IL TEST di FLUTTUAZIONE - e

Il test di fluttuazione
Il modello malthusiano nella biologia cellulare
IL TEST di FLUTTUAZIONE
(S.E. Luria e M. Delbruck ”Mutations of bacteria from virus sensitivity to
virus resistance” (1943) Genetics vol.28, pp.491-511).
()
5 novembre 2013
1 / 47
Il test di fluttuazione
I problemi
• Negli anni ’40 del ’900 non é ancora chiarito il rapporto il DNA e i
geni.
• Un altro problema ancora irrisolto era quello sulla possibilitá di
unificazione delle teorie sul mondo vivente: infatti si pensava che solo
gli organismi superiori contenessero geni, mentre altri organismi piú
“semplici”, come i batteri, regolassero la loro riproduzione tramite le sole
reazioni chimiche delle sostanze che li componevano.
()
5 novembre 2013
2 / 47
Il test di fluttuazione
Le procedure sperimentali
Sperimentalmente era noto che una cultura batterica pura, se attaccata da
un virus batteriofago, in poche ore diventava limpida come se le cellule
sensibili al virus fossero state distrutte.
Dopo una incubazione ulteriore di alcune ore (talvolta giorni), la cultura
ritornava pero’ torbida, come se si fosse sviluppato un variante batterico
resistente all’azione del virus (variante originario).
Questo variante, isolato e liberato dal virus, in molti casi mostrava di
mantenere la resistenza all’azione del virus anche se coltivato per molte
generazioni in assenza del virus: risultava cioe’ stabile.
()
5 novembre 2013
3 / 47
Il test di fluttuazione
Il ceppo sensibile assorbiva velocemente il virus e veniva distrutto mentre il
variante resistente non mostrava, in genere, alcuna affinità con
quest’ultimo.
Il fenomeno dei varianti batterici appariva anche in culture di cloni derivanti
da una singola cellula; sebbene tutti i batteri in questo caso dovessero
risultare identici, alcuni sembravano essere sensibili all’azione del virus, altri
resistenti.
Questo fatto, osservato negli esperimenti, risultava inspiegabile.
()
5 novembre 2013
4 / 47
Il test di fluttuazione
Max Delbruck e Salvador Lurja fondano gruppo del fago nel 1942 presso i
laboratori di Cold Spring Harbour per studiare i problemi precedenti.
()
5 novembre 2013
5 / 47
Il test di fluttuazione
Le ricerche di Luria e Delbruck, e la collaborazione dei due con Alfred
Hershey, ebbero il massimo riconoscimento del Nobel per la Medicina nel
1969.
()
5 novembre 2013
6 / 47
Il test di fluttuazione
Le due ipotesi interpretative del fenomeno.
(1) Ipotesi di immunita’ acquisita (ed ereditaria) (o di tipo
LAMARCKIANO).
I batteri interagiscono con il virus ed una piccola frazione, predisposta alla
sopravvivenza (e’ piu’ forte o fisiologicamente piu’ attrezzata), supera
l’attacco.
La progenie di questi batteri e’ resistente e non assorbe mai piu’ il virus
(2) Ipotesi di mutazione ereditaria all’immunita’ (o di tipo
DARWINIANO)
I batteri originari in qualche momento della loro evoluzione hanno subito
una mutazione alla resistenza in modo del tutto indipendente dalla
presenza del virus, eventualmente anche prima dell’immissione del virus.
I loro discendenti, ereditandone il patrimonio genetico, risultano anch’essi
resistenti al virus.
Questa ipotesi presuppone che anche i batteri siano, come gli
organismi superiori, dotati di DNA.
()
5 novembre 2013
7 / 47
Il test di fluttuazione
I modelli teorici.
Per formulare due modelli teorici che descrivano il fenomeno in accordo con
le due possibili spiegazioni , Lurja e Delbruck osservano che per ipotesi é
noto che
(a) se consideriamo C colonie tutte uguali e, in ognuna immettiamo il virus
al tempo tv , l’azione del virus rapidamente distrugge quasi tutte le cellule
in tutte le colonie.
(b) dopo un certo tempo in ogni colonia si riforma una nuova colonia dalle
poche cellule sopravvissute: come mai alcune cellule sono state risparmiate?
