Procedure di controllo qualità dei dati bio-geochimici

Procedure controllo di qualità dei dati
Indice
1
PREMESSA .................................................................................................................................... 2
2
DATABASE BIOGEOCHIMICO ..................................................................................................... 3
2.1
2.1.1
Temperatura e salinità ......................................................................................... 3
2.1.2
Ossigeno disciolto .............................................................................................. 4
2.1.3
Nutrienti inorganici (NO2, NO3, NH4, SiO4, PO4) ................................................ 4
2.1.4
Clorofilla a ........................................................................................................ 5
2.2
QUALITY CONTROL .............................................................................................. 5
2.2.1
Temperatura ...................................................................................................... 8
2.2.2
Salinità.............................................................................................................. 8
2.2.3
Ossigeno disciolto .............................................................................................. 9
2.2.4
Nutrienti............................................................................................................ 9
2.2.5
Clorofilla a ...................................................................................................... 10
2.3
3
METODICHE UTILIZZATE ..................................................................................... 3
LETTERATURA .................................................................................................... 11
DATA SET FITOPLANCTON E MESOZOOPLANCTON ............................................................ 13
3.1
METODICHE UTILIZZATE ................................................................................... 13
3.1.1
Fitoplancton .................................................................................................... 13
3.1.2
Zooplancton .................................................................................................... 14
3.2
QUALITY CONTROL ............................................................................................ 15
3.2.1
3.2.1.1
Documentazione dei metodi ........................................................................... 16
3.2.1.2
Strumentazione ed apparecchiature ................................................................. 18
3.2.1.3
Impiego di personale adeguatamente formato ................................................... 18
3.2.1.4
Analisi dei campioni fito- e zooplanctonici ...................................................... 19
3.2.2
3.3
Controllo interno di qualità ................................................................................ 16
Controllo esterno della qualità ........................................................................... 20
LETTERATURA .................................................................................................... 20
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1
Premessa
La valutazione della qualità dei dati attraverso procedure di controllo di qualità (QC) è un
elemento indispensabile nella condivisione di dataset. Nel caso dei dati raccolti nel Golfo di
Napoli, dal 1984 ad oggi, alla stazione LTER-MC, intorno alla quale sarà costruito un
dimostratore di Osservatorio, le procedure di QC ad oggi sono consistite in operazioni di
‘pulizia dei dati’ sulla base dell’esperienza diretta dei ricercatori che li hanno prodotti negli
anni e della loro conoscenza del sito, che hanno permesso l’uso di dati in pubblicazioni
scientifiche prodotte dagli stessi ricercatori. Nella nuova fase di pubblicazione e condivisione
dei dati, prevista nel caso di un Osservatorio, è necessario che questi siano corredati da
informazioni che ne evidenzino la robustezza (o i limiti). In questo modo si permetterà la
piena fruizione del dataset evitando possibili errori nel loro uso.
Nell’ambito dell’azione 2 dell’ SP5-RITMARE sono stati quindi individuati i criteri e le
procedure idonee ad un QC basato su criteri largamente accettati dalla comunità scientifica,
identificati sulla base di metodologie pubblicate o disponibili sul web, che vengono di
seguito illustrati separatamente per il data set biogeochimico e per quello relativo al
fitoplancton e al mesozooplancton. Tali procedure sono precedute da una descrizione
sintetica dei dataset e delle metodologie applicate per l’acquisizione dei dati, che hanno
subito alcune variazioni nel corso degli anni.
È importante a sottolineare la differenza fra le due tipologie di dati. Per i dati biogeochimici,
il controllo di qualità è volto ad individuare possibili errori nella raccolta, trattamento ed
analisi dei campioni (ad esempio, inquinamento dei campioni con sostanze estranee), così
come possibili malfunzionamenti delle strumentazioni o anche errori nei calcoli. Nel caso dei
dati di biodiversità planctonica, dove è preponderante il ruolo dell’operatore che esegue il
conteggio, un primo controllo di qualità relativo ad errori di raccolta e trattamento del
campione avviene già nella fase di osservazione del campione e produzione del dato, mentre
gli errori, derivanti principalmente da limiti nelle conoscenze generali o degli operatori stessi,
sono difficilmente identificabili ‘a posteriori’.
I contenuti di seguito esposti faranno parte di un booklet disponibile sul sitoweb
http://szn.macisteweb.com/.
Nella fase pratica di applicazione, le procedure QC descritte di seguito subiranno
presumibilmente modifiche in relazione alla natura dei dati stessi, per cui il booklet sarà
periodicamente aggiornato e integrato con informazioni aggiuntive.
2
2
DATABASE BIOGEOCHIMICO
Il database biogeochimico di pubblico accesso della LTER-MC include i seguenti parametri:
Temperatura
Salinità
Ossigeno disciolto
Nutrienti (NO2, NO3, NH4, SiO4, PO4)
Clorofilla a (Chla).
I dati di temperatura, salinità, ossigeno disciolto e nutrienti sono stati acquisiti a 10 profondità
(0,-2,-5,-10,-20,-30,-40,-50,-60 e -70m) mentre le misure di Chl a sono state effettuate su 7
quote (0,-2,-5,-10,-20,-40,-60m).
I campionamenti sono stati effettuati con cadenza quindicinale dal 26/01/1984 al 30/07/1991
e con cadenza settimanale dal 21/02/1995 ad oggi.
