ErbLab 5 - Espt Biosaggi Batteri 01-12-2016

Scienze Erboristiche 2016
Patologia vegetale
Lab 5 – Esperimento - BIOSAGGIO CON BATTERI
1. INTRODUZIONE
La difesa della pianta dall’attacco dei patogeni è dovuta alla Resistenza – la capacità di una pianta ospite di
annullare o ridurre l’attività di un patogeno. Quando l’interazione tra ospite e patogeno è Compatibile la pianta non possiede nessun gene di resistenza contro il patogeno e sviluppa la malattia. Se invece,
l’interazione è Incompatibile – c’è mancata infezione, e non si sviluppa la malattia.
Nel caso della Resistenza (verticale o qualitativa), che deriva da un “riconoscimento” tra pianta e patogeno,
e l’interazione è incompatibile, si manifesta nella maggior parte dei casi, con la Reazione/Risposta di
Ipersensibilità (RI) o Hypersensitive Reaction (HR) quando la pianta sacrifica alcune cellule per la sua
sopravvivenza. La necrosi del tessuto vegetale nella zona della penetrazione del patogeno riesce a
bloccare l’avanzamento dell’invasione e la colonizzazione, fermando il processo di patogenesi.
2. Obiettivo:
 Valutare la risposta della pianta (foglie di tabacco) all’infiltrazione con il batterio patogeno, una patovar
di pomodoro .
 Osservare gli effetti nell’interazione incompatibile, che determina la reazione di ipersenbilità (RI).
3. Materiale
a. Inoculo
1) Batterio - Pseudomonas syringae pv. tomatine (PST; patogeno del pomodoro)
- già pronta la sospensione di cellule (=coltura pura); concentrazione di 1x107 cellule/ml
2) Acqua (non-patogeno)
b. Pianta ospite: tabacco Nicotiana tabacum (diverse varietà)
Due foglie per ogni esperimento, tenute separate per l’inoculazione con:
Trattamento 1 - il patogeno (batterio), e
Trattamento 2 - l’acqua (non-patogeno)
c. Materiale del Laboratorio
i. Tubi di plastica ca. 10 ml, e Portatubi
ii. Bunsen, alcool - piano di lavoro ben pulito con l’alcool
iii. Pipette mono-uso
iv. acqua sterile
v. Parafilm
vi. Bisturi
vii. Siringhe 1 ml (senza ago)
viii. Carta per le mani
4. Metodo
a. Preparazione sospensione di batteri (già pronta)
- Coltura batterica crescita in substrato liquido
- Preparare la concentrazione delle celle di 1x107 cellule/ml
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Patologia vegetale
b. Preparazione del materiale vegetale
- Tagliare le foglie mature dalla pianta di tabacco, lasciando il picciolo lungo
-
Riempire il tubo pieno d’acqua (colmo al bordo).
-
Immergere la foglia tagliata nell’acqua, e attentamente sigillarla in posizione nel tubo con la
striscia di parafilm (una pellicola di cera).
c. Infiltrazione della foglia con l’inoculo
i. Prendere due siringhe (togliere l’ago), e su ognuno segnare con un pennarello il trattamento “PST” o
“A” (Acqua). Non mescolare i trattamenti!
- Nella siringa PST (senza ago!), aspirare 0.1-0.2 ml della sospensione del batterio patogeno.
- E nell’altra siringa A, aspirare 0.1-0.2 ml dell’acqua (non-patogeno).
ii. Togliere l’aria dalla siringa prima di fare l’infiltrazione.
-Tenere la siringa in posizione verticale, con la punta verso il soffitto. La bolla d’aria salirà fino alla
punta. Premere il pistone leggermente per fare uscire la bolla d’aria dalla punta, con un poco del
liquido.
iii. Con attenzione, fare un piccola puntura sulla foglia con l’ago, in una posizione intervenale.
iv. Mettere il dito sotto la foglia di tabacco in corrispondenza apposto del buco.
v. Poggiare leggermente la siringa A con l’inoculo sopra il buco, e lentamente premere l’inoculo della
siringa per fare l’infiltrazione del liquido nel tessuto fogliare.
- Deve apparire una macchia “bagnata” nella foglia se sta entrando il liquido bene.
- Segnare con un pennarello sulla foglia, il bordo intorno la macchia, con l’indicazione del
trattamento eseguito.
- Ripetere le altre infiltrazioni nella foglia (2-4 punti a distanza)
Ripetere con l’altro trattamento (siringa PST) sull’altra foglia di tabacco.
Portare via con attenzione le foglie trattate -tubo.
d. Dopo 24 ore, fare l’osservazione dei punti di infiltrazione sulla foglia.
- Il batterio è considerato patogeno, se determina un collasso dei tessuti vegetali infiltrati e formano
le lesioni (sintomi) crescente in grandezze col tempo (va avanti la malattia).
- Se successivamente necrotizzano le lesioni (grandezze iniziale), mostrano la reazione di
ipersensibilità che blocca la malattia.
- Effetto con l’acqua?
Mandare le foto dei risultati a [email protected]
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