Catalisi Enzimatica/Biotrasformazioni in Chimica Verde

Scuola di Ingegneria Industriale e dell’Informazione
Corso 096125 (095857)
Introduction to Green and Sustainable Chemistry
A.A. 2015/2016
Catalisi Enzimatica/Biotrasformazioni
in Chimica Verde
Prof. Attilio Citterio
Dipartimento CMIC “Giulio Natta”
http://ISCaMaP.chem.polimi.it/citterio/
http://chimicaverde.vosi.org/citterio/education/course-topics/
Definizioni
•
Biochimica
 Lo studio della chimica dei sistemi viventi
 lo studio delle molecole biologiche
1. Come funzionano
2. Le loro strutture 3D
3. Come le loro funzioni si combinano per produrre un sistema vivente
•
Bioingegneria
 Un ampio ambito che può includere le ingegnerie elettrica,
meccanica, industriale, ambientale e chimica che lavorano
su sistemi bio/medici e agricoli (ingegneria biologica ha lo
stesso significato).
•
Ingegneria Biomedica
 Come l’ingegneria biochimica normalmente si applica al
settore medico.
Attilio Citterio
Definizioni
•
Ingegneria Biochimica
 L’uso di organismi viventi o di prodotti di sistemi biologici per scopi
pratici
 Ingegneria di processi che usano dei biocatalizzatori, materie
prime bio-organiche e/o bioassorbenti usando i principi
dell’Ingegneria Chimica
•
Biotecnologia
 Ogni tecnica che usa organismi viventi o sostanze da essi
prodotte per fare o modificare un prodotto, per migliorare piante o
animali, o per sviluppare micro-organismi per specifici usi
 Comunemente implica l’uso o lo sviluppo di metodi di of
manipolazione genetica diretta per obiettivi desiderabili.
(ingegneria genetica o tecnologia del DNA ricombinante).
 L’uso di cellule o di componenti di animali, piante e microbi, per
produrre sostanze o processi utili.
Attilio Citterio
Definizioni
•
Enzimi,
 Prodotti dagli organismi viventi, sono composti di natura proteica con
proprietà catalitiche. Questi catalizzatori sono sia efficienti che altamente
specifici per una particolare reazione chimica che implica la sintesi, la
degradazione o l’alterazione di un composto. In queste reazioni in cui le
molecole sono ridotte, ossidate, trasposte, o assemblate sono spesso
coinvolti dei cofattori. Alcuni enzimi sono modificati covalentemente per
fosforilazione, glicosilazione ed altri processi.
subtilisin
Promuove la proteolisi di
legami peptidici.
CPO
La cloroperossidasi catalizza molte
ossidazioni di substrati organici
Attilio Citterio
phytase
Catalizza l'idrolisi dell'acido
Fitico (mio-inositolo esafosfato)
Cofattori Enzimatici
•
Co-fattori

Un composto non-proteico che si lega a una proteina ed è richiesto per
l’attività biologica della proteina. I cofattori si possono considerare
"molecole di supporto" che assistono nelle trasformazioni biochimiche.
 I cofattori sono sia organici che inorganici. Si classificano in dipendenza
della forza di legame con l’enzima, con quelli debolmente legati detti
coenzimi e quelli saldamente legati detti gruppi prostetici. Un enzima
inattivo, senza cofattore è detto un apoenzima, mentre l’enzima completo
con il cofattore è detto oloenzima.
 I coenzimi servono come trasportatori transienti di specifici gruppi
funzionali
 Derivano spesso da vitamine (nutrienti organici essenziali in piccole
quantità nella dieta).
Attilio Citterio
Alcuni Esempi di Coenzimi
Coenzima
Esempi di gruppi chimici Precursori nella dieta
trasferiti
in mammiferi
Biocitina
CO2
Biotina
Coenzima A
Gruppi acili
Acido pantotenico e altri
composti
Coenzima B12
atomi H e gruppi alchilici
Vitamina B12
Flavin adenina dinucleotide
Elettroni
Riboflavina (Vitamina B2)
Lipoato
Elettroni e gruppi acili
Non richiesto nella dieta
NAD
Ione idruro (H-)
Acido nicotinico (niacina)
Piridossal fosfato
Gruppi amminici
Piridossina (vitamina B6)
Tetraidrofolato
Gruppi a 1-carbonio
Folato
Tiamina pirofofato
Aldeidi
Tiamina (vitamina B1)
Attilio Citterio
Biotecnologia
•
•
•
La manipolazione di geni è detta ingegneria genetica o tecnologia a
DNA ricombinante.
L’ingegneria genetica implica il prelievo di uno o più geni dalla
porzione di DNA di un organismo e alternativamente:
 Trasferirli in un altro organismo
 Rimetterli nello stesso organismo originale in combinazioni
differenti
Settori coinvolti







• Tipi di Biotecnologie
biologia cellulare/molecolare
microbiologia
genetica
anatomia e fisiologia
biochimica
ingegneria
“computer science”
Attilio Citterio
• Ricombinante, proteine R , DNA R
• Organismi Geneticamente Modificati
(GMO)
• Anticorpi (anticorpi monoclonali)
• Transgenica
• Terapia genica, Immunoterapia
• Rischi e vantaggi del biotech
Applicazioni delle Biotecnologie
•
•
•
•
Piante alimentari e organismi resistenti ai virus
Diagnostici per rivelare malattie genetiche e malattie acquisite
Terapie che usano i geni per curare le malattie
Vaccini ricombinanti per prevenire le malattie
•
Composti chimici
semplici o complessi
(per esempio proteine)
via over-espressione
genica.
•
Ausilio nel risolvere
problemi ambientali.
evoluzione del mais
Attilio Citterio
Obiettivi della Biotecnologia
•
•
•
Comprendere meglio i processi dell’eredità e dell’espressione genica
Fornire una migliore comprensione e trattamento di varie malattie,
particolarmente quelle dovute a disordini genetici
Generare ritorni economici, inclusi il miglioramento genetico di piante
e animali per l’agricoltura e la produzione efficiente di molecole
biologiche utili
Esempi:
 Riso ingegnerizzato per rafforzamento con Vitamina A
 Mais ingegnerizzato per resistere all’attacco di funghi
 Piante ingegnerizzate per resistere alla siccità
Attilio Citterio
Sviluppo della Biotecnologia
• Biotecnologia Antica - storia connessa a cibo-casa; Include l’allevamento
 Le popolazioni paleolitiche iniziano a stanziarsi e sviluppare società
agricole circa 10,000 anni fa (siti con colture in America, Asia e Europa)
 I primi coltivatori in medio oriente coltivavano grano, orzo e anche segale
 7,000 anni fa, dei pastori si spostavano nel Sahara con pecore, capre,
bestiame e cercavano e usavano pietre nella preparazione del cibo
 I primi agricoltori arrivarono in Egitto 6,000 anni fa con bestiame, pecore,
capre e sementi quali orzo, farro e ceci
 Cibi fermentati - 1500 BC (lieviti – succhi di frutta, vino, birra, pane, alcool;
gli egizi usavano il lievito 1500 BC. Il lievito da birra ind. risale al 1915-20)
• Biotecnologia Classica - costruita sull’antica biotecnologia; produzione di cibi
e medicina promossa da Fermentazioni
• Biotecnologia Moderna - manipola le informazioni
genetiche in organismi; Ingegneria Genetica
Attilio Citterio
Fermentazione
•
•
•
•
•
•
Fermentazione: processo microbico in cui avvengono trasformazioni
di composti organici controllate enzimaticamente
La fermentazione è stata praticata per anni e ha prodotti cibi quali il
pane, il vino e la birra
4000 - 9000 B.C. – La fermentazione del latte produce lo Yogurt
5000-9000 B.C. – Elaborazione del latte in Cina a produrre formaggio
La pasta fermentata fu scoperta per caso quando dell’impasto non fu
cotto immediatamente
La moderna fabbricazione dei formaggi implica:








inoculazione del latte con batteri produttori di acido lattico
aggiunta di enzimi quali il caglio per precipitare la caseina
riscaldamento
separazione del siero dalla cagliata
essicazione della cagliata
salatura
pressatura della cagliata
maturazione
Attilio Citterio
Bevande Fermentate
• La produzione della birra inizia già
prima del 6000-5000 B.C.
• Gli egizi ~5000 B.C facevano il vino
dall’uva
• Malto d’orzo – Lievito di birra trovato
in antiche urne di terracotta
• Monasteri - maggiori produttori di
birra
• 1680 - Leeuwenhoek osserva il
lievito al microscopio
• Tra il 1866 e il 1876 - Pasteur
stabilisce che I lieviti e altri microbi
sono responsabili della
fermentazione
Attilio Citterio
Biotech Classica
•
Descrive lo sviluppo che la fermentazione ha assunto dai tempi
antiche ai giorni nostri
•
Alta Fermentazione – sviluppata per prima, il lievito sta sopra
•
1833 - Fermentazione sommersa (o bassa) – il lievito sta sul fondo
•
1886 – Apparecchiature per fermentazioni realizzate da E.C. Hansen
e ancora oggi usate
•
I Guerra Mondiale – Fermentazione di solventi organici per esplosivi
(glicerina)
•
II Guerra Mondiale – bioreattori o fermentatori:

Antibiotici
 Colesterolo – Steroidi
 Amminoacidi
 Grandi quantità di aceto si producono con
l’Acetobacter su substrati di trucioli di legno
Attilio Citterio
Biotech Classica
• Negli anni 1950, il colesterolo fu convertito in cortisone e ormoni
sessuali per idrossilazione microbica (inserimento di un gruppo -OH )
• Dalla metà degli anni 1950, si producono amminoacidi e altri
metaboliti primari (necessari alla crescita cellulare), ma anche enzimi
e vitamine
• Dagli anni 1960, si cominciò a usare i microbi come fonti di proteine e
altre molecole dette metaboliti secondari (non necessari alla crescita
cellulare)
Oggi per questa via si producono molte cose:
 Composti farmaceutici quali gli antibiotici
 Amminoacidi
 Molti composti chimici, ormoni e pigmenti
 Enzimi con un’ampia varietà di usi
 Biomassa per consumo commerciale e animale (quali proteine di singola-
cellula)
Attilio Citterio
La Vecchia Biotech Incontra la Nuova
•
•
•
•
La fermentazione e l’ingegneria genetica sono state usate nella
produzione di cibi fin dalli anni 1980
Organismi geneticamente ingegnerizzati sono coltivati in fermentatori
e sono modificati per produrre grandi quantità di enzimi utili, che
vengono estratti e purificati
Si usano enzimi nella produzione del latte, formaggio, birra, vino,
dolciumi, vitamine e supplementi minerali
L’ingegneria genetica è stata usata per aumentare la quantità e
purezza di enzimi, per migliorare la funzione di un enzima e per
fornire un metodo più conveniente per produrre enzimi.

Chimosina, usata per produrre formaggio, è una delle prime prodotte
1590 - Zacharias Janssen - Prime due lenti per microscopio (30x)
1665 - Robert Hooke - “Cellulae” (Piccole Camere) del sughero
1676 - Anthony van Leeuwenhoek – (200x) «animalculi» (in stagni)
1684 – protozoi e funghi
Attilio Citterio
Basi della Moderna Biotecnologia
•
1838, Matthias Schleiden, stabilisce che tutte i tessuti delle piante sono
composti da cellule e che ogni pianta deriva da una singola cellula
•
1839, Theodor Schwann, arrivò a una conclusione simile per gli animali
•
1858, Rudolf Virchow, concluse che tutte le cellule derivano da cellule e la
cellula è l’unità base della vita
•
Prima della teoria cellulare si credeva nel vitalismo: l’organismo intero, non
sue singole parti, possedevano la vita
•
Dall’inizio degli anni 1880, I microscopi, le tecnologie di conservazione dei
tessuti e le colorazioni permisero agli scienziati di capire meglio la struttura e
le funzioni delle cellule
•
1928 - Fred Griffith effettuò esperimenti usando lo Streptococcus pneumonia
Due ceppi: Liscio (S) - Virulento (gelatinoso) Ruvido (R) - Meno Virulento
Iniettando l’R e l’S (pastorizzato) – il gatto moriva e conteneva batteri S
Non sicuro di cosa cambiava R in S, egli indicò ciò col termine “Principio di
Trasformazione”
Attilio Citterio
Principio di Trasformazione
Batterio
Liscio
capsulato
infettivo
estratti
Trattato con
desossiribonucleasi
(spezza il DNA)
Cellule infettate
uccise dal calore;
fatto un estratto
Gli estratti trattati aggiunto a batterio
Infettivo, rugoso non capsulato
Nessuna cellula
trasformata nella
forma capsulata,
infettiva
Trattato con
ribonucleasi
(spezza l’RNA)
Alcune cellule
trasformate nella
forma capsulata,
infettiva
Trattato con
proteinasi (spezza
le proteine)
Alcune cellule
trasformate nella
forma capsulata,
infettiva
Attilio Citterio
1952 – Alfred Hershey e Martha Chase
•
•
•
•
Usando il batteriofago T2, un virus che infetta i batteri
Radio marcando il batteriofago con S35 (Proteina) e P32 (DNA)
Si infettarono le cellule batteriche e si misero in un centrifuga per
rimuovere le particelle del fago
L’analisi mostrò del DNA marcato all’interno dei batteri e che questo
era materiale genetico
Attilio Citterio
1953 Watson e Crick
• Determinazione della struttura del
DNA
• Rosalind Franklin e Maurice Wilkins
forniscono i dati di diffrazione ai
raggi X
• Erwin Chargaff determina i rapporti
delle basi azotate nel DNA
• 1953 - modello della replicazione
del DNA
• Le basi del DNA sono fatte di purina
e pirimidina
• A accoppia con T e G accoppia
con C
• 1962 - Premio Nobel
Attilio Citterio
I Primi Esperimenti di DNA Ricombinante
e la Tecnica Elettroforetica
• Nel 1971 degli scienziati manipolano
il DNA e lo inseriscono in batteri
• Nel 1972 degli scienziati legano due
molecole di DNA da diverse fonti
usando l’endonucleasi EcoRI (per
tagliare) e la DNA ligasi (per legare)
• H. Boyer successivamente nei
Laboratori di Cold Spring Harbor
scoprì una nuova tecnica detta gel
elettroforesi per separare i
frammenti di DNA

