Il laboratorio di Biologia Molecolare: introduzione alle tecniche e alla loro applicazione
Il sequenziamento genico e le sue
applicazioni nella diagnostica
molecolare del laboratorio di
microbiologia e virologia medica
Elisabetta Pagani
Direttrice reggente
Laboratorio Aziendale di Microbiologia e Virologia
Comprensorio Sanitario di Bolzano
1
Trento, 26 novembre 2011
Biologia molecolare: le metodiche in uso presso il
Laboratorio Aziendale di Microbiologia e Virologia
PCR end point (nested-PCR,
reverse transcriptase PCR)
Parvovirus B19
Toxoplasma
HIV Provirus
Norovirus
Sequenziamento
HCV genotipo
HBV genotipo
Resistenze HBV
Identificazione microbica (16S)
MTC + rif res
Tipizzazione Enterovirus
Identificazione miceti
Tipizzazione neuroaminidasi +
emoagglutinina Flu
Genogruppi Norovirus
2 Tipizzazione C. difficile
Definizione resistenze Aspergillus
rtPCR qualitativa
HSV1/2, VZV
Adenovirus
JCV
MTC
Chlamydia trachomatis
Chlamydia pneumoniae
Mycoplasma pneumoniae
Legionella pneumophila
Enterovirus
Influenza A(H1N1, H3N2,H1n1 v)/B
rtPCR quantitativa
HCMV, EBV
BKV
HHV6
HBV, HCV, HIV
Immunoblot
MOTT
Storia della sequenza del DNA
Avery propone il DNA
come materiale genetico
Holley sequenza il tRNA
di lievito
1869
Miescher osserva
per la prima volta il DNA
1953
Watson e Crick determinano la
struttura della doppia elica
1944
1965
1970
METODO SANGER
(terminazione di catena)
METODO MAXAM-GILBERT
(degradazione chimica)
KARY MULLIS
Introduce la PCR
1977
1980
1983
1989
3
Il DNA genomico viene clonato nel fago M13
o in vettori plasmidici, nascono i primi
Programmi informatici di analisi dei dati,
vengono sviluppate
nuove tecnologie per il sequenziamento
AUTOMAZIONE PARZIALE
Vengono sviluppate le prime
Apparecchiature per il sequenziamento
che impiegano sistemi
per la rilevazione della fluorescenza.
BANCHE DATI!!!!!!
Automazione completa
Sequenziamento completo
del genoma umano
Vengono sviluppate le tecniche
per la sintesi degli oligonucleotidi e per
la degradazione chimica del DNA. Viene
introdotta l’elettroforesi su gel per la
Separazione di frammenti di DNA
2000
DEFINIZIONI
Sequenziamento
Il termine, in biologia molecolare, indica il
processo per la determinazione esatta della
struttura primaria di un biopolimero
(basi nel caso di un acido nucleico,
aminoacidi nel caso di proteine)
Sequenziamento del DNA
Determinazione dell'ordine dei diversi nucleotidi
che costituiscono l'acido nucleico
Presupposto
Ogni microrganismo ha porzioni di genoma
comuni ad altri e porzioni esclusive
4
Applicazioni in microbiologia e virologia medica
•Identificazioni: sequenziamento di regioni speciespecifiche (16SrDNA, ITS1-2………)
•Identificazioni: sequenziamento
specifiche (genotipi e sottotipi)
di
regioni
tipo-
•Resistenze ai farmaci: sequenziamento di regioni in
cui possono essere evidenziate mutazioni che
individuano fenotipo resistente
• Studi epidemiologici
filogenetici)
•………
5
(fenomeni
epidemici,
alberi
It is hard to exaggerate the impact of the polymerase chain reaction. PCR, the quick,
easy method for generating unlimited copies of any fragment of DNA, is one of those
scientific developments that actually deserves timeworn superlatives like
"revolutionary" and "breakthrough." - Tabitha M. Powledge
La PCR è una metodica
molecolare che si basa
sull’impiego di un enzima, la
Taq Polimerasi, in grado di
catalizzare in vitro la reazione
di amplificazione di una
particolare sequenza di DNA o
RNA a partire da una frazione
di acido nucleico utilizzato
come stampo
Kary Mullis
6
Metodo enzimatico di Sanger
•Nucleotidi che bloccano l’allungamento del
filamento di acido nucleico: la mancanza del
gruppo ossidrile in 3’ impedisce l’attacco al
7
gruppo
fosforico del nucleotide successivo
Le fasi del sequenziamento
• Amplificazione (PCR/RT-PCR o clonaggio)
•Verifica dell’amplificato (visualizzazione
prodotti di PCR/corsa ellettroforetica)
•Purificazione
(digestione
precipitazione / gel filtrzione)
dei
enzimatica
/
•Verifica
•Quantificazione
•Marcatura (PCR di sequenziamento)
•Purificazione (gel-filtrazione/precipitazione)
•Elettroforesi (capillare)
•Analisi dei
allineamenti)
8
risultati
(elettroferogramma
ed
8
Prima del sequenziamento …
•Scelta del campione (puro) da cui è più indicato
estrarre gli acidi nucleici (diretto o dopo isolamento?)
