Strategie biotec per l’incremento di resistenza alle malattie Come si difendono le piante dai patogeni? Difese costitutive: -barriere strutturali: es., cuticola, periderma, parete cellulare -metaboliti secondari tossici Difese indotte: - risposta locale: induzione di una serie di reazioni metaboliche al sito di infezione mirate a bloccare l’ingresso del patogeno -risposta sistemica (Resistenza sistemica acquisita, SAR) Strategie usate per produrre piante transgeniche Strategia 1: interferenza diretta con la patogenicità o inibizione della fisiologia del patogeno Strategia 1a – difesa costitutiva (inserire geni codificanti proteine antimicrobiche) Strategia 1b –difesa indotta (è una variante della strategia 1a dove le proteine antimicrobiche sono controllate da un promotore inducibile) Strategia 2: regolazione della naturale risposta di difesa indotta Strategia 2a: Modifica del sistema di riconoscimento del patogeno (es. geni R) Strategia 2b: Modifica delle vie di regolazione a valle (es. SAR) e fattori di trascrizione Strategia 3: “Pathogen mimicry” o vaccinazione genetica o resistenza indotta. Consiste nella manipolazione della pianta per indurre il riconoscimento di uno specifico patogeno attraverso sequenze derivate dal patogeno. Collinge et al. Eur J Plant Pathol (2008) 121:217–231 I geni più comuni inseriti in piante coltivate e di cui si stanno effettuando prove di campo negli USA Collinge et al. Annu. Rev. Phytopathol. 2010. 48:269–91 Strategia 1a – constitutive defence Resistenza agli insetti Mais resistente alla piralide tramite la proteina Bt Esempio di: •Unica pianta transgenica coltivata in Europa •Implementazione dell’espressione Strategia 1a – constitutive defence Strategia 1a – constitutive defence Proteine PR Families PR-1 Type member Tobacco PR-1a Properties antifungal PR-2 Tobacco PR-2 b-1,3-glucanase PR-3 Tobacco P, Q chitinase type I,II, IV,V,VI,VII PR-4 Tobacco 'R' chitinase type I,II PR-5 Tobacco S thaumatin-like PR-6 Tomato Inhibitor I proteinase-inhibitor PR-7 Tomato P69 endoproteinase PR-8 Cucumber chitinase chitinase type III Tobacco 'lignin-forming PR-9 peroxidase' peroxidase PR-10 Parsley 'PR1' 'ribonuclease-like' PR-11 Tobacco 'class V' chitinase chitinase, type I PR-12 Radish Rs-AFP3 defensin PR-13 Arabidopsis THI2.1 thionin PR-14 Barley LTP4 lipid-transfer protein PR-15 Barley OxOa (germin) oxalate oxidase PR-16 PR-17 Barley OxOLP Tobacco PRp27 'oxalate oxidase-like' unknown Fusariosi della spiga: Fusarium head Blight (FHB) Malattia causata da Fusarium graminearum e altre specie del genere Fusarium spp. Metodo biolistico – co-bombardamento pAHCBarChit + pAHC25 in embrioni immaturi pAHCBarChit: plasmide contenente un gene di chitinasi classe II (PR-3) di orzo T nos: terminatore della nopalina sintasi di A. tumefaciens uidA: gene per la β-glucuronidasi (GUS) di Escherichia coli Bar: gene per la phosphinothricin acetyltransferase (PAT) di Streptomyces hygroscopicus Selezione, rigenerazione e trasferimento in terreno delle piante T 0 Esperimenti di infezione Frumento-Fusarium graminearum Esperimenti di infezione Frumento-Fusarium graminearum % infected spikelets NS T Days post-infection Strategia 1a– (Detossificazione delle tossine) Phytotoxicity of eight mycotoxins associated with the fusariosis of wheat spikelets. Eudes, F.; Comeau, A.; Rioux, S.; Collin, J. Canadian Journal of Plant Pathology 2000 Vol. 22 No. 3 pp. 286-292 The study of eight mycotoxins from Fusarium spp. at concentrations ranging from 0 to 4.3 mg/L for deoxynivalenol, 3-acetyldeoxynivalenol, nivalenol, and a culture filtrate, and from 0 to 14.3 mg/L for T2 toxin, HT2 toxin, diacetoxyscirpenol, and zearalenone, demonstrate that trichothecenes are phytotoxic. The inhibition of coleoptile elongation by each trichothecene is well described by a linear equation and these compounds show differences in phytotoxicity. Deoxynivalenol and 3-acetyldeoxynivalenol are 2.5 times more toxic than T2 toxin, 8 times more toxic than HT2 toxin, and 13 times more toxic than diacetoxyscirpenol. The culture filtrate, which contains deoxynivalenol and 3-acetyldeoxynivalenol, is the most toxic to the coleoptile. A mixture of four purified trichothecenes, deoxynivalenol, 3-acetyldeoxynivalenol, T2 toxin, and nivalenol, revealed differences in trichothecene susceptibility among 11 wheat cultivars. Moreover, reduction of coleoptile elongation of these cultivars was correlated with scab susceptibility (r=0.74; P=0.0068). Strategia 2a – Detection of pathogen Strategia 2a Strategia 2b – Induced defence regulation Infezione su spiga con F. graminearum Trattmento sulla foglia Trattmento sulla foglia