa è stata che solo
⅓ di queste sequenze corrispondeva a geni il restante ⅔ non erano
sequenze codificanti per cui si è dato il nome a queste regioni
conservate tra topo e uomo di Cnc o Cns, è stata data anche una
definizione quindi sono sequenze lunghe almeno 100 paia di basi
con una % di identità almeno del 70%.
Queste Cnc possono rappresentare elementi di controllo
dell’espressione sono stati ipotizzati anche il loro ruolo come RNA
non codificanti ma queste ipotesi non sono state convalidate.
Questo è un es di come si visualizza queste Cnc nel genoma e
questo è un gene che vedremo più avanti, è un gene responsabile
della fibrosi cistica CFTR e in questo grafico sull’asse dell’ascisse è
rappresentata la regione genomica umana e sull’asse delle ordinate
è indicata questi picchi corrispondono alla % di identità che c’è nella
corripondente regione genomica tra uomo e topo quindi la parte più
bassa corrisponde al 50%, questo al 75% e poi 100%, in celeste
vedete le regioni corrispondenti agli esoni del gene CFTR poi
vedere tutti questi altri picchi che superano il 75% che presentano
un identità molto simili a quello di esoni ma non sono esoni e che
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sono le Cnc e il significato rimane da chiarire. L’ultimo gruppo è
rappresentato da sequenze che sono trascritte ma non sono
codificanti, nell’ambito di questo 98% non codificante, e stiamo
parlando degli RNA non codificanti e tra questo possiamo
annoverare i micro RNA. Una delle grosse sorprese sempre del
genoma era che mentre la componente codificante era stata
inferiore all’attesa come quantità invece la componente non
codificante presente nel genoma umano è stata molto più
importante di quanto si pensasse e oltre agli RNA non codificanti
che erano già conosciuti molto prima del sequenziamento del
genoma i cosiddetti RNA non codificanti che svolgono funzioni di
base come ad es. RNA rimosomiale, transfer etc... è venuta fuori
questa grossa categoria di RNA non codificante con ruolo
regolatorio che serve a svolgere un ruolo che è diverso da cellula a
cellula, questi sono vari tipi di RNA, ma abbiamo soprattutto micro
RNA ma adesso stanno venendo fuori Long non coding RNA che
svolgono un ruolo interessante sia per la regolazione genica che
per vari funzioni biologiche di base. Così come abbiamo visto prima
che la correlazione tra numero di gene e complessità di un
organismo non esiste se invece andiamo a considerare la % del
genoma che costituisce RNA non codificante vediamo che c’è una
correlazione nell’ambito dell’evoluzione partendo da escherichia coli
le regione non codificanti sono indicate qui in grigio chiaro e vedete
che nell’escherichia coli il batterio è inesistente, l’1% mentre una
grossa parte del genoma è costituita da regioni codificanti e man
mano che andiamo in alto nell’evoluzione vediamo che nel lievito
questa componente tende a crescere al 10% negli organismi
pluricellulari arriva a costituire il 30% e invece nell’uomo al 43%
quindi mentre con le regioni codificanti non c’è correlazione con
RNA non codificante c’è una correlazione con la complessità di una
specie nell’ambito dell’evoluzione quindi sembra che gli RNA
codificanti possano essere una delle spiegazioni alla domanda che
ci eravamo fatti prima sul perché alcune specie sono più complesse
rispetto a un’altre forse dipende dalla quantità di rna non
codificante.
Quindi è solamente una carrellata sui risultati principali del progetto
genoma umano e dato questi risultati e tutte le serie di domande
che emerge da questi risultati si è venuta a formare una nuova
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disciplina della genetica la cosiddetta Genomica il cui obiettivo
primario è quello di comprendere il significato dell’organizzazione
molecolare contenuto nei genomi con varie implicazioni cioè una
parte che si occupa più di genomica strutturale cioè si occupa di
sequenziare, determinare la struttura di genomi completa ma c’è
questa parte che è più interessane che è la genomica funzionale
che si occupa di determinare come la struttura di un genoma poi si
associa a una funzione e quale è la funzione del genoma nella sua
interezza e del trascrittoma, di tutta la serie di trascritti e del
proteoma, di tutte le proteine; questa è una disciplina che sta
ottenendo sempre più importanza nell’ambito della genetica e per
rispondere a queste domande c’è stata un evoluzione naturale del
progetto genoma umano è stato quello di questo progetto che è
nato subito dopo del progetto genoma umano che si chiama
progetto Encode che si propone di identificare tutti gli elementi
funzionali che sono presenti nel genoma, quindi di annotare base
per base con tutti gli elementi funzionali e vedere dove cominciano i
trascritti esattamente, dove cominciano i promotori dove finiscono,
quali sono le regioni che fanno parte di eucromatina e di
eterocromatina e così via. Questo progetto Encode va
accumulando tutta un serie di informazioni in modo sistematico
quindi è un grosso catalogo di informazioni che al momento non è
arrivato a una definizione funzionale ma fornisce l’utente di tutte le
informazioni che possono essere utilizzati per interpretare i dati
quindi sia il genoma che il risultato del progetto Encode sono
accessibili a tutti tramite internet.
Cominciamo a entrare nel merito della genetica medica e a dare
una introduzione su quali sono le varie discipline della genetica.
La genetica medica è lo studio della variabilità biologica in genere e
entreremo nel merito della genetica medica che è quello che si
propone di studiare la variabilità e di associare la variabilità
biologica allo stato di salute o di malattia quindi a vedere quali sono
le variazioni del DNA che si associa a malattie, conseguenze del
risultato della genetica medica appunto la medicina molecolare è
quello di applicare la conoscenze della genetica medica per
applicarla alla diagnostica delle malattie e la comprensione dei
meccanismi alla base di malattie genetiche. La genetica clinica che
entra nel merito delle varie patologie e che associa conoscenze di
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genetica alle clinica di varie malattie e poi tutta un’altra serie di
discipline di cui parleremo rapidamente in queste lezioni.
Alcune definizione che ci servono per comprendere quello che
diremo dopo; malattia congenita , cosa è malattia congenita? E’ una
malattia che si presenta alla nascita di un individuo e non
necessariamente una malattia genetica quindi tutte le malattie che
si presentano in un neonato o prima della nascita sono malattie
congenite e non significa che sia una malattia genetica può essere
anche dovuta una malattia congenita a un infezione durante la
gravidanza, o ad agenti fisici a teratogeni.
Familiarità è un concetto importante della genetica, per familiarità si
intende che nell’ambito di una famiglia esiste una ricorrenza di una
certa malattia nell’ambito di quella famiglia ma non
necessariamente ci troviamo di fronte a una malattia mendeliana
ma solamente che c’è una predisposizione, una familiarità, caso
sporadico è che solo un individuo solamente in quella famiglia
presenta quella malattia, l’unicità di quella malattia in quell’individuo
che però non implica che la malattia non sia di tipo genetico.
Malattia a carattere ereditario intendiamo una malattia che si
manifesta con della particolari e precise condizioni che possono
essere facilmente riconoscibili, in questo malattie ereditarie
intendiamo malattie mendeliane che hanno un chiaro pattern
ereditario mendeliano. Genotipo è la costituzione genetica di un
individuo, l’informazione genomica per quel locus particolare e
specificamente gli alleli presenti in quel locus particolare a
differenza del genotipo che è la manifestazione fisica di un
carattere genetico che dipende dal genotipo e la sua interazione
con l’ambiente.
Le malattie genetiche possono essere raggruppate in alcuni grossi
gruppi, allora il gruppo principale sono quello delle malattie
mendeliane che possono essere autosomiche dominanti,
autosomiche recessive legate al X; l’altro grosso gruppo è
rappresentato dalle malattie cromosomiche in cui ci sono anomalie
di numero e di strutture dei cromosomi, poi abbiamo il gruppo delle
malattie multifattoriali o poligeniche in cui ci può essere la
conpartecipazione di più geni nella patogenesi e di più geni insieme
a fattori ambientali; poi abbiamo malattie da mutazioni di cellule
somatiche in particolare del cancro, e poi malattie da mutazione del
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genoma mitocondriale. Quindi le malattie monogeniche o
mendeliane sono malattie a chiara trasmissione ereditaria, familiare
che sono dovute alla mutazione di un singolo gene, sono malattie
molto rare se prese individualmente se le mettiamo tutte assieme
vengono a formare un gruppo la cui frequenza non è così rilevante
e ovviamente sono caratterizzate da alto rischio di ricorrenza
familiare e con pattern di ereditarietà facilmente riconoscibile.
Numero di queste malattie genetiche si stimano che siano 7-8 mila
e di queste malattie mendeliane almeno 2.000 hanno un difetto
biochimico o un difetto genetico riconosciuto, è stato riconosciuto
quale è il gene responsabile e quando è noto il gene si può fare una
diagnosi molecolare precisa e addirittura fare una diagnosi
prenatale.
Le malattie cromosomiche sono dovute alla deficienza o all’eccesso
di interi cromosomi o frammenti di un cromosoma quindi un questo
caso non è un singolo gene ma essendo un frammento di
cromosoma che può contenere al suo interno ci possono essere
molti geni che possono essere alterati sia come numero che come
struttura, sono abbastanza rare anche queste però sono più
frequenti delle malattie genetiche in particolare se consideriamo
alcune malattie come la trisomia 21, la sindrome di Down che
presenta una frequenza più alte rispetto alle malattie mendeliane
anche queste sono molto frequenti come gruppo. In questo caso la
ricorrenza familiare non è così certa come nel caso delle malattie
mendeliane e può essere presente o può essere non presente
infatti nella maggior parte dei casi non c’è ricorrenza familiare. Sono
caratterizzati da un punto di vista clinico da ogni malattia
cromosomica ha il suo pattern, il suo quadro clinico, ma hanno dei
segni comuni che sono presenti in tutti i pazienti e la cui presenza
deve far sospettare il medico di una possibile anomalia
cromosomica che sono in genere segni abbastanza generali: ritardo
mentale, presenza di bassa statura e segni disformici quindi
problemi dello sviluppo osseo con caratteri disformici facciali e
anche degli arti, una altro segno distintivo delle malattie
cromosoniche è l’alta frequenza di aborti nell’ambito delle famiglie
in cui c’è ricorrenza di queste malattie. Mentre nel caso delle
malattie genetiche singole parliamo di una frequenza che va da
qualche individuo su 10mila a 100mila qua la frequenza cumulativa
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di tutte le malattie è di 7 su 1000 neonati quindi è una frequenza un
pò più alta. Fra le malattie più frequenti cromosomiche abbiamo la
sindrome di down, di klineferter e così via.
Le malattie multifattoriali a differenza delle altre sono malattie di alto
impatto, sono molto frequenti, sono malattie di alto impatto sociale
in cui c’è una componente genetica e sono malattie dovute a un
coinvolgimento di più geni quindi sono denominate anche
poligeniche, sono molto frequenti perché stiamo parlando di
malattie ad alto impatto, possono riguardare sia malformazioni
congenite ma sono malattie frequenti nell’adulto perché sono
malattie che esordiscono in età avanzata. La modalità di
trasmissione, in questo caso qui ci potrebbe essere familiarità ma
non c’è una modalità di trasmissione facilmente riconoscibile c’è
una predisposizione in alcune famiglie al manifestarsi di quella
malattia ed è importante l’interazione con l’ambiente; purtroppo
nonostante siano le malattie più frequenti e di alto impatto le basi
molecolari nonostante tutta una serie di studi sono ancora
sconosciute nella maggior parte dei casi quindi non si sa bene quali
sono le cause, le predisposizioni genetiche di queste malattie
appunto si parla in questo caso di predisposizione quindi non è un
gene responsabile ma sono fattori di predisposizione, in questo
caso i fattori di predisposizione possono essere anche gli Snip o
Snp o Cnv che sono presenti nella popolazione la cui combinazione
o la presenza di più Snip o Cnv nello stesso individuo può
predisporre alla comparsa di queste malattie, però il ruolo preciso di
questi genotipi specifici che sono alla base di queste malattie
ancora non sono noti e parliamo di malattie come il diabete mellito,
ipertensione, malattie cardiovascolari, malattie psichiatriche e
queste sono le malattie complesse.
Le malattie da cellule somatiche sono dovute a mutazione che non
colpiscono le cellule germinali, non colpiscono i gameti ma
colpiscono i genomi di cellule somatiche che non verranno
trasmesse alle discendenza ma colpiscono determinati tessuti e
queste malattie sono dovute a mutazioni in qualche caso il primo IT
che colpisce le cellule germinali che fornisce una predisposizione
ma la vera mutazione somatica è quella che colpisce il secondo
allele all’interno di una cellula somatica il cosiddetto secondo IT e
questo meccanismo è alla base dei vari tipi di cancro per se. nel
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cancro della mammella c’è una forma familiare di cancro della
mammella che è dovuto a mutazione del gene Brca1 e queste sono
mutazioni in eterozigosi, queste mutazioni nel tessuto mammario
sono accompagnati a un seconda mutazione che dà luogo al
cancro.
Il ruolo della genetica in medica può essere diagnostico, può essere
una diagnosi sia prenatale che postnatale, quindi nell’individuo
postnatale può essere addirittura pre-sintomatica quindi si può fare
una diagnosi con i sintomi della malattia sono già chiari ma
possono essere fatti anche in fase preclinica, può essere una
diagnosi di predisposizione possiamo fare uno screening di
popolazione. La genetica può essere importante nella prevenzione
tramite la consulenza genetica e la possibile interruzione di
gravidanza. Poi la genetica può svolgere un ruolo in terapia non
solo usando i classici strumenti della terapia disponibili per tutte le
malattie ma può svolgere un ruolo anche utilizzando delle particolari
modalità terapeutiche che sono specifiche delle malattie genetiche
come la terapia genica. La genetica può aiutare altre branche della
medicina tramite la produzione di farmaci che possono essere
ottenute con tecniche di genetica molecolare e DNA ricombinanti
anche per malattie non genetiche di cui però la genetica costituisce
uno strumento. La genetica può svolgere un ruolo importante nelle
malattie infettive perché può riconoscere tramite metodiche
molecolare la presenza di un dato microrganismo dato che si
conoscono tutti i genomi di quasi tutti gli organismi principali che
hanno un ruolo patogenetico in varie malattie genetiche, può fare
una diagnosi di certezza molecolare.
Il locus è una posizione specifica su un cromosoma spesso nella
genetica medica per locus ci riferiamo a un gene quindi locus è
sinonimo di gene in molti casi, quindi regione particolare sul
genoma o gene. Ogni locus a livello di un autosoma, gli autosomi
sono le 22 coppie di cromosomi non sessuali ogni individuo
presenterà due copie dello stesso cromosoma e quindi per un certo
locus avremo due forme alternative che verranno chiamati Alleli e
ogni individuo rappresenterà un allele materno e uno paterno per
ciascun locus fatta eccezione per il maschio che avrà un
cromosoma X e Y e quindi per la maggior parte del cromosoma X e
del cromosoma Y non avrà un allele ma avrà una sola copia. Questi
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alleli possono costituire una Aplotipo e per aplotipo si intende la
successione di allele vicini su un certo locus di un cromosoma.
Polimorfismo è una variabilità allelica che è presente in più del 1%
della popolazione anche se oggi con i nuovi studi genomici questa
frequenza tenderà ad abbassarsi.
Un Omozigote viene descritto come un individuo che presenta alleli
identitici a un certo locus, lo abbiamo visto anche per gli Snip quindi
se a un certo locus un individuo presenta due alleli identici sarà
omozigote per quel locus viceversa se i due alleli saranno diversi
l’individuo sarà eterozigote. Un altro concetto importante è il
Carattere di Dominanza, si intende dominante quel carattere
genetico che si manifesta nel fenotipo anche in stato di eterozigote
invece il Carattere Recessivo è quel carattere genetico che si
manifesta in una malattia, in un fenotipo, in una forma clinica solo
nello stato di omozigote; invece l’eterozigote composto è
assimilabile al discorso dell’omozigote e si intende eterozigote
composto un individuo che porta due mutazioni diverse a uno
stesso locus quindi due mutazioni che entrami sono eterozigoti che
però una colpisce una copia e l’altra colpisce l’altra copia quindi alla
fine è come se fosse un discorso di omozigosi, omozigosi è la
stessa mutazione presente in duplice copia ma in questo caso è
due mutazioni diverse allo stesso locus.
Le malattie monogeniche possono trasmettersi come forme
autosomiche legate al X e possono essere a loro volta dominanti e
recessive, questi sono i simboli per costruire gli alberi familiari,
quindi il soggetto di sesso maschile è indicato con un quadrato il
soggetto di sesso femminile con un circolo, il soggetto affetto è
indicato con un quadrato o un circolo completamente ripieni, gli
eterozigoti possono essere indicati con una metà, i portatori con un
puntino all’interno e il soggetto con la freccia indica il soggetto che
viene all’osservazione.
Le malattie autosomiche dominanti sono malattie monogeniche in
cui il fenotipo si manifesta in individui eterozigoti per la mutazione e
se intendiamo con N l’allele normale e A l’allele affetto il genotipo di
questo individuo sarà NA, il fenotipo degli eterozigoti è
indistinguibile da quello degli eterozigoti affetti quindi la presenza di
una o due copie non modifica nella maggior parte il fenotipo quindi
è sufficiente una copia della mutazione per avere il genotipo e
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questo fenotipo non è influenzato dalla presenza di una duplice
variazione, quindi questo è il genotipo dei soggetti affetti quindi o
una singola copia o una duplice copia dell’allele mutato quindi il
soggetto normale è quello che non presenterà assolutamente la
mutazione; questo è un es. di una famiglia con una trasmissione
autosomica dominante ed è caratterizzata da alcune caratteristiche,
essendo autosomica interesserà gli autosomi e non i cromosomi
sessuali e quindi non ci sarà nessuna distinzione di sesso sia a
livello dei soggetti affetti che nella trasmissione, quindi la malattia è
presente in soggetti di sesso maschile e femminile in uguale
proporzioni e sia i maschi che le femmine sono in grado di
trasmettere la malattia sia ai figli maschi che alle figlie femmine
quindi non c’è nessuna dipendenza dal sesso. La malattia si
osserva in tutte le generazioni quindi si parla di trasmissione
verticale e quindi non ci sono salti di generazione. Ancora, il
genitore affetto può trasmette la malattia al 50% dei figli quindi per
ogni gravidanza ci sarà il 50% della probabilità che il figlio nasca
affetto al contrario se partiamo dall’individuo affetto, l’individuo
affetto deve avere almeno uno dei genitori che è affetto dalla stessa
malattia, ma con qualche eccezione. Se la penetranza del carattere
è completa al 100% i figli di genitori non affetti non sono a rischio;
se entrambe i genitori sono affetti da una malattia autosomica
dominante allora il 75% dei figli sarà affetto, è facile fare il conto
con questo quadrato di Punnet in cui si indicano i due alleli per
genitori e poi si calcola la probabilità del genotipo dei figli. Nel caso
di una persona che è omozigote per un carattere dominante tutti i
figli saranno affetti. Una delle prime eccezioni è il caso in cui ci sia
una nuova mutazione, se noi osserviamo una famiglia in cui
solamente alcune generazioni presentano la malattia questa può
essere dovuto al fatto che si determina una nuova mutazione in uno
degli individui quindi al di sopra non si verifica la malattia perché
quella mutazione non era presente.
Un paio di es di malattie autosomiche dominanti una delle malattia
classiche è la Acondroplasia che è una forma di nanismo
disarmonico in cui gli individui si presentano con arti corti
sproporzionati rispetto e con una facies caratteristica, è una
frequenza tipica di una malattia mendeliana quindi 1/15 mila o 1/40
mila nati, è una malattia autosomica dominante e una cosa che
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caratterizza questa malattia è che nella grande maggioranza dei
casi si parla di nuove mutazione, in questo caso qua la
trasmissione autosomica dominante è difficilmente visualizzabile
perché sono tutti casi dovuti a nuove mutazioni e la mutazione è
sempre la stessa, è un gene specifico il gene Fgfr3 che è un
recettore per un fattore di crescita ed è la mutazione della glicina in
posizione 1138 che diventa alanina, è una delle poche eccezioni di
malattie genetiche causate da una singola mutazione. Il
meccanismo di questa mutazione è un guadagno di funzione,
questa mutazione non causa una perdita di funzione di questa
proteina ma fa si che questa proteina acquisti una nuova funzione,
questo spiega anche il meccanismo di altre malattie autosomiche
dominanti che sono causate da meccanismi di guadagno di
funzione e questo spiega perché l’allele normale non è in grado a
supplire alla funzione anomala appunto perché non è la perdita di
funzione ma l’acquisizione di una funzione nuova che molte volta è
tossica e non può essere controbilanciato dall’allele normale.
La Neurofibromatosi di tipi I che è una malattia abbastanza
frequente ed è una malattia con una clinica molto complessa per
vari segni, con presenza di macchie cutanee le cosiddette macchie
caffè latte, inizialmente presenza di tumori benigni fibromatosi che
poi possono diventare maligni e possono colpire anche il sistema
nervoso centrale. La malattia si manifesta anche in modo diverso
da paziente a paziente e si parla anche di espressività variabile,
l’incidenza è più alta rispetto all’acondroplasia, è una malattia
autosomica dominante con una espressività variabile che significa
diversità del quadro clinico tra individui della stessa famiglia e
anche in questo caso c’è una % di nuove mutazioni circa il 50% dei
pazienti presentano una nuove mutazioni e il primo gene ad essere
stato identificato è il gene Nf1 neurofibromatosi di tipo I ed è un
gene molto grande, adesso esistono anche geni Nf2 un altro gene
che causa neurofibromatosi. In questo caso la patogenesi non è un
guadagno di funzione ma la perdita di funzione quindi la perdita di
una copia del gene NF1 ha un effetto deleterio che determina la
comparsa della patologia.
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Banfi 1.2 (Lunedì 18 Marzo 2013)
Malattie Autosomiche Recessive
Patologia Molecolare
Complicazioni Rispetto ai principali modelli di ereditarietà mendeliana
L’altra volta ci eravamo fermati alle malattie autosomiche dominanti
adesso diciamo qualcosa sulle malattie autosomiche recessive,
innanzitutto come si definiscono le malattie autosomiche recessive,
da che cosa sono caratterizzate? Sono caratterizzate dal fatto che il
fenotipo si manifesta in individui che presentano entrambe gli alleli
mutati, entrambi gli alleli di uno stesso locus coinvolti in un
patologia autosomica recessiva devono essere mutati e ne
consegue che essendo entrambi mutati o possiamo trovarci di
fronte al caso di una mutazione in omozigosi quindi la stessa
mutazione presente sugli entrambi gli alleli o due mutazioni diverse
allo stesso locus che colpiscono tutti e due gli alleli e in questo caso
si parla di eterozigoti composti. Mentre come abbiamo visto l’altra
volta nel caso delle malattie autosomiche dominanti il fenotipo è
indistinguibile sia che ci troviamo in una mutazione in omozigosi o
eterozigosi il fenotipo rimane sempre quello in questo caso, delle
malattie autosomiche recessive, il fenotipo si manifesta solamente
negli omozigoti e non negli eterozigoti composti e non c’è differenza
tra il fenotipo che si osserva negli eterozigoti e quello degli
omozigoti normali in questo caso gli eterozigoti sono dei portatori
sani della mutazione. In un albero esplicativo di una malattia
autosomica recessiva è molto diverso dalle malattie autosomiche
dominante, essendo una malattia autosomica anche qui non c’è
coinvolgimento dei cromosomi sessuali quindi sia maschi che
femmine sono ugualmente affetti e sia i maschi e le femmine
possono trasmette in modo uguale la malattia sia ai loro figli maschi
che alle figlie femmine quindi la trasmissione e la presenza della
malattia non dipende dal sesso, la trasmissione in questo caso si
dice di tipo Trasversale a differenza della trasmissione di tipo
verticale delle malattie autosomiche dominanti in cui sono affetti i
soggetti di tutte le generazioni, in questo caso i soggetti affetti
tendono ad essere concentrati in poche generazioni.
L’individuo affetto ha di solito entrambi i genitori sani ecco perché
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per avere una mutazione in omozigosi o un eterozigosi composta
nello stesso locus la mutazione deve essere ereditata da entrambi i
genitori, e come abbiamo gli eterozigoti sono sani e quindi entrambi
i genitori devono essere portatori eterozigoti della mutazione ma
saranno sani e quindi ne consegue che entrambi i genitori sono
portatori eterozigoti della mutazione e trasmettono la malattia al
25% della progenie rispetto al 50% che osservavamo nelle malattie
autosomiche dominanti. Riassumendo quello che abbiamo detto
fino adesso, quindi la trasmissione non dipende dal sesso, la
trasmissione di tipo trasversale, più membri affetti nella stessa
generazione soprattutto nella stessa famiglia, l’individuo affetto ha
di solito entrambe i genitori sani che sono portatori, eterozigote
della mutazione, e che e trasmettono la malattia al 25% dei figli.
Una cosa importante riguardo alle malattie autosomiche recessive è
che sono molto più frequenti in soggetti che sono consanguinei o
che si originari di piccole comunità isolate (fenomeno del
imprinting), quando si parla di comunità isolate si può parlare di
piccoli paesini come nel Cilento, paesi delle comunità montane,
quindi paesi molto più piccoli in cui anche se non c’è una chiara
definizione di consanguineità tutti gli abitanti di questi paese hanno
la maggiore probabilità di avere un antenato comune. Un es. di una
malattia autosomica recessiva in cui vedete in questo caso qua che
c’è un unico soggetto affetto nella famiglia ma si può
immediatamente sospettare la trasmissione autosomica recessiva
perché c’è consanguineità tra i due genitori che sono cugini primi e
il simbolo che si ha per denotare consaguineità cioè il doppio
trattino di connessione. Quindi quando si sospetta anche in
presenza di un unico soggetto affetto possiamo sospettare la
trasmissione autosomica recessiva chiedendo ai genitori se fossero
imparentati o originari di piccole comunità, chiaramente sarà
sempre più difficile oggi dato le piccole dimensioni delle famiglie
avere delle famiglie molto estese con molti soggetti affetti in
un’unica generazione questa sarà la norma per le malattie
autosomiche recessive quindi un soggetto affetto per famiglia quindi
bisogna stare attenti a riconoscere il pattern di ereditarietà.
Per quanto riguarda la probabilità di trasmissione in genere il caso
classico è quello di due genitori portatori, e nel caso di due genitori
portatori la probabilità che nasca un figlio affetto sarà del 25%
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mentre nel 50% avremo figli eterozigoti sani e nel 25% il genotipo
sarà normale. Un altro es. in cui il genitore è normale e l’altro è
portatore in questo caso la probabilità che il figlio sia portatore si
osserva nel 50% dei figli e l’altro 50% sarà portatore non affetto, in
questo caso con un solo genitore portatore non ci sarà il caso di un
figlio affetto. Questo è il caso più frequente entrambe i genitori sono
portatori sani e il 25% dei figli sono omozigoti normali e il 50%
eterozigote portatore non affetto e il 25% sarà omozigote affetto.