Si applica una corrente e le
molecole cariche negative del DNA
migrano verso il polo positivo e si
separano in funzione della loro
dimensione
Attilio Citterio
La Rivoluzione Biotech: Individuazione del
Codice
• Nel 1961, Nirenberg e Mattei
fecero il primo tentativo di
individuare il codice genetico,
usando l’RNA messaggero (mRNA) sintetico.
• Nirenberg e Leder, usando le
sequenze di RNA di codoni
specifici, svilupparono un saggio
di legame che consentì loro di
determinare quale tripletta di
codoni esprime un amminoacido.
Prima
Base
Seconda Base
Terza
Base
U
C
A
G
fenilalanina
serina
tirosina
cisteina
U
fenilalanina
serina
tirosina
cisteina
C
leucina
serina
stop
stop
A
leucina
serina
stop
triptofano
G
leucina
prolina
istidina
arginina
U
leucina
prolina
istidina
arginina
C
leucina
prolina
istidina
arginina
A
leucina
prolina
istidina
arginina
G
isoleucina
treonina
asparagine
serina
U
isoleucina
treonina
asparagina
serina
C
isoleucina
treonina
asparagina
arginina
A
(inizio)
metionina
treonina
asparagina
arginina
G
valina
alanina
aspartato
glicina
U
valina
alanina
aspartato
glicina
C
valina
alanina
aspartato
glicina
A
valina
alanina
aspartato
glicina
G
U
C
A
G
Attilio Citterio
Il Codice Genetico Standard
U
C
A
G
Phe
Phe
Leu
Leu
F
F
L
L
UCU
UCC
UCA
UCG
Ser
Ser
Ser
Ser
S
S
S
S
UAU
UAC
UAA
UAG
Tyr Y
Tyr Y
Stop
Stop
UGU
UGC
UGA
UGG
UAG
Cys C
Cys C
Stop
Trp
StopW
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
U
UUU
UUC
UUA
UUG
C
CUU
CUC
CUA
CUG
Leu
Leu
Leu
Leu
L
L
L
L
CCU
CCC
CCA
CCG
Pro
Pro
Pro
Pro
P
P
P
P
CAU
CAC
CAA
CAG
His
His
Gln
Gln
H
H
Q
Q
CGU
CGC
CGA
CGG
Arg
Arg
Arg
Arg
R
R
R
R
A
AUU
AUC
AUA
AUG
Ile
Ile
Ile
Met
I
I
I
M
ACU
ACC
ACA
ACG
Thr
Thr
Thr
Thr
H
H
Q
Q
AAU
AAC
AAA
AAG
Asn
Asn
Lys
Lys
N
N
K
K
AGU
AGC
AGA
AGG
Ser
Ser
Arg
Arg
S
S
R
R
G
GUU
GUC
GUA
GUG
Val
Val
Val
Val
V
V
V
V
GCU
GCC
GCA
GCG
Ala
Ala
Ala
Ala
A
A
A
A
GAU
GAC
GAA
GAG
Asp
Asp
Glu
Glu
D
D
E
E
GGU
GGC
GGA
GGG
Gly
Gly
Gly
Gly
G
G
G
G
translation start codon
hydrophobic amino acids
negatively charged amino acids
translation stop codon
hydrophilic non charged
amino acids
positively charged amino acids
Attilio Citterio
cysteine
Il primo Clonaggio del DNA e ……
• Boyer, Helling Cohen, e Chang legarono dei
frammenti di DNA in un vettore, e
trasformarono una cellula dell’E. coli
• Cohen e Chang trovarono che era possibile
mettere del DNA batterico in una specie
batterica non correlata
• Nel 1980 Boyer e Cohen ottennero un
brevetto sui metodi fondamentali di
clonaggio e trasformazione del DNA.
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
Taglio con EcoRI
Taglio con EcoRI
AATTC
G
G
CTTAA
Congiunzione terminali
del vettore e DNA estraneo
 La tecnologia del DNA ricombinante aprì
dibattiti più di 30 anni fa tra gli scienziati,
teologi, media, avvocati e altri
C
G
 Negli anni 1980 si concluse che la tecnologia
non ha causato alcun disastro e non porta
minacce alla salute umana e all’ambiente.
 Nel 1997 si clona la pecora – “Dolly” a
Edimburgo
Attilio Citterio
Chiusura della lacuna nel plasmide
chimerico con DNA Ligasi
C
G
DNA ligasi
Sviluppo Industriale del Biotech
Prime compagnie biotech formate:
1976 - Genentech
1978 - Biogen
1980 - Amgen
1981 - Immunex
1981 - Chiron
1981 – Genzyme
 I 160 farmaci e vaccini biotech approvati hanno aiutato più di 325
milioni di persone in tutto il mondo
 Attualmente sono in studi clinici più di 350 farmaci e vaccini biotech
per combattere oltre 200 malattie
 La Biotecnologia è responsabile di centinaia di test diagnostici, inclusi
i test su HIV e i test di gravidanza, mappatura del DNA …
Attilio Citterio
I Progressi Continuano
• Però, si sono addensate preoccupazioni sia sulle applicazioni che sulle
implicazioni etiche :
 Esperimenti di terapia genica hanno sollevato la questione dell’eugenetica
(selezione umana artificiale) come pure dell’analisi di malattie attualmente
senza una cura
 Sono stati sviluppati cloni animali, e ciò ha accresciuto la paura che si
possa passare alla clonazione umana
 In agricoltura, sussistono preoccupazioni sul contenimento genico e la
creazione di “super infestanti” (piante resistenti a erbicidi e/o pesticidi)
 Oggi, le paure sono focalizzate sui cibi geneticamente ingegnerizzati in
commercio e ha portato alla rapida crescita dell’industria dei cibi organici.
• Molte malattie geneticamente modificate, insetti, e piante resistenti agli erbicidi
sono in attesa di approvazione alla commercializzazione
• Si sono identificati i geni coinvolti in alcune malattie
• Si sono sviluppati nuovi trattamenti medici
• Si è anche sviluppata la “fitomedicina” molecolare, in cui si usano piante per
produrre farmaci (biofarmaci).
Attilio Citterio
Dimensioni in Biotecnologia
Nanometri
Aggregazioni
Piccole
molecole Macro
Atomi
molecole
Glucosio
Ribosoma
Legame C-C
10-10 m
10-9 m
1 nm
Emoglobina
10-8 m
10 nm
10-7 m
100 nm
Organismi pluricellulari
C. elegans
Uomo moderno
Cellule
Batteri
Mitocondri
10-6 m
1 μm
Metri
Millimetri
Micrometri
Globuli
rossi
10-5 m
10 μm
Attilio Citterio
Bumblebee
10-4 m
100 μm
10-3 m
1 mm
10-2 m
10 mm
10-1 m
100 mm
100 m
1m
Virus
•
•
•
•
•
•
proteine implicate nella sintesi
del DNA, RNA e di proteine
regolazione genetica
cancro e controllo della
proliferazione cellulare
trasporto di proteine e organelli
all’interno delle cellule
infezione e immunità
possibili approcci alla terapia
genica
Attilio Citterio
Batteri
•
•
•
•
•
proteine implicate nella sintesi
di DNA, RNA e di proteine,
metabolismo
regolazione genetica
bersagli per nuovi antibiotici
ciclo cellulare
comunicazione cellulare
Attilio Citterio
Lieviti
Saccharomyces cerevisiae
•
•
•
•
•
•
Controllo del ciclo cellulare e
della divisione cellulare
secrezione di proteine e
biogenesi di membrane
funzione del citoscheletro
differenziazione cellulare
invecchiamento
regolazione genica e struttura
dei cromosomi
Attilio Citterio
Vermi
Caenorhabditis elegans
• sviluppo del piano corpale
• linee cellulari
• formazione e funzione del
sistema nervoso
• Controllo della morte cellulare
programmata
• proliferazione cellulare e geni
del cancro
• invecchiamento
• comportamento
• regolazione genica e struttura
dei cromosomi
Attilio Citterio
Moscerino della Frutta
Drosophila melanogaster
• Sviluppo del corpo
• generazione di linee cellulari
differenziate
• formazione del sistema nervoso,
cuore e muscolatura
• morte cellulare programmata
• controllo genetico del
comportamento
• geni del cancro e controllo della
proliferazione cellulare
• controllo della polarizzazione
cellulare
• effetti di farmaci, alcool e
pesticidi
Attilio Citterio
Zebrafish
•
•
•
•
sviluppo del tessuto corporeo
vertebrato
formazione e funzione del
cervello e del sistema nervoso
difetti di nascita
cancro
Attilio Citterio
Topo
•
•
•
•
•
•
sviluppo del tessuto corporeo
funzione del sistema
immunitario nei mammiferi
formazione e funzione del
cervello e del sistema nervoso
modelli del cancro ed altre
malattie dell’uomo
regolazione genica e
ereditarietà
malattie infettive
Attilio Citterio
Geni Omeotici
• L’ordine dei
geni omeotici
è lo stesso
• L’ordine dei geni
corrisponde ad
analoghe regioni
del corpo
Attilio Citterio
Piante
•
•
•
•
•
•
•
Sviluppo e differenziazione
dei tessuti
genetica della biologia
cellulare
applicazioni in agricoltura
fisiologia
regolazione genica
immunità
malattie contagiose
Attilio Citterio
Specifiche del Genoma
Organismo
Tipo
# Cromo- # Geni
somi
(bp)
Hepatite B
virus
1
4
3215
E. coli
batterio
1
4,394
4,639,221
S. cerevisiae
lievito
16
6,183
12,000,000
D. melanogaster
moscerino
4
14,000
140,000,000
C. elegans
nematodo
6
19,000
90,000,000
A. thaliana
pianta
5
25,000
125,000,000
M. musculus
topo
20
35,000
3,000,000,000
H. sapiens
uomo
23
35,000
3,000,000,000
Attilio Citterio
Dimensione Genoma
Specifiche del Genoma
Attilio Citterio
Una Tipica Modifica Genetica
Attilio Citterio
Tipi di Sistemi d’Espressione