Informazioni sintetiche sulla strumentazione e le metodiche utilizzate sono riportate nel
seguente paragrafo.
2.1 METODICHE UTILIZZATE
Margiotta F., Conversano F. e Ribera d’alcalà M.
Temperatura e salinità
Dal 26/01/1984 al 12/09/1995 la temperatura è stata misurata con termometri a
rovesciamento. Per la salinità, i campioni sono stati raccolti dalle bottiglie Niskin da 5 litri in
bottiglie di vetro 250 ml e analizzati successivamente in laboratorio.
La salinità è stata determinata con un Salinometro Beckman (mod. RS7C) utilizzando come
metodo di riferimento Grasshoff (1983) e successivamente un salinometro Autosal della
Guildline Instruments.
Dal 03/10/1995 al 17/12/2003, tutti i profili per l’acquisizione dei parametri fisici (pressione,
temperatura, salinità) nello strato 0-70 metri sono stati ottenuti con un sonda
multiparametrica della Sea-Bird Electronics modello 911plus. Per la raccolta dei campioni
d’acqua è stato utilizzato un campionatore automatico con 10-12 bottiglie NISKIN da 10 litri
ciascuna.
3
Per i dati del 2000, alcuni profili di temperatura e salinità mancanti, sono stati ricostruiti a
partire dai valori di salinità e temperatura ottenuti dalle misure BTL riportati a 1 m di
risoluzione adattando il metodo DINEOF (Data Interpolating Empirical Orthogonal
Functions), descritto in Beckers and Rixen (2003), al dataset Marechiara. Il metodo di
ricostruzione si basa sulla stima iterativa dei modi EOF che dominano la variabilità di un
vettore di stato multivariato (normalizzato) di temperatura e salinità. La corrispondente
matrice delle osservazioni è costruita a partire dalle misure CTD (1m di risoluzione verticale)
e dalle misure su una o più quote fisse (BTL: 0 m, 2 m, 5 m, 10 m, 20 m, 30 m, 40 m, 50 m,
60 m, 70 m). Il calcolo iterativo permette di 'riempire' le quote non campionate con le
bottiglie sfruttando la maggiore risoluzione dei dati CTD (Beckers & Rixen, 2003).
Dal 08/01/2004 ad oggi, tutti i profili per l’acquisizione dei parametri idrografici (pressione,
temperatura, salinità), biogeochimici (fluorescenza e ossigeno disciolto) e ottici (PAR), sono
stati ottenuti con una sonda multiparametrica della Sea-Bird Electronics modello 911plus®.
La sonda acquisisce 24 dati al secondo con una accuratezza di 0.001 °C per la temperatura e
0.0003 S/m per la conducibilità. Il CTD è stato calibrato periodicamente presso l’OGS di
Trieste. Per la raccolta dei campioni d’acqua è stato utilizzato un campionatore Carousel con
12 bottiglie NISKIN da 10 litri ciascuna.
Ossigeno disciolto
Dal 26/01/1984 al 17/12/2003 I campioni di acqua sono stati raccolti in bottiglie pirex dalle
bottiglie Niskin. La concentrazione è stata determinata con il metodo Winkler (Carpenter,
1965) utilizzando sia una buretta manuale per il rilevamento degli endpoint che un titolatore
automatico modello DMS 716 Titrino della Metrohm.
Dal 08/01/2004 ad oggi la concentrazione è stata determinata con il metodo Winkler
(Carpenter, 1965) utilizzando un titolatore automatico modello 798 MPT Titrino della
Metrohm. Nel 2009, in alcuni campionamenti non è stato possibile effettuare la
determinazione dell’ossigeno disciolto con il metodo Winkler. Nel database sono stati
riportati, quindi, i dati acquisiti con la sonda multiparametrica.
Nutrienti inorganici (NO2, NO3, NH4, SiO4, PO4)
Dal 26/01/1984 al 14/02/2006, Ii campioni di acqua per la determinazione delle
concentrazioni di nutrienti sono stati raccolti in fiale di polietilene da 20 ml direttamente dalle
bottiglie Niskin. I campioni sono stati congelati subito dopo il prelievo ed analizzati
successivamente in laboratorio. Le concentrazioni sono state determinate utilizzando un
Autoanalyzer ed il metodo di riferimento è stato Grasshoff (1983).
Dal 23/02/2006 ad oggi, le concentrazioni sono state determinate utilizzando un
AutoAnalyzer Flow Sys (SYSTEA) utilizzando come base le metodiche descritte in
Grasshoff (1983) in parte rivisitate come descritto in Saggiomo et al. (2010).
4
Clorofilla a
Dal 0/01/1984 al 01/08/2006 i campioni di acqua sono stati raccolti con bottiglie Niskin alle
profondità 0-2-5-10-20-40-60 m. E’ stato filtrato un volume variabile di acqua di mare (200520 ml) su filtri Whatman GF/F (fibra di vetro) dal diametro di 25 mm. In laboratorio si è
proceduti all’estrazione dei pigmenti in 10 ml di acetone al 90% neutralizzato. Le
concentrazioni di Chl a e dei feopigmenti sono state determinate sia con uno spettrofotometro
(Strickland and Parsons, 1972) e successivamente con uno spettrofluorimentro (Holm-Hansen
et al., 1965; Neveux and Panouse, 1987).