Un altro es., se il genitore è affetto e l’altro è normale cosa
succederà? Che il 100% è portatore ma nessuno dei figli potrà
essere affetto a meno che l’altro genitore sia pure lui eterozigote e
questo non può verificarsi frequentemente a meno che non ci
troviamo di fronte a un matrimonio tra consaguinei, quindi quello
che si può dire a una persona affetta da una malattia autosomica
recessiva è che escludendo i casi in cui il suo partner sia un lontano
parente oppure derivi da questi casi di piccole comunità nessuno
dei figli sarà affetto però tutti i figli saranno portatori eterozigoti della
mutazione. Es. di alcune malattie autosomiche recessive: anemie
falciforme , fibrosi cistica etc…
La fibrosi cistica è una delle malattie mendeliane più frequenti in
assoluto, la fibrosi cistica è una malattia molto severa perché è
caratterizzata dall’alterazione di vari tipi di epiteli quindi è
caratterizzata clinicamente da una malattia polmonare cronica, da
un’insufficienza pancreatica esocrina, crescita stentata, azospermia
ostruttiva, e problemi a carico dell’intestino con ileo da meconio
(materiale contenuto nell’intestino del feto, costituito dai prodotti
delle secrezioni intestinali unitamente a cellule epiteliali intestinali
desquamatesi e dal liquido amniotico ingerito durante il periodo pre-natale),
ostruzione di buona parte degli epiteli secernenti e aumentata concentrazione di cloro nel
sudore. E’ una delle malattie mendeliane più frequenti in assoluto, è la malattia
autosomica recessiva più frequente nei Caucasici con 1/2000 nati ed è autosomica
recessiva ed è causata da mutazione del gene CFTR, CFTR è un canale trasportatore del
cloro e queste mutazioni che si verificano nel canale CFTR causano la perdita di funzione
quindi causano un alterazione di questo canale che non funziona e non è in grado di
esercitare la sua funzione per cui si ha questo accumulo di cloro negli epiteli, ci sono vari
tipi di mutazione a carico del gene CFTR però c’è un caso molto interessane e come
abbiamo visto nell’acondroplasia c’è un’unica mutazione che colpisce il gene responsabile
dell’acondroplasia, nel caso del gene CFTR le mutazioni possono essere multiple ma ce
ne una che è presente in circa il 70% degli affetti soprattutto nella popolazione
occidentale, popolazione europea e si tratta della delezione di un singolo aminoacido
quindi vengono delete tre basi che sono le tre basi che codificano fenilalanina in posizione
508 quindi la delezione di questo aminoacido fenilalanina in posizione 508 rappresenta la
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mutazione più frequente che causa la fibrosi cistica, quindi se si sospetta la fibrosi cistica è
possibile richiedere come esame diagnostico già solamente questa mutazione e avremo
alta probabilità di riscontrare questa mutazione e cominciare a fare una diagnosi
molecolare, come dicevo la patogenesi è dovuta alla perdita di funzione di questa proteina
che è un canale del cloro regolato da AMP-ciclico con risultante difetto del trasporto del
cloro e questo è il meccanismo alla base della malattia, purtroppo è una malattia molto
severa e molto grave e in genere non supera la seconda, terza decade di vita.
L’ultimo capitolo delle malattie mendeliane classiche è quello delle
malattie legate al cromosoma sessuali in particolare al cromosoma
X. Ci sono pochissimi casi di malattie con trasmissione legate al
cromosoma X, ricordiamo che i maschi hanno un solo cromosoma
X e le femmine ne hanno due qui ne consegue la differenza di
manifestazione e trasmissione della malattia. Anche in questo caso
come nel caso delle malattie autosomiche distinguiamo due casi,
abbiamo malattie legate al X recessive in cui solamente i maschi
per lo più saranno affetti e quindi basterà la presenza di una
mutazione sul cromosoma X maschile per dar luogo alla malattia
mentre il maschio che avrà l’allele normale sarà fenotipicamente
normale, invece per quanto riguarda le femmine la presenza dei
due cromosomi X farà in modo che solo nei casi rarissimi in cui
entrambi i loci siano mutati la femmina potrà essere affetta mentre
nel caso di una mutazione in eterozigosi la femmina sarà portatrice
normale. Nel caso delle malattie legate al X dominanti il maschio
sarà sempre affetto perché ha un solo cromosoma X mentre invece
nel caso delle femmine, nel caso delle malattie dominanti, anche la
presenza di un singolo allele darà luogo al fenotipo affetto. Un tipico
es. di albero di una famiglia con trasmissione legata al X recessiva
e già qui ci accorgiamo che rispetto alle malattie autosomiche in
questo caso sono affetti solo i maschi, non c’è mai una
trasmissione maschio-maschio quindi il maschio non potrà mai
trasmettere la malattia al figlio maschio proprio perché in questo
caso non potrà trasmettere il cromosoma X al figlio maschio ma
trasmetterà il cromosoma Y e non potrà trasmettere la malattia.
Solo i maschi sono affetti come dicevamo prima, e tutti i figli maschi
di padri affetti sono sani mentre il maschio trasmetterà l’unico
cromosoma X a tutte le sue figlie femmine che saranno portatrici
nel 100% dei casi quindi tutte le figlie femmine di un maschio affetto
saranno portatrici, a sua volta la femmina portatrice, che avrà due
cromosomi X, avrà un rischio del 50% di avere figli maschi affetti
perché appunto a seconda del cromosoma X che trasmetterà e il
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50% di avere figlie femmine portatrici; quindi il maschio trasmetterà
il suo cromosoma X mutato a tutte le figlie femmine quindi tutte le
figlie femmine del maschio affetto saranno portatrici, una femmina
portatrice avrà il 50% la probabilità di avere figlie femmine portatrici
o figli maschi affetti.
Casi di malattie legati al X recessive abbiamo l’emofilia, disordine
della coagulazione, sanguinamento prolungato di ferite ed
emorragie di zone contuse soprattutto a carico delle articolazioni e
dei muscoli, colpisce 1/10.000 maschi quindi anche questa è una
malattia abbastanza rilevante, possiamo avere due forme A e B
entrambe legate al X recessive le femmine portatrici in genere non
sono mai affette anche se ci può essere un problema di
inattivazione del X che qui complica la trasmissione. La malattie è
dovuta a mutazione di vario tipo nei geni del fattore ottavo forma A
e nona forma B dell’emofilia della coagulazione, nella forma A la
mutazione è un inversione. Essendo una malattia recessiva anche
in questo caso le mutazioni determinano una perdita di funzione,
quindi c’è un’alterazione della funzione del fattore ottavo e nono
con conseguente anomalia della cascata della coagulazione e
difetto della formazione di fibrina e del coagulo. Un pò diverso è il
discorso delle malattie legate al X dominante, questo è un es. in cui
in questo è caso vediamo che non sono più affetti solamente i
maschi ma sono affetti sia maschi che femmine, però la cosa
importante è che anche in questo caso non c’è mai trasmissione
maschio-maschio proprio per il fatto che il maschio non può
trasmettere il proprio cromosoma X al figlio maschio; in quest’altro
caso rispetto alle malattie legate al X recessive il 100% delle figlie
di un padre affetto sono affette perché riceveranno tutte quante il
cromosoma X mutato, mentre la femmina affetta avrà in ogni
gravidanza un rischio del 50% di avere figli maschi affetti anzi sia
maschi che femmine affetti perché in questo caso non ci sarà più il
discorso di portatore, quindi il 50% di figli di una femmina affetta
saranno a loro volta affetti a seconda del cromosoma X che
riceverà. Il caso delle malattie legate al X dominante è un caso
rarissimo cioè non si verifica quasi mai esistono solo rare forme in
cui si osservano sia maschi che femmine in egual misura mentre
invece quello che più facilmente si osserva è un altro caso che è
questo, quelle delle malattie legate al X dominanti che sono letali
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nei maschi in questo caso qui poiché la maggior parte dei geni che
danno luogo alle malattie X dominanti sono dei geni che svolgono
un ruolo molto importante in processi biologici e il fatto che geni
con ruoli fondamentali siano mutati nel maschio che ha una sola
copia di questo cromosoma nella maggior parte dei casi rende
questa situazione incompatibile con la vita, quindi il maschio con
mutazioni in questi geni non è in grado di avere una vita normale
quindi questa mutazione è incompatibile con la vita e si avrà letalità
intraembrionale a livello della vita uterina quindi noi osserveremo
solamente femmine affette da queste malattie quindi quello che noi
vedremo in queste famiglie sarà la presenza di femmine affette e
nessun maschio affetto se poi chiederemo alla famiglia questa
storia di ricorrenza di aborti in famiglia e per lo più saranno aborti di
sesso maschile. C’è un gruppo di malattie legate al X dominante
letali nei maschi di cui, alcuni es, in particolari malattie dello
sviluppo caratterizzate da deficit appunto di grossi problemi dello
sviluppo e in questo caso maschi con questa mutazione avranno
dei fenotipi così gravi che saranno incompatibili con la vita, c’è un
caso di una malattia legata al X dominante e ce ne è una che
invece ha una rilevanza clinica più importante ed è la sindrome di
Rett che relativamente frequente ed è una delle forme più frequenti
di ritardo mentale presente nelle bambine e sarà caratterizzato da
ritardo mentale più altri problemi di origine psichiatrica come
autismo e altri problemi neurologici come atassia e movimenti
stereotipati diciamo una frequenza molto elevata, quindi per quanto
riguarda le malattie X dominante il caso più frequente è quello delle
malattie letali nei maschi. Poi l’eredità legata al Y solo i maschi
sono affetti e c’è una trasmissione diretta da padre a figlio tramite il
cromosoma Y, però sono malattie rarissime e per li più sono difetti,
problemi di sterilità maschile perché nel cromosoma Y esistono per
lo più più geni che sono coinvolti nella regolazione della fertilità e
sono rarissime queste forme e sono anche dovute anche al fatto
che il cromosoma Y è il cromosoma più piccolo presente nel
genoma, presenta solamente 48 geni e per la maggior parte
coinvolti nella funzione della fertilità. L’albero di una famiglia legata
al Y sarà di questo tipo molto facile da riconoscere perché sono
affetti solo soggetti di sesso maschile e la trasmissione sarà diretta
maschio-maschio.
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Le mutazioni possono avere un ruolo nella patologia e sono alla
base dell’evoluzione proprio perché le mutazioni consentono
l’evoluzione della specie, ovviamente la mutazione può essere di
grosse dimensione quando coinvolge numero e struttura dei
cromosomi ma quello che ci interessa adesso sono le mutazioni di
piccole dimensioni che sono sostituzioni di basi, inserzione o
delezione quindi a carico di un singolo gene. La cosa importante
che dobbiamo sapere riallanicciandoci al discorso del genoma che
abbiamo fatto l’altra volta è che riguarda la probabilità che ci siano
nuove mutazioni in ogni generazioni quindi si è visto da dati di
sequenziamento genomico che il numero di nuove mutazioni e
parliamo di mutazioni puntiformi che si verificano de novo, cioè
nuove mutazioni non sono presenti nei genitori è di circa 1 su
100milioni quindi una su 100milione di basi possono essere
soggette a una mutazione de novo e se noi rapportiamo questa
probabilità alla dimensione del genoma e alla dimensione del
genoma che codifica per proteine ne possiamo derivare che
all’interno della porzione codificante del genoma si potrà verificare
per ogni individuo una o due mutazioni a carico di una porzione
codificante quindi diciamo una probabilità molto bassa, questo
spiega il fatto per cui riscontrare una mutazione de novo in un
individuo che presenta una malattia che non è presente nei genitori
ci da una buona probabilità di avere identificato il difetto molecolare
perché questa probabilità è bassissima. Tutte le nuove sostituzioni
sono in eterozigosi e sarà molto difficile che si possa verificarsi una
mutazione de novo in eterozigosi perché colpirà un singolo locus
meno l’1% cade negli esoni codificanti dei geni. Le mutazioni di
singola base possono essere distinte in 4 grosse categorie:
possono essere distinte in Mutazioni Silenti o Sinonime quando
questa mutazione non determina il cambio dell’aminoacido e voi
sapete che c’è degenerazione del codice aminoacidico per cui molti
aminoacidi possono essere codificati da codoni diversi quindi
quando ci troviamo di fronte a una mutazione che non cambia la
codifica dell’aminoacido si parla di mutazione silente o sinonima
che per lo più viene intesa come una mutazione che non ha un
significato causativo. Invece salendo come complicazione la
Mutazione Missenso quando determina la sostituzione con un altro
aminoacido, qui la mutazione può essere più o meno grave a
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seconda della posizione in cui si viene a cadere e dal tipo di
sostituzione che viene a costituire, perché se avremo una
mutazione conservativa di un aminoacido avremo maggiore
probabilità che questa mutazione non abbia effetto causativo
rispetto a una mutazione che cambia drasticamente o la struttura o
la carica elettrostatica di quell’aminoacido. Poi sempre salendo di
più come complessità, probabilità di avere un effetto patologico
Mutazioni Non Senso quando c’è una sostituzione che fa si che un
aminoacido venga sostituito da un codone maturo di terminazione e
in questo caso la mutazione è ancora più drastica perché
determinerà la codifica della proteina a quel livello e quindi sarà
importante verificare a livello di quale regione ci troviamo e se sarà
verso la fine possiamo avere la probabilità che la mutazione sia
meno dannosa, naturalmente se ci troviamo all’inizio avremo un
interruzione prematura della proteina e quindi sarà maggiore
probabilità che sia più grave. Ultimo caso è quello in cui la
Mutazione che causa una Trasformazione di un Codone di stop in
un altro aminoacido per cui causerà una estensione della proteina
rispetto alla sua sequenza originaria e sono meno frequenti però
anche questi possono avere la loro importanza ci sono molto casi di
mutazioni che determinano l’estensione della proteina.
La delezione è l’eliminazione di una o più basi, l’inserzione è
l’aggiunta di una o più basi, e l’effetto della mutazione è molto più
grave perché in questo caso l’aggiunta di una o la perdita di una
base fa si che si alteri completamente la cornice di lettura della
proteina e per cui avremo a partire dal sito in cui si verifica la
mutazione una completa trasformazione della proteina e la maggior
parte dei casi quello che succederà sarà una interruzione precoce
della proteina quindi le inserzioni e delezioni le cosiddette
frameshift determinano un effetto più dannoso rispetto alle
sostituzioni. Quando le delezioni e inserzioni riguardano un numero
di nucleotidi che non è divisibile per 3 si avrà un conseguente
sfasamento della cornice di lettura delle triplette e l’RNA
messaggero e quindi l’alterazione completa della proteina e quindi
una mutazione di questo tipo determina la traduzione non corretta
della proteina a valle della mutazione; se invece ci troviamo di
fronte a una delezione o inserzione di un numero divisibile per tre in
teoria potremmo ancora avere la conservazione della corretta
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cornice di lettura per es. nel caso della delezione della fenilalania in
508 in quel caso c’è una conservazione della cornice di lettura
perché sono deleti 3 nucleotidi che codificano per la fenilalanina,
però anche in quel caso li la mutazione determina un effetto severo,
perdita di funzione.
Altri tipo di mutazioni che dobbiamo tener conto possono essere
classicamente oltre alle mutazioni che si verificano nelle regioni
codificanti sono le mutazioni che alterano il fenomeno dello splicing,
quindi possono essere mutazioni che alterano i siti di splicing
facendo in modo che vengano distrutti i siti di splicing o che
possono creare nuovi siti di splicing, in questo caso qui uno splicing
anomalo, l’alterazione di questa mutazione è identica a quella che
si osserva in una frameshift perché altera completamente la
cornice di lettura e porta alla formazione di codoni di stop prematuri.
Un altro tipo di mutazioni che vengono ancora difficilmente
identificate sono mutazioni che non colpiscono ne le regioni
codificanti ne di splicing ma colpiscono gli elementi che controllano
le espressioni di un gene quindi possono colpire i promotori che
sono appunto le sequenze che determinano il livello di trascrizione
di un gene che a loro volta possono influenzane l’espressione dei
geni però fino a poco tempo fa queste mutazioni erano difficili da
identificarsi proprio perché non conoscevamo bene le sequenze dei
promotori adesso con i metodi di sequenziamento genomico sarà
un pò più semplice identificarli anche se attribuire a queste
mutazioni un carattere patogenetico rimarrà sempre un compito
molto difficile. Per il fenomeno dello splicing per ricordarvi che ci
sono dei siti classici che sono coinvolti nello splicing, ad es l’esone,
quando termina l’esone ci sarà la presenza di due basi che sono
quasi sempre presenti nell’introne e sono una G e una U a livello
del RNA (GT) e l’introne terminerà con una sequenza, una
doppietta AG e mutazione a carico dei questi 4 nucleotidi nella
maggior parte determina alterazione dello splicing per cui, se viene
mutato uno di questi 4 aminoacidi molto probabilmente avremo una
rimozione dello splicing per cui avremo una formazione di un RNA
messaggero anomalo.
Quali saranno le conseguenze funzionali di una mutazione?
Incominciamo a dire una cosa che riguarda della mutazione non
senso e frameshift, uno può pensare che la mutazione non senso o
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un frameshift darà luogo a una proteina tronca, a seconda di dove
io verifico la presenza di questo codone di stop io immagino che
avrò un RNA messaggero che darà luogo alla produzione di una
proteina che si fermerà a quel livello quindi avrò semplicemente
una proteina tronca e questo è quello che si riteneva fino a poco
tempo fa. Invece si è visto che molte volte la presenza di un
segnale di stop dovuta a una mutazione non senso o di un
frameshift dà luogo alla degradazione completa dell’intero RNA
messaggero quindi non una proteina tronca ma una proteina
assente e questo perché è stata scoperto il fenomeno del
cosiddetto degradazione del RNA messaggero mediato da una
mutazione non senso, si è visto che esiste un sistema di controllo
nella cellula che riconosce tutti gli RNA messaggeri che presentano
un codone di stop nell’esone che non sia l’ultimo esone cioè
normalmente l’ultimo esone presenta il codone presente e quando
l’RNA messaggero presenta un codone di stop nell’ultimo esone
viene riconosciuto come RNA messaggero normale se un RNA
messaggero presenta un codone di stop a monte dell’ultimo esone
quindi in un esone intermedio c’è un sistema per cui la cellula lo
riconosce come dannoso e lo degrada quindi è un sistema di
controllo; questo serve soprattutto nelle cellule somatiche per
impedire l’accumularsi di mutazioni che possono avere un effetto
canceroso, un effetto neoplastico però quando questa mutazione si
verifica in una cellula germinale si ha questo sistema potrà essere
dannoso e potrà dare luogo al fenomeno di degradazione del RNA
messaggero quindi alla mancanza della proteina.
A livello funzionale quello che possono determinare le mutazioni
sono due classi principali di alterazioni funzionali, una mutazione
può determinare una perdita di funzione del prodotto proteico
corrispondente, loss of function (LOS) in questo caso qua la
mutazione intendiamo una mutazione no non senso ma frameshift
fa si che la proteina corrispondente abbia una ridotta o nessuna
funzione e questo è il caso classico che si verifica nelle malattie
recessive; nelle malattie recessive per lo più le mutazioni sono da
perdita di funzione e questo caso qua spiega perché è necessario
avere 2 alleli mutati perché l’altro allele nella maggior parte dei casi
è sufficiente a vicariare (sostituire) la funzione dell’allele mutato,
quando si tratta di perdita di funzione perché li è semplicemente
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una questione quantitativa, quindi l’altro allele è in grado si
sopperire alla mancanza di funzione dell’altro allele, fanno
eccezioni i casi in cui è importante che ci sia un dosaggio
prestabilito, predeterminato che è consentito solo dal
funzionamento dei due alleli, nei casi in cui la perdita di funzione di
un allele determina un abbassamento del dosaggio di quella
proteina che è sufficiente a determinare l’apo-insufficienza, apoinsufficienza sono malattie che sono dovute alla perdita del 50%
dell’espressione di un allele. In buona sostanza le mutazioni che
causano perdita di funzione causano patologie recessive a meno
che non ci troviamo di fronte a un caso di apo-insufficienza e in quel
caso potremmo trovarci anche di fronte a una malattia autosomica
dominante ma nella maggior parte sono recessive.
Invece il secondo grosso gruppo è dovuto al fatto che la mutazione
fa acquisire una nuova funzione alla proteina e per lo più può
essere una funzione tossica allora in quel caso si parla di guadagno
di funzione, acquisizione di funzione o addirittura aumento della
funzione e quando si verifica una mutazione di questo tipo che per
lo più è dovuta a una mutazione Missense che nel cambio
aminoacidico che fa si che venga acquisita una nuova funzione,
come ad es. nel caso nell’acondroplasia in quel caso il cambio
aminoacidico fa assumere una funzione nuova alla proteina, l’allele
sano non è in grado di sopperire a questa funzione perché l’allele
sano continua a fare il suo mestiere, non può controbilanciare una
nuova funzione che viene ad acquisire questa proteina, per cui
l’acquisizione di funzione è il meccanismo più frequente alla base
delle malattie dominanti ecco perché è sufficiente una mutazione
perché non c’è la possibilità dell’altro allele di controbilanciare a
questa situazione.
Un’ultima cosa che riguarda sempre le nuove acquisizioni del
progetto genomico è di fare una verifica di quante sono le mutazioni
che sono presenti all’interno di ognuno di noi e questi numeri hanno
rappresentato una sorpresa perché si è visto che il numero di
mutazioni potenzialmente dannose che ognuno di noi può avere nel
genoma è molto alto, questo è un progetto mille genomi che
prevede il sequenziamento di 1000 individui, i primi risultati che ha
già dato questo progetto sono questi: in ogni individuo ha 10.00012.000 polimorfismi sinonimi Snp, quindi sono polimorfismi che non
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alterano la sequenza aminoacidica, ma presenta tra i 10-10.800
Snp che non sono sinonimi tra cui perdita di stop 4 su 14, non
sense da 67 a 100, perdita di splicing 28-45, frameschift 192-280,
facendo il conto di quante di queste non sono polimorfismi cioè
polimorfismi presenti all’1% della popolazione ne risulta che ogni
genoma potrebbe presentare 200-300 mutazioni che sono
potenzialmente dannose quindi ognuno di noi presenta un certo
numero di alterazione che hanno un possibile significato patologico
per la maggior parte di queste non daranno problemi perché
saranno mutazioni recessive presenti in eterozigosi. Però questo
numero da idea del fatto che quando si faranno sequenziamenti a
scopo diagnostico bisognerà essere molto attenti a interpretare il
significato di queste mutazioni perché non possiamo dire appena
troviamo una variazioni tipo di stop, una mutazione, non possiamo
dire questa è una mutazione causativa bisogna essere molto cauti
nel interpretare questi dati.
Vediamo quali sono le complicazioni rispetto ai principali modelli di
ereditarietà mendeliana, queste sono complicazioni, sono delle
situazioni che complicano l’interpretazione dei pattern di ereditarietà
però non ci portano al di fuori di quello che abbiamo detto.
Alcune le possiamo vedere molto velocemente come le mutazioni
de novo, questo è un caso di una malattia autosomica dominante
causata da una nuova mutazione abbiamo già visto prima la
probabilità di una nuova mutazione, probabilità molto basse però
possiamo avere questo caso, e abbiamo visto l’altra volta
l’acondroplasia causata da mutazioni de novo se noi ci fermassimo
alla valutazione dell’albero in questo caso non diremmo mai che è
una malattia autosomica dominate perché abbiamo un unico
soggetto affetto, più un solo caso sporadico, quindi siamo più
portati a pensare a una malattia recessiva quindi attenzione a quel
punto ci aiuta la clinica, sapere di che tipo di malattia si tratta e
sapere che quella malattia è una malattia che si verifica in un
pattern autosomico dominante ci dovrebbe aiutare nella diagnosi, in
futuro ci potrà aiutare anche il sequenziamento genomico o esonico
e possiamo riscontrare che questa mutazione presente in questo
individuo non è presente nei genitori, comunque in ogni caso ci
troviamo di fronte a un caso di trasmissione autosomica dominante,
in ambito di consiglio genetico se si tratta di una malattia
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compatibile con la riproduzione dovremmo dire a quel soggetto che
da quel momento in poi la malattia diventerà autosomica dominante
classica e avrà la probabilità del 50% di avere un figlio affetto.
Finiamo il discorso dell’espressività variabile, per espressività
variabile si intende la manifestazione più o meno marcata di un
fenotipo dovuto a un allele mutante, in parole povere all’interno di
una stessa famiglia la stessa mutazione potrà dar luogo a uno
spettro fenotipico completamente diverso, quindi la malattia sarà
sempre presente però con intensità e modalità diverse, quindi
l’espressività di un carattere si riferisce alla natura e alla gravità del
fenotipo, quindi stessa mutazione fenotipo diverso all’interno della
stessa famiglia e questo potrebbe un pò complicarci la diagnosi
potrebbe far pensare alla presenza di più patologie presenti nella
stessa famiglia quando invece ci troviamo di fronte allo stesso
quadro ma con manifestazione di tipo diverse.
Questo è un es. di una malattia che si chiama sindrome di
Waardenburg che è caratterizzata da un quadro fenotipico variabile,
ed è una malattia a trasmissione autosomica dominante ed è
caratterizzata da 4 principali segni: sordità, eterocromia iridea
(occhi di colore diverso) presenza di ciuffo di capelli bianchi sulla
fronte o un precoce incanutimento (capelli diventano grigi). Questi
spicchi diversi ci indicano la diversa associazione di questi sintomi
nella famiglia, quindi la presenza di un fenotipo diverso in soggetti
della stessa famiglia pure in presenza della stessa mutazione. Ci
sono altri es. di espressività variabile che sono rappresentati dalla
sindrome di Marfan, l’osteogenesi imperfecta che è una malattia
che colpisce l’osso e sono mutazioni del gene del collagene, la
sindrome di Marfan oltre all’osso colpisce anche il sistema
vascolare, in particolare anche la distrofia miotonica che si può
andare dalla presenza di cataratta alla presenza di distrofia
miotonica alla presenza di gravi alterazioni cardiache e potremmo
avere all’interno della stessa famiglia soggetti che presentano lo
spettro più grave come problemi cardiologici e miotonia e cataratta
mentre altri soggetti presenteranno solo la cataratta quindi un
quadro molto variegato di manifestazioni che può confondere la
diagnosi quindi espressività variabile e diverso fenotipo in presenza
di una stessa mutazione ma in ogni caso tutti i soggetti sono affetti.
