metodi di base per l`analisi degli acidi nucleici

METODI DI BASE PER L’ANALISI DEGLI
ACIDI NUCLEICI
SPETTRI UV E QUANTIZZAZIONE
SPETTROFOTOMETRICA DEGLI ACIDI
NUCLEICI
FIGURA 7.6A METODOLOGIA BIOCHIMICA
(WILSON)
a1
a
a = a1
Assorbimento = a - b
b
FIGURA 10.12 MONDUZZI
FIGURA 5.17A STRYER V
GLI ACIDI NUCLEICI MOSTRANO UN
MASSIMO DI ASSORBIMENTO A 260 nm,
MENTRE LE PROTEINE PRESENTANO
L’ASSORBIMENTO MASSIMO A 280 nm
LEGGE LAMBERT-BEER:
A=CxLxE
A: ASSORBIMENTO AD UNA DETERMINATA
LUNGHEZZA D’ONDA
C: CONCENTRAZIONE DELLA MOLECOLA IN
ESAME
L: PERCORSO OTTICO.
E: IL COEFFICIENTE DI ESTINZIONE DELLA
MOLECOLA IN ESAME.
I COEFFICIENTI DI ESTINZIONE
PERCENTUALI A 260 nm SONO PARI A 200
O.D./cm PER IL DNA E 240 O.D./cm PER L’RNA.
C = A/ExL
ESERCITAZIONE: CALCOLARE LA
CONCENTRAZIONE DI UNA SOLUZIONE DI
DNA CHE PRESENTA UN ASSORBIMENTO A
260 nm PARI A 2 OD
DENATURAZIONE TERMICA DEL DNA E
DETERMINAZIONE DELLA TEMPERATURA DI
FUSIONE
PER DENATURAZIONE DEL DNA SI INTENDE
LA PERDITA DELLA SUA STRUTTURA
SECONDARIA CIOE’ LA SEPARAZIONE DELLE
DUE CATENE POLINUCLEOTIDICHE.
LA DENATURAZIONE DEL DNA PUO’ ESSERE
INDOTTA CON UN AUMENTO DELLA
TEMPERATURA.
FIGURA 5.17A STRYER V
FIGURA 5.1 GENE VI
FIGURA 1.11 REECE, ANALISI GENI E GENOMI
EFFETTO SULLA Tm DEL CONTENUTO IN GC
E DELLA FORZA IONICA
FIGURA 4.17 STRYER IV
-
-
Na+Na+Na+Na+Na+Na+Na+Na+Na+-
Aumento della
forza ionica
Stabilizzazione
della doppia elica
(incremento Tm)
-Na+
-Na+
-Na+
-Na+
-Na+
-Na+
-
Tm = 81,5 + 16,6 (log10[Na+]) + 0,41(%GC)
QUESTA EQUAZIONE DESCRIVE L’EFFETTO
DELLA FORZA IONICA E DEL CONTENUTO IN
GC SULLA Tm.
L’EQUAZIONE PUO’ ESSERE UTILIZZATA PER
PREDIRE LA Tm DI UNA MOLECOLA DI DNA.
ESERCITAZIONE: PREDIRE LA
TEMPERATURA DI FUSIONE DEL DNA
GENOMICO UMANO E DI E. COLI AD UNA
FORZA IONICA FISIOLOGICA.
RINATURAZIONE DEL DNA
FIGURA 1.13 GENES VII = 5.2 GENE VI
LA VELOCITA’ DI RINATURAZIONE E’
INFLUENZATA NOTEVOLMENTE DALLA
TEMPERATURA.
LA VELOCITA’ MASSIMA DI RINATURAZIONE
SI REALIZZA AD UNA TEMPERATURA DI
CIRCA 20 GRADI INFERIORE ALLA Tm (5-10
GRADI PER OLIGONUCLEOTIDI).
PRECIPITAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI CON
SALI ED ETANOLO
LA PRECIPITAZIONE E’ ESEGUITA
AGGIUNGENDO AL CAMPIONE:
•ACETATO DI SODIO 0,3 M
•2,5 VOLUMI DI ETANOLO
-
-
-
-
Aumento della
forza ionica
Minore repulsione
intermolecolare
=> maggiore
tendenza
all’aggregazione
-
-Na+- -Na+- -Na+- -Na+- -Na+- -Na+- -
-
FINALITA’:
•CONCENTRARE L’ACIDO NUCLEICO
•CAMBIARE SOLVENTE
•SEPARARE L’ACIDO NUCLEICO DA
NUCLEOTIDI LIBERI
ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO
L’ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO E’
UNA METODICA PER LA SEPARAZIONE E
L’ANALISI DI MOLECOLE DI DNA ED RNA
SOTTO L’INFLUENZA DI UN CAMPO
ELETTRICO
FIGURA 2.11 REECE, ANALISI GENI E GENOMI
L’AGAROSIO
E’ UN
POLISACCARI
DE LINEARE
FORMATO DA
CIRCA 8000
UNITA’ DI
GALATTOSIO
FIGURA 9.2 WILSON (MET. BIOCHIMICA)
POZZETTI
-
+
FIGURA 2.15 REECE, ANALISI GENI E GENOMI
AL TERMINE DELL’ELETTROFORESI GLI ACIDI
NUCLEICI SONO EVIDENZIATI MEDIANTE
TRATTAMENTO CON BROMURO DI ETIDIO.