• Scelta del bersaglio (regione):
-sequenza presente in tutti gli organismi che
desideriamo tipizzare
-sequenza regioni fiancheggianti conservate, ma
contenenti regione variabile
•Messa a punto di una “buona PCR” (scelta dei
primers e delle condizioni di amplificazione)
•Disponibilità di un database contenente le sequenze
con cui si vuole confrontare il bersaglio
9
ALLA FINE DELLA PCR
10
Verifica dell’amplificato
(visualizzazione mediante corsa elettroforetica)
•Camera elettroforetica
•Gel
di
agarosio (1-3%)
(agarosio,
tampone
TBE,
ovvero Tris-borato in EDTA,
etidio bromuro/SYBR Green)
•Colorante
•Ladder
(marker,
peso
molecolare)
•Transilluminatore
(lampada
UV)
Movimento di molecole cariche sottoposte ad un campo elettrico,
generato dalla differenza di potenziale (100 V=50mA), creata da un
alimentatore di corrente; in tampone alcalino (TBE, pH 8.3) o neutro
gli acidi nucleici si comportano come anioni (carica -) e migrano
verso il polo positivo; le molecole di DNA passano attraverso i pori
del gel e a seconda della loro lunghezza percorrono una distanza più
11
11
o meno
lunga
12
Le fasi del sequenziamento
• Amplificazione (PCR/RT-PCR o clonaggio)
•Verifica dell’amplificato (visualizzazione
prodotti di PCR/corsa ellettroforetica)
•Purificazione
(digestione
precipitazione / gel filtrzione)
dei
enzimatica
/
•Verifica
•Quantificazione
•Marcatura (PCR di sequenziamento)
•Purificazione (gel-filtrazione/precipitazione)
•Elettroforesi (capillare)
•Analisi dei
allineamenti)
13
risultati
(elettroferogramma
ed
13
Purificazione dei prodotti di PCR
IMPLICA L’ELIMINAZIONE DI PRIMER, dNTP ED ENZIMA RIMASTI IN
SOLUZIONE AL TERMINE DELLA REAZIONE DI AMPLIFICAZIONE
SI CONSIGLIA
quando la banda è singola EXOSAP-it
(reazione enzimatica): esonucleasi I e fosfatasi
alcalina
(Shrimp
Alkalin
Phosphatase)
degradano primer e dNTPs, ma non rimuovono
sali o altri prodotti secondari
della PCR
quando le bande sono multiple Estrazione da gel
utilizzando colonnine commerciali (ridurre al minimo
le dimensioni della banda tagliata; aumentare il
numero di lavaggi con la soluzione contenente
etanolo; aumentare il tempo della spinnata a vuoto
prima dell'eluizione del DNA dalla colonnina)
Verifica e quantificazione del prodotto purificato
Verifica: visualizzazione dei
prodotti
di
purificazione
mediante
corsa
elettroforetica
Quantificazione del prodotto
di PCR purificato:
• spettrofotometria
• quantitative DNA Ladder
Le fasi del sequenziamento
• Amplificazione (PCR/RT-PCR o clonaggio)
•Verifica dell’amplificato (visualizzazione
prodotti di PCR/corsa ellettroforetica)
•Purificazione
(digestione
precipitazione / gel filtrzione)
dei
enzimatica
/
•Verifica
•Quantificazione
•Marcatura (PCR di sequenziamento)
•Purificazione (gel-filtrazione/precipitazione)
•Elettroforesi (capillare)
•Analisi dei
allineamenti)
16
risultati
(elettroferogramma
ed
16
SEQUENZIAMENTO AUTOMATICO
(metodo di Sanger)
•Richiede la presenza di una molecola stampo di DNA a
singolo filamento e di un oligonucleotide d’innesco
(primer) ad essa complementare
•Il primer si appaia all’estremità in 3’-OH del filamento di
DNA e rende disponibile il proprio terminale idrossilico
per
la reazione di polimerizzazione, catalizzata dalla
DNApolimerasi
• La reazione di sequenza prevede l’utilizzo una miscela di
reazioni
contenente
i
quattro
deossinucleotidi
trifosfati (dNTPs) in quantità
equimolari
e
un
dideossinucleotide (ddNTP)
