Ricombinazione microrganismi 5A [Compatibility Mode]

GENETICA BATTERICA
MECCANISMI DI VARIABILITA’ GENETICA
• La biodiversità nei microrganismi, come in tutti i viventi , dipende
da un buon equilibrio tra i processi di conservazione e quelli di
cambiamento del materiale genetico.
• I processi molecolari e cellulari atti alla trasmissione invariante del
genoma ( duplicazione DNA, riproduzione asessuata) sono integrati
da altri processi che permettono di rimescolare i geni e riarrangiare i
cromosomi ( es. ricombinazione e riproduzione sessuata ).
N.B. E’ necessario ripassare i processi di divisione cellulare e la
riproduzione : ( mitosi, meiosi, riproduzione asessuata nei procarioti,
riproduzione sessuata , cicli riproduttivi).
MECCANISMI DI RICOMBINAZIONE
Analizziamo sinteticamente alcuni meccanismi di
ricombinazione:
a) Ricombinazione omologa o generale
b) Ricombinazione sito- specifica
c) Ricombinazione per trasposizione
Ricombinazione omologa
La ricombinazione omologa può coinvolgere due
sequenze omologhe qualsiasi; avviene con il crossing
over tra tetradi durante la profase della meiosi.
Essa svolge tre funzioni:
1. contribuisce alla riparazione dei diversi tipi di
danneggiamento del DNA;
2. rende possibile il contatto fisico tra cromatidi non fratelli
di una coppia di cromosomi omologhi, importante per
avere una corretta segregazione dei cromosomi
omologhi alla prima divisione meiotica;
3. Contribuisce alla diversità genetica di una popolazione.
Ricombinazione omologa durante la meiosi
Ricombinazione sito- specifica
•
•
•
La ricombinazione sito- specifica
avviene tra due elementi di DNA in
cui sono presenti due siti di
ricombinazione caratterizzati da corte
regioni di omologia;
i siti di ricombinazione sono
riconosciute da proteine( ricombinasi)
che avvicinano i due siti, tagliano i
filamenti di DNA e li riattaccano dopo
lo scambio.
La ricombinazione sito - specifica
può dar luogo a cambiamenti diversi
nel genoma ( es. inserzione o
escissione di un tratto di DNA ) .
Ricombinazione sito- specifica
Ricombinazione per trasposizione
Si tratta di segmenti di DNA presenti in
tutte le cellule, che si spostano da un
punto di un cromosoma ( sito del
donatore) a un altro nello stesso
cromosoma o in uno diverso ( il sito
bersaglio)
•
Non è necessaria omologia tra il
trasposone e il sito di integrazione,
quindi l’inserimento può avvenire in
qualsiasi punto del genoma.
•
Il processo della trasposizione può
avvenire con modalità differenti :
meccanismo taglia - incolla
trasposizione con duplicazione del
trasposone oltre al trasferimento.
-
RICOMBINAZIONE NEI MICRORGANISMI
• TRASFORMAZIONE
• CONIUGAZIONE
• TRASDUZIONE
TRASFORMAZIONE
•
•
Grifft ha individuato il primo
meccanismo di scambio genetico
nei batteri e ha posto le basi per
dimostrare che l’informazione
genetica è codificata dalla
molecola del DNA.
Analizzando le figure che
seguono si possono seguire le
diverse fasi dell’esperimento di
Grifft.
TRASFORMAZIONE
Condizioni necessarie sono:
• - La presenza di DNA libero.
• - Stato di competenza della
cellula ricevente.
La
cellula
è
normalmente
impermeabile al DNA, a meno che
non si trovi in uno stato di
competenza (formazione di pori
transitori nella membrana che
permettono
il
passaggio
di
molecole di DNA).
A questo punto i frammenti di
DNA entrano, si appaiano e
possono ricombinarsi (a sinistra)
Cellule competenti
Le cellule possono essere
rese competenti in modo
artificiale:
- trattamento in soluzione di
CaCl2
- elettroporazione
I batteri Gram-negativi vengono trattati con agenti chimici o fisici, quindi il DNA
attraversa il doppio strato della membrana esterna e della membrana citoplasmatica
e raggiunge i siti dove può essere espresso e replicato. I batteri Gram-positivi non
possiedono la membrana esterna propria degli organismi gram-negativi. Tuttavia
l’ingresso del DNA è impedito dalla presenza di uno strato rigido esterno di mureina o
peptidoglicani, che è molto più spesso del suo equivalente nei batteri gram- negativi.
Questo strato deve essere preventivamente idrolizzato con lisozima, quindi i
protoplasti (cioè i batteri senza parete cellulare) si possono trasformare. Negli studi di
ingegneria genetica, per trasferire DNA nelle cellule è stato necessario trovare un
modo per rendere competente Escherichia coli.
CONIUGAZIONE BATTERICA
• Esperimento di Lederberg- Tatum, 1946, E. coli
• Utilizzo di mutanti poliauxotrofici, per escludere
retromutazioni che diano falsi positivi
Ceppo a. E. coli met- bio- thr+ leu+
x
Ceppo b. E. coli met+ bio+ thr- leu-
10-7
met+ bio+ thr+ leu+
“exconiuganti” o “ricombinanti”
Non compaiono cellule
prototrofe: perché
avvenga la coniugazione
è necessario il contatto
fisico fra i due ceppi
• Escludono trasformazione seminando in tubo a U, con
terreno minimo e filtro permeabile a DNA, aa, virus ma
non batteri.