Dal 08/08/2006 ad oggi le concentrazioni sono state determinate utilizzando uno
spettrofluorimetro RF-5301 PC (Shimadzu), utilizzando la metodica riportata in HolmHansen et al., 1965 .
Al fine di stimare la precisione e l’accuratezza delle misure in corso, si provvederà ad
effettuare quanto prima delle analisi su campioni replicati e si cercherà di partecipare a test di
calibrazione internazionali (QUASIMEME).
2.2 QUALITY CONTROL
Per poter assegnare un quality flag ai dati acquisti (1984-2010), è stato identificato il
seguente controllo di qualità, ottenuto rielaborando le procedure proposte durante il primo
IODE Workshop (2010), nel WP15 di MyOcean (2011), in Segura-Noguera et al. (2011).
Tabella 1: Flag adottati nel Quality Control dei dati biogeochimici
QF
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Significato
Non è stato eseguito nessun QC
Dato buono
Dato probabilmente buono
Dato probabilmente cattivo
Dato cattivo
Valore manipolato
Valore al di sotto del limite di detezione
Valore superiore al range individuato
Valore interpolato
5
9
Valore mancante
Per ogni dato deve essere necessariamente assegnato almeno uno dei flag in grigio.
Il significato del QF può essere riassunto come segue:
QF=0 prima di poter utilizzare il dato, l’utente dovrebbe effettuare un QC
QF=1 Possono essere utilizzati senza ulteriori controlli
QF=2 i dati potrebbero essere utilizzabili per alcune applicazioni, l’utilizzatore
dovrebbe contattare il data manager per ottenere specifiche informazioni sul dato in
questione
QF=3 il dato non è utilizzabile ma potrebbe essere potenzialmente correggibile
QF=4 dato non utilizzabile
QF=5,6,7,8 dati utilizzabili per alcune specifiche applicazioni con le limitazioni del
caso.
Come può dedursi dalla descrizione dei flag, esiste anche una componente soggettiva
giustificabile in base all’esperienza dei produttori dei dati e alla loro consocenza del sito. Per
ridurre al minimo la componente soggettiva sono stati elaborati dei criteri quantitativi basati
sulle proprietà statistiche delle distribuzioni dei dati, e sui vincoli imposti alla loro covarianza
dai processi oceanogafici conosciuti. Questo secondo approccio, peraltro largamente
utilizzato in oceanografia, contiene anch’esso una componente non oggettiva, in quanto
ipotizza che la covarianza rifletta relazioni ricorrenti tra i valori dei parametri, che in
ambiente costiero possono mostrare eccezioni. (v. nel seguito).
Per definire i test per l’assegnazione dei QF sono state effettuati tre analisi successive basate
su:
Analisi visiva della distribuzione dei dati (Appendice I-III);
Analisi della frequenza di distribuzione dei dati (Appendice IV);
Analisi della climatologia (Appendice V).
L’analisi visiva dei dati permette di identificare la distribuzione verticale dei parametri lungo
la colonna d’acqua: temperatura, salinità, nutrienti e Chl a mostrano un marcato gradiente
verticale che costituisce la base per la definizione dei range di variabilità dei singoli parametri
e dei test per l’assegnazione dei QF.
Inoltre, è possibile identificare alcuni anni che presentano valori particolarmente anomali
(vedi, p. es. PO4 negli anni 1985 e 1988).
La frequenza di distribuzione mostra un andamento quasi-normale per alcuni parametri (es.
ossigeno disciolto) e una distribuzione asimmetrica per altri (es. nutrienti). I valori estremi
nella coda dell’istogramma potrebbero rappresentare degli outliers o dei dati non plausibili.
Tuttavia, sebbene tali valori possano essere considerati degli errori, bisogna considerare che
6
le aree costiere presentano una variabilità ambientale estremamente elevata, tale da
giustificarne la presenza. Pertanto, applicare un approccio puramente statistico può risultare
inappropriato. Molto spesso l’aumento di nutrienti e di Chl a è associato a input terrigeni che
determinano una simultanea diminuzione della salinità. Saranno quindi effettuate delle
verifiche di consistenza dei dati utilizzando un approccio multiparametrico (parameter
relationship test).
Infine, l’analisi della climatologia ha evidenziato una marcata stagionalità per alcuni
parametri (es. temperatura) di cui si terrà conto per la definizione dei test per l’attribuzione
QF.
Sulla base di queste evidenze sono stati individuati i test da applicare che sono descritti
sinteticamente nei paragrafi seguenti e più dettagliatamente in relazione ad ogni singolo
parametro.
I test da applicare per il QC saranno effettuati indipendentemente e saranno volti ad
assicurare che il dato in esame rientri in un intervallo prefissato (test 1-2) e che sia superiore
al detection limit (test3). Saranno poi effettuati dei test per assicurare che i profili non
presentino degli spike (test 4) o dei gradienti eccessivi (test 5). Quando possibile, saranno
effettuati dei test correlando tra loro differenti parametri in modo da verificare ulteriormente
la consistenza dei dati (test 6). Infine, si procederà ad effettuare un confronto tra le
distribuzioni annuali per identificare degli anni anomali (test7).
Test per i quality flag:
1)
Range di variabilità per ogni profondità: limite superiore
2)
Range di variabilità per ogni profondità: limite inferiore
3)
Detection limit test.