presente
in bassa
concentrazione
17
Nucleotidi terminatori (ddNTP)
•Nucleotidi che bloccano
l’allungamento
del
filamento
di
acido
nucleico: la mancanza
del gruppo ossidrile in 3’
impedisce l’attacco al
gruppo
fosforico
del
nucleotide successivo
•Nucleotidi marcati con
32P (in passato) o
molecole fluorescenti
(recentemente)
18
Quando la catena nascente incorpora un ddNTP, la
reazione di polimerizzazione si
arresta e si ha la terminazione della catena; ciò avverrà più volte, in posizioni diverse della
sequenza, generando una serie di frammenti interrotti di lunghezza variabile.
19
Produzione dei frammenti (metodo di Sanger)
5’
3’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
3’
5’
molecola stampo di DNA a singolo filamento
5’
3’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
3’
5’
Produzione dei frammenti (metodo di Sanger)
5’
3’
oligonucleotide d’innesco (primer)
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
5’
3’
TTACGTAACGTCA
3’
5’
il primer si appaia all’estremità in 3’-OH del filamento di DNA e rende
disponibile il proprio terminale idrossilico per
la polimerizzazione
5’
3’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
dA
dC
dG
dT
+ DNA Polimerasi
5’
3’
TTACGTAACGTCA
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
3’
5’
Produzione dei frammenti (metodo di Sanger)
5’
sintesi del DNA
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
3’
5’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
3’
3’
5’
22
Produzione dei frammenti (metodo di Sanger)
miscela di reazione contenente i deossinucleotidi trifosfati
(dNTPs) in quantità equimolari e i dideossinucleotidi (ddNTP)
a bassa concentrazione
5’
3’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCG
5’
3’
TTACGTAACGTCA
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGC
3’
5’
dA
dC
dG
dT
+ DNA Polimerasi
ddA
ddC
ddG
ddT
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
TTACGTAACGTCAGA
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
TTACGTAACGTCAGAA
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
TTACGTAACGTCAGAAC
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
TTACGTAACGTCAGAACG
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
TTACGTAACGTCAGAACGT
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
TTACGTAACGTCAGAACGTC
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
Produzione dei frammenti (metodo di Sanger)
25
Quando la catena nascente
incorpora un ddNTP, la reazione
di polimerizzazione si arresta e si
ha
terminazione,
altrimenti
l’allungamento
prosegue;
ciò
avverrà più volte, in posizioni
diverse
della
sequenza,
generando
una
serie
di
frammenti interrotti di lunghezza
variabile: se il bersaglio è
composto da n nucleotidi si
avranno frammenti di tutte le
lunghezze possibili da 1 a n,
separabili
mediante
corsa
elettroforetica
Coniugando a ciascun ddNTP un diverso marcatore
fluorescente è possibile distinguerli e, indipendentemente dalla
lunghezza, tutti i frammenti terminanti con A emetteranno
fluorescenza di tipo A, quelli terminanti con citosina di tipo C e
26
via di seguito
Produzione dei frammenti (metodo di Sanger)
Quando la catena nascente incorpora un ddNTP, la reazione di
polimerizzazione si arresta e si ha terminazione, altrimenti
l’allungamento prosegue; ciò avverrà più volte, in posizioni diverse
della sequenza, generando una serie di frammenti interrotti di
27
lunghezza
variabile.
