Bioinformatica
RNA non codificanti ed RNAi
Dott. Alessandro Laganà
Piccoli RNA non codificanti
Struttura dell’RNA
RNA regolatore
microRNA
RNAi e siRNA
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26-04-2010
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L’RNA (Acido Ribonucleico) è un polimero organico
costituito da ribonucleotidi.
E’ sintetizzato da enzimi detti RNA polimerasi,
solitamente sulla base di uno stampo di DNA.
Esistono diversi tipi di RNA, ognuno dei quali svolge una
determinata funzione.
L’mRNA (RNA Messaggero) trasporta l’informazione per
la sintesi delle proteine dal nucleo al citoplasma.
L’informazione principale sta nella sua sequenza, ma studi
recenti hanno rivelato l’importanza della sua struttura
nella regolazione dell’espressione genica.
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Gli RNA non codificanti (ncRNA – non coding RNA) giocano
un ruolo fondamentale nei sistemi biologici complessi, pur non
codificando alcuna proteina.
Tra i ncRNA maggiormente caratterizzati troviamo i tRNA
(RNA transfer) e gli rRNA (RNA ribosomiali).
Recenti studi hanno però rivelato diverse altre classi di
ncRNA, aventi funzioni catalitiche e strutturali.
Questi RNA sono componenti essenziali di complessi
riboproteici (RNP), all’interno dei quali svolgono il ruolo di
guida e riconoscimento di sequenze nucleotidiche target
attraverso il meccanismo di complementarità delle basi.
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I tRNA (RNA Transfer) sono in grado
di riconoscere i codoni nelle sequenze
di mRNA e di trasportare gli
aminoacidi corrispondenti nei
ribosomi, durante la sintesi proteica.
La loro struttura secondaria è ben
determinata ed è fondamentale per la
loro funzione.
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L’rRNA (RNA Ribosomiale) è un costituente dei
ribosomi ed ha funzione catalitica assieme alle
proteine ribosomiali.
Gli RNA con funzione di catalizzatore sono
generalmente chiamati Ribozimi (RNA-Enzimi) e
tale funzione gli viene conferita dalla loro
struttura tridimensionale.
Quindi questo tipo di RNA sono simili alle
proteine, in quanto devono assumere una
struttura particolare per poter svolgere la loro
funzione.
Data la loro capacità di immagazzinare
informazione e di partecipare alle reazioni
chimiche, gli RNA sono considerati tra le
molecole più antiche, ancor più di DNA e
proteine.
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snoRNA (Piccoli RNA nucleolari): sono implicati nel
processamento e nella maturazione degli RNA ribosomali
e di altri tipi di RNA, aumentandone l’attività.
miRNA e siRNA: sono piccoli RNA in grado di regolare
l’espressione genica a livello post-trascrizionale,
silenziando specifiche molecole di mRNA.
piRNA: sono coinvolti nel silenziamento trascrizionale dei
retrotrasposoni nelle cellule germinali.
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Piccoli RNA non codificanti
Struttura dell’RNA
RNA regolatore
microRNA
RNAi e siRNA
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La catena di RNA ha un backbone
(scheletro) formato da gruppi zuccherofosfato aventi come catene laterali le basi
Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) e
Uracile (U).
Le catene di RNA hanno lunghezza che
varia solitamente tra le 100 e le 10000
basi, molto inferiore quindi a quella del
DNA.
Esistono RNA a doppio e a singolo
filamento; questi ultimi sono
particolarmente interessanti, data la loro
capacità di assumere strutture
tridimensionali anche molto complesse.
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Appaiamenti canonici di Watson-Crick
Legami idrogeno A=U e G≡C
Wobbles
Legami idrogeno G=U (virtualmente stabili come A=U)
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I legami G=U introducono una deformazione nella struttura
dell’RNA. Tale deformazione produce un adattamento della
struttura che promuove l’attività catalitica.
Esperimenti effettuati su molecole di tRNA, mostrano come i
legami G=U siano indispensabili per lo svolgimento della
funzione.
Infatti, la “correzione” di tali appaiamenti ad appaiamenti
canonici di W/C, inattiva il tRNA impedendogli di funzionare
correttamente.
Le coppie G=U sono meno stabili delle coppie canoniche e
questo rende le molecole più reattive.
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Si definisce struttura secondaria di una molecola di
RNA il preciso ripiegamento bidimensionale adottato
in seguito alla formazione di legami idrogeno tra
coppie di basi complementari.
