Relazione
Dr. Giulio Pisani
Le malattie infettive trasmesse da
vettori e l’impatto
l impatto sul sistema
donazioni/trasfusioni
Diagnosi di laboratorio
Corso E.C.M. Le malattie infettive trasmesse da vettori e l’idoneità alla donazione di sangue e di
emocoponenti alla luce delle novità normative”
San Donato Milanese, 8 novembre 2014
Febbre
Mal di testa
Dolori muscolari
Nausea, Vomito
g
Linfonodi ingrossati
Rash cutaneo
Febbre
Confusione
Convulsioni
Debolezza muscolare
Perdita vista
Intorpidimento
Paralisi
Stato comatoso
Ricerca
IgM nel
- Siero
- CSF
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IgM
• Le IgM compaiono a partire dall
dall’ottavo
ottavo giorno dall
dall’infezione
infezione
• Le IgM compaiono 3-8 giorni dopo la sintomatologia
• Presenti per almeno 30 – 90 giorni
• Raramente presenti anche fino a 12 mesi ed oltre
ASSENZA
IgM
prima
i
d ll’ tt
dell’ottavo
giorno
i
fine della fase acuta
PRESENZA
E id
Evidenza
di una infezione
i f i
recente
t
Possibile cross-reattività
Ripetere
Ri
t
il test
t t dopo
d
7 14
7-14
giorni
Testt di conferma
T
f
d
da
eseguire mediante test
neutralizzazione in vitro
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Febbre
Mal di testa
Dolori muscolari
Nausea, Vomito
g
Linfonodi ingrossati
Rash cutaneo
Febbre
Confusione
Convulsioni
Debolezza muscolare
Perdita vista
Intorpidimento
Paralisi
Stato comatoso
Ricerca
IgG nel
- Siero
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IgG
• Le IgG compaiono qualche giorno dopo le IgM
• Presenti per almeno 1 – 2 anni ….ed oltre
ASSENZA
Prelievo in periodo precoce
I G
IgG
Ripetere il test dopo 7-14
giorni
Da associare con le IgM
Evidenza di una infezione
PRESENZA passata
Possibile cross-reattività
Ripetizione dopo 7-14
giorni per valutare un rialzo
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Possibile cross
cross-reattività
reattività
Usutu Virus
Virus Febbre gialla
g
Virus Encefalite giapponese
Virus encefalite di St. Louis
Virus Dengue
Plaque-reduction neutralization tests
PRNT
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Isolamento su coltura Cellulare
Febbre
Confusione
Convulsioni
Debolezza muscolare
Perdita vista
p
Intorpidimento
Paralisi
Stato comatoso
Febbre
Mal di testa
Dolori muscolari
Nausea
vomito
Linfonodi ingrossati
rash cutaneo
Ricerca
Campione raccolto in
condizioni
sterili
in
terreno con antibiotici e
conservato a +4°C per
un massimo di 24 ore
del Virus
plasma, siero,
CSF
Ricerca del genoma virale
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da 2–3 giorni a
14–18
14
18 giorni
post-infezione
Efficacia TEST SIEROLOGICI
vs MOLECOLARI
Studio condotto tra il 1999-2000
Pazienti New York
• 95% IgM + nel CSF
• 90% IgM + nel siero entro 8 giorni dai sintomi
• 55% PCR + nel CSF
• 10% PCR + nel siero
West Nile virus surveillance and control: an update for healthcare providers in
New York City. New York Department of Health. City Health Information.
2001;20.
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Ricerca del
genoma virale
i l
NAT WNV RNA
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anno 2002
23 casi di trasmissione virale WNV attraverso il sangue
g
durante la stagione epidemica
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Trasfusione Sangue da 63 donatori
WNVD
Donatore Organi
Febbre da WNV
anno 2002
WNVD
WNVD
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La Food and Drug Administration (FDA) richiese ai
produttori di kit di sviluppare prima possibile un saggio
molecolare per rilevare il WNV RNA nel sangue
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Giugno 2003
disponibili due kit diagnostici che vennero impiegati in
ambito di investigational
g
new drug
g ((IND)) nello screening
g del
sangue durante la stagione esiva 2013
Giugno Dicembre 2003
6 milioni di unità analizzate.
818 confermate positive WNV RNA
Evitate 1000-1500 potenziali trasmissioni di
WNV attraverso la trasfusione
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virus
IgG
IgM
rtPCR MP 6
240 cp/mL
160 cp/mL
TMA MP 16
40 cp/mL
rtPCR ID
10 cp/mL
TMA ID
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.. rare transfusion-transmitted infections could still occur from the transfusion of
units with low level viremia that would not be detected by MP NAT…
Busch MP et al. Emerg
g Infect
f Dis 2006
Giugno Dicembre 2003
6 milioni di unità analizzate.