Fluorocromi
28
Fluorocromi
29
PCR di sequenziamento: metodo Sanger o enzimatico
reagente
Due reazioni parallele, utilizzando in ciascuna, un
solo primer (forward o reverse)
RRBigDye1.1/3.1
4 /2 µl
Buffer5X
2 /3 µl
H2O
PRIMER (HPLC-purificati): sovrapposto, meglio
se interno, al primer di I amplificazione
(forward/reverse)
3,2 pmol
Buffer 5X: tampone di reazione con Mg++
per 1
campione
3.8 /6.8 µl
Primer (1pmol/µl)
V intermedio
3.2µl
13 /15
EXOs-product
7/5µl
Volume finale
20µl
2 ml
Big Dye Terminator Kit
ENZIMA: polimerasi (T-elongazione=60°C)
DEOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATO (dNTPs): dATP,
dCTP, dGTP, dTTP : precursori del DNA
DI-DEOSSINUCLEOTIDI
nucleotidi terminator
TRIFOSFATO:
TARGET: amplicone purificato
30
ddNTPs,
Ready Reaction Mix
(2,5X)
4 ml
5 ng/100 bp
Protocollo di reazione:
temperature e tempi
Denaturazione iniziale: 1’ @ 96°C
Denaturazione: 10’’ @ 96°C
Annealing: 5’’ @ 50°C
25 cicli
Elongazione: 4’’ @ 60°C
•evitare temperature di annealing<50°C
•nel caso di primers con Ta>60°C, eliminare lo step di annealing (10’’ @ 96°C,
4’ @ 60°C)
•aumentare il nr. di cicli se il prodotto di I amplificazione è debole
31
Le fasi del sequenziamento
• Amplificazione (PCR/RT-PCR o clonaggio)
•Verifica dell’amplificato (visualizzazione
prodotti di PCR/corsa ellettroforetica)
•Purificazione
(digestione
precipitazione / gel filtrzione)
dei
enzimatica
/
•Verifica
•Quantificazione
•Marcatura (PCR di sequenziamento)
•Purificazione (gel-filtrazione/precipitazione)
•Elettroforesi (capillare)
•Analisi dei
allineamenti)
32
risultati
(elettroferogramma
ed
32
Metodi di purpficazione (ddNTPs non incorporati)
33
G
e
l
f
i
l
t
r
a
z
i
o
n
e
34
Elettroforesi
• Amplificazione (PCR/RT-PCR o clonaggio)
•Verifica dell’amplificato (visualizzazione dei prodotti di
PCR/corsa ellettroforetica)
•Purificazione (digestione enzimatica / precipitazione /
gel filtrzione)
•Verifica
•Quantificazione
•Marcatura (PCR di sequenziamento)
•Purificazione (gel-filtrazione/precipitazione)
•Elettroforesi (capillare)
•Analisi
dei risultati (elettroferogramma ed allineamenti)
35
Corsa elettroforetica
36
Viene utilizzato un gel ad
altissima
risoluzione
(poliacrilamide
4-6%),
in
condizioni denaturanti (urea),
capace di separare frammenti di
DNA che differiscono tra di loro
per
un
solo
nucleotide
(spessore del gel: 0,3-0,4 mm;
lunghezza lastre di vetro: 40 cm
circa)
Precursori normali del
deossiribonucleosidetrifosfato
Innesco per la DNA
polimerasi marcato
a fluorescenza
5’
3’
Piccola quantità del
dideossiribonucleosidetrifosfato
DNA - POLIMERASI
GCTACCTGCATGGA
CGATGGACGTACCTCTGAAGCG
3’
5’
Molecola di DNA
a singolo filamento
da sequenziare
L’infrequente incorporazione del dideossiribonucletide
blocca l’ulteriore accrescimento della molecola di DNA
GCTACCTGCATGGA
GCTA
GCTACCTGGA
Miscela di molecole di DNA
fluorescenti di diversa lunghezza,
tutte terminate da A
Quattro inneschi fluorescenti di colore diverso incubati nella miscela di