Batteri
Insetti
Lieviti
Linee di cellule di mammiferi
 Transgenica
 Animale
 Pianta
Attilio Citterio
Batteri
Svantaggi
Vantaggi
1. Genetica semplice e ben
caratterizzata
2. Rapida crescita cellulare
(raddoppia in 20-30 minuti)
3. Facili da crescere in mezzi di
cultura non costosi
4. Fermentazione facile da
ampliare di scala
5. Alti livelli di espressione
1. Mancanza di glicosilazione e
altre modifiche posttraslazionali
2. La rottura delle cellule
provoca problemi più
complessi di purificazione
3. Formazione di corpi di
inclusione; richieste
solubilizzazione e
ricostruzione
4. Presenza di endotossine e
proteine delle cellule ospiti
Attilio Citterio
Lieviti (e.g. S. cerevisiae, P. pastoris)
Vantaggi
Svantaggi
 Genetica ben conosciuta
 Rapida crescita cellulare
(raddoppia in 90 min)
 Mezzi culturali poco costosi
 Fornisce e facilita la
formazione di legami
disolfuro
 Relativamente pochi
problemi di purificazione
Attilio Citterio
 Le proteine possono essere
glicosilate e organizzate in
modo non corretto
 La over-glicosilazione è un
rischio
 Limite altre modifiche post-
traslazionali
 Generalmente livelli di
espressione inferiori a quelli
dei sistemi batterici
Cellule di Insetti (Baculovirus vector)
Vantaggi
Svantaggi
 Disponibili sistemi di
 Lenta crescita cellulare
secrezione
 Mezzi di cultura costosi
 Attivate le modifiche post-
traslazionali richieste per le
proteine eucariotiche superiori
 Alta espressione
 I vettori Baculovirus sono non
patogeni per l’uomo
Attilio Citterio
 Possibilità di modifiche
post-traslazionali non
identiche a quelle dei
sistemi superiori
 Sensibile a forze di taglio
Cellule di Mammiferi
Vantaggi
Svantaggi
 Glicosilazione di tipo
complesso
 Lenta crescita cellulare
(raddoppia in 18-24 ore)
 Altre modifiche post-
traslazionali
 Bassa densità cellulare finale
 Mezzi di cultura costosi
 Disponibili sistemi secretori
 Sensibile a forze di taglio
Produzione di vaccini, enzimi, ormoni, MAbs, proteine native o
modificate, proteine di fusione
CHO
NSO
Cellule umane – preoccupazione: potenziali trasportatori di malattie
Attilio Citterio
Differenti Tipi di Cellule
Eucariote
Procariote
 Nessun vero nucleo
 Nucleo legato alla
membrana
 Nessun organello legato
 Organelli intracellulari
alla membrana
 Piccole dimensioni
 Può contenere
cromosomi multipli
 Cromosoma circolare
lineari
 Cellule singole
 Generalmente cellule
più grosse
 Si possono organizzare
in organismi
multicellulari
Attilio Citterio
Cellule Procariote
Attilio Citterio
Cellule Eucariote
Attilio Citterio
Metabolismo Cellulare
Attilio Citterio
Metabolismo Cellulare (Ciclo Ac. Citrico, CTA)
È utile pensare all’ossidazione
metabolica dei substrati come a
un processo a 3 stadi:



il carbonio è incorporato
nell’acetil-CoA
il carbonio viene quindi
ossidato a CO2, agenti ridotti di
trasferimento elettronico e una
piccola quantità di ATP
gli agenti ridotti di
trasferimento elettronico sono
riossidati fornendo energia per
la sintesi di ulteriore ATP
(fosforilazione ossidativa)
L’attività del ciclo TCA è favorita
da bassi rapporti NADH/NAD+
Attilio Citterio
Promesse del Biotech in Campo Medico
DNA
proteine
Alcuni farmaci sono così complessi che si possono sintetizzare solo in
sistemi viventi.
Attilio Citterio
Promesse del Biotech in Campo Vegetale
•
Riso “giallo”
A livello mondiale, 7% dei bambini presentano deficienza
da vitamina A, molti vivono in regioni in cui il riso è un
alimento della dieta.
Il riso giallo
con il riso
standard
bianco.
•
Rilevazione di Mine
• Transgenica brevettata
inserita in piante
• Quando si rivela il metallo
dalla mina
• La pianta vira dal
verde al rosso
• Tecnologia sviluppata da
Aresa Biodetection
Rivel. Mine
Attilio Citterio
Innovazione nei Sistemi di Produzione di Enzimi
Piattaforme
Aspergillus
SVILUPPO DI PROCESSO
Trichoderma
Molecola
di interesse
Valutazione
su 10 L
B. licheniformis
Ampliamento
di scala
> 100.000L
B. substilis
Streptomyces
test iniziali:
Definite piattaforme
per una rapida scelta
di sistemi ospiti ottimali
Attilio Citterio
Mezzi per analisi
dei ceppi:
Miglioramento
Ceppi:
DNA arrays
Sequenza Genoma
Secrezione
Stabilità prodotto
siRNA
HTS
FACS
Modifiche genetiche
Prodotto
Sistemi Esperti per le Biotecnologie
Controlli
in linea
Flusso
Informazioni
Attilio Citterio
Biotecnologia:
Struttura di Produzione su Scala Pilota
Controllate, non classificate
Aree classificate
(stanze sterili)
Corridoi di uscita (“sporchi”)
Spazi per servizi (“grigi”)
Attilio Citterio
Personale di bioprocesso
Personale dei Servizi Centrali
Materie prime
Intermedi e prodotti in bulk
Scuola di Ingegneria Industriale e dell’Informazione
Corso 096125 (095857)
Introduction to Green and Sustainable Chemistry
A.A. 2015/2016
Biotrasformazioni
(trasformazione di un composto chimico in un
altro usando un biocatalizzatore)
Biotrasformazioni e Bioprocessi
“il processo con cui un materiale è convertito in un altro usando
agenti biologici (cioè., organismi viventi, microbi o enzimi). Esso
combina chimica, ingegneria, microbiologia e biochimica”
Ogni
materia
prima
Isolamento
Bio-trasformazione
Preparazione
Biocatalizzatore
Isolamento
bioingegneria
Sottoprodotti
scarti
prodotto
mutagenesi
Attilio Citterio
Enzimi: Fonti e Usi
A. I microrganismi si usano per produrre i catalizzatori naturali come gli enzimi
B. Gli enzimi si purificano dai microorganismi per uso industriale
C. Un enzima seleziona uno specifico substrato al suo sito attivo
D. Esso catalizza la reazione chimica con cui si formano i prodotti
E. Quindi si può separare i prodotti dalla superficie dell'enzima
Attilio Citterio
Efficacia Catalitica di Alcuni Enzimi
Enzima
Velocità di Reazione
Non enzimatica (s-1)
Velocità di Reazione
Enzimatica (s-1)
Aumento di
Velocità
Anidrasi Carbonica
1.3 × 10-1
1 × 106
7.7 × 106
Chorismato mutasi
2.6 × 10-5
50
1.9 × 106
Trioso fosfato
isomerasi
4.3 × 10-6
4300
1.0 × 109
Carbossipeptidasi
3.0 × 10-9
578
1.9 × 1011
AMP nucleosidasi
1.0 × 10-11
60
6.0 × 1012
Stafilococco nucleasi
1.7 × 10-13
93
5.6 × 1014
Fonte: Radzicka, A.; Wolenden R. Science, 267, 91 (1995).
Attilio Citterio
Purificazione e Funzioni degli Enzimi
Purificazione:
• Certamente una buona
opzione per vari enzimi
• Sono costosi.
• Ancora non pratici se sono
richiesti dei cofattori (p.es.
reazioni redox)
Funzione:
• Riconoscimento dei substrati
• Catalisi (abbassamento di Eatt
o Satt)
• Selettività
Attilio Citterio
Specificità di substrato:
• Complementarietà geometrica
• Complementarietà elettronica
• Adattamento Indotto
Stereo-specificità
H O
D
HO
N H2
N
R
H
O
+
YADH
H
H3C
C
H
NADD
Attilio Citterio
H3C
D
NAD+
Cofattori e Coenzimi
• Per alcuni enzimi sono necessari dei cofattori. Molto
spesso sono piccole molecole o ioni metallici
• Coenzimi
 Molecole Organiche
 Solubili
 Gruppi Prostetici
• Apoenzima vs. Holoenzima
NH2
N
O
O
P
O
O
O

O
P
O

O
P

N
O
O
O
OH OH
Attilio Citterio
N
N
Alcuni Cofattori
Attilio Citterio
Caratteristiche di Coenzimi Comuni
Coenzima
Reazione mediata
Fonte Vitamina
Malattia umana da
Deficienza
Biocitina
Carbossilazione
Biotina
a
Coenzima A
Trasferimento di acile
Pantotenato
a
Coenzimi Cobalammina
Alchilazione
Cobalammine (B12)
Anemia Perniciosa
Coenzimi Flavinici
Ossido-riduzioni
Riboflavina (B2)
a
Acido lipoico
Trasferimento di acile
-
a
Coenzimi Nicotinammide
Ossido-riduzione
Nicotinammide
(niacina)
Pellagra
Piridossal fosfato
Trasferimento di gruppo
ammino
Piridossina (B6)
a
Tetraidrofolato
Trasferimento di gruppo a
un-carbonio
Acido folico
Anemia
megaloblastica
Tiamina pirofosfato
Trasferimento di aldeide
Tiamina (B1)
Beriberi
aNessun
nome specifico: la deficienza nell’uomo è rara o non osservata.
Attilio Citterio
Da dove Ottenere gli Enzimi:
Cosa dire sull’uso di animali superiori?
• La società in generale è meno spaventata dalle forme
macroscopiche della vita che dai membri del mondo
microscopico
• L’uomo ha usato animali da molto tempo per
biotrasformazioni
• Molte problematiche etiche e ambientali associate
• Spesso costoso
Attilio Citterio
… e sull’uso delle Piante?
•
•
•
•
•
Grande diversità e capacità metabolica.
Minori problemi etici e ambientali associati.
Probabilmente non costosi
Molti vecchi e nuovi lavori si riferiscono a cellule di piante
sospese
Del tutto simile all’uso di microorganismi ma in pratica più
complicato