6 donazioni sfuggite
818 confermate positive WNV RNA
Retrospective studies of samples from donors in epidemic areas established
that a substantial fraction (20% - 30%) of WNV RNA–positive blood donations
had very low- level viremia that was detectable by ID-NAT but not by MP-NAT
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Strategia
g del “trigger”
gg
ID
Sensibilità 40 cp/mL
6 MP
Sensibilità 240 cp/mL
ID
Sensibilità 10 cp/mL
16 MP
Sensibilità 160 cp/mL
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1 MP positivo alla NAT WNV
------Trasmissione all’uomo di WNV nella popolazione
Se il numero delle infezioni
1 caso ogni 1.000 abitanti nelle aree rurali
non vengono più
iù identificati
id tifi ti
1 caso ogni 2.500 abitanti nelle aree urbane
nella popolazione scende o e
donatori positivi alla NAT per
WNV nei successivi 7 gg, si
può ritornare a MP6
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4 MP positivi alla NAT WNV
------Trasmissione all’uomo di WNV nella popolazione
1 caso ogni 1.000 abitanti
Se non vengono più identificati
donatori positivi alla NAT per
WNV nei successivi 7 gg, si
può ritornare a MP6 o MP16
2004 : un caso di trasmissione WNV (il MP6 era negativo)
2006 : due casi di trasmissione WNV da uno stesso donatore (emazie e plasma)
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Dal 2003, circa 3.750 Unità di
Sangue NAT positive per il WNV
sono state identificate e rimosse
total
35,153
WNV human cases
WNV reactive units
3,762
Un totale di 12 casi di trasmissione di WNV con il sangue sono stati identificati
Fatal WNV infection after probable transfusion-associated transmission —
Colorado, 2012
MMWR / August 9, 2013 / Vol. 62 / No. 31
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Infezione umana da WNV rientra tra le malattie notificabili
Commission Decision 2009/312/EC
2009/312/EC.
Definizione di caso infezione umana da
WNV Commission Decision of 28/IV/2008
28/IV/2008.
Criteri Clinici
Qualsiasi persona con febbre o almeno Encefalite o Meningite
Criteri Diagnostici
- Isolamento virale dal sangue o liquido cerebrospinale
- rilevamento genoma virale dal sangue o liquido cerebrospinale
- presenza di IgM anti-WNV nel liquido cerebrospinale
- presenza di alto titolo IgM anti-WNV,
anti WNV presenza di IgG e conferma mediante
neutralizzazione in vitro
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NAT per WNV RNA
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++
+
biglia
magnetica
+
+
+
+
- - - - - - - - -
Fase di estrazion
• Lisi della particella virale
• Rilascio del genoma virale
• legame a biglie magnetiche
• lavaggi
biglia
magnetica
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Fase di Amplificazione
Fase di Rilevazione
Sonda TaqMan
Valore soglia
Crossing-point
Threshold cycle
Threshold-cycle
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TMA
Transcription
Mediated Assay
Fase di Amplificazione
Fase di Rilevazione
16000
14000
probe
12000
EA
RNA target
chemiluminescenza
10000
8000
6000
4000
RLU
2000
0
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WNV RNA NAT
Sensibilità Analitica
95%LOD
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WNV RNA NAT: Sensibilità Analitica
95% Limit of Detection
WNV Lin 1
~ 40 cp / mL1
Real time PCR
Health Canada reagent
HC-SC, WNV Nat Ref 001/03
Saldanha J Transfusion 45, 2005
~ 10 cp /
mL2
TMA
1) Saldanha et al Transfusion 48, 2008
2) Linnen et al J Med Virology 79 2007
WNV Stock,
Stock NY 2001-6263 Lot 302142
FDA WNV Reference Panel
CONFIRMED
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WNV RNA NAT: Sensibilità Analitica
95% Limit of Detection
WNV Lin 2
~ 5 cp / mL1
Real time PCR
The WNV RNA qualification
~ 20 cp / mL2
TMA
panel QWN701
1) Saldanha et al Transfusion 48, 2008
2) Linnen et al J Med Virology 79 2007
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WNV RNA NAT
Specificità Analitica
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Cross-reattività
VIRUS
Real time PCR
TMA
Japanese Encephalitis Virus
SI
no
Murray Valley encephalitis virus
SI
no
Saint Louis encephalitis virus
SI
no
Kunjin virus
SI
SI
Yellow fever virus
non riportato
no
Dengue
g virus
non riportato
p
no
SI 2
SI 1,2
Usutu virus
1) Gaibani P et al.
al J Clin Microbiol 2010; 48: 3338
3338-9
9
2) Pisani G et al, Blood Transfusion 2010; 10:515-20
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WNV screening
g in Italia
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WNV screening
i in
i Italia
It li
Anno
n. donatori
NAT +
n. donazioni
testate
Casi WNVD
2009
2
59.815
18
2010
6
118.295
3
2011
4
119.345
14
2012
14
116 255
116.255
28
2013
19
284.564
44
2014
1
Non riportato
21
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IgM
IgG
RNA: ~ 9.000 cp/mL
IgM negativa
IgG negativa
donazione
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IgM
IgG
RNA: << 100 cp/mL
IgM positiva
IgG negativa
donazione
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Su 9 donazioni positive alla NAT
IgM
g e IgG
g negative
g
IgM e/o IgG positive
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Grazie
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