()
5 novembre 2013
8 / 47
Il test di fluttuazione
Se la spiegazione corretta del fenomeno é quella lamarckiana, in ogni
colonia alcune cellule sopravvivono perché l’attacco le ha “fortificate”.
Ogni volta che si esegue l’esperimento, il numero delle cellule sopravvissute
è casuale e piccolo.
Contando quante sono le sopravvissute e sapendo come i batteri evolvono,
si può prevedere (con l’aiuto della teoria della probabilitá) coma varia
(fluttua) la loro numerositá media in ogni ripetizione dell’esperimento.
Si dimostra che, se sono corrette le ipotesi,
la fluttuazione deve essere piccola.
()
5 novembre 2013
9 / 47
Il test di fluttuazione
PREMESSE
1. L’evoluzione dei batteri si descrive con una legge malthusiana
N(t) = N(0)e t
N(0) = N0
(possiamo assumere r = 1)
2. Vale la formula ”interessante”:
se 0 < t 0 < t allora
0
N(t) = N(t 0 )e (t−t )
(possiamo calcolare la numerositá in funzione di quella ad un tempo t 0 < t,
invece che di quella iniziale)
()
5 novembre 2013
10 / 47
Il test di fluttuazione
Previsione sulla numerosita’ dei varianti originari nell’ipotesi di
immunita’ acquisita (spiegazione di tipo lamarckiano)
All’istante t 0 si osserva 1 cellula: N(t 0 ) = 1
Sia tv e’ l’istante in cui il virus viene a contatto con i batteri, il numero dei
batteri e’ (formula ”interessante”)
N(tv ) = e tv −t
0
0
Segue che in C colture identiche vi sono CN(tv ) = Ce tv −t batteri.
()
5 novembre 2013
11 / 47
Il test di fluttuazione
Dopo l’immissione del virus, si osservano pochissimi sopravvissuti (i
resistenti); questi sono distribuiti in modo casuale nelle C colture
(ad es. in una coltura sopravvivono r1 batteri, in un’altra ne sopravvivono
r2 ... nella C-esima ne sopravvivono rC ).
Il numero medio dei batteri sopravvissuti e’ quindi
rM =
r1 + r2 + .... + rC
C
I valori ri , i = 1, 2, ..., C sono molto piccoli, quindi l’evento “essere un
batterio resistente ha una probabilità molto piccola di realizzarsi.
Se si vuole calcolare con quale probabilità (quanto frequentemente) si
osservano in una coltura k resistenti (k = 0, 1, 2, ...) bisogna usare la
distribuzione di probabilità di Poisson.
()
5 novembre 2013
12 / 47
Il test di fluttuazione
CHE COSA E’ LA DISTRIBUZIONE DI POISSON?
I risultati di misure sperimentali di numerositá, di lunghezza, di durata ecc.
vengono, di solito, descritti da variabili numeriche e ripetendo piú volte lo
stesso esperimento, accade inevitabilmente, per vari motivi, che i valori
ottenuti nelle misure risultino diversi. In particolare se misuriamo la
numerositá di una coltura di batteri originata dal un solo individuo e lasciata
evolvere per la stessa quantitá di tempo, questa varia da esperimento ad
esperimento e ció dipende non solo dalla precisione degli strumenti che
usiamo per il conteggio, ma anche dal fatto che il tempo di fissione puó
variare da una generazione ad un’altra. In altre parole, per quanto siano
accurati gli esperimenti, ripetendo piu’ volte lo stesso esperimento, e’
praticamente impossibile ottenere le stesse misure ad ogni ripetizione.
Le misure sono quindi variabili aleatorie.
()
5 novembre 2013
13 / 47
Il test di fluttuazione
Se i valori che assume una variabile aleatoria variano per interi, la variabile
aleatoria e’ detta discreta, se possono assumere tutti i valori reali la
variabile e’ detta continua.
Dato un certo esperimento, supponiamo di aver effettuato un certo numero
di misure (variabili aleatorie discrete). Supponiamo che queste misure non
siano tutte diverse, ma che alcune di queste, almeno approssimativamente,
si ripetano: si puo’ calcolare la frequenza assoluta di ciascuna misura,
cioe’ il numero di volte che la stessa misura si presenta.