• Concludono che è necessario contatto fisico
In cosa differisce la coniugazione batterica
coniugazione negli eucarioti, anche microbici?
dalla
• I ceppi parentali non mettono in compartecipazione il loro
intero genoma
- non si formano “figli” diploidi, e
- non si ha segregazione dei caratteri parentali
• Il contributo dei genomi parentali alla composizione genomica
del genoma “ricombinante” è asimmetrico:
- un batterio funge da “ricevente”, l’altro da donatore
• Un batterio “donatore” può trasmettere con alta frequenza al
“ricevente” la capacità di fungere da “donatore”
- “Fattore di fertilità” F: un elemento "infettivo“
Batteri F+: donatori
- di marcatori genetici
- di F
Batteri F-: riceventi
Coniugazione batterica:
F+ x FTrasferimento del plasmide F da
un batterio donatore ad un ricevente
mediante coniugazione.
La coniugazione può avvenire tra
ceppi della stessa specie o tra ceppi
di specie e generi diversi (anche se
con una frequenza minore)
•Il DNA viene trasferito con un
meccanismo noto come rolling
circle, che prevede la formazione di
un intermedio a singolo filamento
Completato il trasferimento
entrambe le cellule contengono una
copia completa del plasmide F e
possono comportarsi da donatore.
Coniugazione batterica
Hfr x F• La cellula batterica Hfr ha il
plasmide integrato nel cromosoma
batterico; si tratta di cellule ad alta
frequenza di ricombinazione.
• L’integrazione del plasmide F non
avviene in regioni casuali del
genoma batterico.
• nella coniugazione Hfr e F- anche
geni del cromosoma batterico
possono essere trasferiti da una
cellula donatore a una cellula
ricevente.
• l’elica intatta funge da stampo nel
donatore, quella interrotta
incomincia a essere trasferita.
• solo pochi geni di norma si
trasferiscono, perchè l’intero
cromosoma richiede tempi lunghi e
il ponte di coniugazione si rompe
facilmente.
•Le cellule riceventi rimangono F-,
ma sono caratterizzate da una
maggiore frequenza di
ricombinazione.
TRASDUZIONE
•
•
•
Processo ricombinante osservato per la prima volta da Zinder…. (1952)
lavorando con due ceppi auxotrofi :
Ceppo auxotrofo phe- ,trp-, tyrCeppo auxotrofo met-, hisInoculati insieme in terreno minimo hanno ottenuto colonie , quindi
comparsa di ricombinanti.
Le prove con tubo a U e trattamento con DNasi facevano escludere sia la
coniugazione sia la trasformazione
Quale spiegazione dare al fenomeno ?
Ipotizzarono che l’agente trasformante poteva essere un virus; tale ipotesi
ha avuto conferma con successive esperienze.
TRASDUZIONE
Per capire il processo di ricombinazione
genetica mediante virus ( trasduzione) è
necessario analizzare le modalità di
riproduzione virale all’interno della cellula
batterica , che risultano evidenziate nelle
successive slide.
Ciclo litico e ciclo lisogeno
QUAL E’ IL SIGNIFICATO DELLA LISOGENIA ?
Per i batteriofagi (virus):
- attesa di tempi migliori per riprodursi , in quanto la
replicazione può portare all’eliminazione delle cellule ospiti.
Per i batteri (ospite):
- stato di immunità nei confronti dell’infezione da parte dello
stesso virus ;
- trasferimento orizzontale di geni batterici alla base del
processo di trasduzione
SIGNIFICATO LISOGENIA
Per i batteriofagi (virus):
- attesa di tempi migliori per riprodursi , in quanto la
replicazione può portare all’eliminazione delle cellule ospiti.
Per i batteri (ospite):
- stato di immunità nei confronti dell’infezione da parte dello
stesso virus ;
- trasferimento orizzontale di geni batterici alla base del
processo di trasduzione
TRASDUZIONE
• IL processo di trasduzione permette il trasferimento di
geni da batterio a batterio ad opera di batteriofagi.
• In base al meccanismo con cui avviene il trasferimento
dei geni si possono distinguere due tipi di trasduzione:
- trasduzione generalizzata: trasferimento di qualsiasi
segmento di genoma batterico
- trasduzione specializzata : trasferimento di un limitato
numero di geni specifici
TRASDUZIONE
GENERALIZZATA
Errori nel montaggio dei fagi
determinano incorporazione del
DNA batterico nel capside ,avente
dimensioni uguali a quello del fago.
Il DNA trasdotto giunto nella cellula
ricevente può:
1.
2.
Integrarsi al cromosoma
dell’ospite
essere denaturato.
N.B. Il virus trasducente
generalmente non riesce a
replicarsi proprio per mancanza
di genoma completo.
TRASDUZIONE
SPECIALIZZATA
LaTrasduzioneSpecializzata
richiede l’integrazione del genoma
virale nel cromosoma batterico e
viene quindi effettuata solo da
virus LISOGENI.
LaTrasduzioneSpecializzata
determina quindi il trasferimento,
con elevata efficienza, di geni
batterici posti vicino al sito di
integrazione del profago lisogeno.
(DNA misto ).
Il distacco del DNA misto potrà
essere incapsidato in una
particella fagica che in caso di
successiva infezione dei fagi potrà
essere inserito in regioni di
omologia nella cellula ricevente.