Diverso invece è il discorso della penetranza incompleta, in questo
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caso non è una variabilità clinica diciamo un aspetto quantitativo
per cui alcuni soggetti avranno una malattia più o meno grave, nel
caso di una penetranza incompleta avremo una situazione di tutto o
nulla cioè stessa mutazione alcuni soggetti saranno affetti e altri
soggetti apparentemente non saranno affetti, in caso di penetranza
incompleta solamente una certa proporzione di individui che
presentano la mutazione presenteranno la malattia e i casi che
abbiamo visto fino adesso di malattie autosomiche dominanti sono
a penetranza completa per cui tutti i soggetti che presentano la
mutazione presentano la malattia, invece nel caso di penetranza
incompleta avremo che solamente una % di individui presenteranno
la malattia, quindi la penetranza si esprimerà come una % o
frazione di uno, nel senso che sarà una divisione tra il numero di
soggetti che presentano la malattia rispetto al numero di soggetti
che presentano la mutazione, quindi abbiamo detto prima è un
fenomeno tutto o nulla che si riferisce all’espressività quindi
presenza o assenza della malattia quindi si riferirà
quantitativamente come la proporzione di portatori obbligati della
mutazione che esprimono il fenotipo, anche questo si verifica per le
malattie autosomiche dominanti e parlare di penetranza incompleta
del 90% significa dire che un portatore dell’allele mutato ha il 90%
di probabilità di esprimere la malattia a livelli diagnosticabili, come
in questo albero, dove una malattia con trasmissione autosomica
dominate sono affetti tutte le generazioni e il problema viene da
questo ramo qui della famiglia in cui vedete, classicamente nelle
malattie autosomiche dominanti si dice che tutti i soggetti affetti
devono avere uno dei genitori affetti, invece in questo caso qua la
mamma che è portatrice della mutazione è apparentemente sana
anzi sarà sana. Quindi se noi osservassimo solo questa parte qui
della famiglia senza tener conto di tutta quest’altra parte noi
potremmo concludere che questa è un malattia autosomica
recessiva perché i genitori sono sani e invece è un caso di
autosomica dominante a penetranza incompleta e in questo caso
qua se noi contiamo tutti i soggetti affetti rispetto ai soggetti
obbligati della mutazione ci troveremo di fronte a 9 su 10 e quindi
parleremo di una penetranza del 90%. Come si può spiegare
questa penetranza incompleta? Si può fare l’es. di un caso in cui la
penetranza incompleta è stata spiegata e si tratta di una forma di
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Retinite Pigmentosa, malattia genetica molto complessa che
colpisce la retina, una forma molto frequente di retinopatia
ereditaria colpisce 1 su 400 individui ed è caratterizzata da problemi
della visione che cominciano soprattutto a livello della vista
periferica. Presenta una genetica molto complessa perché può
essere causata da mutazioni di tanti geni diversi circa 50 con un
fenotipo clinico indistinguibile e può avere un pattern di ereditarietà
dominante recessivo legato al X. Nella forma RP11 che è causato
dalla mutazione di un gene implicato nel processo dello splicing,
questa forma è una retinite pigmentosa autosomica dominante in
cui era noto da tempo la presenza di penetranza incompleta e con
la sua identificazione si è notato che nei soggetti che presentano
questa mutazione non presentano il fenotipo clinico e un gruppo di
ricercatori ha ipotizzato che potessero essere i livelli di espressione
dell’allele normale a determinare la penetranza cioè sono andati a
verificare quali fossero i livelli di espressione dell’allele normale del
gene PRPF31 quindi allele del gene non mutato e hanno riscontrato
che laddove i livelli di espressione superavano una certa soglia i
soggetti non erano affetti mentre al disotto 3 i soggetti presentano
la patologia mentre al di sopra di 3 i soggetti che presentano la
mutazione sono protetti quindi in qualche modo quindi sembra che i
livelli normali proteggano o determinano la presenza della malattia
cioè è la mutazione che determina la malattia però se l’altro allele
riesce ad esprimere la proteina a livelli superiori rispetto ad una
certa soglia questi soggetto saranno protetti, quindi questo vuol dire
che esistono due polimorfismi nella popolazione normale che fanno
si che uno sia associato ad un livello altro di espressione, l’altro sia
associato ad un livello più basso. Quando la mutazione è associata
a un livello alto di espressione dell’altro allele la patologia non si
manifesta, quando invece la mutazione che è la perdita di funzione
dell’altro allele si accompagna ad un livello basso di espressione
dell’allele sano la malattia si manifesta. Questo ha spiegato la
penetranza in questa malattia.
Attenzione, si ci può confondere tra Espressività e Penetranza
incompleta!!! Quindi Espressività di diversa intensità di un fenotipo
all’interno di una famiglia con la stessa mutazione ma in cui tutti i
soggetti sono affetti, Penetranza invece è il discorso di presenza o
assenza all’interno della spessa famiglia in presenza di una
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mutazione del fenotipo.
Un altro aspetto che può complicare, più raramente, il quadro di
trasmissione è quello del Mosaicismo Germinale, intendiamo per
Mosaicismo la condizione in cui in un individuo sono presenti due o
più linee cellulari che sono geneticamente diverse derivate da un
singolo zigote e che possono essere diverse per una mutazione
cioè significa genomi diversi all’interno dello stesso individuo e
queste mutazioni possono avere luogo in epoca prenatale o post
natale, chiaramente quanto più precocemente queste mutazioni
possono avvenire maggiore sarà il livello di mosaicismo e maggiore
sarà la presenza di questo secondo genoma. Se colpiscono solo le
cellule somatiche si parlerà di mosaicismo somatico che potrà
colpire solamente un certo tipo di tessuto, se invece questo
mosaicismo colpisce fasi precoci dello sviluppo interessa anche le
cellule germinali ovviamente si può osservare all’interno dello
stesso individuo cellule germinali gameti con un genotipo normale e
con un genotipo mutato, quindi il soggetto sarà fenotipicamente
sano cioè non porterà la mutazione però potrà trasmettere
eventualemente questa mutazione con uno di questi gamenti
alterati alla progenia. Quindi tanto più precoce dello sviluppo, della
formazione del embrione si verifica la mutazione maggiore sarà il
numero di cellule colpite dal mosaicismo.
Quindi nel mosaicismo germinale possono essere presenti due o
più linee cellulari derivate da un singolo zigote che differiscono per
la presenza di una mutazione. Tutto questo porta interesse al
consiglio genetico perché possono essere confuse con una nuova
mutazione “de novo”, quindi mentre per una mutazione de novo noi
possiamo dire ai familiari che quello è stato un evento sfortunato
che però non si verificherà più in una seconda gravidanza in quanto
si ha una probabilità 1 su 100milioni. Nel caso di un mosaicismo
germinale invece no, in quanto dipende dall’entità del mosaicismo
per cui in una nuova gravidanza potrebbe esserci un nuovo caso di
figlio affetto.
Un altro caso che può complicare la normale trasmissione è quello
dell’Insorgenza Tardiva cioè che avvengono dopo la nascita come
alcune che si verificano in età tardiva e questo può essere dovuto
da varie situazioni come malattie da un lento accumulo di sostanze
nocive in cui vi è una morte rallentata di certi tessuti ad esempio la
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retinite pigmentosa non è una malattia che si manifesta alla nascita,
così come buona parte delle malattie neurodegenerative causate
da triplette sono malattie che esordiscono in modo relativamente
tardivo ovviamente ci potremo trovare di fronte a quadri in cui
potremmo avere delle malattie nelle generazioni superiori mentre
nelle generazioni più giovani apparentemente non ci sono affetti ma
questo è dovuto solo ad una questione di tempo perché poi in fasi
successive anche alcuni di questi soggetti nell’ultima generazione
presenteranno la malattia, ovviamente anche in questo caso è
semplice da diagnosticare quando si analizza l’albero nel suo
complesso, ma quando andiamo ad analizzare solamente una
piccola famiglia senza tener conto la relazione con gli altri rami
potremmo essere tratti in inganno, però bisogna essere sempre
attenti a chiedere ai pazienti qualsiasi altra informazione che
riguardano altri parenti, altri rami della famiglia.
Ultima complicanza di Trasmissione è la Eterogeneità Genetica che
è il fenomeno per cui lo stesso fenotipo può essere causato da
mutazioni di geni diversi e questo si può verificare quando ci
troviamo in mutazioni in geni che codificano per proteine che in
qualche modo siano correlate tra di loro funzionalmente come il
caso di diverse unità o subunità di una proteina oppure con proteine
che interagiscono con altre proteine all’interno di uno stesso
processo metabolico, molecolare. Nel caso delle proteine che sono
subunità di una stessa proteina o un aggregato proteico è quella
dell’osteogenesi imperfetta che è causata da mutazioni nel
collagene il quale è formato da varie catene diverse e che sono
codificate da vari tipi di geni come ad es. il gene presente sul
cromosoma 17 o 7 e quindi mutazioni in una qualunque di questi
due catene del collageno può portare ad una forma di osteogenesi
imperfetta che è indistinguibile dal punto di vista clinico.
Un altro caso è quello della retinite pigmentosa in cui può essere
causata da mutazioni in almeno 50 geni diversi ed il fenotipo di
queste mutazioni è indistinguibile, quindi l’oculista potrà fare solo
diagnosi di retinite pigmentosa però non potrà indicare qual’è il
gene responsabile, quindi sarà necessario uno screening genetico
per arrivare al gene responsabile di quella forma.
In sintesi la maggior parte delle complicazioni riguardano la
trasmissione autosomica dominante, quali sono i casi in cui una
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malattia trasmessa con modalità autosomica dominante possiamo
avere in caso in cui un affetto presenta entrambi i genitori sani,
quindi come abbiamo visto può essere un caso di mutazione de
novo, un caso di penetranza incompleta oppure potremmo avere
apparentemente la presenza di genitori sani, la presenza di
mosaicismo germinale e un altro caso che non bisogna
sottovalutare è quello di un errata attribuzione di paternità.
Fino a poco tempo fa è stato molto difficile riconoscere tra
mutazione de novo e mosaicismo germinale in quanto non erano
presenti test diagnostici adatti.
Poi abbiamo classi particolari di malattie genetiche come: le
malattie mitocondriali sono per definizione sono completamente
diverse rispetto alla genetica mendeliana perché colpiscono un altro
genoma, non colpiscono il genoma nucleare costituito da 3miliardi
di nucleotidi e 22mila geni, il genoma mitocondriale che è formato
da 16600 basi e codifica per 37 geni e questo genoma può
presentare mutazioni che possono avere un ruolo clinico, 13 geni
codificano per proteine che sono coinvolte nella catena respiratoria,
22 per RNA di trasporto al livello della sintesi proteica ribosomiale e
2 per RNA ribosomiali, quindi il mitocondrio presenta una sorta di
suo apparato per la sintesi proteica, quindi la cosa importante è che
solo 13 geni rientrano nella catena respiratoria, quindi solo una
piccola parte. Il mitocondrio presenta non solo un genoma diverso
ma anche un codice genetico leggermente diverso da quello
nucleare che si distingue soprattutto per i codoni di stop. Le
proteine mitocondriali possono essere prodotte sia dal genoma
mitocondriale sia dal genoma nucleare, la maggior parte.
Quando parliamo di malattie mitocondriali bisogna stare attenti a
distinguere, malattie mitocondriali sono tutte malattie che in qualche
modo presentano un alterazione in cui c’è un alterazione della
funzione mitocondriale però quando parliamo di mutazioni
mitocondriali ovviamente ci si riferisce solamente alle mutazioni che
colpiscono solo il genoma mitocondriale, tutte le altre mutazioni che
colpiscono la sintesi di proteine mitocondriali ma che sono
codificate dal genoma nucleare ovviamente rientrano nelle modalità
di trasmissione mendeliana che è stata descritta in precedenza.
Mentre le mutazioni che colpiscono il genoma mitocondriale
presentano una loro diversa modalità di trasmissione e diverse
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modalità di manifestarsi.
Quando parliamo di malattie dovute a mutazioni del genoma
mitocondriale dobbiamo rifarci a questi 5 aspetti: Poliplasmia è il
fenomeno per cui in ogni cellula sono presenti molti mitocondri da 2
a 100 e ogni mitocondrio, a sua volta, contiene multiple copie del
suo genoma quindi all’interno di ogni cellula avremo migliaia di
copie di DNA mitocondriale e bisogna anche tener presente che
durante la divisione cellulare i mitocondri vengono distribuiti
casualmente alle cellula figlie. Eteroplasmia è una conseguenza
della Poliplasmia cioè in tessuti normali tutte le copie del genoma
mitocondriale saranno identiche tra di loro ma quando però
incominciano ad essere presenti mutazioni queste mutazioni
possono o colpire tutte le copie (ma quasi mai succede) oppure
determinare un fenomeno detto Eteroplasmia per cui queste
mutazioni saranno presenti solamente in un certo numero di
genomi mitocondriali all’interno della cellula, quindi avremo genomi
diversi all’interno di una stessa cellula.
Effetto Soglia si intende quella soglia che al di sopra della quale si
potrà manifestare il fenotipo a carico di un certo tessuto, e l’aspetto
importante questo tipo di patologia colpisce determinati tessuti
come per esempio tessuti che hanno maggior bisogno dell’attività
mitocondriale come il sistema nervoso centrale, il cuore e muscolo
quindi tutte quelle strutture che hanno bisogno di grandi quantità di
energie (ovviamente questo determina un effetto soglia infatti
queste copie mutate del DNA mitocondriale manifesteranno i loro
effetti solamente quando si supererà una certa soglia di numero di
genomi mutati rispetto al numero di genomi normali presenti
all’interno di un certo tessuto, quindi bisogna avere un certo numero
di geni mutati per avere il fenotipo clinico) Segregazione mitotica,
come detto, non si ha una trasmissione 1:1 ma durante la divisione
cellulare molti mitocondri verranno trasmessi nelle cellule figlie e a
seconda della distribuzione delle copie del genoma mutato avremo
un conseguente cambiamento fenotipico e questo avviene
soprattutto nelle prime fasi dello sviluppo dove alcune cellule
deriveranno dai tessuti a seconda della segregazione di copie
mutate andrà a finire in quel particolare tessuto si potrà avere la
comparsa o meno dei sintomi clinici di quella malattia.
Ereditarietà Materna, i mitocondri nell’ambito della formazione dello
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zigote lo zigote riceverà tutti i mitocondri dalla cellula uovo materno,
quindi tutte le mutazioni verranno ereditate sempre dalla mamma,
lo spermatozoo non trasmetterà mitocondri allo zigote per cui
solamente le mamme portatrici potranno trasmettere la mutazione
nel DNA mitocondriale a tutti i figli sia figlie femmine che figli
maschi, ma solo le figlie femmine lo trasmetteranno ai loro figli. La
funzione mitocondriale è importante a quasi tutte le cellule e poiché
l’espressione di una mutazione dipende dalla proporzione relativa di
DNA mitocondriale normale mutante nelle cellule che formano i vari
tessuti e quindi dipenderanno dal grado di eteroplasmia, effetto
soglia per quel tessuto, nelle malattie mitocondriali la regola è la
penetranza ridotta e l’espressività variabile perché dipenderà da
dove si sono andati a distribuire i mitocondri mutati rispetto a quelli
sani quindi in ogni famiglia con una malattia mitocondriale ci sarà
sempre l’espressività variabile e penetranza non necessariamente
completa.
Un po più complesso è il discorso da malattie da Espansione
Triplette, rispetto alla genetica mendeliana classica le mutazioni
che abbiamo parlato prima sono per definizione sono stabili e
vengono trasmesse invariate da una generazione all’altra, invece
negli ultimi 20 anni è venuto fuori un gruppo di malattie in cui la
mutazione non è stabile ma si hanno una presenza di mutazioni
instabili che sono dovute da un meccanismo diverso cioè un
espansione di DNA ripetuto quindi non sostituzione o delezione ma
espansione di DNA ripetuto in particolare sono espansioni di
triplette ripetute in particolare CAG e CGG e queste triplette hanno
la particolarità a di avere un comportamento anomalo cioè mentre
le altre tendono ad essere abbastanza stabili nel corso delle
divisioni cellulari, queste triplette mostrano una certa tendenza
all’instabilità allorché superano una certa soglia sia in mitosi che in
meiosi, il meccanismo attraverso il quale avviene può dare luogo ad
appaiamenti alterati nel corso della replicazione del DNA per cui
potremmo avere degli scivolamenti, appaiamenti errati quindi ad un
mancato appaiamento, il perché si manifesti a carico di queste
triplette ora non è noto.
Tre caratteristiche fondamentali che caratterizzano queste triplette
sono il concetto di Premutazione, Istabilità e Anticipazione.
Premutazione è quel fenomeno per cui all’interno delle malattie con
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espansione di triplette noi osserviamo che non c’è mai passaggio
diretto dalla normalità alla mutazione ma c’è un passaggio
intermedio che è quello della comparsa di una premutazione che è
un limite di un numero di triplette che è superiore alla norma ma
non sufficiente a determinare una patologia franca ma questo limite
superiore è quello che rende la cellula predisposta alla mutazione
vera e propria quindi se non si ha il passaggio per questa
premutazione in genere la mutazione non avviene ed è un limite
superiore che di per se non causa la malattia ma è prono alla
generazione successiva all’espansione e alla mutazione. Un altro
aspetto importante delle malattie da triplette è l’Instabilità Genetica,
cioè se noi andiamo a verificare all’interno di una famiglia vediamo
che si passa sempre da numeri più bassi di un numero di triplette a
numeri sempre più elevati.
Per quanto riguarda la Trasmissione anche l’origine parentale della
tripletta può essere importante perché ci sono malattie da triplette in
cui la trasmissione da parte del padre ha un maggiore rischio di
espansione, e questo si verifica nel caso di malattie di
poliglutammine, mentre ci sono altri casi in cui la trasmissione
materna che determina l’espansione più grave è quella che si
verifica per esempio nella distrofia miotonica e nella sindrome del X
fragile.
Ultimo aspetto importante che è comune a tutte le malattie da
espansione da triplette è quello dell’Anticipazione ed è il fenomeno
per cui osservando famiglie con queste malattie si osservava un
peggioramento della malattia da una generazione all’altra ed è un
classico quadro che si osservava nella distrofia miotonica (difficoltà
a decontrarre il muscolo) e gravi alterazioni della funzionalità
cardiaca. Si osservava in famiglie, con trasmissione autosomiche
dominate, si avevano individui che nelle generazioni più anziane (la
nonna) presentava cataratta e a 50 anni con esordio con il difetto
muscolare, quando si andava alla seconda generazione (figlia)
aveva un problema muscolare che sorgeva già in adolescenza e la
presenza di cardiomiopatie che sorgeva precocemente, nella
generazione successiva (nipote) si osservavano forme gravissime
di miotomie congenita che portava addirittura insufficienza
respiratoria, ipotomia e anche morte. Quindi in questo fenomeno si
ha peggioramento del quadro clinico all’interno della stessa
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famiglia, mam mano che si scende nelle generazioni veniva
chiamato anticipazione. Dopo vari studi si è visto che l’età di
esordio e le gravità del quadro clinico sono inversamente
proporzionali al numero di triplette, cioè man mano che aumenta il
numero di triplette nel genotipo di questi individui tanto più si
abbassa l’età di esordio ed il quadro clinico diventa più grave.
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Banfi 1.3 (Mercoledì 20 Marzo 2013)
Complicazioni Rispetto Ai Principali Modelli
Di
Ereditarietà Mendeliana Aberrazioni Cromosomiche
Riprendiamo il discorso che abbiamo interrotto la scorsa volta, la
scorsa volta avevamo cominciato ad accennare l’argomento delle
malattie da espansioni da triplette che rappresentano un caso
particolare nell’ambito delle malattie mendeliane e avevamo parlato
del discorso della Premutazione dell’Instabilità
e della
Anticipazione adesso entriamo più nel merito di questo interessante
gruppo di malattie e vediamo dei casi specifici e poi facciamo un
ulteriore classificazione, perché nell’ambito di queste malattie di
espansione da triplette sono stati distinti due grossi gruppi che
distinguo sulla base sia del tipo di mutazione che si verifica che
anche della funzionalità associata a questa mutazione;
distinguiamo delle malattie da espansione di tripletta da perdita di
funzione e da acquisizione di funzione, questi meccanismi di
mutazione l’abbiamo già accennato la scorsa volta e questa
classificazione dipende da dove è posizionata la tripletta nell’ambito
del gene responsabile. Cominciamo con il dire che questi due tipi
principali di malattie si differenziano nel senso che il primo gruppo
quello da guadagno di funzione è caratterizzata da triplette che si
trovano nella regione codificante di un gene e parliamo di malattie
di Tipo 1, quando invece le triplette si trovano in regioni non
codificanti del gene parliamo di malattie di Tipo 2, le malattie di tipo
1 sono caratterizzate da guadagno di funzione e le malattie di tipo 2
da perdita di funzione e alcune delle principali malattie da
espansione da triplette che sono conosciute a monte e vediamo
che qui stiamo parlando di malattie di tipo 1 quindi malattie da
guadagno di funzione che sono causate da espansione nella
regione codificante e la tripletta che qui è interessata è CAG,
trovandosi nella regione codificante del gene questa codifica per un
aminoacido che è la glutamina e poiché si parla di più triplette
parliamo di malattia di poli-glutamine cioè da molte glutamine che
possono aumentare il loro numero, parliamo in particolare della
Corea di Huntington che rappresentata all’interno della regione
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codificante ci sono queste CAG che possono aumentare di numero,
quello che ci interessa sapere è che a livello di numero di triplette di
cui parliamo abbiamo questa situazione: la normalità prevede dalle
10-30 unità triplette e in questo ambito le tripletta è stabile, invece
per avere la mutazione in media l’espansione avviene al di sopra
delle 40 unità, nella regione di mezzo tra 30-40 abbiamo una zona
intermedia che possiamo assimilare al discorso della premutazione
che abbiamo fatto l’altra volta. Questo tratto poli glutaminico
espanso conferisce una nuova funzione patologica alla proteina,
alcuni degli esempi di malattia da triplette di tipo 1 ma adesso ci
soffermeremo soprattutto sulla Corea di Huntigton, in linea generale
queste malattie da triplette di tipo 1 sono malattie
neurodegenerative e colpiscono prevalentemente il sistema
nervoso centrale causando la degenerazione di classi particolari di
neuroni, oltre la Corea di Huntington abbiamo anche altri tipi di
malattie degenerative in particolare sono forme di atassie spinocerebellare quindi malattie che colpiscono prevalentemente il
cervelletto e il midollo spinale.
La più frequente di queste malattie è la Corea di Huntington che è
stata descritta già da un secolo e mezzo la prima volta da questo
medico americano, viene anche denominata a causa della sua
particolare manifestazione clinica ballo di San Vito, questo medico
riconobbe questi pazienti che avevano questi movimenti
incontrollati, involontari che diventavano quasi una sorte di danza e
ha dato nome a questa malattia. Si tratta di una malattia
neurologica devastante che è dovuta alla degenerazione specifica
di un componente neuronale e in particolare il neurone del corpo
striato, è la classica malattia autosomica dominante e ha
penetranza completa e in genere l’età di esordio è in media intorno
ai 40 anni, comincia con segni di mutabilità, comparsa di
depressione, comparsa di questi gravi disturbi del movimento e
progressiva aderenza, è una malattia lunga, progressiva che però
al momento ha prognosi infausta. Dal punto di vista genetico è
caratterizzata da eraditarietà autosomica dominante e c’è qui la
presenza di Anticipazione ed è una delle prime condizioni in cui è
stata descritta l’anticipazione insieme alla sindrome del X fragile e
alla distrofia miotonica si cui parleremo dopo. Quello che si
osservava era che nell’ambito di queste famiglie c’era un
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progressivo peggioramento del quadro clinico con un anticipazione
dell’esordio e in particolare si notava che il quadro più severo si
osservava in figli di maschi affetti quindi la trasmissione paterna
determina l’insorgenza delle forme più gravi. Per quanto riguarda il
numero delle CAG al di sotto di 28-30 parliamo di livello normale,
quindi al di sotto di 28-30 la tripletta è stabile quindi non tende ad
aumentare nelle successive generazione, mentre invece tra 29-34
chi possiede questo tipo di triplette non ha alcun problema clinico
ma comincia ad entrare in quel range di stabilità per cui la
generazione successiva può essere a rischio di mutazione; tra 3539 siamo ancora più intermedio perché alcuni possono avere la
malattia e altri no quindi siamo in un quadro in cui se volessimo
usare un termine improprio in cui la penetranza non è completa
però la generazione successiva è a rischio, al di sopra di 40 c’è la
malattia conclamata e c’è il rischio di sviluppare ulteriore stabilità.
La proteina interessata ha preso il nome della malattia e si chiama
Huntington proteina molto grande in cui la poli-glutamina è presente
nella porzione più iniziale della proteina nella N terminale, questa è
una proteina ubiquitaria ed è espressa in tutti i tessuti e la funzione
normale di questa proteina è quella di regolare il meccanismo di
trascrizione e proteggere le cellule dalla morte cellulare quindi una
funzione molto importante ma molto generale e pur essendo una
proteina ubiquitaria determina questo quadro specifico di
degenerazione a carico solamente di questa popolazione neuronale
e quindi la funzione normale non ha nulla a che vedere con la
patogenesi della malattia perché infatti l’espansione della poliglutamina fa acquisire una nuova funzione tossica a questa
proteina che determina un danno alla cellula con una
degenerazione progressiva della cellula, in particolare questa
tossicità è dovuta alla presenza di questi cosiddetti aggregati
all’interno del nucleo di queste cellule, e in particolare si parla di
aggregati intranucleari che si formano all’interno del nucleo e che
sono dovuti proprio alla presenza di poli-glutamina non è
un’alterazione della funzione dell’ATT che determina la comparsa
della malattia ma la presenza di questi aggregati intranucleari che
per qualche meccanismo ancora non ben noto determina questi
aggregati si accumulano nel nucleo e determinano la sofferenza
della cellula e alla fine muore. Quindi la Corea di Huntington così
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come le altre malattie da triplette di tipi 1 presentano delle
caratteristiche generali: presentano questo progressivo fenotipo
neurologico che è dovuto a perdita di neuroni, quindi
degenerazione neuronale, e questa degenerazione neuronale è
dovuta all’acquisizione di funzione della proteina che presenta il
tratto della poli-glutaminico espanso, la cosa che riguarda non solo
la Corea di Huntigton ma anche e altre forme di malattie di tipo 1
che queste tutte queste proteine non sono specifiche di tipo
neuronale ma sono proteine espresse in tutti i tessuti ma il fenotipo
è selettivo, selettivo per alcuni neuroni, nel caso della Corea di
Huntigton abbiamo visto che sono i neuroni dello striato invece nel
caso della atassia sono neuroni cerebellari e il fatto che questo
fenotipo sia specifico si presuppone che questa proteina tossica in
qualche modo interagisca con altre proteine che in quei siti sono più
sensibili, oppure potrebbe indicare che l’associazione di quel tipo di
mutazione in quella particolare proteina può determinare una
sofferenza specifica di quel tipo neuronale perché quel tipo
neuronale è più sensibile a quella data situazione comunque ci
deve essere un fattore di specificità che al momento non è stata
ancora ben chiarito.