4)
Spike test: Test Value = |V2 – (V3 + V1)/2 | - | (V3 – V1)/2 |, dove V1, V2 and V3
sono tre misure consecutive e V2 è il valore da testare come spike. Il valore è
identificato come spike se il Test Value supera un threshold value.
5)
Gradient test: identifica i punti con gradienti verticali eccessivi. È definito come:
Test_value = |V2 – (V3 + V1)/2|, dove V1, V2 and V3 sono gli stessi dello spike test.
6)
Parameter relationship test
7)
Confronto tra le distribuzioni annuali per verificare l'esistenza di anni anomali
Ci si riserva di apportare modifiche ai test nella fase di controllo di qualità del database
(deliverable D5.1.2.5).
7
Temperatura
Saranno individuati dei range stagionali di temperatura in tre differenti strati della colonna
d’acqua (0-10m, 20-40m, 50-70m) in modo da poter effettuare i test 1-2.
Non sarà effettuato nessun detection limit test (test 3).
Saranno analizzati i profili verticali utilizzando i test 4 e 5.
Non sarà effettuato nessun controllo incrociato dei dati (test 6).
Sarà effettuata una verifica di massima con i dati di SST satellitare (test7).
I quality flag da assegnare saranno:
0: non sarà possibile eseguire il QC
1: se saranno superati tutti i test
3: se non è superato il test 7
4: se non sarà superato uno dei test range di variabilità, spike test e/o gradient test
8: valore interpolato (come nel caso dei profili del 2002 ricostruiti)
9: valore mancante.
Salinità
Anche in questo caso saranno individuati dei range stagionali di salinità in tre differenti strati
della colonna d’acqua (0-10m, 20-40m, 50-70m) in modo da poter effettuare i test 1-2.
Non sarà effettuato nessun detection limit test (test 3).
Saranno analizzati i profili verticali utilizzando i test 4 e 5.
Anche in questo, in presenza di anni anomali, ovvero che mostrino un offset rispetto ad altri,
si faranno confronti con le climatologie disponibil in Mediterraneo e con i rusultati dei
modelli per verificare se variazioni sistematiche sono state osservate anche su scala piu’ larga
(test7).
I quality flag da assegnare saranno:
0: non sarà possibile eseguire il QC
1: se saranno superati tutti i test
3 se non è superato il test 7
4: se non sarà superato uno dei test range di variabilità, spike test e/o gradient test
8
8: valore interpolato (come nel caso dei profili del 2002 ricostruiti)
9: valore mancante.
Ossigeno disciolto
Saranno individuati dei range stagionali di concentrazioni in tre differenti strati della colonna
d’acqua (0-10m, 20-40m, 50-70m) e saranno effettuati i test 1 e 2.
La distribuzione verticale sarà testata con lo spike test (test 4) e il gradient test (test 5).
Sarà effettuato un parameter relationship test con Chl a nello strato 0-10m (test 6).
Sarà effettuato un controllo per individuare delle anomalie annuali (test7).
Non sarà effettuato nessun detection limit test (test2).
I quality flag da assegnare saranno:
0: non sarà possibile eseguire il QC
1: se saranno superati tutti i test
2: il valore è inferiore al range individuato ma supera gli spike e gradient test (strato
50-70).
3 se non è superato il test 7
4: se non sarà superato lo spike test e/o gradient test o se il campione sarà esterno al
range di variabilità individuato ad eccezione dei casi previsti per l’assegnazione dei
flag 2 e 7.
7: valore superiore al range individuato ma giustificato da elevati valori di biomassa
(strato 0-10)
8: valore interpolato (dati 2009 ricavati dal sensore di ossigeno della sonda
multiparametrica)
9: valore mancante.
Nutrienti
Anche in questo caso si procederà ad individuare dei range di concentrazioni stagionali per
gli strati 0-10m, 20-40m, 50-70m in modo da poter effettuare i test 1 e 2.
Sarà effettuato il detection limit test (test 3).
Sarà verificata la distribuzione verticale applicando i test 4 e 5.
9
Saranno effettuati dei parameter relationship test con Chl a, salinità e nutrienti (per
concentrazioni dei nutrienti superiori a 0.1 mmol m-3) (test 6).
Sarà verificata la variabiltà interannuale (test7).
Le concentrazioni di nutrienti presentano un brusco gradiente verticale (soprattutto nello
strato 0-10m), pertanto può capitare che il campione non superi lo spike test a causa del
gradiente eccessivo. In questo caso falliranno entrambi i test, ma il dato non è da considerare
di cattiva qualità. Se invece dovesse fallire solo uno dei due test il dato sarà di cattiva qualità.
I quality flag da assegnare saranno:
0: non sarà possibile eseguire il QC
1: se saranno superati tutti i test
2: se lo spike test e il gradient test falliscono contemporaneamente
3: non supera il test di variabilità interannuale e i parameter relationship test
4: se il campione sarà esterno al range di variabilità individuato ad eccezione del caso
previsto per l’assegnazione del flag 7, o se non sarà superato lo spike test o il gradient
test
6: il valore cade all’interno del range stagionale ma è inferiore al detection limit
7: valore superiore al range individuato ma giustificato dai parameter relation test
9: valore mancante.