La struttura secondaria dell’RNA è considerata come
una combinazione di diversi elementi strutturali,
ciascuno dei quali contribuisce in modo indipendente
all’energia libera della struttura complessiva.
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Oltre alle regioni duplex (a doppio filamento) dette stem, gli
elementi base della struttura di un RNA sono:
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Regioni a singolo filamento
Hairpins (forcine)
Bulge loops (protuberanze)
Mismatch
Internal loops
Giunzioni
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Le regioni a singolo filamento consistono di nucleotidi
non appaiati, alle estremità 5’ o 3’ della molecola o tra
regioni “duplex” della struttura secondaria.
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Una forcina consiste in un duplex
collegato da un loop.
Gli hairpin sono spesso siti di legame
per le proteine e sono coinvolti nelle
strutture terziarie di RNA.
La dimensione minima di un loop è di 3
basi, ma i loop di 4 o 5 nucleotidi sono
i più stabili.
E’ possibile avere loop anche molto
grandi.
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Una protuberanza consiste di nucleotidi non appaiati su
un filamento di un duplex nel quale il filamento
opposto ha tutti i nucleotidi appaiati.
I bulge loops creano delle pieghe nella struttura della
doppia elica del duplex, che dipendono dal tipo di
nucleotidi coinvolti e da quelli nelle immediate
vicinanze.
La distorsione introdotta dalle protuberanze può
estendersi alle regioni duplex vicine.
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I mismatch consistono di due nucleotidi che non possono
formare un legame canonico ma che instaurano un
qualche tipo di legame o formano un loop di due
nucleotidi (si “respingono”).
I wobble G=U possono essere classificati come dei
“mismatch”. Tuttavia le deformazioni introdotte da tali
legami non formano pieghe significative nello scheletro.
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I loop interni contengono 3 o più nucleotidi che non
sono in grado di formare legami di W/C e
contengono almeno un nucleotide spaiato su ciascun
filamento.
I loop possono chiudersi instaurando legami non
canonici o restare aperti, permettendo la
formazione di interazioni terziarie con altre parti
della molecola.
I loop possono essere simmetrici o asimmetrici;
questi ultimi sono termodinamicamente meno
stabili.
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Le giunzioni contengono 3 o più regioni
duplex con un numero variabile di nucleotidi
spaiati che congiungono le eliche.
I nucleotidi spaiati nelle giunzioni
controllano i legami tra le eliche e
determinano la struttura tridimensionale
della molecola.
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Struttura dell’RNA
RNA regolatore
microRNA
RNAi e siRNA
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L’espressione genica può essere regolata a livello post-trascrizionale.
Non è detto che tutto l’mRNA che viene trascritto a partire da un
certo gene venga utilizzato per sintetizzare la relativa proteina.
Trascrizione
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Traduzione
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La regolazione post-trascrizionale dell’espressione genica avviene per
mezzo di molecole di RNA regolatore.
L’RNA regolatore è una molecola di RNA in grado di legarsi ad una
molecola di mRNA impedendone la traduzione.
L’RNA regolatore riconosce il suo bersaglio in base al principio di
appaiamento complementare delle basi.
Gli RNA regolatori sono solitamente piccole molecole di RNA con una
certa struttura secondaria, ma con una regione a singolo filamento
complementare ad una regione a singolo filamento dell’mRNA bersaglio.
Nella regolazione basata su small RNA è importante anche la struttura
secondaria della molecola di RNA target.
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L’appaiamento di una molecola di RNA regolatore ad
una regione a singolo filamento di mRNA può
provocare:
L’inibizione della traduzione senza distruzione della
molecola di mRNA
La degradazione della molecola di mRNA
In entrambi i casi si ha il “silenziamento” del gene, il cui
effetto è la mancata produzione della proteina
corrispondente.
Perché un RNA regolatore possa legarsi ad una
molecola di mRNA bersaglio:
La regione di legame sul bersaglio deve essere accessibile,
ovvero meno stabile (deve contenere una regione, anche
piccola, a singolo filamento).
Il legame con l’RNA regolatore deve essere
energeticamente favorevole.
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Accessibile
Non accessibile
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Un gene antisenso codifica per un RNA la cui sequenza è complementare a
quella di un RNA bersaglio:
Target RNA
5’-AGGACTACCGACTAGCATA-3’
3’-TCCTGATGGCTGATCGTAT-5’
Antisense RNA
A volte il gene antisenso si trova sul filamento opposto a quello del gene
bersaglio, pertanto i due RNA saranno perfettamente complementari.