Invece le malattie di tipo 2 sono quelle in cui le triplette si trovano al
di fuori della regione codificante e si può trovare in varie regioni del
gene, quando vi ho accennato alla struttura del gene vi ho ricordato
che la sequenza genomica è formata da un alternarsi di esoni e a
monte e a valle del primo e ultimo esoni esistono due regioni non
tradotte, 5′ non tradotto e 3′ non tradotto che vengono a formare
l’RNA messaggero; due delle principali malattie da triplette di tipo II
si trovano in queste regioni, parliamo del X fragile per quanto
riguarda il 5′ non tradotto quindi qui la tripletta qui non è CAG, ma
ACGG o GA nel caso della terza malattia della Friedreich. Quindi
nel caso del X fragile la tripletta si trova nel 5′ non tradotto nel caso
della distrofia miotonica si trova nel 3′ non tradotto invece nella
terza malattia che è la malattia di Friedreic, comunque sono
accomunate dal fatto che si trovano al di fuori della regione
codificante, in questo caso la dimensione dell’allele normale è tra le
5-50 ripetute la differenza rispetto alle malattie di tipo 1 è che
quando c’è un espansione può essere un espansione davvero
incontrollata si può arrivare addirittura alle centinaia, migliaia di
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copie. E in questo caso qua l’espansione della ripetuta non
determina un acquisizione di funzione ma determina una perdita di
funzione della proteina soprattutto può determinare una riduzione di
efficacia di trascrizione. Malattie principali, malattie importanti
abbiamo la distrofia miotonica, ne abbiamo già l’altra volta abbiamo
già accennato quando abbiamo parlato della malattia del X fragile e
la atassia di Friedreich e un’altra forma di malattia neurologica
caratterizzata da atassia e problemi dell’equilibrio.
Diciamo qualcosa di più della malattia del X fragile, è una delle
forme più comuni di ritardo mentale ereditabile e rappresenta il 1520% dei ritardi mentali legati al cromosoma X e come dice la parola
stessa il locus si trova all’interno del cromosoma X. E’ una delle
forme più frequenti colpisce 1 su 4.000 maschi ma può colpire
anche le femmine e si trasmette con un tratto legato al X recessivo,
ora questa definizione con penetranza ridotta è dovuta al fatto
soprattutto all’evidenza prima che venisse conosciuta questo
meccanismo di mutazioni quindi c’era questo quadro di
trasmissione molto particolare che però poi è stato chiarito quando
è stato identificato il meccanismo di mutazione, può colpire sia
maschi e molto raramente anche femmine per il fenomeno di
inattivazione del X, perché si chiama sindrome del X fragile?
Perché era noto già da tempo, prima ancora che fosse noto il
meccanismo molecolare, che quando si andava a fare un indagine
citogenetica, quando si andava a visualizzare il cromosoma di
questi pazienti in condizioni particolari quando veniva applicata la
preparazione di cromosomi di acido folico si osservava una
presenza di un sito cosiddetto fragile a carico del cromosoma X
come se ci fosse una rottura in questa parte del cromosoma X e per
questo ha preso il nome di X fragile. Il quadro clinico è
caratterizzato da ritardo mentale, ma non c’è solo ritardo mentale
ma ci sono anche delle caratteristiche dismorfiche quindi i pazienti
presentano una facies anomala con una mandibola prominente e
grosse orecchie e presentano anche macro orchidismo e anomalie
del comportamento non solo ritardo mentale, anche iperattività e
autismo e si manifestano soprattutto nei maschi. La tripletta in
ACGG si trova nel 5′ non tradotto del messaggero e in condizioni
normali è tra le 5-50 unità e in questo caso la tripletta è stabile,
quando superiamo le 50 e arriviamo a 200-220 in questo caso la
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tripletta può essere instabile è parliamo di Premutazione, il gene
responsabile si chiama FMR1, quindi una tripletta si trova nel gene
FMR1, quando la tripletta supera le 200 unità allora siamo in
quadro clinico conclamato abbiamo la mutazione franca e in questo
caso la malattia si manifesta. Il gene FMR1 codifica per una
proteina con un ruolo nel trasporto del RNA messaggero e la
stragrande maggioranza delle forme di X fragile sono dovute a
questa espansione della tripletta CGG nel 5′ non codificante del
gene FMR1, ci sono rarissimi casi in cui la mutazione può essere
una mutazione puntiforme a carico del gene FMR1 però sono
davvero una netta minoranza di casi la maggior parte dei casi ci
troviamo di fronte a delle espansioni di questa tripletta per cui è
anche facile una diagnosi perché quando si sospetta la sindrome
del X fragile in passato si faceva questa indagine citogenetica che
dimostrava la presenza di questo sito di fragilità del X adesso basta
andare a cercare direttamente la tripletta nel 5′ non tradotto del
gene FMR1 quindi è una ricerca abbastanza diretta e facile. Cosa
comporta questa espansione, perché c’è perdita di funzione? Come
dicevo questa tripletta si trova nella regione 5′ non tradotta del gene
FMR1 e si trova in prossimità del cosiddetto promotore, c’è il
promotore, la sequenza che serve ad attivare la trascrizione del
gene, quello che succede che quando questa tripletta supera il
numero 230 si ha una modifica della regione del 5′ non tradotto del
promotore che si chiama Metilazione, la metilazione è una modifica
del DNA ed è a carico soprattutto dei mucleotidi delle citosine e
guanosine che determina, quando si trova a livello del promotore,
un compattamento della regione della cromatina e fa si che non ci
sia la possibilità di trascrivere quel gene quindi in ultima analisi
l’Ipermetilazione di quella regione fa si che il gene FMR1 non venga
trascritto e quindi per questo c’è una perdita di funzione manca
l’RNA messaggero per l’FMR1. La variabilità fenotipica che si può
osservare nei pazienti dipende dall’espansione della ripetuta quindi
quanto più è espansa la ripetuta peggiore sarà il quadro clinico
perché diverso sarà il grado di metilazione del promotore quindi
quando ci sarà dei casi di metilazione completa, di parziale
metilazione ci potrà ancora essere produzione di un messaggero
del FMR1 quindi si potranno avere dei quadri clinici meno gravi; poi
a rinforzare il grado ci potrebbe essere problemi di mosaicismo,
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l’altra volta abbiamo parlato del mosaicismo germinale che è quello
che si verifica nella popolazione di gameti di un individuo abbiamo
cellule con diversi genomi, il mosaicismo può verificarsi anche a
livello somatico e una ripetuta instabile dà luogo al classico quadro
di instabilità, quindi anche all’interno dello stesso tessuto possiamo
avere una instabilità all’interno dello stesso tessuto con presenza di
mosaicismo. Se all’interno del tessuto cerebrale per es. possiamo
avere delle regioni che avranno delle espansioni più ridotte rispetto
ad altre quindi il quadro di ritardo mentale potrebbe essere meno
grave, questo discorso del mosaicismo somatico lo ritroviamo
anche quando parleremo delle Anaplodie in particolare della
sindrome di Down. Quindi la genetica del X fragile, per riassumere,
è una malattia legata al cromosoma X, per avere la mutazione è
necessario un meccanismo duplice, cioè passiamo prima dalla
premutazione alla mutazione vera e propria per arrivare
all’espressione della malattia, quindi non ci sono dei casi che dalla
normalità si passa alla mutazione ma bisogna passare prima da
una premutazione, e come vi dicevo prima che per la Corea di
Huntgton i casi più gravi i casi più gravi di trasmissione sono quelli
ereditati dal padre in questo caso, del X fragile, è il contrario, i casi
più gravi sono quelli ereditati dalle madri, e la cosa interessante è
che mentre la premutazione quando si trasmette da un maschio ai
figli rimane stabile quindi il maschio con la premutazione non
trasmetterà una mutazione alle figlie, ovviamente il maschio può
trasmettere il cromosoma X sono alle figlie femmine in questo caso
le figlie femmine di un maschio portatore di una premutazione non
saranno mai affette. Mentre invece, quando a trasmettere la
premutazione sarà un soggetto di sesso femminile i figli maschi
potrebbero essere affetti perché c’è una maggiore tendenza
all’instabilità, quindi vedete possibile trasmissione da parte dei
maschi normali attraverso le figlie di portatrici sane ai loro nipoti
intendendo che per arrivare a un maschio con premutazione
potrebbe trasmettere la malattia in ultima analisi solamente ai nipoti
tranne che un passaggio attraverso una figlia portatrice attraverso
la quale si potrà avere il passaggio alla mutazione della
premutazione; quindi questo riassume quello che ho detto la
tendenza all’espansione di questa tripletta CGG si verifica solo
quando la premutazione è trasmessa dalla madre. Mentre invece
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quando la premutazione è trasmessa dal padre rimane instabile e
quindi le figlie femmine ricevono la premutazione senza che ci sia
espansione, mentre i figli maschi ricevono l’Y e non sono a rischio
di ereditare la malattia.
Per quanto riguarda la Distrofia Miotonica, che abbiamo accennato
l’altra volta, il discorso è abbastanza simile solo che la tripletta si
trova nel 3′ non tradotto del gene e anche nel caso della distrofia
miotonica possiamo avere i quadri più grave di instabilità quando a
trasmettere è la madre e addirittura nella distrofia miotonica,
abbiamo accennato l’altra volta, mentre è una malattia a esordio in
età adulta possiamo avere, quando l’espansione aumenta in modo
incontrollato arrivando a centinaia, migliaia, possiamo avere delle
cosiddette forme congenite di distrofia miotonica gravissime in cui il
fenotipo si manifesta direttamente alla nascita e quelle forme sono
trasmesse dalla madri.
Esiste un altro gruppo di malattie da espansione di triplette che
sono un pò a parte rispetto a quelle di cui abbiamo parlato di quelle
di tipi 1 e di tipo 2 perché sono triplette un pò atipiche e si parla di
espansioni di poli-alanine e questo solo per sapere che esistono
come numero di triplette siamo come nel caso delle malattie di tipo
1 quindi siamo 10-20 normalità allele espansi al di sotto o più un
limite un pò più basso tra i 17-33 anche in questo caso parliamo di
triplette all’interno della regione codificante e in questo caso la
tripletta codifica per un aminoacido e parliamo di poli-alanina,
rispetto alle poli-glutamine queste espansioni sono abbastanza
stabili non c’è quella tendenza all’instabilità, all’anticipazione e il
tratto poli-alaninico non è associato incontrovertibilmente o a un
guadagno di funzione o a una perdita di funzione ma può conferire
entrambi le cose. Sono malattie caratterizzate per lo più presenti in
fattori di trascrizioni cioè geni che svolgono ruoli importanti in
processi dello sviluppo tranne con unica eccezione che è una forma
di distrofia muscolare particolare che è la distrofia muscolare oculofaringea e colpisce prevalentemente i muscoli oculari e della faringe
che è abbastanza invalidante perché colpendo i muscoli della
faringe può determinare problemi della deglutizione.
Per chiudere l’argomento delle classi particolari delle malattie
genetiche c’è rimasto solamente quest’altro gruppo che è il gruppo
delle malattie da difetto dell’Imprinting, e l’imprinting è stata
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assimilata a una battaglia tra i sessi perché appunto è determinata
da una differenziale espressioni di geni che siano derivati dal padre
o dalla madre ed è una battaglia che è stata descritta a cominciare
già dalla formazione dello zigote. Quale è la definizione di
imprinting? Fino adesso di tutti i casi che abbiamo parlato di tutte le
modalità di trasmissioni non abbiamo mai fatto distinzioni tra il fatto
che quel gene fosse di origine materna o paterna tranne nel caso ci
troviamo di fronte a una trasmissione legata a mutazione del
cromosoma X o cromosoma sessuale però per mutazioni che
derivano da autosomi noi dicevamo classicamente che non c’è
differenza di trasmissione alla progenie sulla base del sesso, era
dato per scontato che entrambe gli alleli paterni e materni si
esprimessero allo stesso modo; questo non vale per alcuni geni e
questa è stata una recente scoperta che è stata effettuata
nell’ambito della genetica medica, ci sono alcuni geni che fanno
eccezione perché l’espressione di questi geni dipende dall’origine
parentale degli alleli. Per alcuni geni che sono geni soggetti
all’imprinting viene espresso solamente l’allele di origine materna e
per altri solo l’allele di origine paterna e a questo fenomeno si dà il
nome di impritinting genomica; quando parliamo di un gene
imprinted si definisce imprinted la copia del gene che non viene
espresso quindi dire che un gene presenta un imprinting materno
vuol dire che la copia materna non viene espressa ma viene
espressa solo la copia paterna quindi impriting è la copia del gene
che non viene espresso. Es. di geni che sono sottoposti a imprintig,
consideriamo tre geni, anticipiamo già adesso i geni imptinting non
sono quasi mai localizzati isolatamente nel genoma ma sono
presenti in gruppi, in cluster in cui c’è alternanza di imprinting
materna o paterna per cui se facciamo l’ es. di un cluster di geni
imprinted abbiamo che il primo di questi geni qui non è imprinted è
acceso, on, sia sulla copia materna che paterna, invece il gene a
fianco presenta l’imprinting in particolare in questo è imprinted
materno però è paterno l’express, quindi è imprintata la copia
materna che vedete spenta, off, ed è accesa quella paterna, al
contrario quest’altro è imptinting materno per cui la copia paterna è
spenta e la copia materna è accesa quindi vedete che c’è
l’alternanza cioè viene espressa solo una delle due copie. Questo
fenomeno dell’imprinting è stato scoperto recentemente, una
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trentina di anni fa, dei ricercatori effettuarono questa manipolazione
di trapianti di nuclei nell’embrione di topo e formarono degli
embrioni di topo che erano manipolati in modo da contenere o 2
genomi materni o 2 genomi paterni e l’idea è che si dovessero
sviluppare correttamente perché presentavano il corredo
cromosomico appropriato e invece questi genomi un pò aberranti
non si sviluppavano correttamente e in particolare si osservava che
gli embrioni che presentavano due nuclei di orgine materna, si
sviluppavano più o meno regolarmente almeno all’inizio nella
componente dell’embrione vero e proprio ma presentavano un
sviluppo minimo, assente, delle componenti membrane
extraembrionali cioè della placenta si formava un abbozzo di
embrione ma non si formava la placenta. Invece al contrario
quando andavamo a osservare embrioni con due genomi paterni si
aveva una crescita quasi normale della placenta, delle componenti
extraembrionali ma strutture embrionali altamente anomali. Questa
situazione ha un riscontro anche in patologia ci sono dei casi di
patologia umana in cui si osserva che sono dovuti alla presenza di
genomi sbilanciati di questo tipo, in particolare abbiamo la forma di
tumore placentare che si chiama Mola Idatiforme che è un tumore
che si verifica nell’uomo ed è abbastanza raro che è causato dalla
presenza di due corredi aploidi di origine materno senza contributo
materno quindi praticamente sono tumori placentari che danno
luogo a una pseudogravidanza in cui si forma solamente questo
tessuto placentare tumorale e si è visto che sono dovuti alla
formazione di uno zigote formato solamente da due componenti
aploidi materni.
Il Teratoma Ovarico è un tumore ovarico benigno che deriva da
cellule che contengono due genomi femminili, questo tumore
ovarico si forma delle masse embrionali che contengono tessuti dei
vari foglietti embrionali e sono caratterizzati dalla presenza di
genomi con due componenti femminili.
Poi ci sono altre osservazioni cliniche, si è visto che in gravidanze
umane con assetto Triploide hanno caratteristiche diverse a
seconda che il genoma in più sia materno o paterno quindi un certo
tipo di triploidia con un cromosoma in più non si presenta allo
stesso modo in vari soggetti ma si presentono in modo diversa a
seconda che il cromosoma in più sia di origine materna o paterna.
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Alcune malattie che si manifestano con un ereditarietà autosomica
dominante e si manifestano solo quando è ereditato da un genitore
e no quando ereditati dall’altro, oppure, la stessa cosa, la delezione
di certe regioni cromosomiche che dà luogo a un certo fenotipo a
seconda che si trova sul cromosoma di origine materna o paterno e
questa è la sindrome di Padrer-Willi e Angelman.
I geni imprinting sul genoma che si conoscono fino a tutto oggi non
sono moltissimi ma rappresentano un problema rilevante per la
medicina, e sono molte le malattie dovute a deficit dell’imprinting ad
oggi se ne conoscono circa 156 che sono sottoposti a imprinting e
di questi circa una 60 possono essere in grado di influenzare lo
stato di salute. Quasi tutti i cromosomi presentano geni imprintati
però la maggior parte sono clusterizzati distribuiti su alcuni
cromosomi, il 2-6-7-11-14-15-16-20 e in particolare 11 e il 15 sono
quelli che hanno maggiore rilevanza per la patologia, e ora ci
soffermeremo su quelli del cromosoma 15, un cluster di geni
imprintati sul cromosoma 15. Questi geni imprinted sono spesso
geni coinvolti nel controllo della crescita fetale e poi vedremo che
questa evidenza del controllo del coinvolgimento di questi geni nella
crescita fetale ha dato origine a una teoria che cerca di spiegare il
perché l’origine evolutiva del fenomeno dell’imprinting. Non solo
isolati nel genoma ma tendono a formare dei cluster in cui c’è
un’alternanza di geni imprinted di origine materna e paterna e in cui
c’è anche la presenza di loci che controllano l’efficacia
dell’imprinting quindi si parla anche di centri rilevatori dell’imprinting
nell’ambito di questi cluster.
Abbiamo accennato prima alla metilazione, la metilazione è una
modifica del genoma che ci può funzionare come un interruttore di
alcuni geni quindi metilando una certa regione genomica in
particolare il promotore noi possiamo accendere in quel caso
spegnere il gene che si trova a valle e quindi a seconda che quel
promotore sia metilato o non metilato il gene associato a questo
promotore sarà acceso o spento. Quindi il fatto che le due copie
alleliche di geni una sia acceso e l’altra spento è dovuta alla
metilazione differenziale dei due alleli e quindi uno dei due alleli
sarà metilato e l’altro no, i geni imprinted possono essere sia dei
geni codificanti per proteine che geni che rappresentano RNA non
codificanti non tradotti. Quindi la modificazione principe che svolge
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il ruolo principale è la metilazione del DNA, la metilazione è
l’addizione covalente di gruppi metilici alle basi del DNA e nelle
cellule eucariote questa modifica avviene a livello delle citosine ed
è associata a ridotti livelli di trascrizione dei geni quando parliamo di
una regione metilata intendiamo che c’è una inattivazione del gene
associata. La metilazione quindi è un fenomeno che serve a
regolare lo spegnimento e accensione del gene e gioca un ruolo
nell’imprinting. In questo caso a differenza negli altri casi la
metilazione è un fenomeno per cui un gene che dovrebbe
funzionare come abbiamo detto all’inizio noi possediamo un certo
genoma tranne nei casi di mosaicismo però normalmente è uguale
in tutte cellule però poi ogni cellula presenta un corredo di geni che
sono attivi o spenti e a questo livello la metilazione gioca un ruolo
nel dire chi è acceso o chi è spento in certo tessuto, per es. il gene
della rodopsina che è importante per la visione sarà acceso
solamente nei fotorecettori ma sarà spento nelle cellule muscolari
poco funzionanti perché non ci serve e proprio li sarà la metilazione
a giocare un ruolo però appunto proprio in quel caso li la
metilazione è presente su entrambe gli alleli del locus nel caso
dell’imprinting la metilazione sarà di tipo differenziale per cui
all’interno di un locus un allele sarà metilato e l’altro no. Ad esempio
se noi consideriamo un gene imprintato vediamo che l’allele 1
presenterà metilazione, la cromatina sarà compattata e questo
gene non sarà trascritto; mentre sull’altro allele non ci sarà
metilazione la cromatina sarà in forma srotolata e il gene si potrà
trascrivere. Questa metilazione può avvenire in varie fasi dello
sviluppo addirittura può essere introdotta nella linea germinale e
mantenuta durante lo sviluppo in tutte cellule, però vi possono
esserci anche dei casi in cui questa metilazione può modificarsi
nell’ambito dello sviluppo quindi diciamo che è un processo molto
dinamico e questi processi di metilazioni differenziali rientrano nelle
modifiche genetiche che noi osserviamo nel genoma quindi sono
modifiche che non sono stabilmente presenti nel nostro genoma ma
possono essere introdotte o rimosse a seconda dell’esigenza del
tessuto. Leggendo una lista di geni imprintati che possono svolgere
un ruolo in patologia e distinguiamo le forme classiche in cui c’è un
diretto coinvolgimento di questi geni che svolgono un ruolo
principale nella genesi di queste malattie genetiche e questi sono i
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classi geni imprintend e ci soffermeremo sulla Prader-Willi e sulla
Angelman e poi altre situazioni in cui c’è più probabile
coinvolgimento di altri geni imprintati in cui ci sono anomalie
cromosomiche come la sindrome di Turner e poi ci sono fattori di
suscettibilità da malattie complesse il cui meccanismo ancora non è
ben chiarito.
Le classiche malattie di geni imprinted sono due gruppi, uno sul
cromosoma 11 e uno sul cromosoma 15 che danno luogo a queste
malattie genetiche che hanno rappresentato un mistero per molti
anni e ci soffermeremo su queste due sulla sindrome di PraderWilli e sulla sindrome di Angelman. Per quanto riguarda il
meccanismo di mutazione è abbastanza simile a quello che
abbiamo visto per le altre condizioni quindi mutazioni puntiformi,
mutazioni dell’intero gene, mutazioni del centro dell’imprinting e vi
ho accennato che esiste il centro dell’imprinting che regola il
corretto imprinting di questa regione e quindi vi possono essere
mutazioni al carico di questo locus e che possono essere mutazioni
puntiformi ma c’è un terzo meccanismo che è particolare per queste
malattie che si chiama Disomia Uniparentale che vedremo dopo.
Per quanto riguarda la Prader-Willi e la Angelman dal punto di vista
clinico si presentano con un quadri abbastanza diversi tra loro; nel
caso della sindrome di Prader-Willi si presenta con un quadro
abbastanza precoce ipotonia, facies particolare, occhi a mandorla,
strabismo, questi bambini si presentano con capelli chiari e
ipopigmentazione e con ritardo mentale medio, la cosa più
caratteristica dal punto di vista clinico di questa malattia è l’iperfagia
cioè sono bambini che hanno un impulso irrefrenabile a mangiare e
diventano obesi proprio per questa loro iperfagia tanto che a volte i
genitori devono chiudere il frigorifero perché loro hanno questo
impulso convulsivo a mangiare. La sindrome di Angelman ha un
quadro particolare di inappropriato eccessi di riso di questi bambini
che presentano postura atipica detta a marionetta e presentano un
quadro neurologico con epilessia e anche questi bambini
presentano una facies particolare con lingua protrusa e bocca larga
etc. e quello che c’è in comune tra le due sindromi è il ritardo
mentale grave con assenza di parole; se mettiamo insieme i due
quadri vediamo che sono per lo più abbastanza diversi hanno
qualcosa in comune l’ipopigmentazione e il ritardo mentale però nel
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complesso sono abbastanza diversi. Nella maggior parte dei casi
questi pazienti sono sporadici quindi non c’era una chiara evidenza
di familiarità, la cosa che ha colpito dall’inizio che entrambi queste
patologie erano dovute ad anomalie della stessa regione del
cromosoma 15, quindi di una delezione, un’assenza di questa
regione del cromosoma 15 tra la banda Q1-1 e Q1-3 e la cosa
sorprendente che alcuni soggetti che presentavano questa
delezione avevano la Prader-Willi e altri la Angelman e possono
essere affetti sia maschi che femmine ed è rimasto un qualcosa di
misterioso per molto tempo per capire perché poi la stessa regione
è associata a due malattie diverse. L’analisi molecolare ha
dimostrato che è deleto lo stesso intervallo ma dopo si è chiarito
che la differenza del fenotipo è dovuto alla differente origine
parentale della delezione in particolare quando ad essere deleto
era l’allele paterno si aveva la sindrome di Prader-Willi quando
invece ad essere deleto era l’allele materno si aveva la sindrome di
Angelman e ciò ha portato appunto anche sulla base degli altri studi
di cui abbiamo accennato prima fatti nel topo all’ipotesi che nella
regione ci fossero 2 più geni imprinting in maniera opposta alla
regione deleta. Quello che si è ipotizzato è che nel gene o geni che
causano nel Prader-Willi è espresso esclusivamente nell’omologo
paterno e questo spiega perché se la delezione viene trasmessa
dal padre, e poiché l’allele paterno è l’unico che viene espresso
avere una delezione dell’allele paterno significa non avere
espressione di quel gene nel soggetto per cui avremo la malattia;
per quanto riguarda l’Angelman il discorso è opposto, il gene che
causa sindrome di Angelman che in questo caso è noto e si chiama
UB-3A, è un gene specifico è espresso nell’omologo materno e
quando quella regione è deleta sull’allele materno l’individuo non
avrà espressione del gene UB-3A e quindi avrà la sindrome di
Angelman quindi la delezione dell’allele espresso determina
Mullisomia e anche se c’è l’altra copia sull’altro allele, ma l’altro
allele non può essere espresso perché è metilato, quindi il soggetto
non avrà espressione di quel gene quindi avrà mullisomia e come
se avesse 0 copie di quel gene, anche se una copia
genomicamente c’è. In questo caso l’ereditarietà è completamente
deviata rispetto alle regole mendeliane e quindi non possiamo solo
in base alla trasmissione dire chi è affetto e chi no, quindi dobbiamo
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tenere conto di chi trasmette l’allele mutato, per la delezione il
discorso può essere ancora relativamente semplice ma a
complicare le cose c’è il fatto che che c’è un nuovo meccanismo di
mutazione che è stato identificato in queste malattie che è al
Disomia Uniparentale che consiste nel fatto che per uno stesso
locus questi soggetti presentano 2 copie dello stesso cromosoma
ereditati dallo stesso genitore mentre nessuna copia deriva
dall’altro genitore quindi noi possiamo avere che qui trovandoci qui
nel caso del cromosoma 15 noi potremmo avere nel caso del gene
della sindrome di Angelman UB-3A vengono ereditate due copie di
origine paterna il soggetto con disomia uniparentale di questo tipo
manifesterà la malattia perché le due copie paterne non si possono
esprimere e viceversa con la sindrome di Prader-Willi quindi
malattie dell’imprinting sono state alla base della scoperta alla base
di questo nuovo meccanismo di mutazione che appunto è la
presenza di due copie, di due regioni cromosomiche che hanno la
stessa origine parentale.