Clorofilla a
Anche in questo caso si procederà ad individuare dei range di concentrazioni stagionali per
gli strati 0-10m, 20-40m, 50-70m in modo da poter effettuare i test 1 e 2.
Sarà effettuato il detection limit test (test 3).
Sarà verificata la distribuzione verticale applicando i test 4 e 5.
Saranno effettuati dei parameter relationship test con salinità e nutrienti (per concentrazioni
dei nutrienti superiori a 0.1 mmol m-3) (test 6).
Sarà effettuato un confronto con dati satellitari per avere un verifica di massima (test 7).
I quality flag da assegnare saranno:
0: non sarà possibile eseguire il QC
1: se saranno superati tutti i test
2: se lo spike test e il gradient test falliscono contemporaneamente
10
3: non supera il test di variabilità interannuale e i parameter relationship test
4: se il campione sarà esterno al range di variabilità individuato ad eccezione del caso
previsto per l’assegnazione del flag 7, o se non sarà superato lo spike test o il gradient
test
6: il valore cade all’interno del range stagionale ma è inferiore al detection limit
7: valore superiore al range individuato ma giustificato dai parameter relation test
9: valore mancante.
2.3 LETTERATURA
Beckers, J.M and Rixen M. (2003) EOF Calculations and Data Filling from Incomplete
Oceanographic Datasets. Journal of Atmospheric and Oceanic Technology 20, 1839-1856.
Carpenter, J.H. (1965). The Chesapeake Bay Institute. Technique for the Winkler oxygen
method. Limnol. Oceanogr., 10, 141–143.
First IODE Workshop on Quality Control of Chemical Oceanographic Data Collections.
Workshop Report No.228; IOC Project Office for IODE, 2010.
Folkestad A., Sørensen K., Wehde H., Kaitala S., Durand D. (2011) Real Time Quality
Control of biogeochemical measurements. My Ocean document, WP15
Grasshoff, K.; Ehrhardt, M.; Kremung, K. (Eds.), 1983: Methods of Seawater Analysis.
Weinheim: Verlag Chemie.
Holm-Hansen, O., Lorenzen, C.J., Holmes, R.W., Strickland, J.D.H., 1965. Fluorometric
determination of chlorophyll. Journal du Conseil Permanent International pour l’Exploration
de la Mer 30, 3–15.
Neveux, J. and M. Panouse - 1987. Spectrofluorometric determination of chlorophylls and
pheophytins. Arch. Hydrobiol., 109: 567-581.
11
Saggiomo, V., Catalano, G., Corato, F., Ribera d’Alcalà, M., 2010. Metodi automatici per
l'analisi dei nutrienti. In: Socal, G., Buttino, I., Cabrini, M., Mangoni, O., Penna, A. & Totti,
C. [Eds.] Metodologie di studio del plancton marino Manuali e Linee Guida 56/2010, ISPRA,
SIBM Roma, pp. 53-77.
Segura-Noguera M., Cruzado A., Blasco D. (2011) Nutrient preservation, analysis precision
and quality control of an oceanographic database of inorganic nutrients, dissolved oxygen
and chlorophyll a from the NW Mediterranean Sea. Scientia Marina 75(2), 321-339
Strickland, J.D.H. and T.R. Parsons. – 1972. A practical handbook of sea water analysis.
Bull. Fish. Res. Bd. Canada, 167: 1-310.
12
3
DATA SET FITOPLANCTON E MESOZOOPLANCTON
Il database biologico di pubblico accesso della LTER MareChiara comprende i dati di
abbondanza e biomassa del fitoplancton e zooplancton, acquisiti dal 1984 ad oggi.
In particolare, i dati disponibili riguardano:
l’abbondanza, nelle acque superficiali (0,5 m), espressa in cell ml-1, delle diverse
specie o categorie tassonomiche del fitoplancton totale
la composizione specifica del microfitoplancton nelle acque superficiali
La biomassa dello zooplancton nello strato 0-50 m, espressa come peso secco (mg C l1
)
L’abbondanza, nello strato 0-50 m, espressa il ind/m-3delle diverse specie o categorie
tassonomiche dello zooplancton.
Sono inoltre disponibili dati di fitoplancton relativi ad altre profondità raccolti per periodi
limitati.
I campionamenti sono stati effettuati con cadenza quindicinale dal 26/01/1984 al 30/07/1991
e con cadenza settimanale dal 21/02/1995 ad oggi. Essi comprendono, per il fitoplancton:
un campione superficiale vivo di retinata, per la stima qualitativa della diversità del
microplancton;
un campione superficiale raccolto con bottiglia Niskin, per il conteggio e la stima
quantitativa del fitoplancton totale:
e per lo zooplancton
un campione vivo di retinata verticale nello strato 0-50 m, per la determinazione della
biomassa
un campione fissato di retinata verticale nello strato 0-50 m, per l’identifcazione e il
conteggio del fitoplancton totale.
3.1 METODICHE UTILIZZATE
Fitoplancton
Percopo I., Sarno D. e Zingone A.
Per studi floristici o per la raccolta di organismi da portare in coltura per studi fisiologici,
tassonomici o molecolari, vengono utilizzati campioni di retino. Il campionamento avviene
trascinando il retino nelle acque di superficie a bassa velocità di traino. Il retino da
fitoplancton è di forma conica e maglia da 20 μm. Il campione viene raccolto in barattoli di
plastica da 500 ml e mantenuto in luogo fresco fino all’arrivo in laboratorio dove viene
osservato al microscopio ottico e viene compilata una lista di specie.