nucleotidi contenente un diverso dideossiribonucleosidetrifosfato che
termina la catena (A, C, G, T)
Miscela di molecole di
diversa lunghezza tutte
terminate da A
Miscela di molecole di
diversa lunghezza tutte
terminate da C
A
37
A C G
T CA
G
T T GA G T C
G A
C C A G
T
T
G
A T GT C
A
Miscela di molecole di
diversa lunghezza tutte
terminate da G
C
G
T
Miscela di molecole di
diversa lunghezza tutte
terminate da T
Elettroforesi
L’intensità e la lunghezza d’onda delle emissioni fluorescenti
vengono captate durante l’elettroforesi, quando i frammenti di
DNA,
eccitati dalla luce laser, passano davanti ad un rilevatore
38
Elettroforesi
39
Il sequenziamento automatizzato
(ABI Prism 3130 Genetic Analyzer)
40
41
Il sequenziamento automatizzato (elettroforesi capillare)
Lo strumento, dopo aver prelevato il
prodotto della PCR di marcatura lo
sottopone ad elettroforesi all’interno di un
capillare in vetro-resina di diversa
lunghezza a seconda delle esigenze
Il capillare, del diametro di 50 mm,
contiene
un
polimero
di
corsa,
automaticamente caricato dal sistema
Esistono sistemi a 1, 4,
16 e 96 capillari
Un raggio laser colpisce il capillare eccitando i fluorocromi marcanti i
frammenti di diversa lunghezza
42
Una cellula fotoelettrica rileva e memorizza i segnali fluorescenti
43
Calibrazioni: spettrale + spaziale
44
Analisi dei risultati
• Amplificazione (PCR/RT-PCR o clonaggio)
•Verifica dell’amplificato (visualizzazione dei prodotti di
PCR/corsa ellettroforetica)
•Purificazione (digestione enzimatica / precipitazione /
gel filtrzione)
•Verifica
•Quantificazione
•Marcatura (PCR di sequenziamento)
•Purificazione (gel-filtrazione/precipitazione)
•Elettroforesi (capillare)
•Analisi
dei risultati (elettroferogramma ed allineamenti)
45
Elettroferogramma (Sequencing Analysis 5.2 AB)
•Durante la corsa elettroforetica i frammenti di DNA vengono colpiti da un
raggio laser (emissione a 490 nm)
•Questo provoca l’eccitamento dei fluorocromi che marcano i frammenti
•Ciascuno dei quattro fluorocromi emette ad una lunghezza d’onda diversa
•Una cellula fotoelettrica rileva sequenza, tipo ed intensità delle emissioni
luminose
•Il tutto viene convertito in un sistema grafico
•La sequenza dei picchi corrisponde alla sequenza dei nucleotidi ed il colore
del picco corrisponde al tipo di base azotata
46
Raw data (Sequencing Analysis 5.2 AB)
47
ELETTROFEROGRAMMA
48
Analisi dei risultati: qualità
49
Allineamenti: banche dati
50
GenBank
•Banca
dati
ad
accesso
libero
(internet)
•Circa 50 milioni di
sequenze
geniche
(animali e vegetali)
•Permette il confronto
della propria sequenza
in tempo reale: motore
di ricerca (programma
blast)
individua le
sequenze con il più
elevato
grado
di
omologia
•Chiunque
può
depositarvi le proprie
sequenze
51
52
53
Blast
54
Blast
55
Blast
56
Blast
57
Altre banche dati: redom
58
Altre banche dati: redom
59
Altre banche dati: redom
60
Altre banche dati: redom
61
Banche dati dedicate: HCV sequence database
62
Banche dati dedicate: HCV sequence database