FIGURA 14.8 GENOMI II
ECCITATO CON LUCE ULTRAVIOLETTA (280360 nm) IL BROMURO DI ETIDIO EMETTE
LUCE VISIBILE (590 nm).
Il LEGAME AL DNA INCREMENTA LA
FLUORESCENZA DI 20-30 VOLTE.
FIGURA P. 37 GENOMI II
IL GEL SI
OSSERVA AL
BUIO
ESEMPIO DI ANALISI SU GEL DI AGAROSIO
21226 5148 + 4973
4268
3530
2027+1904 1584 1375 947 831 564 -
125 -
m=k V•t•d
log PM
m = MIGRAZIONE ELETTROFORETICA
(DISTANZA PERCORSA DA CIASCUNA
MOLECOLA AL TERMINE
DELL’ELETTROFORESI)
V = DIFFERENZA DI POTENZIALE ELETTRICO
APPLICATA
t = DURATA DELLA CORSA
ELETTROFORETICA
d = DENSITA’ DI CARICA CIOE’ RAPPORTO
CARICA/MASSA
k = COSTANTE DI PROPORZIONALITA’ TIPICA
DEL SISTEMA ELETTROFORETICO
UTILIZZATO: DIPENDE DALLA GEOMETRIA
DELLA MOLECOLA E DALLA GRANDEZZA DEI
PORI DEL GEL
NEL CASO DI MOLECOLE DI DNA LINEARI, LA
MIGRAZIONE ELETTROFORETICA DIPENDE
UNICAMENTE DALLE DIMENSIONI DELLA
MOLECOLA, ESSENDO INVERSAMENTE
PROPORZIONALE AL LOGARITMO DEL PESO
MOLECOLARE (O DEL NUMERO DI BP). NE
CONSEGUE CHE LA METODICA PUO’ ESSERE
UTILIZZATA PER DETERMINARE LA
LUNGHEZZA DI UNA MOLECOLA DI DNA.
FIGURA 2.13 REECE, ANALISI GENI E GENOMI
SE SI DISPONE DI UN
APPROPRIATO
MARCATORE DI PESO
MOLECOLARE, LA
RETTA DI
CALIBRAZIONE PUO’
ESSERE SUPERFLUA
LA MIGRAZIONE ELETTROFORETICA DEI
PLASMIDI E’ INFLUENZATA NOTEVOLMENTE
DAL GRADO DI SUPERAVVOLGIMENTO.
FIGURE 2.14 E 2.15 WATSON - DNA
RICOMBINANTE
NE CONSEGUE CHE LA TAGLIA
MOLECOLARE DI UN PLASMIDE PUO’
ESSERE STIMATA CON ACCURATEZZA SOLO
IN SEGUITO ALLA SUA LINEARIZZAZIONE
CON UN’ENDONUCLEASI.
LA MIGRAZIONE ELETTROFORETICA DEGLI
RNA E’ INFLUENZATA SIA DALLA TAGLIA
MOLECOLARE CHE DALLA STRUTTURA
SECONDARIA.
LE DIMENSIONI DI UNA MOLECOLA DI RNA
POSSONO ESSERE STIMATE SOLO
OPERANDO L’ELETTROFORESI IN
CONDIZIONI DENATURANTI: VIENE
AGGIUNTA FORMALDEIDE AL CAMPIONE E AL
GEL DI AGAROSIO.
LA FORMALDEIDE (HCOH) SI LEGA AI GRUPPI
AMMINICI DELLE BASI AZOTATE IMPEDENDO
LA RINATURAZIONE DELL’RNA
SEQUENZIAMENTO DEL DNA
IL METODO DI SEQUENZIAMENTO PIU’
UTILIZZATO E’ QUELLO DI SANGER, BASATO
SULL’USO DI DIDEOSSINUCLEOTIDI.
IL DNA DA SEQUENZIARE VIENE RICOPIATO
IN PRESENZA DI DIDEOSSINUCLEOTIDI 5’TRIFOSFATO CHE AGISCONO COME
TERMINATORI DELLA POLIMERIZZAZIONE
SEGNALANDO LA POSIZIONE DELLE
SINGOLE BASI.
FIGURA 6.2 GENOMI II
FIGURA 6.7 GENOMI II