13
Per le analisi quantitative della comunità fitoplanctonica vengono utilizzati icampioni di
bottiglia. Il campione viene raccolto a 0 m con una bottiglia Niskin da 5 l collegata a un
campionatore automatico (rosette o carosello). Subito dopo aver effettuato il campionamento,
un sub-campione viene raccolto in tempi molto rapidi per evitare la sedimentazione nelle
bottiglia di campionamento. Il sub-campione viene raccolto in bottiglie di vetro scuro da 500
ml contenente il fissativo (formalina). La bottiglia viene riempita ad un livello appena al di
sotto dell’orlo, per consentire agitazione e omogeneizzazione prima dell'analisi in laboratorio.
Il campione raccolto, trasportato in laboratorio, viene conservato in frigorifero a 4 °C prima
dell’analisi, che avviene a pochi giorni dal campionamento.
Prima di effettuare il conteggio cellulare il campione viene acclimatato a temperatura
ambiente e agitato delicatamente 150 volte per omogeneizzarlo. Il passo successivo prevede
la sedimentazione in apposite camere di conteggio. Dopo il riempimento la camera viene
posizionata su un piano perfettamente orizzontale per un tempo sufficiente alla
sedimentazione di tutte le cellule (3-5 ore per cm di altezza del cilindro di sedimentazione).
L’analisi quantitativa viene effettuata con il metodo di conteggio Uthermöl al microscopio
invertito (per dettagli vedi Zingone et al., 2010).
Successivamente viene calcolata l’abbondanza delle cellule fitoplanctoniche presenti nel
campione con una semplice formula matematica. Il contenuto in carbonio delle singole
specie viene poi calcolato a partire dal volume cellulare medio attraverso l’applicazione di
formule di conversione derivate empiricamente (per dettagli vedi Zingone et al., 2010).
Zooplancton
Di Capua I. e. Mazzocchi M.G
Per la raccolta vengono effettuate due retinate, delle quali solo un aviene fissata ,con retino
standard (mod. Nansen) con una bocca con superficie pari a 1 m2 (diametro 113 cm) e
apertura di maglia di 200 μm, munito di un collettore di Plexiglas da 1 Litro con finestra
filtrante. La scelta di utilizzare tale retino (invece del più piccolo e comunemente usato WP2)
è stata dettata da ragioni storiche. Si è pensato infatti a una migliore comparazione con dati
acquisiti precedentemente dalla SZN utilizzando questo tipo di retino per la raccolta del
mesozooplancton nel Golfo di Napoli e in acque aperte del Mediterraneo.
Il campione non fissato viene utilizzato per stimare la biomassa zooplanctonica come peso
secco e successivamante per effettuare l’analisi del contenuto di carbonio al CHN. ll
campione viene filtrato su un pezzo di retino di maglia uguale a quella della rete di raccolta
(200 µm) e risciacquato con acqua distillata. Successivamente il campione viene raccolto,
impacchettato in un pezzo di foglio di alluminio prepesato, avendo cura di lasciare
un’apertura per facilitare l’evaporazione. è posto in stufa a 60 °C. Dopo 24h si pesa il
campione alla bilancia analitica. Nei giorni successivi si effettuano 1-2 pesate addizionali,
fino al raggiungimento di un valore (quasi) costante. Alla fine si procede al calcolo del peso
secco espresso in mg m-3.
Dopo circa una settimana in stufa, i campioni di biomassa zooplanctonica vengono
potterizzati ed omogenizzati e rimessi in stufa per 24h, prima di essere processati per l’analisi
al CHN.
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Il campione fissato con formalina viene utilizzato per le analisi quali- quantitative della
comunità di zooplancton. Il campione viene filtrato sotto cappa e portato a volume noto
concentrato in una coppa graduata con acqua di rubinetto, oppure acqua di mare filtrata (su
filtri GF/F) e portato ad un volume noto (solitamente 200 ml).
Il campione viene poi rimescolato accuratamente mediante una siringa graduata tipo pipetta
di Stempel, con la quale si effettuano i subcampioni.
Ogni sub-campione viene posto, con la pipetta, in una camera di conteggio mini-Bogorov da
10 ml. Per ogni sub-campione vengono identificati e contati tutti gli organismi zooplanctonici
presenti. Viene contato un numero minimo di individui che sia statisticamente significativo
per un intervallo di confidenza del 95% (generalmente ≥ 800 individui). Il resto del campione
viene poi controllato per verificare la presenza di specie rare.Il riconoscimento tassonomico
viene effettuato a livello di specie per copepodi, cladoceri, chetognati, dolioli e sifonofori, e
a livello di classe, ordine, o genere per gli altri gruppi zooplanctonici. Alla fine si procede al
calcolo dell’abbondaza della comuità espressa come individui metro cubo (ind. m-3). Lo
stesso campione contato viene analizzato allo ZOOSCAN, per aggiungere all’informazione
quali-quantitiva, anche quella relativa agli spettri di taglia degli organismi presenti nel
campione.