Quindi per riassumere un pò il meccanismo delle mutazioni che
causano imprinting qui c’è il parallelo tra la sindrome di Prader-Willi
e Angelman nella maggior parte dei casi la malattia è dovuta nel
75% dei casi è dovuta a una delezione del cromosoma 15q, quindi
una delezione visibile, nella sindrome di Prader-Will abbiamo una
notevole quota 20-25% che è dovuta a disomia uniparentale mentre
un pò più bassa un 2% nella sindrome di Angelman, nel caso della
Prader-Willi possiamo avere mutazioni puntiformi nei geni e anche
se come vi dicevo non è ancora ben chiaro perché sono vari i geni
associati a Prader-Willi mentre più semplice il discorso
nell’Angelman perché li è stato identificato il gene che si chiama
UB-3A e li sono state identificate le mutazioni. Nel caso di disomia
uniparentale materna abbiamo che coinvolge la regione di PraderWilli e abbiamo la sindrome di Prader-Willi perché abbiamo la
delezione dell’omologo paterno e abbiamo due copie di quel gene
che sono tutti e due di origine materna e non avremo nessuna
copia paterna per cui avremo la Prader-Willi invece al contrario se
la disomia uniparentale di tutta la regione è di origine paterna
avremo la sindrome di Angelman perché manca l’allele materno
che è l’unico che viene espresso. Meccanismo alla base della
disomia uniparentale potrebbe essere una non disgiunzione nella
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meiosi ovviamente è questa la cosa che riguarda specificamente
quella regione del cromosoma, osservando la struttura del cluster
della Prader-Willi e Angelman tutta la regione che è soggetta, poi
abbiamo il gene UB-3A ed è il gene che provoca la sindrome di
Angelman poi abbiamo i geni che sono stati messi in relazione alla
sindrome di Prader-Willi e vi dicevo all’inizio che questi sono geni
sia codificanti per proteine che geni non codificanti infatti questi
geni SNRPN non codificanti per proteine che sembrano avere un
ruolo importante per la genesi della Prader-Willi, poi si osservano
geni espressi paternamente e maternamente. La teoria che è stata
avanzata per spiegare il motivo della presenza del imprinting di
questa complicazione è una teoria che al momento è ancora valida
cioè del conflitto parentale. È stato detto che i geni coinvolti nel
imprinting sono coinvolti nella crescita fetale quindi molti geni
imprinting sono espressi nella placenta e ciò avviene in modo
antagonistico e questo avviene soprattutto negli organismi
placentari, in geni espressi si è visto che quelli che vengono
espressi dal cromosoma paterno aumentano la crescita mentre i
geni espressi dal cromosoma materno tendono a sopprimere la
crescita del feto, questa dicotomia è stata dimostrata con il fatto che
ci sono interessi diversi da parte del padre e della madre riguardo la
loro progenie, l’idea sarebbe che il proprio figlio cresca nel modo
migliore a scapito delle risorse della madre quindi debba attivare in
modo incontrollato la crescita sottraendo risorse alla madre mentre
la mamma ha l’interesse di conservare le proprie risorse per vari
figli e possono essere anche da altri individui e non dal individuo
stesso per cui c’è questa tendenza al contrasto tra le copie paterne
che tende a sottrarre energia alla madre invece la madre tende a
mantenere le risorse per altri figli. Riassumendo, sull’eccezione
delle complicazioni sull'ereditarietà mendeliane possiamo dire che
vi sono alcune regole e alcune eccezioni: le malattie monogeniche
normalmente si trasmettono secondo pattern ben definiti
(cromosomi dominanti, recessivi X linked) e questo quando le
mutazioni sono presenti sul cromosoma nucleare e una delle
eccezioni che è stata osservata è quando queste mutazioni
vengono trasmesse su di un altro genoma e cioè sul genoma
mitocondriale e quindi l’ereditarietà mitocondriale rappresenta un
eccezione ad i normali pattern di ereditarietà mendeliana proprio
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perché i mitocondri si trasmettono in modo madre lineare.
Altro esempio di eccezione è che quando ci troviamo di fronte a
mutazioni de novo è stato detto che c’è assenza di ricorrenza quindi
queste mutazioni sono molto infrequenti 1/100milioni ma
l’eccezione a questa regola è quando non ci troviamo di fronte a
questo tipo di mutazione de novo ma quando ci troviamo di fronte a
mosaicismo germinale, quindi attenzione a distinguere mutazione
de novo e mosaicismo germinale come nel caso dell’osteogenesi
imperfetta.
Per un locus autosomico il figlio in genere eredita un allele da
ciascuno dei due genitori eccezione può essere quello della
presenza di segni parentali in cui il figlio riceve nello stesso locus
due copie dallo stesso genitore.
In ultimo, Entrambi gli alleli di un locus autosomico sono
ugualmente espressi cioè nel caso in cui quel gene sia imprinting,
come la Prader-Willi e la Angelman.
Ultima grossa eccezione, le mutazioni vengono ereditate
stabilmente tranne quando le mutazioni sono instabili come nel
caso di malattie da triplette.
Dopo il discorso delle malattie monogeniche, incominciamo a
parlare delle malattie cromosomiche, cosa diversa in quanto prima
abbiamo parlato di singoli geni mentre qui parliamo di grosse
regioni e più geni coinvolti e quindi parliamo di anomalie e della
struttura dei cromosomi.
Per parlare di queste anomalie bisogna parlare un po di
citogenetica che non è altro che lo studio della struttura della
funzione dell’evoluzione dei cromosomi ed ha una vita molto più
lunga rispetto alla genetica molecolare in quanto la citogenetica è
stata studiata molto prima degli studi molecolare e quindi abbiamo
una decifrazione cromosomica molto prima rispetto agli studi del
menoma umano.
La citogenetica si occupa anche dello studio del comportamento dei
cromosomi durante la divisione somatica e germinale quindi
durante la mitosi e la meiosi ed ha una storia molto più lunga della
genetica molecolare (1956) quando furono messi appunto le prime
tecniche per l’analisi dei cromosomi e si stabilì che il numero di
cromosomi in condizioni di normalità era 46, quindi ha una
tradizione più lunga.
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Le malattie cromosomiche sono una grossa categoria di malattie
genetiche che possono avere dei segni comuni che si riscontrano in
vari pazienti a prescindere dal tipo particolare di difetto e in genere
sono rappresentate dalla perdita della capacità riproduttiva, dalla
presenza di malformazioni congenite (dimorfismi, ritardo mentale) e
spesso queste malattie sono associate anche ad eventi oncologici.
Quindi quando ci troviamo di fronte un quadro complesso in cui
dove possono essere presenti altre manifestazioni e ritroviamo di
fronte uno di questi segni, dobbiamo sempre sospettare un
anomalia cromosomica più o meno grave. Sono una grossa
categoria di malattie genetiche, tra cui la sindrome di Down, sono
responsabili di qualche centinaio di differenti sindromi genetiche
definite identificabili e sono più comuni di tutte le malattie genetiche
mendeliane da alterazioni di un singolo gene quindi possono colpire
una significativa % di nati vivi e gravidanze. La maggior parte delle
malattie cromosomiche non arriva ad un evidenza clinica perché
sono incompatibili con la vita quindi il numero di patologie
cromosomiche teoriche che possono esistere è molto più elevato e
dà le sue manifestazioni nella vita intrauterina quindi noi non
arriveremo mai a vedere clinicamente queste manifestazioni proprio
perché sono incompatibili con la vita. Queste anomalie possono
essere dovute o alla deficienza o eccesso di interi cromosomi o
frammenti di cromosoma e quindi non colpiscono i singoli geni ma
molti geni. Rispetto alle malattie poligeniche o multifattoriali sono
rare però sono multo più frequenti rispetto alle malattie mendeliane,
ma la cosa importante è che è frequente causa di aborto quindi la
maggior parte delle aberrazioni cromosomiche non arrivano alla
manifestazione clinica proprio perché determina la morte
intrauterina.
Giusto un ricordo per la struttura dei cromosomi: il cromosoma
presenta un braccio corto P e un braccio lungo Q con due telomeri
che sono le estremità terminali ed il centromero al centro quando
osserviamo i cromosomi dobbiamo ricordare che vengono osservati
in un momento particolare della mitosi nella tecnica del cariotipo in
un momento particolare che è la metafase e in questa fase il
cromosoma è formato da due cromatiti perché si è avuta la
replicazione del DNA quindi ogni cromosoma presenterà una
doppia porzione di DNA e ognuna di queste sarà presente su di un
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cromatide e i cromatidi si congiungeranno a livello del centromero,
quindi il centromero unisce i due cromatidi fratelli per un appropriata
segregazione alla mitosi e alla meiosi. Per quanto riguarda il
telomero, fino a poco tempo fa si considerava una struttura inerte
ma nel telomero sono presenti delle porzioni ripetute tipo satellite,
ma si è visto che presentano delle proprietà protettive cioè
proteggono le estremità dei cromosomi dalla degradazione e dalla
fusione con altri cromosomi, si è visto anche che la maggior o
minore integrità del telomero durante l’invecchiamento è quello che
determina il processo di invecchiamento di un individuo per cui la
protezione del telomero protegge le cellule dall’invecchiamento.
Ricordando la mitosi, ci sono varie fasi che consiste nella
duplicazione con l’origine di due cellule da un'unica cellula e si
verifica nelle cellule somatiche, mentre nella meiosi che si verifica
nei gameti e porta alle formazioni dei gameti e da 1 cellula madre si
arriva a 4 cellule figlie che hanno un menoma apolide quindi ad un
singolo corredo cromosomico. Le fasi della meiosi maschile avviene
per tutta la vita mentre la meiosi femminile si completa durante la
fertilizzazione.
I cromosomi possono essere visualizzati sulla base della
dimensione, posizione del centrometro è alla modalità di
distribuzione delle bande cromosomiche. Per quanto riguarda la
dimensione è importante perché in base alla dimensione che i
cromosomi vengono distinti e assegnati un numero ai cromosomi
da 1 a 22 più i cromosomi sessuali e i numeri indicano l’ordine di
grandezza cioè dal 1 sarà il più grande e così via… questa regola
vale per tutti tranne per i cromosomi sessuali. Per quanto riguarda
la distinzione del centromero in quanto non si trova esattamente al
centro del cromosoma, se è posizionato al centro viene detto
metacentrico e di solito sono i cromosomi più grandi (1, 3, 16, 19,
20) in altri casi il cromosoma viene ad essere localizzato più
asimmetricamente rispetto ai due bracci viene denominato
cromosoma submetacentrico in cui c’è un asimmetria nella
posizione del centrometro però si distinguono braccio lungo e
quello corto. Mentre per quanto riguarda il cromosoma detto
aplocentrico dove si osserva il centromentro che corrisponde quasi
ad un telomero con un braccio corto quasi assente e in questo caso
(21, 22) il braccio corto conterà più eterocromatina che geni. Ultimo
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aspetto è quello delle bande servono ai citogenetisti per individuare
regioni particolari come 15-Q, quindi sono punti di riferimento
artificiali dove i citogenetisti coloreranno con coloranti più chiari
(regioni ricche di GC, le quali sono quelle più presenti) o più scuri
(regioni ricche di AT, sono regioni di DNA più ripetuto) e poi queste
bande verranno numerate a partire dal centrometro.
Con queste metodiche permette ai citogenetisti di individuare il
cariotipo che è il patrimonio cromosomico di un individuo.
Per effettuare il cariotipo si parte da un prelievo di sangue
precisamente di linfociti oppure mediante biopsia cutanea, liquido
amniotico (amniocentesi), in caso di tumore come leucemia si
effettua il prelievo di midollo osseo.
Le anomalie cromosomiche, come già accennato, sono responsabili
nel grosso numero di aborti nel primo trimestre di gravidanza e
sono presenti in circa lo 0,5% delle nascite in particolare la
sindrome di Down, sindrome del X fragile, anomalie delle cellule
somatiche.
Le anomalie cromosomiche possono essere: anomalie di numero
dei cromosomi cioè aploidia e anomalie strutturali dei cromosomi.
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Banfi 1.4 (Lunedì 25 Marzo 2013)
Tipi di Anomalie Cromosomiche
Anomalie Strutturali Cromosomiche
Nell’ultima lezione abbiamo accennato la struttura del cromosoma,
come si distinguono i cromosomi sulla base della grandezza,
posizione del centrometro, come si possono visualizzare i
cromosomi con il test del cariotipo, fino alle anomalie
cromosomiche.
Le anomalie cromosomiche rappresentano una grossa fetta delle
malattie genetiche e possono essere suddivise sulla base di
alterazione del numero dei cromosomi e alterazioni strutturali.
Per quanto riguarda le Anomalie Numeriche si dividono in due
grosse sotto categorie una che prevede l’alterazione del Aploidia e
un l'altra che prevede la variazione del numero, in genere di un
cromosoma, e si parla di Aneuplodia.
Alterazioni del Aploidia rappresentano un fenomeno interessante
dal punto di vista biologico ma legato dal punto di vista clinico non
costituiscono un problema rilevante per la pratica clinica perché
sono situazioni che raramente arrivano a manifestarsi un loro
fenotipo questo perché per alterazioni dell’Aploidia si intendono
alterazioni molto importante per i numeri dei cromosomi che sono
incompatibili con la vita.
Noi sappiano che il set di una cellula somatica normale presenta un
corredo cromosomico diploide perché è formato da una coppia di
cromosomi per cui il numerosi cromosomi normali di una cellula
somatica è 46 (2x23, 23 è il corredo cromosomico standard che
moltiplicato x 2 che sono le cellule germinali). Mentre nel nostro
organismo ci sono delle cellule che presentano un corredo
cromosomico che è la metà del corredo diploide e cioè il corredo
apolide e sono le cellule germinali (spermatozoo e ovociti) che è
formato da 23 cromosomi, ovviamente per avere la corretta
formazione dello zigote le cellule germinali devono dimezzare il
numero di cromosomi in modo che quando si ha la fecondazione e
la fusione dell’ovocita con lo spermatozoo si ristabilisce il numero
normale di cromosomi. Quindi diploide nelle cellule somatiche e
apolide nelle cellule germinali.
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Tutte le alterazioni di questo corredo cromosomico vanno sotto il
nome di Alterazioni Aploidia e le alterazioni che si possono
riscontrare è la Triploidia e Tetraploidia. Per cellula triploide si
intende quella cellula che presenta un numero triplo del corredo
cromosomico quindi 3n cioè 3x23 e che da un punto di vista di
cariotipo si identificano il 69 che è il numero dei cromosomi più i
cromosomi sessuali. La triploidia può derivare dalla fecondazione di
un singolo ovocita da parte di due spermatozoi oppure da una
difettosa meiosi nel corso della produzione di un gamete diploide e
questo consegue che si può avere anche la tetraploidia con la
presenza di un corredo cromosomico 4n cioè 4x23 che si arriva a
92 cromosomi e questo è un difetto che in genere non si verifica
nella meiosi ma un difetto della mitosi e si verifica a carico della
prima divisione dello zigote. Questi tipi di alterazioni sono talmente
aberranti che non sono compatibili con la vita e risultano in genere
in rapporto con gli aborti spontanei, ma in alcuni rari casi queste
situazioni possono arrivare alla nascita ma con durata della vita
molto breve.
La triploidia può derivare per la maggior parte dei casi dalla
fecondazione di un ovocita da parte di due spermatozoi con la
formazione di con corredo triploide, oppure in casi più rari può
avvenire la fecondazione di un ovocita diploide che non ha
completato la sua maturazione quindi presenta ancora un corredo
diploide da parte di uno spermatozoo o anche da un ovocita
normale che viene fecondato da uno spermatozoo diploide cioè che
non ha completato la sua maturazione.
La Tetraploidia invece, non deriva per lo più da problemi nel ambito
della meiosi o della fecondazione ma deriva da un’anomala
divisione mitotica di uno zigote che si è correttamente formato e
deriva dal caso in cui ci sia un anomala duplicazione della mitosi in
cui si ha duplicazione del DNA senza la divisione cellulare per cui
alla fine si avrà la formazione di uno zigote tetraploide.
Dal punto di vista clinico la frequenza di triploidie è molto alta per
spiegare situazioni di aborto 1 su 14 aborti è causata da triploidia.
In oltre si può avere una varia distribuzione cioè a seconda della
presenza di cromosomi sessuali.
Mentre è molto più rilevante a livello clinico il discorso delle
Aneuplodie dove parliamo di alterazioni del numero di cromosomi
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che riguardano un singolo cromosoma che può essere in eccesso o
in difetto, quindi quando abbiamo un acquisizione di un cromosoma
in più ci troviamo in presenza di una Trisomia, quando siamo alla
presenza di un cromosoma in meno parliamo di Monosomia.
Nel caso della Monosomia quello che osserviamo è che al fronte di
un corredo cromosomico normale XX quindi un fenotipo femminile
si può osservare un esempio con il cromosoma, il numero 5, in
meno e questo cariotipo verrà identificato con 45 meno 5 ed il
genotipo sessuali XX. Dal punto di vista biologico quello che
comporta la monosomia è quello di slatentizzare, rendere evidenti
dei caratteri, delle mutazioni recessive che normalmente nel ambito
di un genotipo normale, perfettamente diploide, la presenza di
mutazioni recessive in eteroziogosi sono compensate dall’altro
allele che è normale. Ovviamente i caso di monosomia quello che
abbiamo è che tutti gli alleli, le mutazioni recessive che sono
localizzate sul cromosoma mancante non vengono compensate dal
cromosoma normale per cui si ha un fenotipo molto grave che porta
alla monosomia di quel allele e quindi determina la slatentizzazione
di caratteri recessivi e questo è grave perché tra le mutazioni
recessive che possiamo avere ci saranno alcune che avranno un
significato incompatibile con la vita, quindi ciò determina la letalità
della maggior parte delle situazioni monosomiche.
Al contrario nella Trisomia abbiamo la presenza di un cromosoma
in più, ad esempio in una cellula che è normalmente diploide si può
osservare che all’interno sono presenti 3 cromosomi. Anche la
Trisomia ovviamente può portare dei problemi perché determinerà
un fenotipo che è altamente deleterio (nel caso della monosomia è
sempre deleterio e nella maggior parte dei casi è letale) ma non al
100% dei casi sarà letale e in ogni caso quello che ci sarà sarà un
dosaggio genico perché avremo la presenza di una triplice copia
dei geni che sono presenti sul cromosoma soprannumerario.
Nel caso dell’Aneuploidia sono nella maggior parte sono dovute ad
un problema che si verifica al livello della meiosi cioè una non
disgiunzione nella meiosi, quindi nell’ambito della meiosi non si
avrà una corretta segregazione dei cromosomi per cui una delle
cellule figlie potrà avere degli sbilanciamenti dei cromosomi per cui
una delle cellule figlie potrà avere una situazione di presenza di due
coppie dello stesso cromosoma e l’altra cellula invece l’assenza del
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cromosoma del cromosoma in questione. Quindi la non
disgiunzione meiotica causa una variazione del numero dei
cromosomi che è causata dall’incapacità di una coppia di omologhi
appaiati di segregare correttamente la meiosi, potremmo avere
anche dei problemi di mitosi però in questo caso porteranno ad un
mosaicismo che probabilmente sarà molto meno grave.
Nell’ambito delle meiosi il problema della non disgiunzione può non
verificarsi in due momenti o nell’ambito della prima divisione
meiotica o nell’ambito della seconda divisione meiotica e da un
punto di vista biologico ci sono due grandi differenze: immaginiamo,
in un problema di non disgiunzione che succede a carico della
prima divisione meiotica si parte dal gamete e quello che succede è
che se non si ha disgiunzione nell’ambito della prima divisione
meiotica avremo una cellula che sarà completamente monosomica
cioè non riceverà nessuno dei due cromosomi 21, mentre in un
altra cellula riceverà 2 cromosomi 21 quindi si avrà uno
sbilanciamento per cui avremo che 2 delle cellule origineranno da
questo problema di non disgiunzione meiotica una volta che andrà
ad essere fecondato dal altro gamete avrà un genotipo trisomico
mentre nell’altra cellula figlia, derivata da questa prima divisione
meiotica, darà luogo a zigoti monosomici che non presenterà
nessun cromosoma 21 e quindi la fecondazione da parte dell’altro
gamete darà luogo ad altre cellule che sono monosomiche per quel
cromosoma, quindi da una singola cellula noi avremo che tutte le 4
discendenti saranno alterate ma un altro aspetto importante è che i
due cromosomi che daranno luogo alla trisomia saranno di origine
sia paterna che materna, quindi non avendo una prima
segregazione della copia materna e copia paterna entrambi
andranno a formare lo zigote, quindi nello zigote saranno
rappresentati sia il cromosoma 21 che derivano da entrambi i
genitori dell’individuo. Nel caso della non disgiunzione della
seconda divisione meiotica quello che succederà che se la prima
divisione meiotica è andata correttamente in porto avremo che tutte
le cellule che deriveranno da uno delle cellule andrà a formare
correttamente uno zigote normale, mentre il problema sarà limitato
solamente alla progenie che deriveranno da questa problematica
seconda divisione meiotica per cui quello che succederà una non
disgiunzione della seconda divisione meiotica e quindi avremo un
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numero più limitato di alterazioni, si avrà formazione solo di uno
zigote monosomico e uno zigote bisomico, mentre quell’altra cellula
andrà correttamente a buon fine nelle successive divisioni. Un'altra
differenza è che i cromosomi soprannumerari saranno tutti e due
della stessa origine parentale quindi non sarà un cromosoma 21
uno materno e uno paterno ma saranno entrambi deriva da uno dei
due genitori quindi per quanto riguarda per il fenomeno
dell’imprinting può determinare delle differenze. Quindi come
abbiamo visto per le alterazioni per la poliploidia sono incompatibili
per la maggior parte con la vita tranne alcune situazioni.
Quindi le monosomie come le trisomie sono in genere incompatibili
con la vita quindi sono letali quando parliamo soprattutto di
autosomi però per le monosomie e trisomie autosomiche sono in
genere incompatibili con la vita diverso il discorso per le
monosomie e trisomie che colpiscono i cromosomi sessuali, ma lo
vediamo dopo.
Per quanto riguarda le aneuplodie che colpiscono gli autosomi si
hanno tre situazioni che sono compatibili con la vita, quindi per
quanto riguarda le monosomie in genere non abbiamo monosomie
complete di nessun autosoma infatti come abbiamo visto non sono
compatibili con la vita proprio perché slatentizzano i caratteri
recessivi. Per le trisomie abbiamo tre situazioni compatibili con la
vita che sono la trisomia 21 che è del cromosoma 21 che è una
delle malattie genetiche più frequenti (Sindrome di Down) poi
abbiamo altre due trisomie quelle del cromosoma 13 che da luogo
alla Sindrome di Patau e la trisomia 18 che da luogo alla sindromi di
Edwards, sono trisomie compatibili con la vita perché colpiscono 3
dei cromosomi più piccoli e anche perché i problemi di dosaggio
genico che sono correlati alla trisomia di questi tre cromosomi non
danno dei problemi di letalità quindi possono essere superati
dall’organismo. Quindi in ogni caso non sono situazioni che sono
sempre compatibili con la vita se cominciamo ad affrontare il
discorso della sindrome di Down vediamo il 70% delle gravidanze
con sindrome di Down non giunge a termine quindi quello che noi
vediamo nella pratica clinica rappresenta solamente la punta di un
iceberg quindi la maggior parte delle situazioni di trisomia del
cromosoma 21 di sindrome di Down non è compatibile con la vita.
Dal punto di vista storico la malattia si chiama così perché fu
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descritta per la prima volta da un medico inglese che si chiamava
Down e la descrisse la prima volta alla fine dell’800, un altro
momento importante della sindrome di Down fu quando questa
sindrome fu associata alla presenza di una trisomia del cromosoma
21, questo è il fenomeno più recente, il riconoscimento del fatto che
il nostro corredo cromosomico è di 46 cromosomi è abbastanza
recente risale alla fine degli anni 50 e all’inizio degli anni 60, è una
delle prime conseguenze di questa evidenza sul fatto che i soggetti
con la sindrome di Down presentano una trisomia del cromosoma
21.
Come abbiamo detto la sindrome di Down ha una frequenza molto
elevata nonostante il discorso di letalità della maggior parte dei
casi, è una delle malattie genetiche più frequenti circa lo 0.15%
delle nascite 1/800 nascite è caratterizzata da un ritardo mentale
molto grave con un quoziente intellettivo tra i 20-50 a seconda dei
casi, l’attesa di vita media era molto limitata all’inizio del secolo
scorso circa di 9 anni ma grazie ai miglioramenti siamo arrivati a
circa 60 anni quindi dà una aspettativa di vita abbastanza buona e
come fattore di rischio della sindrome di Down è l’età materna e le
cause della trisomia 21 nella maggior parte dei casi nel 95% la
sindrome di Down è dovuta a un problema di non disgiunzione
meiotica e possiamo anche distinguere che nella maggior parte dei
casi la non disgiunzione meiotica si verifica nella prima divisione
meiotica; nel 95% dei casi il cromosoma in più è di origine materna
quindi c’è questa osservazione che per il problema avviene a carico
dell’ovocita anche se le cause non sono bene note ed è questo per
cui c’è la stretta correlazione con l’età materna, si è visto che
quanto più aumenta l’età materna tanto più c’è maggiore probabilità
di avere problemi di non disgiunzione meiotica e questo che ci sia
questa associazione con l’età materna. In una certa % di casi, nel
5% dei casi, la sindrome di Down non è associata all’avanzata età
materna e questi sono i casi di sindrome di Down dovuto alla
presenza di traslocazione sbilanciata quindi non a problemi di non
disgiunzione meiotica ma a traslocazioni sbilanciate. Per
traslocazione c’è il passaggio di materiale cromosomico dal luogo
normale a un altro cromosoma, a un altra regione del genoma e in
genere quello che succede è che si ha una traslocazione del
cromosoma 21 intero o in parte su un altro cromosoma, e in
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presenza di traslocazioni sbilanciate non abbiamo nessuna
associazione con l’età avanzata materna, i casi di sindrome di
Down che si verificano non in madri che hanno superato i 35 anni
sono per lo più dovute a traslocazioni sbilanciate e mentre in casi di
non disgiunzione meiotica la sindrome di Down non presenta un
carattere di familiarità quindi la presenza in una famiglia di un
evento Down non significa che c’è un maggiore rischio di Down in
una successiva gravidanza, questo è quando si verifica in problemi
di non disgiunzione meiotica, invece nei casi dovuti a traslocazione
invece la buona parte di questi casi il 50% potremmo anche avere
una ricorrenza, quindi potremmo avere i cosiddetti casi di Down
familiare. Nei casi di traslocazione succede che il cromosoma 21 va
a traslocare su un altro locus cromosomico e in genere va a
traslocare con il cromosoma 14 o con il cromosoma 22 o il
cromosoma 21 stesso. Un’ultima situazione è quella dei mosaici,
nei casi dei mosaici il problema non avviene a carico della meiosi
ma a carico della mitosi e si ha durante le prime divisioni meiotiche
dello zigote, si ha la non disgiunzione dei due cromosomi 21 per cui
ci sarà per tutte le cellule discendenti da questa cellula che subisce
questo problema presenteranno la trisomia 21 e a questo punto il
fenotipo sarà meno grave perché sarà solamente un certo numero
di cellule somatiche che presenteranno questa problematica, e
quindi a seconda dell’entità delle cellule che presenteranno questa
problematica il fenotipo sarà più o meno grave. Possiamo un pò
accomunarlo se vi ricordate a quando abbiamo parlato delle
malattie mitocondriali, delle poliplasmia, dell’eteroplasmia quindi a
seconda del numero delle cellule che presenteranno questo
problema, quindi avremo che solamente alcune cellule avranno il
genotipo 47+21 mentre le altre saranno normali e quindi le
manifestazioni cliniche saranno attenuate.