Altre volte gli RNA antisenso vengono trascritti da altre regioni del genoma, per
cui si potrebbe avere una parziale complementarità delle loro basi.
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Piccoli RNA non codificanti
Struttura dell’RNA
RNA regolatore
microRNA
RNAi e siRNA
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I microRNA (miRNA) sono piccole molecole di RNA in grado
di regolare negativamente l’espressione di geni target a livello
post-trascrizionale.
Sono dei piccoli RNA antisenso che mostrano
complementarità parziale (quasi sempre) o totale (più
raramente) delle loro basi rispetto a quelle dei loro mRNA
bersaglio.
I miRNA sono in grado di impedire la traduzione dei loro
target preservandone la stabilità o provocandone la
distruzione.
Un miRNA può avere più target ed uno stesso mRNA può
essere target di diversi miRNA.
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I miRNA sono trascritti da particolari sequenze
genomiche (geni miRNA) situate di solito in regioni
intergeniche o negli introni di altri geni.
Molti miRNA sono altamente conservati, in specie anche
molto lontane tra loro (Es. Caenorhabditis elegans e Homo
sapiens).
Sono presenti anche nei virus, probabilmente come
meccanismo di autoregolazione e di interferenza con le
cellule ospiti, ma non nei batteri.
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I geni miRNA hanno sequenze tali da generare trascritti di RNA con
struttura a forcina (hairpin):
loop
GGCCUGUUCCCCGAGACUAUUGAUCUCGGGGAACAGGCC
CUA
GGCCUGUUCCCCGAGA
A
CCGGACAAGGGGCUCU
A
UGA
Si parla di strutture di tipo STEM-LOOP. I due bracci dello STEM possono
non essere totalmente complementari:
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I trascritti primari dei geni
miRNA sono chiamati primiRNA.
I pri-miRNA vengono tagliati
da un enzima chiamato
Drosha in molecole più
piccole, a doppio filamento,
chiamate pre-miRNA.
• I pre-miRNA vengono esportati nel citoplasma e tagliati in RNA doppio
filamento più piccoli da un altro enzima chiamato Dicer.
• Uno dei due filamenti contiene il miRNA maturo, lungo solitamente tra
i 19 e i 25 nucleotidi, che viene incorporato in un complesso proteico
chiamato RISC.
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I miRNA nei RISC sono in grado di legarsi a siti specifici di mRNA
provocandone il silenziamento:
L’appaiamento della sequenza del miRNA con il suo sito bersaglio
non è perfetto, ma può contenere bulge e loop.
Dalle coppie miRNA/target individuate sperimentalmente
emergono alcune regolarità nelle modalità di appaiamento.
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La regione iniziale (5’) del miRNA è chiamata seed e sembra
essere la regione più importante nel silenziamento.
E’ lunga solitamente tra i 7 e i 10 nucleotidi, ma esistono casi
di seed più corti o più lunghi.
Tale regione è solitamente appaiata in modo perfettamente
complementare al suo target:
Il primo nucleotide del miRNA non è determinante e può non
essere appaiato.
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• La regione a valle del seed contiene solitamente un bulge
o un loop:
• La regione 3’ del miRNA mostra solitamente una
complementarità imperfetta al suo target.
• Le coppie G:U nella regione del seed sembrano essere
sfavorevoli al silenziamento, sebbene siano ammesse,
mentre sono abbastanza comuni nella regione 3’.
• Infine, le regioni di legame dei miRNA si trovano nella
regione 3’ UTR degli mRNA bersaglio.
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I miRNA svolgono un ruolo centrale nel controllo di numerosi processi
fisiologici:
Aberrazioni nella loro espressione (mancanza, sotto o sovra espressione)
sono correlate a diversi tipi di patologie:
Sviluppo
Differenziamento cellulare
Apoptosi
Cancro
Malattie neurodegenerative
Malattie cardiache
Si tratta dunque di molecole molto importanti, il cui studio è fondamentale
nella comprensione dei processi biologici, dei fenotipi patologici e, di
conseguenza, nel design di terapie innovative.
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Ad oggi, nell’uomo, sono stati individuati quasi 500 miRNA.
Sono noti miRNA in molti altri eucarioti e nei virus.
La ricerca di nuovi geni miRNA è uno dei compiti principali
della bioinformatica nello studio della regolazione genica posttrascrizionale.