3.2 QUALITY CONTROL
Come premesso, i dati di biodiversità planctonica vengono prodotti attraverso l’osservazione
diretta e il conteggio del campione. Il controllo di qualità relativo ad eventuali errori di
raccolta e trattamento del campione avviene già nella fase di osservazione del campione e
produzione del dato, mentre gli errori, derivanti principalmente da limiti nelle conoscenze
generali o degli operatori stessi, sono difficilmente identificabili ‘a posteriori’. Ai dataset
biologici sono inoltre difficilmente applicabili i metodi statistici che vengono abitualmente
utilizzati per i dati oceanografici, anche per la mancanza di repliche. Inoltre, l’intervallo di
variazione delle concentrazioni planctoniche è molto ampio e la definizione stessa di outlier,
normalmente utilizzato per evidenziare valori che si discostano troppo dalla media, non è
facilmente applicabile.
Quindi, piuttosto che controlli successivi della qualità del dataset, è opportuno seguire
procedure controllate nel corso della produzione del dato. In fase di condivisione del dato,
dovranno poi essere fornite contestualmente tutte le informazioni relative all’attendibilità dei
conteggi e delle identificazioni, che permetteranno una fruizione corretta dei dati prodotti da
parte di utenti diversi.
Vengono di seguito riportate delle linee guida, ispirate a indicazioni fornite da rapporti e
pubblicazioni recenti sull’argomento (Hötzel and Croome 1999, Ospar 2002). Tali linee
guida rispecchiano i due aspetti di cui si compone la garanzia di qualità per le componenti
fitoplanctonica e zooplanctonica: il controllo interno di qualità e la valutazione esterna della
qualità.
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Controllo interno di qualità
3.2.1.1 Documentazione dei metodi
È necessaria la stesura di protocolli relativi a tutte le fasi delle attività svolte, dalla raccolta
alla conservazione, fino al trattamento dei campioni e all'analisi dei dati. Attualmente i
protocolli utilizzati per LTER-MC sono disponibili in forma sintetica sul sito web
(http://szn.macisteweb.com/).
I protocolli relativi alle metodologie impiegate per la stima delle abbondanze e della
composizione del fitoplancton marino sono in corso di adeguamento allo Standard Europeo
CSN EN (1520), mentre quelli relativi alle metodologie di studio dello zooplancton sono
redatti in accordo con le procedure standard riportate nell’ICES Zooplankton Methodology
Manual (Harris et al., 2000).
È in fase di elaborazione un manuale dettagliato dove saranno riportate singolarmente le
metodologie relative alle singole componenti studiate e riguardanti:
campionamento
trattamento ed analisi dei campioni
Procedure utilizzate per assicurare la qualità del trattamento e delle analisi dei dati.
Di seguito sono riportate due tabelle, rispettivamente per il fitoplancton (Tab. 2) e per lo
zooplancton (Tab. 3) nelle quali viene sintetizzata la documentazione dei metodi attualmente
impiegati, dei fattori critici e degli interventi prioritari atti a garantire un controllo di qualità,
che saranno maggiormente approfonditi nel manuale.
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Tabella 2. Sintesi dei fattori critici nei singoli step metodologici, e delle azioni volte ad
assicurare la qualità dei dati di fitoplancton.
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Tabella 3. Sintesi dei fattori critici nei singoli step metodologici, e delle azioni volte ad
assicurare la qualità dei dati di zooplancton.
3.2.1.2 Strumentazione ed apparecchiature
La strumentazione e le attrezzature utilizzate a mare ed in laboratorio (es. retini, bottiglie
Niskin, camere di sedimentazione) sono oggetto di regolare manutenzione. Microscopi e
stereomicroscopi sono sottoposti a manutenzione annuale da parte del personale tecnico delle
case fornitrici.
3.2.1.3 Impiego di personale adeguatamente formato
Tutti gli operatori SZN coinvolti nelle diverse fasi dell’attività, dal campionamento fino al
conteggio delle specie fito- e zooplanctoniche possiedono una competenza qualificata
acquisita negli anni.
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Al personale meno esperto, in fase di formazione, viene sempre fornita supervisione
adeguata. La competenza individuale del personale in formazione, inoltre, viene migliorata
attraverso la partecipazione periodica a workshop e/o corsi di specializzazione.
Almeno due membri del personale sono competenti nelle diverse attività.
3.2.1.4 Analisi dei campioni fito- e zooplanctonici
Ogni campione biologico raccolto a mare rappresenta un’entità diversificata, costituita da un
insieme di specie particolare per quel campione. Per questa ragione, la competenza nella
identificazione tassonomica è il primo ed indispensabile aspetto che determina la qualità
finale dei dati prodotti.
Gli operatori impegnati nei conteggi effettuano abitualmente lavoro di gruppo e
consultazione per l’identificazione di specie incerte o nuove.
Per molti gruppi planctonici, soprattutto quelli oggetto di studi tassonomici
approfonditi, è già disponibile una collezione di riferimento. In particolare, per il
fitoplancton è stato creato nel tempo un database che contiene immagini di specie
presenti nel Golfo di Napoli ed in altre aree del Mediterraneo. Per lo zooplancton è in
fase di allestimento una collezione di organismi-tipo per le specie di copepodi
presenti in Mediterraneo, conservati in formalina.
L’identificazione delle specie viene condotta prendendo in considerazione la
letteratura specialistica di riferimento e con un continuo aggiornamento delle
competenze tassonomiche. Gli elenchi di specie prodotti sono sottoposti a controllo
della nomenclatura e delle sinonimie riportate dal World Register of Marine species
http://www.marinespecies.org/.