L’informazione sulla frequenza assoluta di una misura non ci dice se questa
misura si ripete tante o poche volte; per avere questa informazione bisogna
confrontare la frequenza assoluta della misura con il numero totale
delle misure eseguite: bisogna cioe’ calcolare la frequenza relativa.
()
5 novembre 2013
14 / 47
Il test di fluttuazione
Ad esempio per sapere se una mutazione ad un certo locus é o no
frequente in una popolazione é necessario dire quanti individui formano la
popolazione. Se N é il numero degli individui della popolazione e M ≤ N
sono portatori della mutazione, il numero f = M/N e’ detto la frequenza
relativa della mutazione nella popolazione. E’ evidente che la frequenza
relativa varia da 0 (M = 0) a 1 (M = N).
Se il numero degli esperimenti che eseguiamo e’ molto grande (nell’esempio
precedente se N → ∞), ad ogni particolare misura, cioe’ ad ogni valore
delle variabili si puo’ associare la probabilita’ con cui questo valore si
realizza.
In un certo senso si puo’ dire che la probabilita’ e’ la frequenza relativa su
un numero molto grande di prove.
()
5 novembre 2013
15 / 47
Il test di fluttuazione
Se ad esempio si dice che la probabilita’ di trovare in una coltura
esattamente k batteri resistenti ad un certo virus vale 0.002, cio’ significa
che, considerato un numero molto molto grande di culture, si trovano k
batteri resistenti 2 volte ogni mille prove.
Se ad ogni valore di una variabile aleatoria si puo’ associare la probabilita’
con cui questo valore si rileva, si avra’ la legge di distribuzione di
probabilita’ della variabile aleatoria. Se la variabile aleatoria e’ discreta,
la legge di distribuzione sara’ discreta.
Un esempio di legge di distribuzione discreta di probabilita’ e’ quello
binomiale o di Bernoulli.
()
5 novembre 2013
16 / 47
Il test di fluttuazione
DISTRIBUZIONE BINOMIALE
Se, dato un certo esperimento, si hanno solo due esiti possibili,
incompatibili tra loro (genericamente un ”successo”, nel secondo un
”insuccesso”), se e’ noto che il successo si realizza con probabilita’ p, e
quindi che l’insuccesso si realizza con probabilita’ 1 − p, allora e’ possibile
stimare la probabilita’ con cui un successo (o insuccesso) si realizza k = 0,
1, 2, ... , N volte su N ripetizioni dell’esperimento.
Ad esempio immaginiamo che ci interessi studiare se il numero di batteri in
una coltura originata da un sol individuo possa essere superiore a 106
batteri dopo 3 ore. Gli esiti di questo esperimento sono solo due, tra loro
incompatibili: dopo 3 ore infatti il numero di batteri o E’ superiore a 106 ,
oppure NON LO E’.
La variabile aleatoria, sia X , conta il numero di successi (il numero é
superiore a 106 ) ottenuti nelle ripetizioni delle osservazioni.
()
5 novembre 2013
17 / 47
Il test di fluttuazione
La formula con cui si puo’ calcolare la probabilita’ di avere esattamente
X = k successi (k = 0, 1, 2, ..., N) su N prove e’ data da
P(X = k) = (
N k
)p (1 − p)N−k .
k
(B)
ES: e’ noto che la probabilita’ di trovare in una coltura piu’ di 106 batteri
dopo 3 ore sia p = 0.001 e quindi che la probabilita’ di trovarne meno sia
0.999.
La probabilita’ che, considerate 5 colture, in 3 di queste si trovino piu’ di
106 batteri dopo 3 ore e’ data da
P(X = 3) = (
()
5
)(0.001)3 (0.999)2 ≈ 10−8
3
5 novembre 2013
18 / 47
Il test di fluttuazione
Se la legge di distribuzione di probabilita’ e’ nota, se cioe’ si puo’ calcolare
con quale valore la variabile aleatoria X prende ogni valore k, allora e’
possibile anche calcolare la media (il valore atteso) e la varianza dei valori
assunti dalla variabile aleatoria che sono dati rispettivamente da
hX i =
N
X
kP(X = k)
k=1
V = σ 2 = h(X − hX i)2 i =
N
X
(k − hxi)2 P(x = k)
k=1
()
5 novembre 2013
19 / 47
Il test di fluttuazione
In particolare se la legge di distribuzione di probabilita’ e’ binomiale, si puo’
dimostrare che le formule precedenti diventano, in particolare
hX i = Np
V = Np(1 − p)
Nell’esempio N = 5 colture, in media in 5 · (0.001) = 1/200, quindi in
meno di una, troveremo 106 batteri dopo 3 ore.