Nel caso di traslocazioni, il genotipo dei 2 genitori da un lato
abbiamo un genotipo normale con due coppie di cromosoma 21 e
due coppie di cromosoma 14, parliamo del caso più frequente che è
quella di una traslocazione 14-21, invece dall’altro possiamo avere
individui che presentano un normale cromosoma 21 e un normale
cromosoma 14 ma presentano una traslocazione 14-21 e quello
che è successo è che il cromosoma 21 si è andato a traslocare a
fondere con il cromosoma 14 e in questo soggetto questa
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traslocazione non darà problemi perché sarà una Traslocazione
Bilanciata in cui non c’è perdita di materiale genetico, quindi questo
soggetto non avrà nessuna caratteristica perché avrà due
cromosomi 21 e due cromosomi 14 e l’unica differenza è che una
copia di questi cromosomi 14 e 21 sarà presente sullo stesso
cromosoma, però quando nella linea germinale questo cromosoma
traslocato andrà a formare i gameti è li che si potrà verificare il
problema. Quindi in questo caso qua si potrà avere la formazione di
gameti che daranno luogo a uno zigote che non potrà sopravvivere
in cui avremo la presenza o di una monosomia del cromosoma 21,
allorchè questo gamete andrà a essere fecondato del gamete del
partner, o la presenza di una monosomia 21 o la presenza di
trisomia del 14 non saranno compatibili con la vita; avremo dei casi
in cui potremmo avere la formazione di uno zigote normale quando
a segregare saranno le copie normale del 14, se invece andrà a
segregare in questi gameti la copia traslocata insieme alle copie
normali del 14 dell’altro gamete avremo la formazione di un carrer,
di un portatore, ma in ultima analisi quello che succederà è che
potrebbe segregare in questi gameti un cromosoma traslocato 2114 insieme al cromosoma 21 in questo caso avremmo una
triploidia. Nei casi di traslocazione la maggior parte delle
traslocazioni colpisce il cromosoma 14, poi il 13-15-21 stesso e
queste sono le cause di sindrome di Down non dovuta a
disfunzione meiotica, quindi nel caso di non disgiunzione meiotica il
fattore principale è l’età avanzata materna negli altri casi non c’è
associazione con l’età avanzata materna e c’è possibilità di Down
familiare.
Dal punto di vista clinica la sindrome di Down, la trisomia 21 è
molto frequente, principalmente è caratterizzata da ritardo mentale
nel 100% dei casi, sono sempre presenti alterazioni a carico del
sistema nervoso centrale, e presenza di Alzheimer dopo i 35 anni,
possiamo avere la presenza di ipotonia muscolare e la presenza di
bassa statura, poi sono anche caratteristiche le anomalie
disfomorfiche che si verificano nella sindrome di Down, come la
brachicefalia cioè tipica conformazione del cranio, e l’epicanto che
sarebbe la presenza di una plica cutanea in corrispondenza
nell’angolo interno dell’occhio e la presenza del cosiddetto
telecanto che sarebbe l’aumentata distanza tra i bulbi oculari ma
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l’aumenta distanza tra l’angolo interno dell’occhio, poi abbiamo altre
malformazioni disformiche tra le quali la lingua protrudente. Quello
che influisce sulla sopravvivenza dei soggetti con trisomia 21 sono
soprattutto i difetti cardiaci sono quelli che in passato
determinavano una letalità precoce di questi soggetti, sono i difetti
cardiaci congeniti caratterizzati dalla presenza di canale atrioventricolare e altri difetti di questo tipo poi possiamo avere anche
anomalie gastro-intestinale e la presenza di alterazioni neoplastiche
a carico delle cellule del sangue in particolare le leucemie che
colpiscono un certo numero di soggetti. L’aspettativa di vita è
passata dai 9 anni del 1930 dell’inizio del secolo scorso fino ai 60 di
oggi questo però comporta che oltre al problema di ritardo mentale
compaiono anche manifestazioni patologiche del morbo di
Alzheimer quindi degenerazione dei neuroni cerebrali che abbiamo
superato i 35 anni. Quali siano i meccanismi che spiegano questo
particolare fenotipo a tutt’oggi non sono chiari, si ipotizza che ci
siano alterazioni del dosaggio genico e quindi la triplice copia del
cromosoma 21 determina questa problematica, ma il meccanismo
specifico che porta alla comparsa di questo fenotipo ancora non è
noto, quello che si sa è che il cromosoma 21 contiene circa 350
geni e quello che si ipotizza è che questi geni vadano a interagire
con altri geni del genoma e determinando delle cascate molecolari
che sono alterati quando nella sindrome di Down viene alterata
l’espressione di questi geni. Però si è fatto l’ipotesi che la presenza
della copia intera del cromosoma 21 non è necessario per avere la
sindrome di Down e infatti è stato introdotto il discorso della regione
critica per la sindrome di Down che è ancora sotto discussione cioè
che di questi 350 geni esistono alcuni che sono fondamentali per
dar luogo alla sindrome di Down, anzi si sono addirittura fatte le
ipotesi che alcuni geni sono importanti per il fenotipo cardiologico
altri per il sistema nervoso centrale e così via... Quindi che non è
necessario la presenza di tutto il cromosoma ma sono alcuni geni
del cromosoma 21 perché si abbia questa sindrome però questi dati
sono ancora in discussione, ci sono ricercatori che contestano la
presenza di questa regione critica per cui sono necessari ulteriori
studi per capire qual’è il meccanismo patogenetico della sindrome
di Down. Questa è una delle malattie genetiche più rilevanti, più
importanti e più frequenti però vi ho detto che vi sono altre due
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forme di trisomia che sono compatibili con la vita, una è la trisomia
18 la sindrome di Edwards, con una frequenza più bassa rispetto
alla sindrome di Down, 1/7000 nati e anche in questo caso, nel 90%
deriva da una non disgiunzione materna e così come nella
sindrome di Down il 70% dei casi non arriva termine quella che
vediamo è solo una minima % dei feti arrivano alla nascita, solo il
2.5%, è una situazione più grave della sindrome di Down, vedete il
33% di questi bambini muore nel primo mese e il 50% entro 2 mesi,
è caratterizzato da un notevole problema della crescita, peso sotto
la norma, difficoltà nell’alimentazione, presenza di idrocefalo,
epilessia, malformazioni cardiache gravi, notevoli malformazioni di
tipo scheletrico con gambe incrociate. Il cromosoma 21 è il
cromosoma che possiede il minor numero di geni questo spiega
perché la trisomia del 21 è compatibile con la vita anche in età
avanzata, mentre quando parliamo del cromosoma 18 e del
cromosoma 13 presentano un numero di geni elevati e i problemi
della sopravvivenza sono più elevati. Stesso discorso è per la
trisomia del cromosoma 13 (Patau) ancora più rara della trisomia
del 18, 1/12.000-20.000 anche qui non disgiunzione materna nella
maggior parte dei casi, anche qui il 2.5% dei concepimenti arriva
alla nascita e la maggior parte di questi neonati muoiono nei primi 2
mesi di vita, qui ci sono grosse anomalie di formazione del cervello,
olopresencefalia, quindi sono anomalie della formazione del
cervello con fusione dei due emisferi cerebrali che può arrivare alla
cosiddetta ciclopia, quando si ha la fusione dei due emisferi e la
presenza di un unico globo oculare, poi abbiamo cecità, sordità,
microcefalia, palatoschisi, epilessia e varie malformazioni
cardiache. In sintesi le cause di trisomia autosomica nella maggior
parte dei casi essendo non disgiunzione meiotica il fattore
principale l’età dei genitori che porta a un problema di mal
funzionamento del macchinario di ricombinazione all’interno della
meiosi, questo è il discorso della trisomia autosomica.
L'aneuploidia di cromosomi sessuali sono molto meglio tollerate
infatti abbiamo varie entità cliniche nell’ambito dei cromosomi
sessuali, quindi possiamo avere sia presenza di monosomie che
presenze di trisomie, infatti possiamo avere una monosomia
completa del cromosoma X che da luogo alla Sindrome di Turner
oppure possiamo avere presenza di trisomie una delle quali è più
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rilevante dal punto di vista clinico è la Sindrome di Klineferter che è
caratterizzata da una triplice copia di cromosomi sessuali in cui
però il cromosoma sessuale è presente in duplice copia ed è
accompagnato da un cromosoma Y.
Come sappiamo i cromosomi determinano il sesso di un individuo
quindi il genotipo XX è associato ad un fenotipo femminile ed il
genotipo XY è associato da un fenotipo maschile. Ovviamente
questa evidenza cioè il fatto che nelle femmine ci siamo due
cromosomi X ha fatto si che sorgesse un problema per cui come
poteva l’organismo impedire il problema di eccesso di espressione
della duplice copia del cromosoma X presente nelle femmine?
Quindi le femmine avendo due cromosomi X dovrebbero in teoria
presentare un espressione genica, di questi geni, che è il doppio
rispetto che è quella che è presente nel singolo cromosoma X
maschile quindi questo potrebbe portare ad un iper dosaggio
genico. Ricordiamoci che i due cromosomi X, da questo punto di
vista, sono come due autosomi cioè ogni locus del cromosoma X
nel genoma femminile presenta una sua controparte sull’alto allele,
invece il cromosoma X ed il cromosoma Y sono omologhi
solamente per piccole regioni mentre nella maggior parte del
cromosoma X nel maschio non ha una sua controparte allelica.
Quindi c’è questo problema di dosaggio che deve essere in qualche
modo risolto, quindi in teoria se non ci fosse questo sistema di
compensazione il cromosoma X raddoppia l’espressione di tutti i
geni contenuti quindi produrrebbe due volte due RNA per quei geni
rispetto al genoma maschile. Ovviamente non succede questo per
via del fenomeno dell’inattivazione del X per cui uno dei due
cromosomi X nelle cellule femminili viene inattivato casualmente già
dalle prima fasi dello sviluppo, quindi anche l’organismo femminile
alla fine produrrà lo stesso dosaggio genico sul cromosoma X che
verrà prodotto nell’organismo maschile proprio per il meccanismo di
disattivazione del X che inattiverà specificatamente uno dei due
cromosomi a caso (random) nei vari tessuti e varie cellule.
Per il gioco dell’inattivazione del X, di cui abbiamo parlato la
melilazione, per cui il cromosoma X che viene inattivato sarà
ipermetilato e ciò darà luogo alla non espressione dei geni presenti
su quel cromosoma.
La Sindrome di Klineferter è caratterizzata dalla presenza di una
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trisomia di cromosomi sessuali, il fenotipo sarà indicato come 47
XXY perché il soggetto presenterà un cromosoma in più che sarà
l’X in un soggetto che presenterà un fenotipo di tipo maschile quindi
la presenza del cromosoma X darà luogo ad un fenotipo maschile.
La frequenza non è tanto trascurabile 1 su 600/900 maschi ma
anche in questo caso c’è però una grossa fetta di gravidanze che
non giunge a termine. Quindi nelle alterazioni, nella aneuploidie dei
cromosomi la caratteristica principale è quella dell’incompatibilità
con la vita però a seconda delle situazioni abbiamo dei casi in cui
possiamo arrivare a termine ed avere un fenotipo. Quando si arriva
a termine il fenotipo sarà maschile e le caratteristiche principali di
questo fenotipo saranno l’alta statura, la presenza di anomalie dello
sviluppo sessuale di ipogonadismo con bassi livelli di testosterone,
mancata produzione di spermatozoi, sterilità, la comparsa di
caratteri sessuali femminili come la ginecomastia con la comparsa
di ipertrofia delle ghiandole mammarie. Da questo punto di vista
però la Sindrome di Klineferter sia l’intelligenza che l’attesa di vita
sono normali, non ci sono anomalie per quanto riguarda
l’aspettativa di vita e per la qualità di vita di questi soggetti.
Oltre alla Sindrome di Klineferter, quella classica con duplice
cromosoma X e Y, possiamo avere altre varianti che sono dovute al
numero di cromosomi X o Y che si associano, quindi avremo delle
Sindrome di Klineferter in cui abbiamo 2 cromosomi X e 2
cromosomi Y, 3 4 cromosomi X etc... e poi dei casi di mosaici.
Quello che è importante da ricordare è che queste sindromi
essendo compatibili con la vita perché per via del fenomeno
dell’inattivazione del X per cui questi soggetti le copie in più di
cromosomi X vengono inattivate e quindi tende ad attenuare il
problema che è dovuto all’iperdosaggo genico di geni localizzati sul
cromosoma 21. Quindi l’inattivazione del X che si verifica in un
organismo, in una cellula, ogni qualvolta abbiamo più di un
cromosoma X, a prescindere dal sesso fenotipico del individuo
abbiamo inattivazione del X funziona anche in questi casi però non
riesce a compensare tutto perché per un dato motivo che è dovuto
dalla presenza delle cosiddette regioni Pseudosomiche.
Possiamo avere anche dei casi di Trisomia del cromosoma X, ma
queste sono più benigne dal punto di vista fenotipico e anche qui
sono dovute da disfunzioni meiotica materna correlata con l’età
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materna. Come caratteristiche cliniche potrebbero anche sfuggire
alla diagnosi perché presentano statura elevata, fertilità normale,
sia l’intelligenza che l’attesa di vita sono normali, quindi non è
infrequente fare riscontro di trisomia del cromosoma X per motivi
casuali.
Così come esiste la trisomia del cromosoma X esiste un altra
particolare situazione che si ha la presenza di un cromosoma X
accompagnato da due cromosomi Y in questo caso fenotipo
maschile non si hanno grosse problematiche, quindi ogni volta che
c’è un problema a carico dei cromosomi sessuali abbiamo problemi
di alta o bassa statura, la fertilità è normale, non vi è correlazione
con l’età paterna, intelligenza e attesa di vita sono ormonali, una
curiosità. Per quando riguarda questa situazione è che verso gli
anni 70 si riteneva che questo tipo di genotipo fosse più frequente
in soggetti a tendenze ad una iper aggressività, cioè la presenza di
due cromosomi X veniva associata all’aggressività ed alcuni
avevano suggerito che questo caripotipo erano più frequenti tra
soggetti che avevano compiuto dei grossi reati, ma si scoprì che
questo non era associato ad una tendenza a delinquere.
Per le Monosomie che non sono compatibili con la vita, in quanto
determinano la comparsa di caratteri recessivi letali. Mentre se
abbiamo una monosomia completa che riguarda i cromosomi
sessuali che è la monosomia del cromosoma X detta anche
Sindrome di Turner (prende il nome dal endocrinologo Henry
Turner che la descrisse nel 1938). Il Cariotipo di questi individui è
formato da un solo cromosoma X e definisce solo un fenotipo di tipo
femminile che è dovuto a completo o parziale assenza del secondo
cromosoma sessuale. In questo caso l’errore è nella
spermatogenesi nel 80% dei casi e non correla con l’età dei genitori
e una cosa da ricordare è che la presenza di un figlio con Sindrome
di Turner non aumenta il rischio riproduttivo previsto per la coppia di
genitori quindi non si presenta in forma ereditaria.
La monosomia X della Sindrome di Turner è l’unica monosomia
compatibile con la vita però anche in questo caso quello che noi
osserviamo è solamente una minima % di casi perché la maggior
parte dei feti monosomici 98% non arriva alla nascita va incontro ad
aborto spontaneo. Quindi la sindrome del cromosoma X
rappresenta una grossa % di causa di aborti spontanei e quindi si
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presuppone che questo cariotipo X0 abbia un importanza
fondamentale nelle prime fasi dello sviluppo dell’embrione ed è
compatibile con la sopravvivenza post natale, il motivo perché si
hanno tutta la serie di aborti non si sa ancora.
La vera monosomia del X è responsabile del 45% dei casi di
sindrome di Turner negli altri casi è possibile la presenza di
mosaicismo cioè con la con presenza dello stesso individuo di
cellule con genotipo 45 X0 e presenza di cariotipo 46 XX, in oltre è
stato osservato che c’è un certo livello di mosaicismo somatico
Turner che è inferiore al 2% di tutte le cellule presente in tutta la
popolazione quindi all’interno di tutti gli individui è presente una
certa piccola quota di cellula che presentano la monosomia del
cromosoma X.
Da un punto di vista clinico la Sindrome di Turner è caratterizzato
dal fenotipo femminile, si osserva sterilità femminile in quanto le
ovaie si presentano anomale con forma allungata e formate da
tessuto che va incontro a fibrosi e quindi non maturano
correttamente e quindi si ha una genesi di una amenorrea primaria
con sterilità. Solamente una piccola % di casi si può verificare la
pubertà soprattutto nei casi di mosaicismo si possono osservare
gravidanze però con aumentato rischio di perdita fetale. Quindi è
presente una grossa variabilità del fenotipo in soggetti con
Sindrome di Turner soprattutto associati a casi di mosaicismo.
Quindi ricapitolando alcune caratteristiche cliniche del cromosoma
X: bassa statura, sterilità, pterigio del collo cioè la presenza di
pliche cutanee particolari, in rari casi si presenta anche delle
alterazioni cardiache.
E’ stato detto che l’inattivazione del X che consente la
sopravvivenza di questi casi con aneuploidia dei cromosomi
sessuali, però tornando un attimo al discorso dell’inattivazione del X
per spiegare quali sono i problemi, il perché i soggetti con
aneuploidia dei cromosomi sessuali poi presentano dei problemi
clinici e in particolare perché ci sia il problema di bassa o alta
statura che si accompagna nei soggetti con aneuploidia dei
cromosomi sessuali. E’ stato detto che il cromosoma X in genere
viene inattivato cioè tutte le copie del cromosoma X che superano
una unità vengono inattivate però questo non vale per tutto il
cromosoma X perché ci sono delle regioni del cromosoma X che
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non vengono inattivate e queste sono le cosiddette regioni che
presentano un corrispettivo anche sul cromosoma Y cioè sono le
cosiddette regioni pseudosomiche cioè ci sono delle regioni del
cromosoma X che hanno un corrispettivo allelico sul cromosoma Y
e sono delle regioni che in genere sono localizzate localizzate a
livello dei due telomeri sia del telomero del braccio corto che del
telomero del braccio lungo e queste vengono nominate regioni
pseudosomiche 1 e 2 e queste regioni possono appaiarsi nel
maschio con il cromosoma Y e saranno le regioni del cromosoma X
che saranno espresse in duplice copia perché queste non daranno
problemi di dosaggio genico anomalo nel maschio perché nel
maschio sul cromosoma Y ci sarà la corrispettiva regione quindi il
cromosoma Y avrà la sua regione pseudosomiche 1 e 2, quindi
queste regioni non saranno inattivate perché come se fossero delle
regioni autosomiche normali, infatti il numero di geni che sono
localizzati all’interno di queste regioni è molto limitato sono 24
regioni per la regione 1 e 4 regioni per la 2. All’interno di queste
regioni esiste un gene che si chiama Shox che è associato alla
determinazione della statura dell’individuo, quando ci sono
anomalie a carico di questo gene o delezione o aumento di numero
copie di questo gene quello che si osserva si ha un’alterazione
della statura degli individui che manifestano queste alterazioni. Per
cui nella Sindrome di Turner quello che succede è che c’è solo una
copia di questo gene Shox perché l’altro cromosoma X non esiste e
quindi nella Sindrome di Turner si ha una bassa statura, mentre con
soggetti con Sindrome di klinefelter che hanno una duplice copia
del cromosoma X oltre al cromosoma Y si ha un elevata statura,
così come abbiamo visto che c’è un elevata statura anche nei casi
di trisomia del X o di presenza di copia soprannumerario del
cromosoma Y e questo sembra essere dovuto alla presenza di tre
copie del gene Shox. Quindi una delle manifestazioni cliniche
associate all’aneuploidia dei geni sessuali più essere spiegato dalla
presenza di alterazioni del numero di copie del gene Shox. Quindi
nelle aneuploidie dei geni sessuali la sindrome clinica è determinata
per lo più per la presenza di sbilanciamento a carico del gene
presente nelle regioni pseudosomiche.
Riassumendo le monosomie autosomiche non esistono in clinica,
non si osservano perché sono quasi tutte letali, le trisomie
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autosomiche sono deleterie però sono compatibili con la vita, come
in alcuni casi come la sindrome di Down, la trisomia del 18 e la
trisomia del 13, le aneuploidie dei cromosomi sessuali sono meglio
tollerate come la sindrome di Turner o Klineferter più altre situazioni
come la trisomia dell’X o XXY e danno delle anomalie.
Oltre alle anomalie del numero possiamo avere anomalie strutturali
dei cromosomi, anomalie che non riguardano il cromosoma nella
sua interezza ma riguarda alcune problemi di struttura del
cromosoma, quindi possiamo avere delle anomalie che riguardano
delle regioni particolari del cromosoma e in questo caso possiamo
trovarci di fronte Delezioni, Duplicazioni, Inversioni, Traslocazioni,
Isocromosoma e così via...
Le Delezioni possono causare la perdita di una porzione di
cromosoma e la delezione può colpire una regione terminale del
cromosoma che viene chiamata Delezione Terminale oppure può
essere una Delezione Interstiziale in cui la delezione riguarda la
porzione interna del cromosoma, così come nel caso della
monosomia le delezioni di cromosomi possono determinare una
parziale monosomia di quel cromosoma e monosomia della regione
interessata quindi l’organismo diventa monosomico per la porzione
di cromosoma che è deleta quanto più questa regione è grande
maggiore sarà la gravità del fenotipo e maggiore potrà essere la
possibilità di incompatibilità con la vita come nella monosomia la
maggior parte delle delezioni segmentali è deleteria. Esiste una
forma particolare di delezione che è abbastanza rilevante come
struttura e non è la delezione di un intero cromosoma ma è la
delezione del braccio corto del cromosoma, ed è la delezione del
braccio corto del cromosoma 5, però il braccio corto del cromosoma
5 è molto piccolo per questo diventa compatibile con la vita e viene
denominata sindrome di CRI-DU-CHAT, quindi delezione del
braccio del cromosoma 5 che è presente nello 0.02% dei nati vivi e
si accompagna ad alterazioni anatomiche con ritardo mentale e
malformazioni dell’apparato vocale che determina proprio questo
termine CRI-DU-CHAT che causa un tipo particolare di pianto
emettono questi bambini, è la delezione strutturale più ampia che è
compatibile con la vita.
Le Duplicazioni si possono verificare quando c’è un
raddoppiamento del materiale genetico che riguarda una certa
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regione cromosomica e queste duplicazioni sono spesso il risultato
di crossing-over ineguali che si verificano durante la meiosi e
causano ridondanza dei geni, alterazioni del dosaggio e possono
essere associati ai fenotipi più diversi e possono essere stati anche
fattori importanti di variabilità durante l’evoluzione, in precedenza è
stato detto che le famiglie geniche possono essere localizzate in
cluster o disperse nel genoma e il meccanismo di duplicazione è
appunto quello che ha portato la formazione di famiglie geniche
quindi è un fenomeno che ha portato sia a problematiche di tipo
clinico ma è stato coinvolto anche nell’evoluzione della specie.
L’Inversione è un fenomeno più particolare e si verifica quando si
ha una rottura di una regione di cromosoma e seguita da una
rotazione di questa regione e reinserimento di questa regione nello
stesso cromosoma, quindi si ha praticamente l’inversione di un
tratto cromosomico quindi l’ordine dei geni nel tratto inserito viene
ad essere invertito rispetto alla norma però a parte questo i geni
che sono presenti all’interno dell’inversione non si verificano
problemi. A seconda di dove accade questo fenomeno di
inversione, si possono dividere queste inversioni in Paracentriche
quando queste regioni comprendono il centromero se invece
comprende anche la regione Centromerica si dice Pericentrico.
Nel caso in cui l’inversione non interessa il centromero quindi è a
lato e riguarda solo il braccio lungo o il braccio corto si parlerà di
inversione paracentrica. Se l’inversione include il centromero si
parlerà di inversione pericentrica, queste anomalie di solito non
portano grossi problemi perché non si ha perdita di materiale
genetico però ci può essere un problema che si verifica a carico dei
confini di queste anomalie perché se questa inversione colpisce un
gene, un gene verrà interrotto da questa inversione e
nell’inversione avrà una perdita completa nella sua integrità per cui
il problema può verificarsi a carico dei geni che sono a cavallo nel
punto di rottura e comunque darà delle manifestazioni cliniche che
saranno associate alla funzione del gene che cade nel punto di
rottura. Poi possiamo avere delle anomalie cromosomiche più rare
in particolare è la Formazione di un Isocromosoma, l’isocromosoma
è un’anomalia per cui si ha una duplicazione di uno dei due bracci,
o del braccio lungo o del braccio corto con delezione degli altri
bracci però sono fenomeni abbastanza rari per cui si chiama iso
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perché abbiamo la formazione di un cromosoma che sarà formato o
da due bracci lunghi o corti con la perdita dell’altro braccio sono
situazioni più gravi perché qui la perdita di materiale sarà molto più
elevato.
Le Traslocazioni sono delle anomalie cromosomiche strutturali che
hanno una rilevanza clinica più importante. Le traslocazioni sono
aberrazioni cromosomiche che sono determinate da trasferimento
di un segmento cromosomico in una nuova posizione del genoma
quindi su un altro cromosoma, quindi il passaggio di una parte di un
cromosoma in un’altra regione e possiamo distinguere due tipi
principali di traslocazioni possiamo avere Traslocazioni Reciproce e
Traslocazioni Robertsoniane che coinvolgono i cromosomi
acrocentrici (in cui il centromero è situato molto vicino alla fine del
cromosoma).
Le Traslocazioni Reciproche sono quelle traslocazioni in cui c’è
scambio reciproco di materiali di due cromosomi e vengono anche
denominate bilanciate, quindi lo scambio di segmenti cromosomici
avviene senza nessuna perdita di informazione genetica e avviene
con lo scambio reciproco tra due regioni cromosomiche, quando la
traslocazione è bilanciata non si ha nessuna assenza di regione
cromosomica ma si ha solo il trasferimento di un regione di un
cromosoma all’altro. L’unico problema riguarda i geni che si trovano
nei punti di rottura, se in questo punto di rottura su uno dei due
cromosomi si trovasse un gene, questo gene sarebbe interrotto
dalla traslocazione e questo potrebbe portare dei problemi e questo
in genere è quello che succede nelle traslocazioni somatiche in
alcuni casi di neoplasie come le leucemie che sono caratterizzate
da traslocazioni colpiscono specificamente certe regioni dei
cromosomi, dove magari ci sono degli oncogeni che a quel punto
vengono ad essere gene soppressivi delle tumorogenesi, o
l’aumentata attività degli oncogeni o la perdita di funzione di questi
tumor suppressor può provocare la comparsa di specifiche
neoplasie maligne. Questo dice che in molte cellule somatiche gli
eventi di traslocazioni sono frequenti e tollerati a meno che non
colpiscano una certa regione cromosomica e possono determinare
una degenerazione maligna, lo stesso discorso vale per le cellule
germinali se la traslocazione mette fuori gioco un gene particolare
poi si potrà avere un problema a carico del soggetto che presenta
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questa anomalia.
Le Traslocazioni Robertsoniane, le traslocazione in questo caso
non sono bilanciate perché si ha la perdita di materiale genetico in
particolare la traslocazione robertsoniana si verifica sempre a
carico di due cromosomi acrocentrici e i cromosomi acrocentrici
sono quelli che presentano un braccio corto molto piccolo, quasi
inesistenti e il telomero e il centromero sono quasi corrispondenti.