Crescita lenta
Frequente contaminazione
Attrezzature speciali richieste
Incredibilmente costoso.
Attilio Citterio
Parti di Piante come Reagenti Chimici
I problemi si possono superare se si usa la “pianta stessa”
(o una parte di essa) al posto di lavorare con una cultura
cellulare:
 Le cellule stanno già crescendo
 Non sono richieste attrezzature speciali
 Nessuna contaminazione
 I cofattori sono già presenti
 Pochi problemi ambientali
 Costi molto contenuti.
Attilio Citterio
Classificazione degli Enzimi
in Base al Tipo di Reazione
CLASSI DI ENZIMI
Tipo di REAZIONE CATALIZZATA
____________________________________________________
1. Ossidoriduttasi
Reazioni di ossido-riduzione
2. Transferasi
Trasferimento di gruppi funzionali
3. Idrolasi
Reazioni idrolitiche (H2O) o solvolitiche
4. Liasi
Eliminazione di gruppi (per es. formazione di
doppi legami)
5. Isomerasi
Reazioni di isomerizzazione
6. Ligasi
Formazione di legami accoppiata a
idrolisi del trifosfato ATP
____________________________________________________
Attilio Citterio
Enzimi in Biotecnologia
Enzimi nella produzione di alimenti e bevande
 Industria casearia
 Industria della birra
 Industria del vino e dei succhi
 Industria dell’alcool
 Industria delle proteine
 Industria della carne
 Industria da forno
 Industria degli oli e grassi
Enzimi come catalizzatori industriali
 Industria della lavorazione dell’amido
 Industria degli antibiotici
 Industria della Chimica Fine
Attilio Citterio
Enzimi in Biotecnologia
Enzimi come prodotti finali
 Industria dei detergenti
 Industria degli agenti di pulizia
 Industria Farmaceutica
 Industria dell’alimentazione animale
 Applicazioni analitiche
Enzimi come ausiliari di processo
 Industria Tessile
 Industria del cuoio
 Industria della carta
 Industria dello zucchero
 Industria del caffè
Attilio Citterio
Fattori Importanti nell’Uso di Enzimi
•
Possibili reazioni non realizzabili mediante la chimica
tradizionale
•
Specificità di reazione inclusa la specificità di substrato, la
specificità di posizionale e la stereo specificità
•
Consente condizioni di processo più blande, quali temperatura,
pH, sterilità, ecc.
•
Riduce il numero di fasi di processo richieste
•
Elimina la necessità di usare solventi organici nelle lavorazioni
•
L’immobilizzazione dell’enzima ne permette il riuso o l’uso in
continuo
•
L’uso di enzimi in combinazione con altri stadi chimici
•
Ingegneria genetica per migliorare gli enzimi
Attilio Citterio
Metodi di Immobilizzazione
Metodi Chimici
Metodi Fisici
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
Legami covalenti
E
E
Reticolazione
Intramolecolare
(reticolazione
intersubunità)
Adsorbimento
Intrappolamento in
gel polimerici
Intrappolamento in
fibre
E+
E
E+
- - -
-
E
E
E
E
Microincapsulazione Adsorbimento
elettrostatico
E
E
Reticolazione
Intramolecolare
E
E
E
E
Copolimerizzazione di
enzimi modificati con
monomero insaturo in gel
tridimensionali
E
Intrappolamento in
film polimerici e
membrane
semipermeabili
Attilio Citterio
Intrappolamento in
liposomi
E
Intrappolamento in
fibre cave
Mercato Industriale degli Enzimi
Vendite annuali: 1.6 miliardi di dollari
Lavorazione cibi ed amido:
45%
Detergenti:
34%
Tessili:
11%
Cuoio:
3%
Carta:
1.2%
Prodotti di reazioni enzimatiche
Sciroppi ad alto tenore di fruttosio
1 miliardo di $
Aspartame:
850 milioni di $
Acrilammide
300 milioni di $
Attilio Citterio
Produzione di Concentrati di Fruttosio da
Amido
Impasto di amido (30-35% DS, pH 6.0-6.5, Ca2+ 50 ppm)
Liquefazione
-Amilasi termostabile
Gelatinizzazione (105°C, 5 min)
Destrinizzazione (95°C, 2h)
Amido Liquefatto DE 10-15
Saccarificazione
Glucoamilasi
(60°C, pH 4.0-4.5, 24-72 h)
Melassa di Glucosio DE 95-96
H OH
H O
HO
HO
OH
H
OH
H
H
HO
OH
H
HO
Isomerizzazione
Glucosio isomerasi
(pH 7.5-8.0, 55-60°C, 5 mM Mg2+)
Melassa ad alto contenuto di Fruttosio (42%)
Attilio Citterio
H
O
H
Glucosio
isomerasi
H
OH
Produzione di Glucosio da Amido
_______________________________________________________________
Liquefazione
Saccarificazione
DE
Glucosio
_______________________________________________________________
Acido
Acido
92
85
Acido
Glucoamilasi
95
91
Acido/α-amilasi
Glucoamilasi
96
92
α-Amilasi/alta pressione Glucoamilasi
cottura/ α-amilasi
97
93
α-Amilasi (termostabile) Glucoamilasi
97
94
α-Amilasi (termostabile) Glucoamilasi
97-98.5
95-97.5
_______________________________________________________________
Attilio Citterio
Vantaggi nell’Uso della Pullulanasi nel
Processo di Saccarificazione dell’Amido
•
Aumento delle rese di glucosio (~ 2%) con glucoamilasi
•
Aumento delle rese di maltosio (~ 20-25%) con β-amilasi
•
Riduzione del tempo di saccarificazione (a 48 h)
•
Aumento della concentrazione del substrato (a 40%, DS)
•
Riduzione nell’uso di glucoamilasi (fino al 50%)
Attilio Citterio
Sintesi Enzimatica delle Penicilline:
Acido 6-Amminopenicillanico
Penicillina:
 Scoperta da Fleming nel 1932
 19% del mercato mondiale degli antibiotici.
 > Azione inibitoria sulla sintesi delle pareti cellulari di batteri
 Ampio spettro di attività antibatterica
 Bassa tossicità
 Straordinaria efficacia verso vari ceppi batterici.
 L’eccessivo uso ha portato allo sviluppo di patogeni resistenti
6-APA:





materia prima per la produzione di nuove penicilline
semisintetiche (amoxycillina e ampicillina)
Minori effetti collaterali e diminuita tossicità
H
Maggiore selettività verso i patogeni
H2N
Più ampio spettro antimicrobico
N
Migliori proprietà farmacologiche
O
S
OH
O
Attilio Citterio
Deacilazione Chimica ed Enzimatica di
Penicilline a 6-APA
O
R
H
N
H
S
Penicillina acilasi
N
OH
Alcalina
[Enzimatica]
O
O
Penicillina V o G
[R = Ph o PhO]
H
H2N
S
N
O
(6-APA)
O
R
PCl5
ROH
H2O
[Chimica]
Piridina
Me3SiCl
H
N
H
S
N
OSi(CH3)3
O
O
Attilio Citterio
OH
O
Acido 6-Amminopenicillanico
Metodo Chimico:
 Uso di composti pericolosi - piridina, pentacloruro di fosforo,
nitrosil cloruro
Metodo Enzimatico:
 Regio- e stereo-specifico
 Condizioni di reazione più blande (pH 7.5, 37 °C)
 Il processo enzimatico è del 10% meno costoso
Enzimi:
 Penicillina G acilasi (PGA) - Escherichia coli, Bacillus megaterium,
Streptomyces lavendulae
 Penicillina V acilasi (PVA) - Beijerinckia indica var. Penicillium,
Fusarium sp., Pseudomonas
acidovorans
 Enzima immobilizzato:
vita, 500-2880 ore
Attilio Citterio
Modifica Enzimatica di Penicilline in 6-APA e
Penicilline Semisintetiche
O
R
H
N
H
S
N
OH
O
O
Penicillina acilasi
Alcalino
[Deacilazione]
H2N
H
S
N
OH
O
O
(6-APA)
Penicillina V o G
Penicillina acilasi
[Acilazione]
Acido
Penicilline
Semisintetiche
Attilio Citterio
Sintesi Enzimatica dell’Acrilammide