Se siamo interessati alla probabilita’ di ripetizione di eventi molto rari,
cioe’ aventi una piccola probabilita’ di realizzazione su moltissime
ripetizioni (p ≈ 0, N → ∞), la legge di distribuzione binomiale diventa la
legge di distribuzione di Poisson, dal nome del matematico
Simeon-Denis Poisson (1781-1840), che per primo l’ha ricavata.
Se hX i = m e’ la media della variabile aleatoria, tale legge e’ data da
P(X = k) =
()
mk e −m
.
k!
5 novembre 2013
20 / 47
Il test di fluttuazione
Si puo’ dimostrare che se la distribuzione di probabilita’ e’ di Poisson,
valgono le seguenti uguaglianze
hX i = m = V = σ 2
cioe’ se la probabilita’ di una variabile aleatoria e’ distribuita in accordo con
la distribuzione di Poisson, media e varianza assumono lo stesso valore.
()
5 novembre 2013
21 / 47
Il test di fluttuazione
Torniamo all’ esperimento di Lurija e Delbruck.
Se il numero medio dei resistenti e’
PC
rM = (r1 + r2 + ... + rc )/C =
i=1 ri
C
visto che la probabilità della resistenza
q PèC piccola (evento raro), si deve
√
i =1 ri
avere V = rM e quindi σ = V =
.
C
Quindi, in ogni coltura, il numero di batteri resistenti deve variare
nell’intervallo
I = [rM − σ, rM + σ] =
s
s
PC
PC
PC
PC
i=1 ri
i=1 ri
i=1 ri
i=1 ri
−
,
+
]
=[
C
C
C
C
()
5 novembre 2013
22 / 47
Il test di fluttuazione
SIMULAZIONE NUMERICA
Se, ad esempio, si considerano C = 4 culture generate da una singola
cellula e se il virus viene immesso nella cultura dopo 10 duplicazioni
(tv = 10), si può calcolare quante cellule formano la coltura.
Ricordiamo che nel modello malthusiano tv = 10 ⇒ t = 10 ln 2 ≈ 7 unita’
di tempo.
La numerosita’ corrispondente e’ dunque
N(7) = N(0)e tV = e 7 ≈ 1101
cellule in ogni cultura.
()
5 novembre 2013
23 / 47
Il test di fluttuazione
In C= 4 colture si troveranno quindi, in totale,
4N(t) = 4(1101) = 4404
cellule.
Supponiamo che nelle 4 colture si osservino rispettivamente r1 = 50
r2 = 35 r3 = 15 r4 = 20 cellule resistenti, in totale r = 120 cellule resistenti
(poche e distribuite casualmente). In media in ogni coltura si avranno
rM = 120/4 = 30
cellule resistenti
()
5 novembre 2013
24 / 47
Il test di fluttuazione
La probabilita’ di trovare resistenti e’ distribuita in accordo alla legge di
Poisson, quindi la varianza dei resistenti deve essere uguale alla media cioè
V = rM = 30
√
quindi σ = V ≈ 5 e in ogni coltura ci si devono aspettare fra 30 − 5 = 25
e 30 + 5 = 35 cellule resistenti quindi
poche cellule il cui numero non varia molto da coltura a
coltura=fluttuazioni piccole
()
5 novembre 2013
25 / 47
Il test di fluttuazione
N.B. Se il virus e’ immesso dopo tv = 15 suddivisioni (cioe’ dopo t ≈ 10
unita’ di tempo ”riscalato”) si avranno
N(10) ≈ 20589
cellule in ogni cultura, quindi 4N(t) = 82356.
Se supponiamo che il numero totale dei resistenti non vari e che quindi si
trovino 120 cellule resistenti, cioe’ in media 30 cellule per cultura, anche in
questo caso si prevede che in ogni coltura, indipendentemente dal momento
in cui viene immesso il virus, si devono trovare fra 30 − 5 = 25 e
30 + 5 = 35 cellule resistenti.