Nella traslocazione robertsoniana si parte da due cromosomi
acrocentrici che hanno una loro identità e questi due cromosomi
acrocentrici vanno a perdere i due bracci corti e vanno a costituire
un unico cromosoma formato da due bracci lunghi di entrambi i
cromosomi e questo riguarda i cromosomi acrocentrici che sono il
13-14-15-21-22 e non ci sono grosse problematiche di tipo clinico
perché in questi cromosomi qua il braccio corto è così piccolo che
non contiene geni per cui non si ha perdita di geni in seguito a
queste traslocazioni ma quello che può succedere è che queste
traslocazioni robertsoniane, lo vedete anche nel cromosoma 21
possono dare luogo alla patogenesi della sindrome di Down perché
possono essere sbilanciate nella discendenza nel caso di
fecondazione o in caso di anomalia di questo cromosoma traslocato
che potrebbe avere un problema di iper dosaggio genico di alcune
regioni. Alcune caratteristiche della traslocazione robertsoniana
quindi colpiscono i cromosomi acrocentrici, nessuna regione
cromosomica è assente perché nel braccio corto di questi
cromosomi non sono contenuti geni e la più frequente traslocazione
robertsoniana è la traslocazione che colpisce i bracci lunghi del
braccio lungo del cromosoma 14 e 13 e rappresenta il 75% di tutte
le traslocazioni robertsoniane seguite dalla traslocazione 14q 21q
che è quella coinvolta nella sindrome di Down, si formano in genere
durante la meiosi femminile e comportano o infertilità maschile o
abortività ripetuta. L’effetto delle traslocazioni sia reciproche che
robertsoniane se non si ha perdita di materiale essenziale e non
vengono danneggiati i geni dalla rottura gli individui saranno
clinicamente normali, però avranno un rischio aumentato
soprattutto nelle traslocazioni robertsoniane di avere figli con
riarrangiamenti cromosomici sbilanciati e si parla di traslocazione
bilanciata quando non c’è perdita di materiale genetico
e
traslocazione sbilanciata quando non c’è perdita di materiale
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genetico, la traslocazioni può essere anche sbilanciata e in quel
caso darà manifestazioni nel soggetto che la presente e il fenotipo
sarà dovuto alla perdita del materiale cromosomico.
La presenza di cromosomi ad anello in cui si ha la formazione di un
cromosoma di tipo circolare in cui si avrà la perdita di porzioni del
telomero, il telomero è una formazione che rende integra la
struttura del cromosoma, la perdita del telomero fa si che queste
estremità diventino “appiccicose” e si chiudono su se stesse e
formare un anello anche in questo caso la sintomatologia clinica
associata alla presenza di questa struttura ad anello dipende dal
grado di mosaicismo e dal materiale genetico perduto durante la
formazione ad anello.
Tutte queste anomalie che abbiamo visto sono grossolane
anomalie cromosomiche che possono essere visualizzate con
l’analisi del cariotipo, esistono altre alterazioni che vengono
denominate Anomalie Genomiche e non si parla più di
cromosomiche perché non possono essere visualizzate con il
cariotipo,
e
vengono
chiamate
Anomalie
Genomiche
submicroscopiche perché non possono essere visualizzate con il
cariotipo. Il disordine genomico submicroscopico genomico è
caratterizzato da acquisizione di materiale, una delezione, una
duplicazione che però riguarda delle regioni che non sono
visualizzabili al cariotipo quindi parliamo di duplicazioni, delezioni,
inversioni che sono al di sotto del potere di risoluzioni del cariotipo.
La dimensione minima di anomalia cromosomica che si può vedere
al cariotipo è di 5 milioni di basi (o megabasi), tutto che è al di sotto
di 5 megabasi, se pur presente, non riusciamo a vederlo ed è quello
che noi chiamiamo disordine genomico submiscoscopico.
Nell’ambito di queste anomalie genomiche submiscroscopiche ci
sono anche situazioni che possono essere benigne che possono
essere presenti normalmente negli individui, nella prima lezione
abbiamo parlato del variazioni di numero di copie che sono presenti
nella popolazione normale e quindi alcune regioni cromosomiche
possono essere presenti o in singola copia o in duplice, triplice
copia senza che questo porti a delle anomalie cliniche, quindi
ricordiamoci che la presenza di anomalie genomiche
submicroscopiche non necessariamente deve essere associata ad
anomalie cliniche, questo è lo spettro benigno di queste anomalie
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però poi esistono delle sindromi, delle anomalie submicroscopiche
che sono associate a malattie genetiche importanti come la
Sindrome di Prader-Willi e di Angelman, ci sono alcune anomalie
genetiche di rilevanza una è la Sindrome di DiGeorge ed è una
delle più frequenti sindromi da microdelezione, ed è una delezione
del braccio lungo del cromosoma 22, la delezione comprende
3milioni di basi quindi e non è visualizzabile all’esame del cariotipo
e si ha la perdita di questi 30 geni che sono localizzati all’interno
della regione che si trova sul braccio lungo del cromosoma 22 e
queste delezioni submicroscopiche vengono anche denominate
Sindromi Da Geni Continui perché quello che succede è che il
fenotipo che ne risulta è il risultato di vari geni che ognuno svolge la
sua funzione che sono tutti localizzati all’interno della regione
deleta, quindi se ci sono geni associati a diversi funzioni e la perdita
contemporanea determina un fenotipo complesso che è dovuto alla
funzione diversa di questi geni. Dal punto di vista clinico si
caratterizza per queste anomalie cardiache quindi si è ipotizzato
che esistesse un gene coinvolto nello sviluppo del cuore ma
abbiamo anche presenza di palatoschisi, quindi di un anomala
fusione dell’osso palatale e la presenza di problemi di tipo
immunitario, poi si è visto che ci può essere una mutazione
puntiforme in uno di questi geni che all’interno di questa regione e
si chiama tbx1 e quindi buona parte della clinica in questa patologia
è dovuta alla delezione del gene tbx1, però quando i soggetti che
hanno delezione del gene tbx1 non presentano un quadro completo
di questa sindrome perché non hanno problemi a carico del sistema
nervoso centrale, problemi dell’apprendimento che invece sono
presenti quando ad essere deleta è l’intera regione.
Un altro es. è la sindrome di Williams che caratterizzata da un lieve
ritardo mentale e con questa facies tipica denominata anche facies
da elfo perché presenta questo naso con la punta bulbosa, bocca
larga e guance piene, statura ridotta e problemi a carico delle
arterie e del cuore con stenosi periferica delle arterie polmonari e
stenosi aortica, nel caso della sindrome di Williams c’è una
delezione di una regione cromosomica che è di 2 megabasi sul
braccio lungo del cromosoma 7 anche questo caso si parlerà di
sindrome di geni continui, e i geni che si trovano nella regione
deleta e in particolare un gene che determina la comparsa dei
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fenotipi a carico delle arterie è il gene dell’elastina che è quello che
comporta la fragilità della parete arteriosa di questi pazienti e
determina il quadro vascolare di questi pazienti, per quanto
riguarda altri segni è associata alla presenza o delezioni di altri geni
che sono presenti nella regione e anche questa è una delezione
submicroscopica perché non può essere visualizzabile al cariotipo.
Poi abbiamo la sindrome di Prader Will e Angelman abbiamo la
delezione di una regione sul braccio lungo del cromosoma 15 che
in certi casi può essere visualizzabile al cariotipo.
Le tecniche per evidenziare le anomalie cromosomiche, per quanto
riguarda le anomalie al di sopra di 5 milioni basi il cariotipo è
sufficiente, ci può far vedere anomalie del numero, anomalie
strutturali che riguardano che colpiscono regioni al di sopra di 5
milioni di basi, quando queste anomalie sono al di sotto di questo
limite dobbiamo utilizzare altre tecniche. Il cariotipo può farci fare la
diagnosi, e le indicazioni al caritipo sono: anomalie congenite
multiple associato a ritardo mentale, disordine della differenziazione
sessuale, presenza di anomalie dismorfiche, neoplasie
ematologiche, abortività ripetute, gravidanze in donne di età
avanzata dobbiamo effettuare un cariotipo.
Quando invece sospettiamo una problematica che è al di sotto della
dimensione di 5 megabasi dobbiamo rivolgerci ad altre tecniche.
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Banfi 1.5 (Mercoledì 27 Marzo 2013)
Test genetico
I Micro RNA e il Loro Ruolo Nelle Malattie Genetiche
Quando parliamo di test genetico intendiamo le modalità di
determinare le cause di variazioni di sequenza o di struttura del
genoma che sono correlate a malattie genetiche, quindi la diagnosi
finale di una malattia genetica deve avvalersi di un test genetico
che è mirato ad identificare le precise cause molecolari della
condizione, quindi noi possiamo pure fare diagnosi di una malattia
basandoci sull’aspetto del fenotipo di quel paziente però la diagnosi
finale di una malattia genetica, in cui è coinvolta una problematica a
carico di un genoma deve essere fatto con un test genetico
molecolare appropriato, e ci sono varie tecniche per effettuarlo.
Possiamo fare un test genetico tramite un modo diretto detto Analisi
Diretto del DNA o del RNA a seconda della situazione. Questo test
diretto ci permette di andare a verificare la struttura del DNA e
verificare la presenza di mutazioni. Poi esiste un test Indiretto che
non va direttamente a guardare cosa succede a livello del DNA ma
va a vedere le conseguenze della mutazione a carico del DNA sul
funzionamento della cellula in genere questo viene a corrispondere
al test biochimico dove si va a vedere quali sono gli effetti della
mutazione sull’attività e sulla struttura delle proteine. In ultimo il test
Citogenetica ci fa osservare la struttura dei cromosomi e si usa
quando si ha il sospetto di un’anomalia cromosomica o un
riarrangiamento strutturale.
Il test Diretto, quando andiamo a guardare delle mutazioni
mendeliane, in genere, ci sono delle mutazioni puntiformi, quindi noi
andiamo ad identificare una mutazioni puntiforme in una singola
base nel ambito di un genoma che è di 3 miliardi, prima difficoltà.
Ammettiamo anche che, con l’aiuto della clinica, noi sappiamo
anche qual è sia il gene responsabile ad esempio abbiamo di fronte
un paziente con fibrosi cistica in questo caso con un sospetto del
genere noi possiamo restringere il test genetico con il test diretto
all’analisi del gene che causa la fibrosi cistica cioè il gene cftr,
quindi in qualche modo abbiamo, fra tutti e 3 miliardi di nucleotidi
abbiamo identificato qual'è la regione che vogliamo ad andare ad
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analizzare però anche andare a verificare la presenza di una
mutazione nell’ambito di un singolo gene cftr non è una cosa
semplicissima perché ci dobbiamo ricordare che qualsiasi genoma
presenta una struttura molto complessa con un alternanza di esoni
ed introni quindi nel caso della fibrosi cistica avremo un certo
numero di esoni che sono intervallate da tante sequenze introniche
e quindi noi per andare a verificare la presenza di una mutazione
nell’ambito della regione codificante del gene della fibrosi cistica
dobbiamo restringere l’analisi ad ogni uno di questi esoni che
compone il gene quindi noi dovremmo andare ad amplificare, con
tecnica di PCR, solo gli esoni, che normalmente andranno a
codificare le varie proteine, con il test di sequenziamento diretto
dove andremo a leggerci la sequenza di ciascuno di questi esoni e
comparare la sequenza ottenuta con la sequenza normale e vedere
se è presente la mutazione e questa è un indagine molto lunga e
non si può effettuare in un solo giorno e in media ci vuole un mese,
due mesi per fare un indagine di questo tipo, questo spiega anche
perché i test genetici richiedono tempi molti lunghi quindi non
dobbiamo aspettarci dei risultati immediati. Quando noi effettuiamo
un indagine con il test genetico diretto utilizzando le metodiche
convenzionali cioè PCR, sequenziamento diretto i tempi sono molto
lunghi e dobbiamo anche avere in mente quale è il gene che
vogliamo andare ad analizzare, quindi se noi sospettiamo una
malattia genetica però non abbiamo idea di quale possa essere il
gene non possiamo chiedere di fare un mappaggio genetico per
vedere cosa esce perché vedremo che con le tecniche
convenzionali nei laboratori di diagnostica del nostro servizio
sanitario nazionale dobbiamo chiedere quale è il gene da
analizzare questo con le metodiche convenzionali. Ci sono stati
degli sviluppi che permettono di fare queste indagini in modo molto
più rapido e il primo passaggio è stato quello della messa a punto di
questo test che si chiama Array che permette di fare indagini
contemporanee su più geni in uno stesso momento e in particolare
questa tecnica si chiama Arrey Primer Extension (APEX),
innanzitutto il micro cip è un vetrino di 1 cm² di dimensioni sul cui si
può andare a depositare delle sequenze di DNA di nostro interesse,
questa metodica qua che è l’estensione per singolo nucleotide ci
permette di andare a verificare la presenza di mutazione che noi già
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conosciamo associate a certi geni, ad es. il gene della fibrosi
cistica noi prendiamo tutta la lista delle mutazioni che già sono state
descritte nel gene della fibrosi cistica e andiamo a immobilizzare su
questo vetrino le sequenze che corrispondono alle regioni in cui
queste mutazioni sono state riscontrate, poi per una metodica di
estensione, praticamente nel vetrino noi prendiamo le sequenze
che si fermano a una base precedente alla mutazione poi
prendiamo il DNA del paziente lo denaturiamo, estraiamo le regioni
corrispondenti ai geni della fibrosi cistica e le andiamo a ibridare sul
vetrino, quindi a questo punto si formerà un ibrido tra la sequenza
del paziente e la sequenza del gene fibrosi cistica e a questo punto
facciamo un estensione cioè aggiungiamo al vetrino una miscela di
nucleotidi che corrispondono alla base di cui vogliamo verificare se
è mutato o no. Poiché queste 4 basi sono marcate con un
marcatore fluorescente di colore diverso a secondo della base che
andiamo a inserire sul vetrino noi sapremo se quella base sarà
mutata o no, questa è una tecnica permette di sbrinare una serie di
mutazioni già note in un certo gene o anche in situazioni in cui sono
più geni coinvolti, vi ho fatto l’es quando abbiamo parlato
dell’eterogeneità genetica di malattie come la retina pigmentosa
che possono essere causate da 50 geni diversi, allora su questo
vetrino qua andiamo a mettere tutte le mutazioni note nei geni noti
che causano retinite pigmentose e possiamo andare ad analizzare
tutte le mutazioni note, questa è un indagine che si può fare
rapidamente, in un paio di settimane possiamo avere i risultati. Il
problema di questa analisi è che siamo limitati alle mutazioni che
già sono state descritte in quel gene quindi se nel gene della fibrosi
cistica che noi vogliamo andare a diagnosticare nel nostro paziente
c’è una mutazione nel gene CFTR che però non è stata descritta
prima questa non sarà presentata sul vetrino e ce la perdiamo e
questo è il grosso svantaggio. Questo è il primo test che negli ultimi
10 anni ha permesso di velocizzare l’indagine. Il sequenziamento di
cui abbiamo parlato prima è un sequenziamente con il metodo
SANGEM che è anche detto sequenziamento di prima generazione
e questo è anche il sequenziamento che si è usato per arrivare al
sequenziamento del genoma umano, quindi il progetto genoma
umano è stato costruito proprio con questo metodo che fino adesso
si è rivelato molto redditizio infatti vedete qui che questo
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sequenziamento ha portato la scoperta più di 2000 geni
responsabili di malattie genetiche. Questo metodo è un metodo
abbastanza lento e non è proprio efficace e per analizzare un gene
ci vuole tempo prima dobbiamo generare un frammento con PCR e
poi dobbiamo sequenziare quindi non è molto redditizio infatti per
sequenziare il genoma umano ci sono voluti 10 anni con questo
metodo. Adesso è venuto fuori un nuovo metodo che contrasto a
questo metodo SANGEM viene chiamato sequenziamento di
seconda generazione o di nuova generazione, detto in inglese Next
Generation Sequencing (NGS), ed è un metodo che vi permette di
avere un numero di sequenze veramente elevatissimo in tempi
rapidi. Quindi il metodo che permette di sequenziale il genoma in
tempi molto rapidi con costi molto più limitati.
Quindi per arrivare al primo sequenziamento di genoma sono stati
necessari 10 anni con un costo di 10 miliardi di dollari oggi con
queste metodiche di nuova generazione è possibile ottenere una
sequenza completa di un genoma umano in circa due settimane
con un costo di 10 20 mila dollari.
Quindi si dispongono tre metodi per il sequenziamento del DNA: il
primo è il cosiddetto Targeted Resequencing che è un pò la stessa
metodica che viene utilizzato con il sequenziamento normale cioè
noi non sequenziamo tutto il genoma ma sequenziamo solo la parte
di genoma che ci interessa quindi se noi abbiamo già in mente quali
geni che possono causare quella data patologia andiamo ad
estrarre solo quello, quindi o un gene particolarmente grande che
non può essere analizzato con metodo Sangem perché troppo
grande e ci metteremo troppo tempo a farlo oppure quando
abbiamo una malattia che è eterogenea che può essere causata da
tanti geni e quindi a questo punto noi bersagliamo solamente nel
genoma del paziente andiamo ad estrarre solamente i geni che
vogliamo analizzare e facciamo un sequenziamento di nova
generazione cioè unico a tappeto solamente di queste regioni, e
questo si chiama Targeted Resequencing quindi targeted perché
noi ci restringiamo solo ad uno e questo si può utilizzare solamente
quando abbiamo un forte sospetto diagnostico quindi quando
sappiamo che conosciamo il gene responsabile.
Il secondo (Whole exome sequencing) incomincia a diventare già
un pò più generale in questo caso facciamo il sequenziamento del
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exome cioè tutto l’insieme degli esoni codificanti per tutti i geni e
proteine che sono presenti nel nostro genoma, quindi quando non
sappiamo quale sia il gene responsabile o ci sia una nuova malattia
genetica si potremmo ipotizzare di usare l'exome dove permette
l’estrazione tutti gli esoni codificanti tutto il genoma e li andiamo a
sequenziare tutti.
La terza tecnica (Whole genome sequencing) è invece quella
ancora più ampia cioè quella di sequenziare tutto il genoma,
chiaramente nella maggior parte dei casi l’exome la maggior parte
delle mutazioni sono contenute all’interno di esoni codificati però se
ci trovassimo di fronte a casi in cui la mutazione è presente non
nell'esone non codificante ma nel promotore o all’interno di un
introne allora l’exome non ci darebbe una risposta.
Quindi queste sono le tre metodiche che possiamo ipotizzare di
usare per la diagnosi per il test genetico con exome. Ma quel è il
problema? Una cosa è quando noi andiamo a sequenziale un
singolo gene noi a quel punto dobbiamo valutare la patogenicità o
meno di una mutazione di un singolo gene ma quando ci troviamo
di fronte ad una serie di mutazioni, di variazioni di sequenza in
migliaia di geni o in miliardi di nucleotidi il problema è ancora più
grande ed è quello di distinguere tra le variazioni di sequenza che
hanno una responsabilità causativa rispetto a quelle che sono dei
polimorfismi rari.
Cosa dobbiamo considerare quando noi valutiamo una data
variazione di sequenza e vogliamo stabilire se quella ha un
significato patologico o meno? Esistono vari criteri e chiaramente
nessuno di questi è un criterio unico che ci dice che questa è la
mutazione, però la combinazione di questi criteri ci può dare una
mano per l’interpretazione dei dati. Prima cosa, se quella mutazione
e già stata riscontrata in quel gene di un paziente affetto da quella
malattia chiaramente la diagnosi e fatta, quindi tornando al discorso
della fibrosi cistica se noi abbiamo fatto un sospetto di fibrosi
cistica, vi troviamo una mutazione del gene cftr ed è stata descritta
prima ed è presente in letteratura, quindi noi possiamo fornire una
diagnosi, quindi diagnosi già nota. Nel secondo caso Mutazione de
novo assente nei genitori in una persona con una malattia che non
è presente nei genitori quindi se ad esempio sospetto di diagnosi di
Acondroplasia noi troviamo la mutazione che causa nel gene fgf3 e
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che non è presente nei genitori noi abbiamo fatto diagnosi. Terzo
criterio in caso di una malattia genetica che si manifesta nella
famiglia con un dato pattern di ereditarietà noi troviamo la
mutazione nel paziente che è venuto alla nostra attenzione e
vogliamo vedere che se quella mutazione segrega, con il fenotipo
malattia nella famiglia perché se quella è la mutazione tutti i
pazienti affetti devono avere quella mutazione e tutti i soggetti sani
non devono averla e soprattutto su di una malattia dominante,
quindi oltre alla segregazione nella famiglia valutare se quella
variazione è presente nella popolazione normale, cioè effettuare un
controllo su 100 o 200 cromosomi cioè su 50 100 individui ma
soprattutto per scopi di ricerca. Quindi se abbiamo il quadro di una
famiglia con trasmissione autosomica dominante e abbiamo trovato
questa variazione è ovvio che deve essere presente in tutti i
soggetti affetti, in quanto per definizione dominante è causata da
variazioni presenti in eterozigoti quindi a meno che non ci troviamo
di fronte a casi particolari come penetranza incompleta tutti i
soggetti che hanno la variazione devono essere affetti e tutti i
soggetti sani non devono averla quindi noi possiamo analizzare
quanto più possibile soggetti della famiglia e verificare la
segregazione della mutazione con il fenotipo, ovviamente nel caso
di una malattia recessiva il discorso è un pò diverso, affinché la
variazione di quel gene abbia un ruolo causativo noi dobbiamo
trovare due mutazioni su entrambi gli alleli di questo gene quindi
potrebbe essere o una variazione di in omozigosi o un eterozigote
composto quindi due mutazioni nello stesso gene e i pazienti
devono avere due mutazioni sullo stesso gene e in eterozigoti
potremmo trovare una di queste due mutazioni in altri soggetti della
famiglia (genitori, fratelli etc…) però non dovremmo avere mai le
due mutazioni assieme in quei soggetti non affetti ne tanto meno se
noi troviamo due mutazioni nel gene X in questo individuo affetto
anche il fratello affetto deve avere entrambe le mutazioni quindi se
ne ha solo una vuol dire che quello non è il gene causativo.
Una altro aspetto importante è quello di valutare il tipo di cambio
che noi osserviamo nel DNA perché ovviamente non tutti i cambi di
DNA hanno un effetto deleterio quindi come andare a vedere se
quel tipo di cambio ha maggiori probabilità di causare un effetto
deleterio? Ovviamente se troviamo delle delezioni non senso,
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anomalie frameschift cioè anomalie della cornice di lettura si avrà
una grossa probabilità di un effetto deleterio; mutazioni che cambia
i segni di splicing come le mutazioni nei siti di GT AG che sono la
fine e l’inizio degli introni alterano quasi sicuramente lo splicing
quindi ha un effetto frameshift. Quindi queste sono le mutazioni che
hanno la maggiore probabilità di determinare l’effetto soprattutto
nelle malattie recessive, malattie causate da perdita di funzioni che
hanno un effetto negativo sulla funzionalità della proteina. Se
invece troviamo mutazioni che non corrispondono ai siti di splicing
determinare la significabilità di quel cambio è molto più difficile.
Quindi quando le mutazioni sono gravi che determinano
troncamento della proteina, variazione grave della proteina si ha
una maggiore probabilità di essere causativa. Quando sono
missenso il discorso è diverso perché potrebbero essere tollerate e
a quel punto bisogna valutare quale porzione della proteina cade
quella mutazione quindi ad esempio se cade su di un enzima quindi
cade nel sito catalitico del enzima chiaramente ha maggiore
probabilità di determinare una problematica a carico della funzione
di qual enzima etc…
Un'altra osservazione importante può essere di andare a verificare
se questo aminoacido che viene cambiato con un altro aminoacido,
un'altra cosa da valutare è quella della conservazione
dell’aminoacido, andare a vedere se quella proteina è presente in
altre specie nel corso dell'evoluzione se quell'aminoacido è mutato
è presente costantemente in quella posizione ad es. se una cisteina
che è intatta nel nostro paziente che costantemente presente ci
viene il sospetto che questa cisteina se la cambiamo succede
quelle anomalia. Per il momento questi sono criteri che venivano
utilizzati fino a poco tempo fa in fase di ricerca come identificazione
di nuovi geni perché nella diagnostica si andava mirati ad
analizzare i geni di interesse, poiché tra l’acquisizione del Next
generationi Sequencing la diagnostica potrebbe diventare ricerca
perché potremmo fare diagnosi di nuovi geni in pazienti in cui
vogliamo fare solamente una diagnosi, sarà importante
implementare questi ragionamenti e fare questi tipi di
considerazioni prima di dire a un paziente se la mutazione è
causativa o non causativa.
Vi ricordo anche come ho detto nelle prime lezioni, quando
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andiamo a seguenziare il genoma o l’esoma di ciascuno individuo
troviamo una serie enorme di variazioni quindi non dobbiamo
pensare che troviamo una mutazione frameshift o non-sense in un
paziente e la prima che troviamo questa è la mutazione causativa,
ma dobbiamo considerare che possono essere presenti mutazioni
gravi non-sense in molti geni e queste mutazioni sono tollerate,
quindi sembrano esserci molti geni la cui la non funzione sembra
essere perfettamente tollerata e non sembrano causare delle
malattie severe e magari sembrano essere implicate in
predisposizioni a malattie complesse, in quel caso non c’è un unico
gene che causa la patologia ma potrebbe esserci la
compartecipazioni di più più variazioni di sequenza a carico di più
geni, magari questi Snp non-sense o frameshift a carico di alcuni
geni possono essere implicati nella patogenesi di questa malattia
comunque bisogna tener conto che ognuno di noi può portare nel
proprio genoma più di 200 mutazioni variazioni potenzialmente
dannose. Quindi andare a estrarre, nel caso di un paziente con
malattie genetiche la mutazione causativa, richiede l’integrazione di
varie informazioni quindi non solo la mutazione in se ma come
segrega nella famiglia, che tipo di gene è, il tipo di cambio. Questo
è per il test diretto, quindi quando sospettiamo una malattia
genetica monogenica con mutazioni puntiformi di poche basi
possiamo utilizzare questo test qui.
Il test Biochimico era il test principe fino a pochi anni fa e veniva
utilizzato quando le metodiche molecolari non erano così avanzate
e non si conosceva la sequenza del DNA e quindi si era costretti ad
andare a guardare le conseguenze della mutazioni quindi il test
biochimico veniva utilizzato soprattutto per le malattie metaboliche
soprattutto per deficit biochimici visualizzabili tipo deficit enzimatici
e quindi si analizza la qualità di un prodotto che è a valle del gene,
e la cosa più semplice può essere o il gene stesso quindi la
proteina codificata dal gene stesso magari che è un prodotto
enzimatico la cui mutazione determina una riduzione dell’attività
enzimatica oppure un prodotto della reazione metabolica
determinata dalla funzione di quelle proteina quindi potrebbe essere
un prodotto finale o un catabolita che normalmente dovrebbe
essere escreto non dovrebbe formarsi ma che si viene a formare
perché manca quell’enzima che serve a neutralizzarlo a farlo
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diventare un altro tipo di metaboliti e quindi quel prodotto si
accumula e può essere escreto nelle urine o nel sangue e può
essere visualizzato, quantizzato nel sangue e andando a
quantizzare o l’attività enzimatica di quella data proteina che non
funziona oppure il prodotto catabolico tossico di rifiuto che non si
dovrebbe formare io posso fare la diagnosi. Per varie malattie
metaboliche ad es il dosaggio della fenilalanina viene utilizzato per
fare diagnosi di malattia di Tay-Sachs, una malattia genetica in cui
viene alterato l’enzima che serve a metabolizzare la fenilalanina, la
fenilalanina idrossilasi, quando questo enzima non funziona si ha
un accumulo (la fenilalanina dovrebbe diventare tirosina) di
fenilalanina che può esercitare un effetto tossico e quindi andare a
dosare la fenilalanina nel sangue di questi pazienti ci permette di
fare la diagnosi però oggi, questo può essere un test che viene
utilizzato come screening neonatali e viene fatto su tutti i neonati
perché la diagnosi precoce di questa malattia può determinare una
drammatica differenza nella prognosi di questi pazienti però poi la
diagnosi di certezza deve essere fatto con il test genetico andando
a cercare la mutazione nel gene della fenilalanina idrossilasi, quindi
il test biochimico è usato per casi particolari ma può essere
utilizzato perché velocizza l’analisi e perché ci permette di fare
immediatamente la diagnosi di una malattia metabolica genetica.