Materia prima monomerica per la produzione di polimeri sintetici
Ottenuta per idratazione della funzione nitrilica dell’acrilonitrile
Mercato mondiale, 200,000 t/anno
Processo Chimico:
 Reazione dell’acrilonitrile con acqua in presenza di H2SO4 (90 °C) o
catalizzatore metallico (80-140 °C)
 Formazione di scarti tossici (HCN)
 La reazione si deve bloccare per prevenire la conversione dell’acrilammide in
acido acrilico
Processo Enzimatico:
H
H
NH2
C
 Resa: 99.9%
N
C
H2C
5 °C
C
H2C
 Kg di prodotto / g cellule
pH 7.5
O
Resa 99.99%
 Non si produce acido acrilico
 Numero minore di stadi di processo
 Molto più ambientalmente compatibile
 Nitto Chemical Industry: 6,000 t/anno L’enzima attivo è la nitrile idrolasi presente
nelle cellule intere di Rhodococcus rhodochrous, immobilizzate su gel di
poli(propenammide)
Attilio Citterio
Confronto tra le Sintesi Chimiche e
Biochimiche dell’Acrilammide
Processo catalizzato (Cu)
Recupero e
preparazione
del catalizzatore
Acrilonitrile
Acqua
Rimozione
di O2
Separazione
catalizzatore
Idratazione
Concentrazione
Rimozionedel
delCu
Cu2+2+
Rimozione
Decolorazione
Decolorazione
Prodotto
Acrilammid
e
Acrilonitrile
non reagito
Processo microbiologico
Coltivazione e
immobilizzazione
del microrganismo
Acrilonitrile
Idratazione
Acqua
Separazione
catalizzatore
Decolorazione
Catalizzatore
spento
Reazioni della nitrile idratasi e amidasi
H2O
CH2=CH-CN
Nitrile idratasi
H2O
CH2=CH-CONH2
CH2=CH-COOH
Amidasi
Attilio Citterio
Prodotto
Acrilammid
e
Biocatalisi e Acrilammide
Poli(propenammide) acqua con
Poliacrilammide
colorante verde
Mescolamento
Gel risultante
Matrice per separazione di
macromolecole biologiche
Attilio Citterio
Sintesi dell'Aspartame (Estere Metilico L-Asp-L-Phe)
L’Aspartame è un dolcificante dipeptidico formato dalla condensa-zione
dell’estere metilico della fenilalanina con l’acido aspartico


Molto usato nei cibi e nelle bevande
200 volte più dolce del saccarosio
 Vendite annuali: 200 milioni di libbre, 850 milioni di $
Metodo Chimico:
 Bisogna proteggere il gruppo amminico dell’acido aspartico per
prevenirne la reazione con un’altra molecola di acido aspartico e
dare sottoprodotti
 Si deve usare il singolo enantiomero corretto di ogni reagente per
dare la corretta stereochimica dell’aspartame (il beta-aspartame è
amaro)
Metodo Enzimatico:
 La Termolisina promuove la reazione solo alla funzionalità alfa
 Condizioni blande, pH 6-8, 40 °C
 Cbz. = benzilossicarbonile
Attilio Citterio
Bioproduzione dell’Aspartame
+
termolisina
Acido N-Cbz-aspartico estere metilico
D,L-fenilalanina
H2O
Ph
H
N
O
O
O
CO2 H
Ph
N
H
Cbz-aspartame
Cbz = benzilossicarbonile
(PhCH2OCO-)
Attilio Citterio
CO2 Me
L-Carnitina
Inibitore della Tiroide
 agente dimagrante
 Supplemento dietetico per atleti
 Si usa solo un enantiomero del composto
Disponibili due strade biocatalitiche:
 Saccharomyces cerevisiae
 Rhizobiaceae
HO H
Me3N
O
O
L-Carnitina
Attilio Citterio
Sintesi della Carnitina
riduttasi
(1)
estere ottilico dell’acido
-cloroacetoacetico
estere ottilico dell’acido
(R)--cloro--idrossibutanoico
+
L-carnitina
idrossilasi
(2)
-butirrobetaina
+
L-carnitina
Attilio Citterio
Sintesi Alternative del Naproxen
COOH
*
biocatalisi
MeO
MeO
COOH
molti stadi
MeO
C2H5
MeO
risoluzione
(D,L)
MeO
O
COOH
1) Acido tartarico
2) Br2
3) Idrolisi
MeO
Attilio Citterio
MeO
COOH
*
Naproxen
*
Sintesi del Calcio Antagonista Diltiazem
esterase
(R,R)
racemate
Diltiazem
Attilio Citterio
(S,S)
Sintesi del Catecolo dal Glucosio
acetone
a
idrochinone
b
benzene
HO
cumene
c
fenolo
HO
OH
catecolo
OH
OH
O
OH
OH
OH
D-glucosio
(a)
(b)
(c)
(d)
CO2H
CO2H
E. coli
d
E. coli
O
OH
OH
Ac. 3-deidroshichimico
HO
OH
acido protocatechico
propilene, catalizzatore solido H3PO4, 200-260°C, 400-600 psi.
O2, 80-130°C quindi SO2, 60-100°C.
Ti-Silicalite, 70-80°C
E. coli AB2834/pKD136/pKD9.069A, 37°C.
Attilio Citterio
Draths and Frost, 1995
Eliminazione dell’Amaro dagli Idrolizzati
Proteici
•
Trattamento con carboni attivi
•
Estrazione con alcool
•
Precipitazione isoelettrica
•
Separazione cromatografica
•
Mascheramento dell’amaro
•
Idrolisi enzimatica dei peptidi amari
 con amminopeptidasi
 con proteasi alcalina/neutra
 con carbossipeptidasi
•
Reazioni di condensazione usando proteasi
Attilio Citterio
Mannitolo
• Additivo alimentare (usato nel chewing gum)
• Riduce la tendenza alla cristallizzazione dello zucchero e si usa come tale per
aumentare la conservazione delle derrate
• Formulazioni farmaceutiche di compresse masticabili e polveri granulari
• Previene l’assorbimento dell’umidità dall’aria, mostra eccellenti proprietà alla
compressione meccanica, non interagisce con i componenti attivi, e il suo
leggero dolce maschera il sapore sgradevole di molti farmaci
• Il mannitolo esanitrato è un ben noto vasodilatore, usato nel trattamento
dell’ipertensione
• Il complesso dell’acido borico con il mannitolo si usa nella produzione dei
condensatori elettrolitici a secco
• E’ un poliolo ampiamente usato per la produzione di resine e tensioattivi
• Ha una bassa solubilità in acqua (solo 18% w/w a 25 °C)
• In soluzioni alcaline, è un potente sequestrante di ioni metallici
• E’ dolce circa la metà del saccarosio
• Si prepara per idrogenazione catalitica del D-fruttosio
Attilio Citterio
Via di Conversione Etero-fermentativa del
Fruttosio a Mannitolo
Fruttosio
2 Fruttosio
ATP
ADP
Fruttosio – 6-P
HO
Glucosio – 6-P
NADP+
OH
O
NADPH +
OH
OH Mannitolo 2-deidrogenasi HO
H+
HO
6 - Fosfogluconato
OH
OH
NADP+
CO2
NADPH + H+
OH
Ribulosio – 5-P
D-Fruttosio
Xilulosio – 5-P
Acetil - P
Gliceraldeide - 3-P
2 ADP
NAD+
NADH + H+
ADP
2 ATP
Piruvato
ATP
NADH + H+
NAD+
Acetato
Lattato
2 Mannitolo
Attilio Citterio
NAD(P)H
NAD(P)
HO
HO
Mannitolo
Produzione del Mannitolo dal Fruttosio per
Fermentazione batch a pH controllato
Fruttosio
(g/L)
Tempo
(h)
Mannitolo
(g/g)
Acido lattico
(g/g)
Acido Acetico
(g/g)
150
15
0.720.00
0.17±0.00
0.12±0.00
200
40
0.69±0.03
0.17±0.00
0.13±0.00
250
64
0.70±0.02
0.16±0.00
0.12±0.00
300
136
0.66±0.03
0.15±0.01
0.11±0.00
A 37oC, 130 rpm, pH Iniziale 6.5, pH controllato a 5.0, recipiente da 500 ml con 300 ml di
mezzo.
Attilio Citterio
Co-Ulilizzazione del Fruttosio e Glucosio e
Produzione del Mannitolo
Substrato o Prodotto (g/L)
100
Fruttosio
Mannitolo
O
37 C
pH 5.0
50
Acido lattico
Acido acetico
Glucosio
0
0
12
36
24
Tempo (h)
Attilio Citterio
48
Produzione del Mannitolo per Fermentazione
(a Batch Alimentato) a pH Controllato
Substrato o Prodotto (g/L)
O
37 C
pH 5.0
200
150
Mannitolo
100
Fruttosio
Fruttosio usato:
300 g/L
(concentrazione
finale)
Acido
lattico
50
Acido acetico
0
0
24
48
72
Tempo (h)
Attilio Citterio
96
Confronto tra Fermentazione e
Idrogenazione Catalitica
•
•
•
•
•
•
Tutto il fruttosio convertito in
mannitolo
Co-prodotti: acido lattico e acido
acetico pari a metà del mannitolo
Il glucosio è la fonte di idrogeno
nella idrogenazione
Una fonte di azoto è essenziale
per la crescita
Elettrodialisi per rimuovere gli
acidi organici
Uso di substrati meno puri non
pone problemi
Attilio Citterio
•
•
•
•
•
•
Solo metà del fruttosio è
convertito in mannitolo
Co-prodotto: sorbitolo in grande
eccesso (3)
E’ necessario idrogeno gas molto
puro
Essenziale il catalizzatore di
Nichel
Resine a scambio ionico per
togliere gli ioni nichel
Necessari substrati molto puri
per prevenire la disattivazione del
catalizzatore
Rigenerazione del Cofattore
• Chimica
• Fotochimica
• Elettrochimica
• Biologica
• Enzimatica
Attilio Citterio
Rigenerazione del Cofattore
(D-Fruttosio-Mannitolo)
Mannitolo Deidrogenasi
Mannitolo
D-Fruttosio
NADH
CO2 + H2O
NAD+
Na-Formiato
Formiato Deidrogenasi
o
Acido Gluconico
Glucosio Deidrogenasi
Attilio Citterio
Glucosio + H2O
Reazioni di Ossidazione Biocatalitiche
Liasi trasferasi
Isomerasi
Lipasi
Ossigenasi
(enzimi isolati)
Ossido-riduttasi
(cellule intere)
Altre Idrolasi
Esterasi
Nitrilasi
Proteasi
I processi di Ossidazione Biologica non sono molto indagati (≠p.es. idrolasi)
1.
2.
mancanza di disponibilità commerciale e
considerati complessi (richiedono attrezzature/conoscenze
microbiologiche, adeguamenti, ‘cofattori’ non-enzimatici e proteine
essenziali redox)
Attilio Citterio
Esempi di Reazioni di Ossidazione
Biocatalitiche Disponibili
Idrossilazioni
Citocromi P450
Ossidazione di alcoli
Alcool
Deidrogenasi
Ossidazioni di Baeyer-Villiger
Flavina
Monoossigenasi (FMO)
Attilio Citterio
Esempi di Reazioni di Ossidazione
Biocatalitiche Disponibili
Ossidazioni di eteroatomi
Varie ossidasi, inc. P450,
diossigenasi, FMO
X = S, Se, N
Ossidazione di amminoacidi
Amminoacido ossidasi
2
2
Epossidazioni
P450,
cloroperossidasi
Attilio Citterio
2
Esempi di Reazioni di Ossidazione
Biocatalitiche Disponibili
Diidrossilazioni
Diossigenasi
Formazione di perossidi
Perossidasi
Dealchilazioni
R-X-Alk
R-X-H
X = N, O
Attilio Citterio
Idrossilazione
O2
enzima
•
Catalizzata dai Citocromi P450 (ossidasi contenenti l’EME
implicate nei processi di detossificazione cellulare
•
Si usano più frequentemente cellule intere in quanto:

I P450 tendono a legarsi alla membrana cellulare (perciò sono
intrattabili)
 L’attività dipende da ‘cofattori’ non-proteici E normalmente da
proteine ausiliarie di tipo redox
Attilio Citterio
Idrossilazione
Classe II
Classe I
NADPH
NAD(P)H
NADP+
NAD(P)+
FAD
FeS
FAD/ FMN
Eme
Eme
ENDOPLASMIC
RETICULUM
Classe IV
Classe III
NADPH
NADPH
HO2C
NADP+
FAD/ FMN Eme
NH2
NADP+
FMN Eme
FeS
NH2
CO2H
Tipi di citocromi P450 (da Roberts G.A., Grogan, G., Greter, A.
Flitsch, S.L. e Turner N.J. J. Bacteriol. (2002) 184, 3898-3908.
Attilio Citterio
Idrossilazione
11
1
Rhizopus arrhizus
8
3
16
14
9
15
7
11-Idrossi-Progesterone
Progesterone
•
•
•
•
Idrossilazione di steroidi (e.g. Peterson et al. J. Am. Chem. Soc. 74,
5933-5936 (1952)
L’applicazione commerciale della idrossilazione 11 del progesterone
ha eliminato metà dei passaggi della sintesi dell’idrocortisone
Esiste un biocatalizzatore per l’idrossilazione selettiva di OGNI
posizione sul nucleo steroideo
Nessun equivalente abiotico dimostra ugual selettività.
Attilio Citterio
Idrossilazione
Acetobacter oxydans
NRRL B3603
(S)-nicotina
6-Idrossi-(S)-nicotina
L’idrossilazione della (S)-nicotina da parte del A. oxydans (Lonza)
implicata nella produzione dell’epibatidina.
Schmid, A., Dordick, J.S., Hauer, B., Kiener, A., Wubbolts, M e Witholt, B., Nature (2001) 409, 258-268.
Attilio Citterio
Idrossilazione
HO
O
O
O
Alkyl
O
H
OBn
HO
HO
HO
HO
HO
O
C
NMe
HO
OH
HO
Attilio Citterio
N H2
O
Ossidazioni di Baeyer-Villiger
Flavina
Monoossigenasi (FMO)
Inserimento di un atomo di ossigeno adiacente al gruppo carbonilico
catalizzato dalla Baeyer-Villiger Monoossigenasi (BVMOs).
BVMOs necessita di
• Un cofattore flavinico
• Un cofattore nicotinamide nucleotide
• O2
Attilio Citterio
Ossidazioni di Baeyer-Villiger
F
O
Acinetobacter
calcoaceticus
F
F
O
NCIMB 9871
+
O
O
Br
Br
(-)-
(+/-)
Levitt, M.S., Newton, R.F., Roberts, S.M. and Willetts, A.J.,
J. Chem. Soc, Chem. Commun., (1990) 619-620.
Però, A. calcoaceticus è un patogeno ACDP di Classe II
Attilio Citterio
Br
(-)-
Ossidazioni di Baeyer-Villiger
1.
Uso dell’enzima isolato
O
BVMO da
R
O
O
R
A. calcoaceticus
+
NADPH
biossido di carbonio
O
NADP
Formaito
deidrogenasi
formiato di sodio
Seelbach K., Riebel B., Hummel W., Kula M.R., Tishkov V.I., Egorov A.M.,
Wandrey C., Kragl U., Tetrahedron Lett., (1996) 37, 1377-1380.
Approccio costoso (NADPH da Catalogo Sigma £ 500/g!)
Attilio Citterio
R
Ossidazioni di Baeyer-Villiger
2. Uso di organismo ingegnerizzato; BVMO espresso nel lievito
‘progettato’ o in Escherichia coli di Classe I
BVMO da A. calcoaceticus NCIMB 9871
espresso nel Lievito di birra
Wang, S., Chen, G. Kayser, M.M., Iwaki, H., Lau, P.C.K. and Hasagawa, Y.
Can. J. Chem., (2002) 80, 613-621
Attilio Citterio
Amminoacido Ossidasi – Racemizzazione di
Amminoacidi
Amminoacido ossidasi
Amminoacido ossidasi
 Catalizza la deamminazione ossidativa di amminoacidi a -chetoacidi
 Richiede ossigeno molecolare e una flavina come cofattore
 Sono commercialmente disponibili con selettività sia ‘D’ che ‘L’
 Si possono usare sia come enzimi isolati, che espressi in sistemi
cellulari completi
Attilio Citterio
Amminoacido Ossidasi – Racemizzazione di
Amminoacidi
bioossidazione con
D-amminoacido ossidasi
+ H2O
riduzione
con per.es.
NaBH4
- H2O
Chemoenzymatic deracemisation of amino acids. After Hafner, E.W. and
Wellner, D., Proc. Natl. Acad. Sci., 1971, 68, 987.
Attilio Citterio
Amminoacido Ossidasi – Deracemizzazione
di Amminoacidi
D-amminoacido Ossidasi
NaCNBH3
resa 86%
99% e.e.
Deracemizzazione dell’acido DL-piperazin-2-carbossilico
(un componente dell’inibitore della protease HIV Crixivan)
Beard T.M. e Turner N. J., J. Chem. Soc. Chem. Commun. (2002) 246-247
Attilio Citterio
Reazioni di Riduzione con “Daucus carota”
H2O, 20 ºC
1 - 24 ore
• Yadav, J. S.; Nanda, S.; Thirupathi Reddy, P.; Bhaskar Rao, A. J. Org. Chem. 2002, 67, 3900.
• Maczka, W. K.; Mironowicz, A. Tetrahedron: Asymmetry 2002, 13, 2299.
• Bruni, R.; Fantin, g.; Medici, A.; Pedrini, P.; Sachetti, G. Tetrahedron Lett. 2002, 43, 3377.
• Baldassarre, F.; Bertoni, G.; Chiappe, C.; Marioni, F. J. Mol. Cat. B: Enzymatic 2000, 11, 55.
• Chadha, A.; Manohar, M.; Soundararajan, T.; Lokeswari, T. S. Tetrahedron: Asymmetry 1996, 7, 1571.
Attilio Citterio
Riduzioni con Lievito di Birra
Saccaromices
cerviceae
H2O, 30 ºC
0.5 - 24 ore
• stereoselettivo
• sostenibile
• facile da fare
• prezzi ragionevoli
• Il “Baker’s Yeast” è il solo microorganismo
che si può comprare in una panetteria.
• Non richiede condizioni asettiche e
neppure un laboratorio microbiologico.
• Non richiede l’aiuto di un microbiologo.
• Di fatto non è necessario conoscere per
