Microbiologia delle
infezioni delle vie
respiratorie inferiori
Dr.ssa Lo Cascio Giuliana
Dipartimento di Patologia e diagnostica, Sezione di
Microbiologia, Facoltà di Medicina e Chirurgia,
Università degli Studi di Verona
Servizio di Microbiologia, Ospedale G. B. Rossi,
Azienda Ospedaliera Universitaria Integrata di
Verona
Quale l’approccio
microbiologico?
• Fase pre-analitica (raccolta e trasporto
campione)
• Fase analitica-diagnostica: se e chi è il
patogeno?
• Test di Sensibilità
• Resistenze e problematiche correlate
Polmonite
Eziologia:
Età
Microrganismi più frequenti
Neonato (0-1 mese)
E. coli, Streptococcus agalactiae
Infante (1–6 mesi)
Chlamydia trachomatis, respiratory
syncytial virus
Bambino (6 mesi –5 anni)
Respiratory syncytial virus, parainfluenza
viruses
Bambino (5–15 anni)
Mycoplasma pneumoniae, influenza virus
type A
Giovane adulto (16-30 anni)
Mycoplasma pneumoniae, Streptococcus
pneumoniae
Adulto
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus
influenzae
Tabella LRI-2. Agenti eziologici di polmonite: tipologia e correlazione con stato
immunitario
Presentazione e Stato
immunitario
Community acquired
typical pneumonia
Nosocomial pneumonia
typical pneumonia
Community acquired
primary interstitial
pneumonia
Hematogenous
pneumonia
Opportunistic pneumonia
occurring in
immunocompromised
host
Cause più frequenti
Cause meno frequenti
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus
Staphylococcus, Moraxella
influenzae, Klebsiella pneumoniae
catarrhalis, Neisseria meningitidis
Gram-negative aerobic bacilli (Enterobacter,
Klebsiella, Acinetobacter, Pseudomonas),
Legionella, Streptococcus
Staphylococcus aureus, anaerobic bacteria, standard pneumoniae
bacteria*
Adenovirus, Chlamydophila
Mycoplasma pneumoniae, respiratory viruses†,
psittaci, Chlamydia trachomatis,
influenza virus, Chlamydophila pneumoniae,
primary tuberculosis, acute fungal
Legionella sp.
pneumonias
Staphylococcus, Streptococcus
Gram-negative aerobic bacilli
Standard bacteria*, Pneumocystis jirovecii,
Cytomegalovirus, herpes simplex virus, Nocardia,
opportunistic fungi (e.g., Candida, Phycomycetes
mucor, Aspergillus)
Legionella, Listeria, Histoplasma,
Coccidioides
Pneumonia acquired by
environmental exposure
Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis,
Chlamydophila psittaci, Mycobacterium
tuberculosis
Burkholderia mallei, Burkholderia
pseudomallei Coxiella burnetii,
Yersinia pestis, Pasteurella
multocida, Paracoccidioides
Aspiration pneumonia
Prevotella melaninogenicus, Fusobacterium
nucleatum, Peptostreptococcus, Peptococcus, and
other anaerobes, Staphylococcus, Gram-negative
aerobic bacilli
* Standard bacteria:batteri che comunemente causano CAP. †
Respiratory viruses include influenza, parainfluenza, and
respiratory syncytial virus.