()
5 novembre 2013
26 / 47
Il test di fluttuazione
Se la spiegazione corretta é quella darwiniana e anche i batteri sono
dotati di DNA, alcune cellule (poche) sopravvivono perché hanno subito
una mutazione alla resistenza in qualche momento della loro evoluzione,
anche precedente a tv .
Visto che anche le cellule resistenti evolvono come le altre
malthusianamente, si puó prevedere quante sono, in ogni colonia, sia le
cellule destinate all’estinzione sia quelle resistenti e, anche in questo caso,
si puó valutare teoricamente come varia (fluttua) la loro numerositá media.
Si dimostra che in questo caso la fluttuazione sarà grande.
()
5 novembre 2013
27 / 47
Il test di fluttuazione
Previsione sulla numerosita’ dei varianti orginari nell’ipotesi di
mutazione all’immunita’ (ipotesi darwiniana)
Nel corso del suo ciclo vitale ogni batterio ha in qualunque momento,
quindi anche prima dell’immissione del virus, una certa probabilita’ di
mutare da sensibile a resistente.
I discendenti dei batteri resistenti saranno anch’essi resistenti (a meno che
non intervengano retromutazioni).
()
5 novembre 2013
28 / 47
Il test di fluttuazione
Consideriamo C culture indentiche.
All’istante in cui viene immesso il virus, sia tv > t0 , ogni coltura contiene
cloni di varie grandezze di batteri resistenti.
Inoltre, visto che le mutazioni intervengono ad un qualunque istante, un
campione di una cultura prelevato ad un tempo t qualunque sarà formato
dalla progenie dei batteri mutati prima di t e dagli eventuali mutati proprio
all’istante t.
()
5 novembre 2013
29 / 47
Il test di fluttuazione
ESEMPIO SEMPLIFICATO:
Se [t0 , t1 ] = (t1 , t2 ] = (t2 , t3 ] = ... = T durata di un ciclo cellulare, si ha
————————
–*–*——————
–*–*–*–*–*——
t0 : r = 0 (no mutazioni, no resistenti)
t1 : r = 2 (mutazione, 2 resistenti)
t2 : r = 4 + 1 = 5 (mutazione, 1 nuovo resistente
+ discendenti dei resistenti)
–*–*–*–*–*–*–*–*–*–*-t3 : r = 10 (no mutazione, solo i discendenti dei
resistenti)
.........................
Il numero dei resistenti dipende da quante mutazioni si sono
realizzate fino a quel momento
()
5 novembre 2013
30 / 47
Il test di fluttuazione
PROBLEMA: Quante mutazioni si verificano in un certo intervallo di
tempo in una cultura?
Definiamo
- m(t)= numero di mutazioni cui, al tempo t, e’ soggetto 1 solo batterio
- (t 0 , t), un intervallo di tempo di lunghezza t − t 0 = ∆t > 0,
- m(t) − m(t 0 ) = ∆m numero mutazioni per batterio nell’intervallo ∆t,
- a = [m(t) − m(t 0 )]/∆t = ∆m/∆t
il tasso di mutazione per ogni batterio nell’intervallo (t 0 , t),
⇒
()
∆m = a∆t
5 novembre 2013
31 / 47
Il test di fluttuazione
Il numero di batteri in una popolazione che evolve dal tempo t 0 al tempo t
0
(t 0 < t) e’ N(t) = N(t 0 )e t−t
Se M(t) è il numero totale di mutazione avvenute fino al tempo t,
nell’intervallo ∆t, si ha
∆M = M(t) − M(t 0 ) = N(t)∆m =
0
= aN(t)∆t = aN(t 0 )e t−t ∆t
()
5 novembre 2013
32 / 47
Il test di fluttuazione
Dividendo ambo i membri per ∆t e calcolando il limite per ∆t → 0, si ha
∆M
0
= M 0 (t) = aN(t 0 )e t−t
∆t
Moltiplicando per dt ambo i membri e calcolando l’integrale da t 0 a t si ha
Z t
Z t
0
M 0 (t)dt = M(t) − M(t 0 ) =
aN(t 0 )e t−t dt =
lim∆t→0
t0
t0
= aN(t 0 )
Z
t
0
e t e −t dt
t0
⇒
0
0
M(t) − M(t 0 ) = aN(t 0 )e −t (e t − e t ) =
0
= aN(t 0 )(e t−t − 1) = a(N(t) − N(t 0 ))
cioé il numero di mutazioni dipende dalla numerositá della colonia e dal
tasso di mutazione.
