GENI MARCATORE (marker)

GENI MARCATORE (marker)
Consentono di selezionare le cellule trasformate applicando un agente
selettivo fitotossico.
Caratteristiche del gene marker:
- deve esprimersi in un’ampia gamma di cellule e tessuti
- deve produrre una chiara modificazione del fenotipo
- deve distinguersi perfettamente da attività endogene simili
- la resistenza endogena al composto selettivo deve essere bassa
- deve potersi esprimere a livelli sufficienti per garantire la resistenza
- l’enzima prodotto deve inattivare il composto ad alta velocità
- i metaboliti liberati dopo la reazione non devono essere tossici.
Esempi di agenti selettivi: antibiotici, erbicidi.
Geni marker corrispondenti:
- nptII, resistenza alla Kanamicina (aminoglicosidi) via fosforilazione,
isolato da trasposone Tn5 di E. coli, gene più usato, concentrazioni di
lavoro 25-100mg/l. Alcune specie di monocot sono poco sensibili.
L’attività dell’enzima può essere saggiata facilmente con 32P.
- hpt, resistenza all’igromicina via fosforilazione, isolato dal E. coli,
concentrazioni di lavoro 20-200mg/l, saggiabile con 32P.
kanamicina
igromicina
Transformation and regeneration of black cherry leaf explants.
a Leaf explants after inoculation, b Callus formed 3 weeks after transformation,
c Putative transgenic shoots regenerated from 27-day selection,
d Shoots after one sub-culture selection on kanamycin medium; transgenic shoot (left), non-transgenic shoot
(right),
e Shoots after two sub-cultures on 30 mg l−1 kanamycin medium; transgenic shoot (left), non-transgenic shoot
(right),
f Shoots after three sub-cultures on kanamycin medium; transgenic shoot (left), non-transgenic shoot (right),
g Elongated transgenic shoots,
h Rooted transgenic shoots,
i Rooted transgenic shoot 4 weeks after acclimatization
ERBICIDI
Agenti fitotossici attivi su particolari proteine attive in processi
unici ed essenziali delle piante (fotosintesi, sintesi aminoacidi
essenziali), di solito non sono selettivi quindi colpiscono tutte le
piante, erbacce e non. Possono però esserci differenze tra erbacce
e specie coltivate a livello di uptake o di attività in situ.
Resistenze: detossificazione specifica del composto, sintesi di una
proteina modificata insensibile o sovrapproduzione dell’enzima
bersaglio.
Esempi:
glifosato N-fosfonometil-glicina, non selettivo,
più comunemente usato, colpisce l’enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasi EPSP, enzima
chiave
nel
metabolismo
degli
aminoacidi
aromatici, cloroplastico.
Resistenza gene batterico codifica un enzima
tollerante
verso
l’erbicida,
oppure
sovraespressione dell’enzima.
Sulfoniluree
e
imidazolinoni
colpisce
l’acetolattato sintasi ALS implicata nella biosintesi
di aa a catena ramificata (leu, iso, val), enzima
cloroplastico.
Resistenza geni batterici mutanti insensibili,
varietà isolate mutanti
GS is the target of a major herbicide Basta® (AgrEvo
Co.). The active ingredient in Basta®, Rely®, Finale®,
Liberty® and Ignite® is glufosinate-ammonium.
Glufosinate (= phosphinothricin) is a substrate analogue of
glutamate and strong inhibitor of GS causing toxic levels of
ammonium to buildup in treated plants.
Thus it is a broad-spectrum herbicide. Glufosinate is
rapidly degraded in the soil leaving behind no toxic
residues.
-bar, isolato da Streptomyces hygroscopicus, e pat, isolato da S.
viridiochromogenes,
resistenza
al
bialaphos
(fosfinotricina,
nome
commerciale Basta), erbicida, concentrazioni di lavoro 0.5-20mg/lt,
saggiabile con acetilCoA radioattivo.
GENI REPORTER
Non danno alcun vantaggio selettivo alla pianta ma codificano per
enzimi facilmente evidenziabili o che catalizzano reazioni specifiche i
cui prodotti sono facilmente evidenziabili.
Caratteristiche:
- background assente o trascurabile,
- nessun effetto sul metabolismo cellulare,
- moderatamente stabile in vivo,
- facilmente saggiabile con metodi anche non invasivi, quantitativi,
specifici, sensibili ed economici.
-Glucuronidasi
Gene gus o uidA isolato da E.coli codifica per la glucuronidasi, un’idrolasi che scinde un legame glucuronico,
enzima stabile (!), tollera variazioni in lunghezza,
assente nelle cellule vegetali,
saggiabile con metodi spettrofotometrici,
istochimici e fluorimetrici.
Saggi sono solo invasivi, purtroppo.
Substrato MUG (4-metil-umbelliferil-glucoronide) scisso
dall’idrolasi emette fluorescenza,
substrato
X-gluc
(5-bromo-4-cloro-3-indolilglucoronide) che una volta scisso precipita sotto forma
di un colore blu.
Fluorescenza verde
Gene gfp isolato dalla medusa Aequorea victoria codifica per una
piccola proteina che è in grado di emettere una forte luce verde
brillante (509nm) se eccitata da luce UV o blu (470-490nm), l’emissione
è stabile e non richiede substrati speciali.
L’emissione viene da una interconversione (ciclizzazione) di tre
aminoacidi (ser-tyr-gly) che porta alla formazione di un cromoforo. I
saggi non sono invasivi.