In fase di conteggio, le procedure di assicurazione di qualità prevedono:
Una verifica, da parte di altri colleghi, della validità dei risultati in termini di
determinazioni tassonomiche e di precisione dei conteggi e delle procedure impiegate.
Un riconteggio dello stesso campione da parte dell’analista al fine di testare la
ripetibilità dei conteggi.
Per ogni campione, il conteggio di un numero di cellule ed individui statisticamente
significativi, con limiti di confidenza al 95% (CL95) secondo quanto riportato da Lund
et al. (1958).
Il riconteggio del 5% dei campioni da parte di almeno un altro operatore (in parallelo,
sullo stesso sub-campione) al fine di testare la riproducibilità intra-laboratorio.
La corretta immissione dei dati nei file (Access, Excel) e la sua verifica confrontando
una stampa dei dati inseriti con il log originale dei conteggi.
Nonostante quanto premesso sulla difficoltà di applicare i metodi statistici che
vengono abitualmente utilizzati per i dati oceanografici, procedure standardizzate di
controllo di qualità possono comunque evidenziare valori anomali che si discostano in
maniera significativa dal complesso dei dati. Sulla matrice dei dati vengono pertanto
effettuate procedure di controllo, basate sulla verifica di presenza e abbondanza delle
specie evidenziando dati anomali rispetto a concentrazione e/o stagionalità delle
stesse.
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Nella fase di produzione del dataset per la condivisione, si prevede di:
fornire, per ogni campione, indicazioni che permettano di risalire all’effettivo numero
di individui conteggiati per ogni specie, e quindi ai limiti di confidenza dei dati
produrre liste di specie per i due set di dati (fitoplancton e mesozooplancton) che
contengano flag specifici sull’affidabilità delle identificazioni delle singole specie,
sulla base delle metodologie applicate (microscopia ottica, elettronica, metodi
molecolari) e dello stato attuale delle conoscenze.
Controllo esterno della qualità
Questa fase comprende sia il conteggio da parte di laboratori esterni e che esercizi di
intercalibrazione. Generalmente si raccomanda che il 5% dei campioni venga ricontato da un
diverso laboratorio, come consigliato dalle procedure standard di controllo di qualità (APHA,
1995).
Attualmente, per il comparto fitoplanctonico è stata richiesta la partecipazione ad
esercizi di intercalibrazione per analisi qualitative e quantitative dei campioni, organizzati dal
Marine Institute-IOC Science and Communication Centre on Harmful Algae, nell’ambito
delle iniziative di NMBAQC-BEQUALM (National Marine Biological Analytical Quality
Control-Biological Effects Quality Assurance in Monitoring Programmes,
http://www.nmbaqcs.org). Queste organizzazioni sono preposte alla standardizzazione dei
metodi per il Quality Assurance-Quality Control delle analisi di campioni biologici. La
partecipazione al test include l’invio dei campioni da parte del Marine Institute, l’analisi di
campioni da parte dell’analista e la trasmissione dei risultati all’ente organizzatore. Il
superamento dell’esame è finalizzato all’accreditamento ISO, che attesta la conformità delle
metodiche analitiche utilizzate agli standard internazionali.
Per il comparto zooplanctonico il NMBAQC ed il Sir Alister Hardy Foundation for
Ocean Science (SAHFOS, http://www.sahfos.ac.uk) hanno avviato, alla fine di Gennaio
2013, una consultazione fra i vari laboratori di ricerca marina per sviluppare uno schema di
controllo di qualità per le analisi dei campioni di zooplancton. Attualmente non esiste, infatti,
un protocollo standardizzato per garantire la qualità per le analisi dello zooplancton.
3.3 LETTERATURA
Addison, P. (2010). NMBAQC. Quality Assurance in Marine Biological Monitoring. A
report prepared for the Healthy and Biologically Diverse Seas Evidence Group and the
National Marine Biological Analytical Quality Control Scheme. Prue Addison, Environment
Agency/Joint Nature Conservation Committee
th
APHA (1995) Standard methods. 19 Edition. American Public Health Association,
Washington, DC.
20
Hötzel G, Croome R (1999) A Phytoplankton Methods Manual for Australian Freshwaters.
LWRRDC Occasional Paper 22/99
Harris RP, Wiebe PH, Lenz J, Skjoldal HR, Huntely M (2000) Zooplankton Methodology
Manual, Academic Press, London.
Lund J.WG., Kipling C., LeCren E.D. (1958) The inverted microscope method of estimating
algal numbers and statistical basis of estimations by counting. Hydrobiologia, 11: 143-169.
OSPAR (2002) JAMP guidelines on quality assurance for biological monitoring in the
OSPAR area Commission Monitoring guidelines, Ref. No. 2002-15
Zingone, A., Totti, C., Sarno, D., Cabrini, M., Caroppo, C., Giacobbe, M. G., Lugliè, A.,
Nuccio, C. & Socal, G. 2010. Fitoplancton: metodiche di analisi quali-quantitativa. In: Socal,
G., Buttino, I., Cabrini, M., Mangoni, O., Penna, A. & Totti, C. [Eds.] Metodologie di studio
del plancton marino. ISPRA, Roma, pp. 204-28.
21