Data una sequenza genomica ci si chiede se essa contiene uno
o più geni miRNA.
Come nella gene prediction, è importante individuare
regolarità nelle sequenze dei geni miRNA e nei dintorni, al fine
di stabilire regole per la predizione.
Ad oggi la regola principale è la forma di stem-loop assunta dal
trascritto primario (pri-miRNA).
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I tool per la predizione di geni miRNA si basano dunque
sulla ricerca di sequenze in grado di assumere la forma di
stem loop qualora venissero trascritte in RNA.
Ogni sequenza di questo tipo contiene quindi due
sottosequenze (quasi) complementari, l’una in senso
opposto all’altra (stem) separate da una regione “loop”:
loop
GGCCUGUUCCCCGAGACUAUUGAUCUCGGGGAACAGGCC
CUA
GGCCUGUUCCCCGAGA
CCGGACAAGGGGCUCU
A
A
UGA
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Uno dei problemi principali nella ricerca di geni miRNA è
la presenza di un numero elevato di potenziali hairpins nei
genomi eucariotici.
Il problema quindi è l’identificazione degli hairpin corretti.
Occorre quindi trovare dei buoni filtri per la riduzione
dello spazio di ricerca.
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Conservazione
miRScan
Trova potenziali hairpin in un genoma ed utilizza BLAST per
trovare omologhi in un’altra specie.
miRFinder
Confronta sequenze intergeniche di due diversi genomi (es.
Arabidopsis e Riso) e utilizza una serie di regole empiriche per
selezionare gli hairpin più probabili.
La conservazione tra le specie può ridurre
significativamente il numero di hairpin, ma taglia fuori tutti
i geni miRNA specie-specifici.
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Match intragenomici
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miMatcher
Questo tool si basa sul fatto che un miRNA possiede almeno
un target nel genoma. Dato un possibile target, vengono
ricercati match perfetti con i possibili hairpin individuati nel
genoma.
Questo approccio è però praticabile solamente nelle piante,
nelle quali la complementarità tra miRNA e target è totale, a
differenza degli animali nei quali la complementarità è parziale.
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Molti metodi per la ricerca di geni miRNA si basano su
caratteristiche termodinamiche e osservazioni empiriche.
Gli hairpin vengono individuati attraverso tool per la
predizione della struttura secondaria dell’RNA (Es. Mfold)
e classificati in base all’energia libera.
Una volta individuati gli hairpin termodinamicamente più
favorevoli, vi sono due possibili approcci per la
classificazione:
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Metodi basati su regole empiriche
Metodi di machine learning
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Questi metodi si basano su tutte le caratteristiche
osservate nei pre-miRNA noti.
Esempi di regole:
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Non più di un nucleotide ogni 20 può essere spaiato.
Almeno 16 delle basi nel miRNA maturo devono essere
appaiate.
Il contenuto di nucleotidi G e C (indice di maggiore stabilità)
deve essere tra il 30% e il 70%.
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Nei metodi di machine learning, le regole vengono estratte e
verificate automaticamente a partire da esempi (pre-miRNA
validati sperimentalmente).
Questi metodi ricevono in input un hairpin, lo analizzano e
restituiscono in output un valore 1 o 0, a seconda che l’hairpin
abbia le caratteristiche di un miRNA o meno.
I modelli vengono addestrati utilizzando set di hairpin già
classificati.
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miRBase è la banca dati ufficiale dei miRNA:
http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/
Contiene le sequenze dei miRNA maturi e degli stemloop precursori, oltre a riferimenti bibliografici ed
informazione sui target.
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Cliccando su Browse si può sfogliare l’intero database
organizzato per specie:
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Per ogni miRNA sono riportati:
Lo stem-loop…
…ed il miRNA maturo
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Sebbene si conoscano già più di 700 miRNA nell’uomo (e
molti altri in altre specie), solo per il 10% di essi è stato
individuato almeno un target.
Problema:
Esistono numerosi tool su web che offrono servizi di
predizione di target per miRNA:
Dato un miRNA, determinare i suoi possibili mRNA target
TargetScan
PicTar
miRanda
…
Molti di essi offrono dei database di predizioni già effettuate da
consultare.
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• miRanda è il tool per la predizione di target per
miRNA sviluppato al Memorial Sloan-Kettering
Cancer Center (New York).
• La prima versione (1993) è stata utilizzata per
determinare target per miRNA in Drosophila
melanogaster.