63
Banche dati dedicate: HCV sequence database
64
Banche dati dedicate: geno2pheno
65
66
Applicazioni: la nostra esperienza
Individuazione delle regioni da sequenziare
(campione di partenza)
Ricerca di una library (database)
Definizione del flusso di lavoro
Messa a punto e validazione
Controlli di qualità
Introduzione nella pratica giornaliera
67
Applicazioni: la nostra esperienza
• Determinazione dei differenti genotipi (1-3%) e sottotipi (0.5-1%) virali
per HCV (NS5B)
•Determinazione dei differenti genotipi virali per HBV e individuazione del
genotipo resistente a Lamivudina, Adefovir, e/o Entecavir (Tenofovir,
Telbivudina)(pol)
•Identificazioni batteriche (16SrDNA)
•Identificazioni micobatteri per la speciazione all’interno del MTC (gyrB) e
definizione delle resistenze alla rifampicina (RNApolβ
β: rpo/TB)
•Identificazione dei miceti (ITS)
•Tipizzazione Enterovirus (5’UTR)
•Sorveglianza epidemiologica dell’influenza (emoagglutinina)
•Sorveglianza epidemiologica Clostridium difficile (proteina C)
Micobatteri
• OBIETTIVI:
1) rapida distinzione, nell’ambito del MTC, tra M. tuberculosis, M.
bovis (intrinsecamente resistente alla pirazinamide, farmaco di
dimostrata epatotossicità), M. africanum, M. microti;
2) rapida identificazione dei ceppi resistenti alla rifampicina, più
diffusi nei pazienti stranieri, ma rilevati anche negli autoctoni.
• PUNTO DI PARTENZA:
1) le metodiche molecolari in uso (Innolipa) differenziano bene i
MOTT, ma non sono in grado di distinguere all’interno
dell’MTC;
2) l’esecuzione dell’antibiogramma (metodo di riferimento)
richiede in media 20 gg.
Individuazione della regione: gyrB (no 16SrDNA, no ITS)
70
Database gyrB
71
S
E
Q
U
E
N
C
I
N
G
A
N
A
L
Y
S
I
S
5.2 72
Ridom
73
Ridom
74
IL SEQUENZIAMENTO GENICO NELLA PRATICA DEL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA e VIROLOGIA: L’ESPERIENZA DEL COMPRENSORIO SANITARIO di BOLZANO
… e perché non Blast?
75
IL SEQUENZIAMENTO GENICO NELLA PRATICA DEL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA e VIROLOGIA: L’ESPERIENZA DEL COMPRENSORIO SANITARIO di BOLZANO
Limiti
76
Il nostro protocollo/flusso di lavoro
Coltura positiva
MOTT
Innolipa
MTC
SEQ
Rif-RES?
Messa a punto e validazione
Prof. Proedinger; Division of Hygiene
and
Medical
Microbiology,
Department of Hygiene, Microbiology
and
Social
Medicine,
Innsbruck
Medical
University,
Innsbruck,
Austria.
:
MIRU
genotyping
(mycobacterial interspersed repetitive
units)
78
Genotipizzazione HBV: individuazione della regione
79
Primers e condizioni d’amplificazione
reagente
80
per 1
campione
SYBR GREEN
MasterMix
10 µl
primerMix(HBPr256+
KL14;10pmol/ µl)
2 µl
Volume intermedio
12µl
DNA estratto (easy mag)
9µl
Volume finale
21µl
per
campioni
Datbase
60 genotipi
81
Esempio (ridom)
HBV genotipo D
Conferma Prof. Norder/Dr.ssa Crovatto
82
83
BIOLOGIA MOLECOLARE e VIROLOGIA
Chiara Cemin
Dr.ssa Federica Folli
Adriana Giacomozzi
Valentina Pasquetto
Valentina Poletta
Silvia Ruggeri
84
85
Domande??????