NH1 (NPR1 di riso) sotto il controllo del promotore Ubi1 di mais induce una espressione costitutiva dei geni PR Nuove Strategie Nuove Strategie PGIP Strategia 3 Resistenza indotta Resistenza ai virus Virus del mosaico del tabacco Resistance to tomato spotted wilt virus in transgenic tomatoes (left) due to the insertion of a viral gene. Control plants are on the right. (Courtesy T. German) T C Il controllo delle malattie virali è difficile, in genere si controllano gli organismi che ne consentono la diffusione (es. afidi, ma l’uso degli insetticidi ha un impatto limitato nel controllo della diffusione della malattia) o più efficacemente si attuano controlli colturali (rimozione delle piante malate o uso di varietà resistenti/tolleranti) Osservazione chiave: Protezione crociata - 1972: l’inoculo di una pianta con un ceppo virale non molto virulento di TMV si otteneva la protezione contro una successiva infezione con un ceppo virale molto virulento. Quasi tutti i virus esprimono proteine dei seguenti tre tipi: • Proteine di rivestimento (Coat proteins, CPs); • Proteine di movimento (Movement proteins, MPs); • Proteine per la replicazione I meccanismi di difesa naturali delle piante sono diretti verso questi target e verso il genoma virale. La resistenza delle piante ai virus può essere divisa in: • Resistenza mediata da proteine virali • Resistenza mediata a livello di DNA/RNA L’approccio transgenico da intraprendere dipende dal tipo di virus da combattere: • RNA virus • DNA virus • RT virus. Virus ad RNA: Le prime piante transgeniche Es. Virus del mosaico del tabacco (Tobacco mosaic virus, TMV). - 1972: prima osservazione: l’inoculo di una pianta con un ceppo virale non molto virulento si otteneva la protezione contro una successiva infezione con un ceppo virale molto virulento. Protezione crociata • Varietà di zucchine e papaya resistenti a virus in commercio Virus a DNA: Non ci sono piante coltivate in commercio ma solo dati sperimentali contro i geminivirus in pomodoro, cassava e mais. Possibili meccanismi per la resistenza mediata da RNA contro i virus a DNA: 1) Silenziamento dei trascritti di mRNA (PTGS) 2) Metilazione del DNA virale (inattivazione trascrizionale, TGS) RT virus (Reverse transcribing viruses): solo resistenza incompleta (es. Rice tungro bacilliform virus. Solo riduzione del titolo virale esprimendo la CP e RNA ripetuto invertito Come funziona la resistenza indotta nelle piante GM? Sovraesprimendo nella pianta una proteina del virus (in genere la proteina del capside) si induce un processo noto come cosoppressione genica In caso di infezione la cellula vegetale transgenica “percepisce” che un gene è sovraespresso e risponde bloccando l’espressione del transgene e virale Strategia nota anche come Resistenza virale mediata dalla proteina del capside Silenziamento genico nelle piante “Cosoppressione” (RNAi di un gene endogeno indotta da una insezione di un transgene) originalmente descritta in una petunia transgenica in cui desiderava sovraesprimere la calcone sintasi (CHS), un enzima per la biosintesi delle antocianine (Jorgensen et al, Plant Cell 1990 2:279). 35S CHS cDNA promotore Processo che determina la downregulation di un gene •a livello della trascrizione (TGS)(es. trasposoni, geni retrovirali, eterocromatica) •o post-trascrizionale (PTGS)(dopo la trascrizione di un gene) Esistono due meccanismi correlati basati sull’RNA che determinano il silenziamento genico nelle piante : 1) RNA interference (RNAi): degradazione dell’mRNA 2) Metilazione del DNA controllata dall’RNA (RNAdirected DNA Methylation, RdDM): soppressione della trascrizione Meccanismo generale dell’ RNAi RNA a doppia elica dicer ribonucleasi siRNAs RISC Degradazione del trascritto Meccanismo generale dell’ RNAi RNA a doppia elica dicer ribonucleasi siRNAs RISC Degradazione del trascritto Fattori scatenanti l’RNAi nelle piante 1) Infezione con un virus a RNA che contiene un segmento della sequenza genica target replication dicer 2) Integrazione di un transgene ripetuto invertito fortemente trascritto transcription dicer 3) Trascrizione elevata di transgeni ripetuti non-invertiti transcription ? dicer RNAi fornisce una difesa contro virus e sequenze trasponibili, ma si è anche evoluto come meccanismo per produrre micro-RNAs (miRNAs) da sequenze endogene che regolano l’espressione genica durante lo sviluppo disturbando la stabilità o la traduzione dell’ mRNA target. From: Lodish et al. “Molecular Cell Biology” RNA a doppia elica o siRNAs scatenano la metilazione del DNA (RdDM) RNA aberrante priming RdRP, etc. ds RNA dicer ribonuclease siRNAs RISC Degradazione del trascritto animazione