• I concetti base dell’algoritmo di miRanda sono:
- Appaiamento delle sequenze miRNA/Target
- Valutazione termodinamica dei duplex predetti
- Analisi della conservazione dei siti di legame
• Così come le sequenze dei miRNA, anche i loro siti di
legame sui target sono spesso conservati: questo
tipo di informazione è alla base del filtro di miRanda.
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(a) (b) Si considerano le sequenze
dei miRNA e dei 3’ UTR dei
trascritti di Drosophila.
(c1) miRNA e UTR vengono
allineati per complementarità.
Appaiamenti ammessi:
- A:U
- G:C
- G:U
Requisito fondamentale di un
buon appaiamento:
- Alta complementarità nella
regione del seed.
(c2) Viene valutata la struttura secondaria (predetta) dei duplex ottenuti: minore è l’energia
libera, più stabile è il legame.
(d) Viene effettuata l’analisi di conservazione, confrontando i siti di legame dei trascritti con gli
UTR degli ortologhi in Drosophila pseudoobscura e Anopheles Gambiae (mediante
allineamento). I target con siti conservati vengono ordinati per energia e memorizzati nel
database.
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Il web-server di miRanda si trova all’indirizzo:
http://www.microrna.org
Qui è possibile accedere alle predizioni effettuate per uomo,
topo e ratto.
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E’ possibile effettuare la ricerca per miRNA (Es. miR-15a):
E’ possibile effettuare la ricerca per target (Es. Bcl-2):
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Cerchiamo i target predetti per il miRNA miR-15a in Homo sapiens:
Cliccando su “view targets” si ottiene l’elenco dei target, con i dettagli degli
appaiamenti:
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Cerchiamo i miRNA per i quali il gene Bcl-2 è un target predetto:
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Piccoli RNA non codificanti
Struttura dell’RNA
RNA regolatore
microRNA
RNAi e siRNA
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I siRNA sono piccole molecole di RNA simili ai miRNA.
Nell’uomo non sono codificati da sequenze genomiche ma
derivano da altre molecole di RNA più grandi, spesso di
origine esogena (es. virus).
Come i miRNA vengono tagliati dal Dicer ed incorporati nel
RISC.
Si appaiano con complementarità totale a siti specifici sui loro
target (in CDS o UTR) provocandone la degradazione.
Alcune specie animali, come i nematodi e le mosche, e le
piante, esprimono siRNA endogeni.
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I siRNA sono le principali molecole utilizzate nell’RNA
Interference (RNAi) artificiale.
I siRNA vengono disegnati ad hoc sulla base del sito di legame
scelto sul trascritto da silenziare ed hanno generalmente
complementarità totale al loro target.
Le molecole di siRNA vengono solitamente introdotte nelle
cellule mediante vettori virali, virus ingegnerizzati che
trasportano l’informazione per la codifica dei siRNA nel loro
genoma.
Un uso tipico dell’RNAi è il knock-out artificiale dei geni,
ovvero il silenziamento dell’espressione di uno più geni per
studiarne gli effetti e le conseguenze e di conseguenza le
funzioni svolte.
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Premio Nobel 2006 per la Medicina
Craig Mello ed Andrew Fire
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RNA interference
Craig Mello ed Andrew Fire
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RNAi in terapia
L’obiettivo è produrre molecole di siRNA e miRNA
artificiali in grado di ridurre l’espressione di mRNA target
la cui sovra-espressione è correlata alla patologia.
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L’approccio più
comune prevede
l’utilizzo di cocktail
di siRNA in grado di
bloccare
l’espressione di
target sovraespressi.
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RNAi-terapia: vantaggi e problemi
L’interazione RNA-RNA è basata su semplici regole di
appaiamento:
Design delle molecole più semplice, rispetto ai farmaci
tradizionali che inibiscono le proteine.
Predizione degli effetti collaterali più semplice.
Attualmente il problema principale è il delivery efficace
delle molecole all’interno delle cellule bersaglio e la
selettività nei confronti di queste ultime.
Vettori in fase di studio:
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Liposomi (vescicole fosfolipidiche)
Virus
Ormoni
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RNAi-terapia
Diversi farmaci basati su RNAi sono attualmente in fase di
sviluppo:
Malattie respiratorie
Infezioni
Malattie della pelle
Cancro
Alcuni farmaci sono già stati sperimentati con successo su
modelli animali:
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Cutasil (siRNAomics), per la guarigione veloce e senza cicatrice
delle ferite.
Testato con successo su topi e maiali.
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