()
5 novembre 2013
33 / 47
Il test di fluttuazione
Se si considerano C > 1 colture si ha
M(t) − M(t 0 ) = C [a(N(t) − N(t 0 ))]
Sia tm l’istante in cui si realizza la prima mutazione (M(tm ) = 1)
se t 0 < tm < t si ha M(t 0 ) = 0.
Osserviamo che N(t 0 ) << N(t) infatti
0
N(t) = N(0)e t e N(t 0 ) = N(0)e t . Se t 0 < t si ha e t << e t
0
0
(ad es. se t 0 = 1 e t = 6 si ha e t = e ≈ 3 e e t = e 6 ≈ 729)
()
5 novembre 2013
34 / 47
Il test di fluttuazione
Quindi, visto che N(t 0 ) si puo’ trascurare rispetto a N(t) e che M(t 0 ) = 0
⇒
M(t) ≈ CaN(t)
questo e’, con una buona approssimazione, il numero di mutazioni
intervenute all’istante t in C culture batteriche.
OSSERVAZIONE: se sono noti a e N(t), si puo’ calcolare quanto e’
lungo l’intervallo di tempo t − tm (t tempo attuale, tm istante della prima
mutazione)
Infatti:
()
5 novembre 2013
35 / 47
Il test di fluttuazione
se tm < t si ha N(t) = N(tm )e t−tm
Ma M(tm ) = 1 = CaN(tm )
⇒
⇒
N(tm ) = N(t)e −(t−tm )
N(tm ) = 1/Ca
1 = CaN(t)e −(t−tm )
Moltiplicando ambo i membri per e (t−tm ) , si ha equivalentemente,
e t−tm = CaN(t)
calcolando il logaritmo di ambo i membri si ha
t − tm = ln(CaN(t))
cioé il tempo che é passato dalla prima mutazione é dato dal logaritmo del
numero delle colonie per la frazione di cellule mutate.
()
5 novembre 2013
36 / 47
Il test di fluttuazione
Il numero dei resistenti dipende dal numero di mutazioni che si sono
realizzate.
Come si calcola questo numero?
Calcolo del numero dei batteri resistenti ad un qualunque istante t
- I batteri resistenti si moltiplicano con legge malthusiana r 0 (t) = r (t)
(r (t) = e t )
- inoltre, ad ogni nuova generazione, un certo numero di batteri acquisisce,
per mutazione, resistenza;
questi sono aN(t) = aN(tm )e t−tm
- all’istante tm in cui avviene la prima mutazione non ci sono resistenti
(condizione iniziale)
()
5 novembre 2013
37 / 47
Il test di fluttuazione
MODELLO di EVOLUZIONE dei RESISTENTI
r 0 (t) = r (t) + aN(t) = r (t) + aN(tm )e t−tm
r (tm ) = 0
e’ un’equazione differenziale di tipo malthusiano nell’incognita r (t) con
l’aggiunta di un ”termine noto”
g (t) = aN(tm )e t−tm
LA FUNZIONE
r (t) = aN(tm )(e t−tm )(t − tm ) = aN(t)(t − tm )(∗)
E’ LA SOLUZIONE dell’equazione differenziale
()
5 novembre 2013
38 / 47
Il test di fluttuazione
Verifica.
La derivata di (*) vale
r 0 (t) = aN(tm )[(e t−tm )(t − tm ) + e t−tm )
Ma r (t) = aN(tm )(e t−tm )(t − tm ) e g (t) = aN(tm )e t−tm
quindi, sostituendo, si ha r 0 (t) = r (t) + g (t) quindi la funzione (*) e’
soluzione.
()
5 novembre 2013
39 / 47
Il test di fluttuazione
PREVISIONE: se t e’ grande, certamente t − tm grande e a(t − tm ) > 1.
Quindi la soluzione r (t) = aN(t)(t − tm ) verifica che
r (t) ≥ N(t)
dopo un certo tempo, il numero dei resistenti supera quello dei non
resistenti.