Modificata da: N. Chamberlain, 2010
Tabella 3. Cause di Polmoniti secondo Tempo di esordio, modalità di acquisizione e
trasmissione
Esordio
Tipologia di
Trasmissione
Agenti causali
polmonite
Acuta
Community
Persona-a-persona
Streptococcus pneumoniae,
acquired
Mycoplasma pneumoniae, Haemophilus
influenzae, Staphylococcus aureus,
Klebsiella pneumoniae, Neisseria
meningitidis, Moraxella catarrhalis,
influenza virus, Streptococcus pyogenes
Legionella, Francisella tularensis,
Acuta
Community
Animali o
Coxiella burnetii, Chlamydophila
acquired
esposizione
ambientale
psittaci, Yersinia pestis (peste), Bacillus
anthracis (antrace), Burkholderia
pseudomallei (melioidosi), Pasteurella
multocida (pasteurellosi)
Acuta
Community
Persona a persona in
Chlamydia trachomatis (polmonite
acquired
infanti e bambini
apiratica), respiratory syncytial virus e
piccoli
altri virus respiratori, Streptococcus
agalactiae (Group B), S aureus,
Cytomegalovirus, S pneumoniae, H
influenza
Acuta
Nosocomial
Persona a persona
Enterobacteriaceae, Pseudomonas
pneumonia
aeruginosa, Acinetobacters, S aureus
Subacuta
Community
Persona a persona
Mycoplasma pneumoniae, influenza
interstiziale
acquired
virus
Subacuta
Nosocomial or Aspirazione
Mista: anaerobi e aerobi gram-negative,
community
enterobatteri, usualmente
acquired
polimicrobiche
Pneumocystis jiroveci,
Subacuta o Nosocomial or Persona a persona o
cytomegalovirus, atypical
aspiratione in
cronica
community
immunocompromessi mycobacterium (e.g., Mycobacterium
acquired
kansasii), Nocardia, Aspergillus,
Phycomycetes mucor, Candida albicans
Cronica
Community
Persona a persona
Mycobacterium tuberculosis,la più
acquired
frequente. Polmoniti
MICOTICHEBlastomyces dermatitides,
Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis,
Coccidioides posadasii, Cryptococcus
Modificata da: N. Chamberlain, 2010
neoformans
Sethi S.,
NEJM 2008
Ricerca e isolamento di
microrganismi responsabili di
polmonite dipende da:
• Adeguatezza del campione delle basse vie respiratorie
• Assenza di contaminazione della flora del tratto
respiratorio superiore
• Utilizzo delle tecniche microscopiche e colturali
• Trattamenti antimicrobici in corso recenti
Tipologia di campioni
• Emocolture
• Toracentesi
Tecniche INVASIVE:
siti Sterili
• Aspirazione Transtoracica
• Lavaggio Broncoalveolare;
• Aspirato bronchiale;
Tecniche INVASIVE:
siti NON Sterili
• Brushing bronchiale;
• Escreato spontaneo o indotto;
•
Tecniche NON
INVASIVE: siti NON
Tampone faringeo/nasale, Aspirato nasofaringeo;
Sterili
Raccolta dei campioni
• Tempo ottimale di prelievo:
– Emocolture: prima possibile e precedente a terapia
antibiotica (alta specificità ma positive solo nel 4-18%
dei casi, 34% se eseguite nei primi 4 giorni
dall’esordio sintomi )
– Escreato: preferibile campione della mattina
– Preferibile campione precedente alla terapia
antibiotica (Legionella può risultare positiva anche dopo inizio
terapia)
Raccolta dei campioni
Tipo di campione appropriato e metodo di prelievo
– Escreato profondo
–
Se tosse secca, possibilmente fare fisioterapia o drenaggio posturale o
inalazione di aerosol
• Quantità adeguata e numero appropriato di campioni
» Per Emocolture: almeno 2 campioni
» Per BAL max volume
» Escreato: almeno 2 ml, possibilmente ripetere il
campione per 3 giorni consecutivi
Trasporto e conservazione del
campione
• Tempo tra prelievo del campione e procedura
analitica
– Minimo possibile, l’escreato può essere refrigerato per
2-3 h, oltre possibile perdita di Haemophilus e
Streptococcus pneumoniae, sovracrescita di bacilli Gram
negativi.
– In casi eccezionali il campione può essere seminato fino a
48h dopo il prelievo, ma l’interpretazione deve essere
fatta con attenzione
• Accorgimenti speciali per ridurre il
deterioramento
– Refrigerazione è preferibile alla conservazione a T
Ambiente. Non tollerati ritardi superiori alle 48h.