nulla la microbiologia.
Attilio Citterio
Limiti nell’uso del Lievito (BY)
•
Nel sistema ci sono molti enzimi differenti, per cui non si
possono escludere reazioni collaterali.
•
Il lievito BY commerciale non è puro e frequentemente
porta a risultati inattesi.
•
•
L’isolamento del prodotto è talvolta complicato.
Ci può essere un impatto ambientale implicato nella
preparazione del BY.
Attilio Citterio
Procedura Semplice
Attilio Citterio
Effetto dei Sostituenti
H2O, 20 ºC
1 - 24 ore
100
Percentuale
80
60
40
20
0
H
Cl
Br
F
Resa
NO2
Me
MeO
HO
ee
Yadav, J. S.; Nanda, S.; Thirupathi Reddy, P.; Bhaskar Rao, A. J. Org. Chem. 2002, 67, 3900.
Attilio Citterio
Effetto del Nucleo Aromatico
H
HO
O
Ar
Ar
C
100
Percentuale
80
60
40
20
0
Naph
MeO-Naph
Resa
Furile
Benzofuranile
ee
Yadav, J. S.; Nanda, S.; Thirupathi Reddy, P.; Bhaskar Rao, A. J. Org. Chem. 2002, 67, 3900.
Attilio Citterio
Effetto del Nucleo Aromatico
H
HO
O
Ar
Ar
C
100
Percentuale
80
60
40
20
0
Tetralone
2-tetralone
Resa
Attilio Citterio
6-MeO-1tetralone
ee
Indanone
Altri Composti Carbonilici
H
HO
O
R
R
C
100
Percentuale
80
60
40
20
0
Tetralone
2-tetralone
Resa
Attilio Citterio
ee
6-MeO-1-tetralone
Fattore E e EMY in Biotrasformazioni
Fattore E =
Kg Scarti reali
Fattore EMY =
Kg di Prodotto
H
HO
O
10 g
Kg di Prodotto
Kg Scarti NBio*
C
H2O, 50 g
R
R
70 mg
100 mg
E = 10 g / 70 x 10-3 g = 143
EMY = 70 x 10-3g / 70 x 10-3 (+10)g
= da 1 a 0.007
* NBio = scarti che non si possono smaltire o riciclare in sicurezza
Attilio Citterio
100
89
72
80
60
62
61
chetoesteri
azidochetoni
45
40
20
0
acetofenone chetoni ciclici
Rapporto carota/
substrato
Tempo di reazione medio (ore)
Tempo di reazione medio (ore)
Tempi di Reazione
chetoni
alifatici
100
80
60
45
40
24
20
6
3
5000/1
10000/1
0
100/1
Attilio Citterio
1000/1
Conclusioni
• Le Reazioni Biocatalitiche continuano ad essere
studiate con grande interesse perché:
 In molti casi, non esistono reazioni equivalenti ‘abiotiche’ di
selettività confrontabile
 Le caratteristiche generali delle Reazioni Biocatalizzate le fanno
percepire come vie ‘più sostenibili’ per molti composti.
• Ostacoli
 Percezione dell’uso di sistemi microbici/ biochimici dalla comunità
organica
 Percezioni dell’uso di organismi/reagenti GM nella produzione di
materiali per il consumo umano
Attilio Citterio
Aree di Ricerca di Bioprocessi
•
•
•
•
Produzione di combustibili e composti chimici
Trattamento biologico di combustibili fossili
Biotrattamento & bioremediation
Biologia applicata
Capacità
• Ing. BioChim. - nuovi reattori, separazioni, modellizzazioni
e integrazione di sistemi
• Biocatalizzatori multi-fase e non acquosi
• Sviluppo di ceppi microbici e bioprospezione
• Infrastrutture per ricerche di bioprocessi
Aree correlate - Separazioni (indotte da campi elettrici)
- Biomimetici (adsorbenti, catalisi, materiali)
Attilio Citterio
Biotrattamenti e Bioremediation di Scarichi
•
Biofiltrazione e Biosolubilità di VOC (alcani, NOx, TCE)
•
Agenti Chim-Bio
•
Biocatalisi non acquosa (‘anidra’) per vapori pericolosi (CWA, VOC)
•
Bioadsorbimento di metalli pesanti (U, Cd) con biopolimeri
•
Rimozione e trattamento del mercurio
•
Bioremediation usando enzimi termofili non acquosi (solventi clorurati)
•
Biodegradazione dei PCB
•
Biodegradazione dei BTEX e combustibili
•
Over espressione microbica di enzimi degradativi e produzione di
GEM
•
Biodegradazione dei pesticidi e farmaci
Attilio Citterio
Usi Non-Convenzionali di Enzimi in Mezzi
Non acquosi
“Anidro”
Liofilizzazione
Acqua Sali
Solvente Organico
(Insolubile)
Attilio Citterio
(Solubile)
Uso non-convenzionale di Enzimi: Stato-Dry
Substrato

Consentite temperature
superiori

Più alte concentrazione di
vapori

Superiore
stabilità/durabilità

Limitato cineticamente, non
limitato dal trasporto
interfase

Verificato in esterificazioni,
vari test in corso
Prodotti
Attilio Citterio
Riferimenti sulla Biotecnologia
•
•
•
•
•
Michael Shuler and Fikret Kargi : Bioprocess Engineering : Basic
concepts
Gary Walsh, Biopharmaceuticals : Biochemistry and Biotechnology
2003 (ISBN: 978-0-470-84327-7)
Ahmann D, Dorgan J. Bioengineering for Pollution Prevention through
Development of Biobased Energy and Materials: State of the Science
Report U.S. EPA Agency, Jan. 2007. EPA/600/R-01/028.
Werpy T, Petersen G. Top Value Added Chemicals From Biomass.
Volume I (2004): Results of Screening for Potential Candidates from
Sugars and Synthesis Gas PNNL Laboratory and National Renewable
Energy Laboratory (NREL), Vol.II (2007)
V. S. Bisaria, A. Kondo Ed. Bioprocessing of Renewable Resources
to Commodity Bioproducts, 2014 (ISBN: 9781118175835)
Attilio Citterio