Il test Citogenetico è utilizzato quando o sospettiamo anomalie
cromosomiche o anomalie strutturali submicroscopiche e
distinguiamo tre tipi di test: Il Cariotipo, La Fish (Fluorescence in
situ hybridation), Array CGH.
Il Cariotipo abbiamo visto che è la possibilità di visualizzare tutto il
corredo cromosomico di un individuo e ci permette di visualizzare
tutte le 23 coppie di cromosomi di contarle e di verificare la
presenza di tutte anomalie strutturali però con limite che queste
anomalie strutturali deve superare la dimensione di 5 milioni di base
e una delezione al di sotto di 5 milioni di base non riusciamo a
visualizzarla con il cariotipo, quindi il vantaggio del cariotipo è che è
un unico test. Quando sospettiamo una malattia, un alterazione
cromosomica senza un sospetto particolare il cariotipo ci farà
vedere qualsiasi tipo di alterazione cromosomica che c’è se però se
sospettiamo una delezione, un riarrangiamento, al di sotto di 5
megabasi basi una risposta al cariotipo non ci escluderà questa
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diagnosi e dobbiamo pensare a qualcos’altro.
Un test citogenetico che ci permette di visualizzare anomalie di
questo tipo ed è la Fish (Fluorescence in situ hybridization) per
effettuare questo test dobbiamo avere un sospetto diagnostico
quindi non è più come il cariotipo per vedere un’anomalia
cromosomica questo è come il test diretto del DNA, bisogna avere
in mente quale è il sospetto perché la Fish si fa utilizzando una
sonda di DNA specifica che viene marcata in modo fluorescente
quindi questa sonda la possiamo visualizzare nell’ambito del
cariotipo umano quindi andiamo a vedere questa sonda dove si
localizza e se in corrispondenza di questa regione marcata da
questa sonda ci sta qualsiasi tipo di anomalia. Si distinguono vari
tipi di fish a seconda del tipo di sonda da utilizzare, possiamo usare
una Fish con sonda specifica quindi io se si ha il sospetto di una
malattia che sia causata da una delezione in una regione di un
cromosoma io posso utilizzare una sonda specifica per quella
regione, io vado a vedere se nel genoma è presente o no; invece io
posso utilizzare delle sonde più generali per es. posso usare queste
sonde che mi servono come marcatori per es ci sono delle sonde
che riconoscono specificamente le regioni centromeriche dei
cromosomi quindi io poi utilizzo questo magari in contemporanea
un’altra sonda per vedere la distanza di quella sonda rispetto al
centromero che io so che deve essere tolta e vedo se è cambiata,
lo stesso si può fare con il telomero quindi ci sono sonde
telomeriche. Poi ci sono delle sonde che coprono l’intero
cromosoma quindi posso andare a vedere se il cromosoma è più
piccolo o è traslocato in altre regioni. Una sonda locus specifica per
es. se sospettiamo della sindrome di Prader-Willi quindi delezione
di una regione del cromosoma 15q utilizziamo la sonda specifica
per questa regione del cromosoma che è marcata in rosso usiamo
anche in contemporanea una sonda specifica per il centromero del
cromosoma 15 che è marcata in verde, su l’altro cromosoma la
situazione è normale abbiamo sia la regione Prader-Willi che il
centromero, sull’altro cromosoma 15 riusciamo a vedere solo la
sonda per il centromero ma non vediamo la sonda rossa per la
regione Prader-Willi questo ci dice che questo paziente su una delle
due copie del cromosoma 15 ha presente una delezione e questo
ci permette di individuare una delezione all’interno di questa
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regione. La Fish possono essere utilizzate sia per diagnosi di
sindrome di Williams oppure di DiGeorge che che sono
submicroscopiche e al cariotipo non si possono vedere. Nel caso di
una traslocazione usiamo Chromosome specific probes cioè
facciamo una chromosome painting cioè andare a visualizzare tutto
il cromosoma di interesse e lo possiamo fare per tutti i cromosomi.
In questo caso qua abbiamo marcato il cromosoma 10 con il verde
dove un cromosoma è a posto ma il resto del segnale verde non è
localizzato su un unico cromosoma come dovrebbe ma è diviso in
due parti, una parte che continua con un cromosoma e un’altra
parte che continua con un altro cromosoma che è il cromosoma 9
quindi in questo caso possiamo fare diagnosi di traslocazione di
parte del cromosoma 10 sul cromosoma 9. Quindi questa è un’altra
metodica che può essere utilizzata per questo tipo di anomalie.
Poi c’è una tecnica più avanzata che si chiama Comparative
Genomic Hybridization che si fa anche questa con l’Array cioè con
un microcip, quindi il solito vetrino di 1 cm² e si va a immobilizzare
su questo vetrino delle sonde di DNA che coprono tutto il genoma e
possono essere o grossi cloni genomici, o degli oligonucleotidi che
sono sparsi e rappresentano tutto il genoma, a questo punto si fa
l’ibridazione con il DNA genomico del paziente e si va a quantizzare
il segnale, si fa con una un ibridizione di fluorescenza e il computer
a seconda dell’intensità del segnale potrà valutare la quantità di
DNA che si è andato a legare a queste sonde e in questo modo
potrebbero essere visualizzati dei riarrangiamenti molto piccoli che
sono troppo piccoli per essere visti sia al cariotipo che alla fish ma
troppo grandi essere visto dalla Next generation sequencing
perché con quest’ultima le sequenze che si ottengono sono
sequenze di massimo 100 paia di basi che poi devo essere unite
l’una all’altra, assemblate, quindi se io ho una delezione di un intero
gene, una delezione di 2Kb che porta via un intero gene io quella
delezione non riuscirò a vederla per Next generation sequencing
però potrò vederla con questa tecnica qui perché si ibrida il vetrino
con il DNA del paziente e il risultato che si ottiene è la
quantizzazione della fluorescenza che dirà quale è l’intensità di
segnale di ibridazione per ogni regione del DNA. Nel caso in cui io
abbia una delezione di quella regione io avrò un segnale che è il
50% inferiore rispetto alla norma e lo potrò visualizzare, quantizzare
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facilmente tramite sistemi computerizzati quindi potrò dire che
questa regione corrisponde ad una delezione e potrò dire che andrà
da posizione x a posizione y per tot numero di basi. Al contrario se
avrò una duplicazione di questa regione avrò un segnale che è il
doppio rispetto a quello del patrimonio diploide, quindi potrò fare
diagnosi di duplicazione e di delezioni anche per regioni molto
piccole. Questa è una metodica che sta sostituendo l’uso della Fish,
il cariotipo rimane sempre utile perché è una metodica poco
costosa e può dare un risultato ottimale. Mentre per le altre
situazioni sub caritipiche, dove il craiotipo non può andare a
diagnosticare, si preferisce ad andare ad usare la RGCH anzi
questa metodica potrebbe essere una scelta primaria prima di
arrivare a fare una Next Generation Sequencing su di un paziente
che presenta una malattia genetica di cui non sappiamo quale
possa essere il gene la prima cosa che si può ad andare a
visualizzare è vedere se ci sono anomalie cromosomiche
microscopiche che possono spiegare quella data malattia. Anche
qui nel caso della next generation sequencing bisogna fare
attenzione perché molte degli arrangiamenti delle alterazioni che
noi possiamo riscontrare possono essere presenti nella
popolazione normale ad es. come nella CNB che sono variazioni
del numero di copie di una certa regione che sono presenti nella
popolazione normale, quindi non è sufficiente trovare una qualsiasi
alterazione per dire questa è la diagnosi, questa è la variazione
responsabile, dobbiamo fare qui quel ragionamento che è stato
fatto per quanto riguarda l’interpretazione delle mutazioni puntiformi
vedere come segrega quella delezione nel ambito della famiglia se
il paziente ha uno dei genitori che ha quella stessa delezione ma i
genitori non hanno nessun problema è chiaro che è più difficile che
la variazione può essere causativa, se quella variazione è presente
nel 5% della popolazione la si tende ad escludere come variazione
causativa.
Ultimo aspetto del test genetico è che queste tecniche possono
essere effettuate sia su soggetti adulti, ragazzi cioè in epoca post
natale ma possono essere utilizzati anche in epoca prenatale quindi
si può fare un test prenatale con le stesse tecniche e cioè sia
l’analisi diretta del DNA che l’analisi citogenetica.
Per le tecniche prenatali sono previste due metodiche:
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l’Amniocentesi e il Prelievo dei Villi Coriali che si distinguono sia per
la modalità di effettuazione che per il periodo di gravidanza in cui si
possa effettuare. Per quanto riguarda l’Amniocentesi prevede una
piccola quantità di liquido amniotico che viene eseguita in genere
alla 16° settimana di gravidanza dove vengono estratte cellule da
cui si può estrarre il DNA o si possono effettuare tecniche
citogenetiche effettuando il cariotipo o la Fish oppure l’array-CGH si
possono effettuare nel periodo prenatale tramite l’amniocentesi,
quindi entro la 16° settimana. Ancora più precocemente si può
effettuare il prelievo dei Villi Coriali che viene eseguita tra la 9/12°
settimana anche questo prelievo può si può utilizzare le tecniche
sia di citogenetica che molecolari.
Come ultimo argomento, emergente negli ultimo anni è il discorso
del MicroRNA orientato verso la patologia in quando hanno un ruolo
orientato verso un importanza biologica quindi possono avere un
ruolo causativo in genetica quindi nei prossimi anni dobbiamo
pensare che possono essere geni responsabili non solo per
codificare proteine ma anche geni non codificanti tra cui soprattutto
i microRNA.
Come detto all’inizio non c’è correlazione tra il numero di geni
codificanti per proteine e la complessità evolutiva di una specie ma
una grossa sorpresa è stata rappresentata da fatto che la
componente non codificante sembra correlare la quantità, la
proporzione di RNA non codificante presente all’interno di un dato
trascrittoma sembra correlare con la complessità della specie come
nel caso del uomo una buona fetta del genoma è costituito da
regioni che codificano per RNA non codificante.
Esistono due grosse categorie di RNA non codificanti, la prima
categoria è quella che è già nota da tempo detti Housekeeping cioè
svolgono funzioni di base come RNA ribosomiale o transfer cioè
RNA che svolgono funzioni di base nell’ambito della sintesi proteica
e sono presenti in tutte le cellule allo stesso modo non ci sono
differenze quindi svolgono funzioni fondamentali ma non variano a
seconda del tipo di cellula.
Quello che è cambiato negli ultimi anni è il riconoscimento di nuovi
tipi di RNA codificanti che sono gli RNA non codificanti di tipo
regolatorio, regolatorio perché svolgono un ruolo nella regolazione
dell’espressione che varia a seconda del tessuto della cellula in cui
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sono espressi quindi non sono espressi in tutte le cellule ma
possono avere delle modalità di espressione diverse, un pò come
gli RNA codificanti per le proteine, come appunto i microRNA anche
se esistono altri RNA come i Long Promoter RNA che presentano
anche un ruolo importantissimo in biologia che in patologia.
I MicroRNA sono degli RNA non codificanti molto corti 20/25
nucleotidi che svolgono la loro funzione principalmente andando a
legare delle sequenze specifiche dei loro geni target, quindi ogni
microRNA può legare uno o più geni target e questo legame può
essere un legame completo, come avviene nelle cellule vegetali,
che determina il taglio del RNA messaggero. Nelle cellule animali
quello che succede è che c’è un’appaiamento incompleto tra il
microRNA e la sequenza bersaglio e questo appaiamento può
avere due conseguenze o la riduzione dell’efficienza di traduzione
del RNA messaggero bersaglio oppure la degradazione del RNA
messaggero. Quindi in ogni caso sia che si tratti di un effetto a
livello di trascrizione che è l’effetto della traduzione di questo RNA
messaggero l’effetto è di inibire l’espressione del gene bersaglio
quindi il microRNA agisce diminuendo l’espressione del gene
bersaglio sia perché determina una riduzione dell’attività di
traduzione perché può determinare una riduzione del trascritto, una
cosa interessante è che questo sito di legame è classicamente
presente nel 3′ non tradotto degli RNA messaggeri presenti ai siti di
bersaglio per i microRNA, quindi questa era una regione che fino a
poco tempo era considerata una regione con significati incerti
invece ora sappiamo che è regolata da microRNA e posseduta dal
3′ non tradotto. Ci sono delle evidenze che non solo i 3′ non tradotto
hanno ospiti di siti target ma che possono essere presenti negli
esoni codificanti o nel 5′ non tradotto.
Come il microRNA maturo, la sequenza completa, di 20-25
nucleotidi si va a legare al suo target nel 3′ non tradotto insieme a
un complesso proteico ed è questo legame che determina la
diminuzione dell’espressione del gene bersaglio, grazie a questo
sistema si sa già che i microRNA hanno ruolo importante nella
funzione dei vari organi e tessuti per es. nello sviluppo del cervello,
della cute, dei polmoni, dell’occhio e così via...
I microRNA di tipo regolatorio non sono Housekeeping quindi
possono avere un espressione diversa a seconda del tessuto quindi
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ci sono dei microRNA, quindi si comportano come dei geni
codificanti per proteine, quindi avremo il microRNA che sarà
espresso ubiquitariamente in tutte le cellule dell’organismo ma
avremo anche dei microRNA che sarà espresso specificamente in
un certo tessuto o un certo tipo cellulare. Questi sono alcuni
microRNA espressi negli occhi, questo è un esperimento di
ibridazione visivo per RNA, si prende una sonda di RNA,
microRNA, si marca in modo fluorescente e si ibrida sezioni di
tessuto che ci interessa, se ci fermiamo solamente qui solo dove
abbiamo la retina adulta, di topo, questo è formato da 3 tipi di strati,
questo strato qui che corrisponde a tre tipi diversi di neuroni,
abbiamo i fotorecettori, interneuroni e poi le cellule gangliari quindi
vedete che ognuno di questo tessuto ha un microRNA diverso e
hanno modalità diverso di espressione, questo microRNA sarà
espresso in tutti e tre i tipi di neuroni della retina, quest’altro
soltanto nei fotorecettori e quest’altro soltanto nelle cellule gangliari
e così via... e rispecchiano possibili funzioni diverse. Dal momento
che sappiamo qual’è la funzione dei microRNA che è quella di
legare i geni target, quando noi lavoriamo su un gene codificante
per proteina la prima cosa si vede è che tipo di sequenza ha e
quale può essere la funzione di quella proteina, che tipo di domini
proteici quindi a che cosa è simile, nel caso dei microRNA vogliamo
vedere quali sono i target che questo microRNA può legare perché
è quello che da l’idea della funzione del microRNA e per identificare
i target c’è un modo che è data dalla struttura stessa della
sequenza dei target quindi si possono identificare i target grazie
all’analisi della sequenza dei microRNA in comparzione dei 3′ non
tradotti di tutti i geni del genoma perché vogliamo andare a vedere
delle regioni di appaiamento. Il problema è che questo appaiamento
non è completo, è una regione di appaiamento incompleto, nelle
cellule animali questo appaiamento non è mai perfetto e questo
complica l’identificazione dei siti di bersaglio. C’è una regione del
legame che è sempre identica, cioè c’è un perfetto appaiamento e
questo corrisponde alle prime 7 basi del microRNA, quindi le prime
7 basi del microRNA vanno ad appaiarsi in modo perfetto ad
altrettante basi del 3′ non tradotto del gene bersaglio e questa
regione si chiama SEED ed è la regione che ci permette di fare
predizioni di target per microRNA. Ci sono vari sistemi computistici,
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computazionali, che permettono di andare a predire questi siti di
target basandosi sulla presenza del SEED che corrisponde alle
prime 7 basi del microRNA. Grazie a dei programmi possiamo fare
delle predizioni sul tipo di traget di un microRNA ma proprio per la
natura stessa del sito di target molte di queste predizioni sono false,
quindi quando avremo una predizione di un target da parte di un
microRNA dobbiamo andarli a convalidarli con metodi sperimentali.
Abbiamo detto prima che il sito di legame di un microRNA al suo
target può avere un duplice effetto, uno che è quello di Abbassare
l’Efficacia di Traduzione e questo è primo meccanismo che è stato
trovato, fino a pochi anni fa si pensava che il meccanismo di azione
del microRNA fosse quello di determinare una riduzione di efficacia
della traduzione del messaggero, negli ultimi anni è venuto fuori il
secondo sistema che è quello della Degradazione del trascritto e
questo ha permesso di semplificare lo studio delle conseguenze di
un azione di un microRNA perché è molto più facile verificare un
effetto di un microRNA andando a guardare i livelli dei suoi
possibili trascritti piuttosto che andare a guardare una proteina che
richiede da un punto di vista di tecnica delle indagini molto più
complesse, ciò ha permesso di studiare l’effetto di microRNA
guardando proprio l’effetto, la composizione e i livelli di espressione
degli RNA messaggeri all’interno di una cellula. Vi voglio fare un es,
di come è stato studiato il ruolo di un microRNA guardando gli
effetti sulla trascrizione, i livelli di trascritti del un messaggero in una
cellula e grazie a questo sistema è stato identificato il ruolo di
microRNA nel processo di sviluppo e differenziamento cellulare,
l’esperimento è molto semplice è stata presa una linea cellulare
immortalizzata, utilizzata in modo standard in laboratorio e si
chiamano cellule HeLa, e si è testato l’effetto su questa linea
cellulare di due microRNA diversi e nessuno di questi due
microRNA era presente nella cellula “selvatica”, uno è il microRNA
chiamato miR-1, questo miR-1 viene espresso specificamente nel
muscolo e nel cardiomiocito in contemporanea si è testato un altro
microRNA che è il miR-124 specifico per le cellule neuronali, quindi
alcune cellule HeLA sono state trattate con miR-1 e altre con miR124 e si è andato a vedere l’effetto di questa trascrizione tramite
esperimenti di macro Array ma in questo caso il macro Array era
disegnato apposta per andare a vedere i livelli di RNA messaggero
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presenti in queste cellule, quindi su questo macro Array erano
presenti una parte di RNA messaggeri che noi conosciamo e si è
visto che cosa succede prima e dopo la trascrizione di questi miR.
Si è visto che c’è una grossa alterazione di queste cellule HeLa e
quando si andava a sovraesprimere miR-1 si aveva un attivazione
dei geni muscolari che normalmente nelle HeLa non sono
espresse, quando si andava a sovra esprimere il miR-124 si aveva
un attivazione dei geni neuronali quindi si determinava un grosso
cambio della struttura del trascrittoma di queste cellule, ma se i
microRNA inibiscono i loro target come è che si osserva una
regolazione in questo caso? Quello che va a fare il microRNA è
quello di inibire l’espressione di inibitori dell’espressione di questi
geni che si up-regolano, quindi i target diretti sono dei geni che
normalmente dovrebbero inibire l’espressione o dei geni muscolari
o neuronali e quando vado a trascrittare i microRNA io inibisco
questi geni e come ultimo effetto ho la up-regolazione e l’attivazione
di geni neuronali e di geni muscolari, quindi questo è stato uno dei
primi esempi che ha dimostrato come un singolo microRNA un
frammento di 20 nucleotidi ha un effetto così importante sul destino
di una cellula. Quindi i microRNA hanno un ruolo importante sia
nello sviluppo che nel differenziamento di tessuti sia i vivo che in
vitro, ma hanno anche importanza per la funzione di tessuti maturi e
qui che entra il discorso della malattia perché addirittura se io vado
a mutagenizzare quindi a interferire con la funzione dei microRNA
anche in organismi adulti, in età postnatale posso avere delle
grosse alterazione nei tessuti maturi. Per es questo microRNA il
miR-375 controlla la secrezione dell’insulina da parte delle isole
pancreatiche quindi se è inattivo questo microRNA posso avere un
effetto proprio a carico della funzione delle cellule pancreatiche
delle cellule di Langherans quindi con possibilità di avere una
condizione di simil-diabete; e lo stesso anche un inattivazione
sempre di microRNA miR-1, in una fase più tardiva, in topi adulti
determina un problema cardiologico visualizzabile con un anomalia
della condizione cardiaca che si può riflettere in un alterato
elettrocardiogramma, quindi non solo importanti processi dello
sviluppo ma anche funzionamenti di tessuti maturi.
Ovviamente data questa importanza i microRNA possono essere
implicati nella patogenesi di malattie genetiche quindi a partire già
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dal cancro, malattie monogeniche, malattie multifattoriali. Il cancro è
stato una delle prime condizioni in cui è stato riscontrato un ruolo
patologico dei microRNA e anzi è stato visto che livelli di
espressione di microRNA sono alterati in molti tipi di cancro,
adesso vengono utilizzati microRNA come marcatori di alcuni tipi
particolari di cancro perché il profilo di espressione di questi
microRNA sono alterati in queste cellule e in modo specifico in
determinati tipi di cancro e non in modo casuale. Quindi i microRNA
possono essere utilizzati per fare addirittura lo studio dei livelli,
determinare il tipo cellulare di cancro, la stadiazione, la prognosi e
la possibile risposta dalla terapia. Quindi possono essere utilizzati
sia come marcatori per valutare la migliore o peggiore prognosi e
possibile risposta a terapia ma poi possono avere anche un ruolo
anche nella patogenesi del cancro quindi possono addirittura
comportarsi da oncogeni o tumor suppressor, possono comportarsi
da regolatori per l’espressione di un oncogene quindi il target di un
microRNA è un oncogene che ovviamente deve essere tenuto sotto
controllo. Se per caso in quel tipo di tumore si ha una mutazione
somatica che prevede la delezione di quel microRNA che
normalmente dovrebbe controllare l’espressione dell’oncogene quel
oncogene può essere espresso in quantità incontrollata e quindi
può determinare la formazione di tumori, quindi in questo caso il
microRNA non effettua più la sua funzione di soppressore del
fenotipo neoplastico. Viceversa si può avere microRNA che
modulano l’espressione tumor suppressor di geni che esercitano
un’azione negativa sulla proliferazione cellulare, se quel microRNA
viene ad essere prodotto in eccesso può avere un effetto di
eccessiva inibizione del tumor suppressor miR quindi può
comportarsi come un oncogene miR. Esistono esempi di questo
tipo dove dei microRNA possono comportarsi da oncogene come
nel caso di un gruppo di microRNA 17-92 che si presentano di
livello aumentato in molte forme di cancro comportandosi come
oncomiR. Esiste anche il caso opposto dove i microRNA si
comportano come suppressor del fenotipo tumorale e si ipotizza
che alcuni microRNA si possano usare come agenti terapeutici per
la modulazione del fenotipo tumorale.
Il ruolo dei microRNA nelle patogenesi di malattie genetiche, si
possono ipotizzare tre meccanismi: i primi due sono uguali a quello
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dei geni codificanti per proteine, il terzo è un pò diverso. Dunque
come può essere mutato un microRNA e determinare una malattia
genetica? Il primo caso è quello di un riarrangiamento genomico
cioè una delezione del microRNA quindi la regione genomica di cui
è ospitato il microRNA viene ad essere deleta e si ha malattia
genetica come l’esempio nelle cellule germinali possiamo avere lo
sviluppo della malattia che ritrasmette in modalità autosomica
dominante che si chiama Sindrome di Pain Word che è una malattia
dello sviluppo caratterizzata dalla delezione del intero cluster dei
microRNA. Quindi mutazioni di questi microRNA possono causare
malattie genetiche allo stesso modo come possono fare quelli
codificanti per proteine.
Gli arrangiamenti genomici che colpiscono i microRNA possono
essere più numerosi di quello che si ipotizza.
Secondo meccanismo Mutazione puntiforme a carico del
microRNA, cosi come abbiamo mutazioni puntiformi per geni
codificati proteine si possono avere mutazioni nella sequenza di
microRNA ad esempio come una forma di sordità non sindromica
cioè una sordità di tipo ereditaria che si può trasmettere in modalità
autosomica dominante e la mutazione che causa questa malattia è
una mutazione di una base all’interno della regione della sequenza
matura di un microRNA chiamato miR-96, quindi anche nutazioni
puntiformi di microRNA possono causare malattie genetiche.
Ultimo caso Mutazioni Non nel microRNA ma nella sequenza di
bersaglio del microRNA, la mutazione può essere a carico di un sito
di target che già esiste ma la mutazione o la può far ridurre
l’efficienza di target di questa regione o di aumentare la capacità di
legami con microRNA e questa è praticamente un inibizione
fisiologica che normalmente c’è che però può essere alterata. In un
altro caso che ci può essere una mutazione che determina la
comparsa de novo di un sito di target e questo è interessante
perché non è un sito di target per un microRNA che non dovrebbe
esserci e fa si che quel gene venga riconosciuto microRNA a cui
non dovrebbe avere nulla a che fare.
Nel primo caso possiamo avere un alterazione di un inibizione
fisiologica dove abbiamo una malattia che è un altra forma di
malattia dello sviluppo la condrodisplasia un alterazione della
crescita ossea e delle cartilagini che è dovuta alla mutazione del
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sito di bersaglio per un microRNA che è il primo non tradotto di
questo gene HDAC-6 che è un gene implicato nella formazione di
alcune modifiche istoniche e la mutazione del 3′ non tradotto di
questo gene determina la comparsa di questa condizione legata al
cromosoma X dominante che si chiama appunto condrodisplasia.
Gli RNA modificanti in generale rappresentano una componente
fondamentale del trascrittoma umano, al loro interno i microRNA
svolgono un ruolo importantissimo nel controllo di sviluppo e
differenziamento ma anche per il funzionamento di organi maturi
ma possono avere un ruolo etiopatogenetico in malattie genetiche
tipo cancro che malattie genetiche mendeliane.
I microRNA possono essere usati come marcatori prognostici sia
nel caso del cancro che in altre malattie genetiche come la distrofia
muscolare dove livelli di alcuni microRNA, che sono altamente
essere espressi nel muscolo, possono essere dosati nel sangue per
riconoscere la gravità della degenerazione muscolare. In ultima
analisi, ma come discorso futuro, possono essere usati come agenti
terapeutici dove possono interferire in varie funzioni sia inibendo
che attivando alcuni microRNA avendo un ruolo benefico contro
malattie genetiche.
Per quanto riguarda il ruolo di microRNA e malattie genetiche
quello che sappiamo oggi è solamente una punta di un iceberg
perché i microRNA sono conosciuti da pochi anni, poi grazie alle
tecniche di sequenziamento sarà sempre più facile verificare
variazioni, mutazioni che prima non sono state studiate.
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