—————————————————–
Ricordando la relazione t − tm = ln(CaN(t)), si puo’ scrivere
r (t) = aN(t)(t − tm ) = aN(t) ln(CaN(t))
r (t)/N(t) = a ln(CaN(t)) = ln(CaN(t))a
⇒
e r (t)/N(t) = (CaN(t))a
r (t), N(t) e CN(t) si ottengono sperimentalmente, quindi si puo’ calcolare
il tasso di mutazione a, che per le popolazioni batteriche risulta sempre
estremamente basso (in genere circa uno su un centinaio di milioni)
()
5 novembre 2013
40 / 47
Il test di fluttuazione
SIMULAZIONE NUMERICA
Supponiamo che sia C = 4.
Il virus viene immesso nella cultura dopo 10 duplicazioni (tv = 10), che nel
modello malthusiano sono tv = 10 ⇒ t = 10 ln 2 ≈ 7 unita’ di tempo.
I resistenti sono
r (7) = aN(7)(7 − 1) = 6606a
Se tm = 1 (la prima mutazione m(tm ) = 1 si realizza nel primo ciclo
vitale), si puo’ calcolare il tasso di mutazione a dalla formula
M(tm ) = 1 = CaN(tm )
Infatti
N(1) = e ≈ 3, C = 4 ⇒
1 = 4aN(1) = 12a
⇒
()
⇒
a=
1
≈ 0.33
12
r (7) = 6606a ≈ 2202
5 novembre 2013
41 / 47
Il test di fluttuazione
N.B. Se invece la prima mutazione M(tm ) = 1 si realizza alla seconda
generazione (tm = 2), ripetendo ragionamento si ha
a ≈ 0.11
e quindi
r (7) ≈ 734
il numero dei resistenti ”fluttua” molto e questa fluttuazione
dipende dalla generazione in cui si realizza la prima mutazione
Per decidere quale interpretazione sia corretta bisogna esaminare i risultati
sperimentali
()
5 novembre 2013
42 / 47
Il test di fluttuazione
GLI ESPERIMENTI
- I batteri: Escherichia coli B
()
5 novembre 2013
43 / 47
Il test di fluttuazione
- Il virus batteriofago: di tipo α.
()
5 novembre 2013
44 / 47
Il test di fluttuazione
Vengono eseguite serie da 5 e fino a 100 culture in parallelo, con piccoli
inoculi uguali. Tutte vengono fatte crescere fino al raggiungimento del
titolo massimo.
Le colonie di resistenti vengono individuate in intervalli di tempo diversi,
notando che le colonie piu’ grandi e piu’ piccole vengono osservate
rispettivamente dopo 12-16 ore e 18-24 ore dall’incubazione.
()
5 novembre 2013
45 / 47
Il test di fluttuazione
Esempio di conteggio dei batteri resistenti effettuato dopo 24-48 ore in una
serie di culture
N. culture
100
Batteri resistenti
0
1
2
3
4
5
6 - 10
11 - 20
21 - 50
51 - 100
101-200
201-500
501-1000
Media per campione 10.12
Varianza
6270
σ ≈ 79
resistenti
10 ± 79
()
87
n. cult
57
20
5
2
3
1
7
2
2
0
0
0
1
Batteri resistenti
0
1
2
3
4
5
6 - 10
11 - 20
21-50
51-100
101-200
201-500
501-1000
n. cult
29
17
4
3
3
2
5
6
7
5
2
4
0
28.6
6431
σ ≈ 80
29 ± 80
5 novembre 2013
46 / 47
Il test di fluttuazione
CONCLUSIONE
in ogni esperimento il numero dei batteri resistenti fluttua molto e il
numero medio dei resistenti non e’ uguale alla varianza.
La procedura sperimentale conferma quindi che i batteri, come gli
organismi piu’ complessi, subiscono mutazioni (devono quindi essere dotati
di DNA) e queste possono realizzarsi in ciascuna cellula in qualunque
momento dell’evoluzione.
In accordo con l’interpretazione darwiniana, il virus, agendo come fattore
selettivo, permette la sopravvivenza solo di quelle cellule che hanno subito
la mutazione e della loro progenie.
()
5 novembre 2013
47 / 47