PERCORSO DIAGNOSTICO POLMONITE
CAP
IMMUNOCOMPETENTE
HAP/ HCAP/ VAP
IMMUNOCOMPROMESSO
IMMUNOCOMPETENTE
IMMUNOCOMPROMESSO
EMOCOLTURA
EMOCOLTURA
COLTURALE (batt., miceti e legionella su ESCR/ BASP/ BAL
COLTURALE (batt., miceti e legionella su ESCR/ BASP/ BAL
Antigene Legionella su urine
Antigene Legionella su urine
Antigene Pneumococco su urine
COLTURALE su liquido pleurico (se presente)
COLTURALE su liquido pleurico (se presente)
β-d glucano su sangue
Sierologia agenti pneumotropi su sangue
Ag. Aspergillo su sangue
Pneumocistis su BAL
Ag. Aspergillo su BAL
β-d glucano su sangue
Ag. CMV su sangue
Ag. CMV su sangue
Virus respiratori su BAL
Se sospetto BK
• Coltura ESCR/ BAS/ BAL
• Quantiferon su sangue
• Quantiferon su l.pleur.
Virus respiratori
sierologia su sangue
Cosa attenderci?
Che risultati possiamo garantire al
clinico?
Loens K., JCM 2009
Microscopia
• Retaggio del passato?
• Se buon campione, una diagnosi
“probabile” di S. pneumoniae o
H.influenzae può essere fatta in 3060 min.
ESCREATO: Campioni non
idonei
> 10 cell squamose/campo,
<25 PMN/campo
ESCREATO: Campioni
idonei
Circa il 30-50% dei
campioni di pz con CAP!!
Morfotipi predominanti
Coltura
•
Fondamentale discriminare fra colonizzazione e infezione;( In CAP
che richiedono ospedalizzazione la coltura dovrebbe essere supportata dalla
microscopia: convincente solo se il microrganismo isolato è compatibile con la
morfologia del batterio evidenziabile nel >90% dei PMN al GRAM)
•
Valutazione quantitativa:
– BAL: cutoff: 103 CFU/ml
– Brush: cutoff: 104 CFU/ml
– Escreato: cutoff: 106 CFU/ml
Necessarie informazioni
cliniche!!
• Interpretazione di colture dovrebbe
sempre essere coadiuvata dal
“sospetto clinico”;
• Comunitaria (CAP)? Nosocomiale
(HAP)? Associata a ventilatore
(VAP)?
Eziologia varia in funzione:
•
•
•
è
Tempo di ospedalizzazione
Trattamento antibiotico
Ventilazione meccanica
maggiore fattore di rischio
Si modifica la flora colonizzante
Aumento dei bacilli Gram
negativi aerobi
Tot
HAP
VAP
VE-VAP
MSSA
16.3
10
18
20.3
MRSA
16
21.4
14.6
12.7
PSE
23.1
25.7
22.8
20.3
Acineto
19.1
21.4
20.2
10.1
50
43
36.7
Enterobat 43.8
Coronamento dell’esame
colturale….
Antibiogramma
Inciso diagnostico: nuove strategie
diagnostiche rapide
• Per contenere inappropriato uso di antibiotici
• Per tempestiva terapia mirata, riduzione mortalità;
• Tecniche basate prevalentemente su Metodi di
Amplificazione Molecolare (Real-time Multiplex, Microarray,
PCR/ESI-MS spettrofotometria di massa dell’aerosol
amplificato)
Inciso diagnostico: nuove strategie
diagnostiche rapide
• Utili se:
– Disponibili 24h/day, 7 g/wk, risultati disponibili
in poche ore;
– Semplici da eseguire, point-of care
– Prezzi ragionevoli;
– Possibilità di evidenziare batteri resistenti
– Capacità di quantificare per distinguere
colonizzazioni da infezioni;
Torniamo
all’antibiogramma….
CHE COS’ E’ L’ANTIBIOGRAMMA?
L’antibiogramma è un test che permette
la valutazione del profilo di sensibilità
batterica in vitro a vari antibiotici
COME SI MISURA LA SENSIBILITA’ DEI
BATTERI AGLI ANTIBIOTICI?
Determinando la minima concentrazione inibente
(MIC), intesa come la più bassa concentrazione del
farmaco in grado di inibire la crescita in vitro del
microrganismo saggiato
Come?
• Microdiluizione
La MIC di per sé non è utile, ma deve
• E-test
essere comparata per esempio alla
concentrazione che il farmaco può
raggiungere nel sito di infezione,
parametro considerato anche nella
definizione dei breakpoints.
• Agar-diffusione
(MIC estrapolata)
Metodi automatizzati
• Noi usiamo Vitek
MIC non precisa ma a
cavallo dei breakpoint
• Ma ci sono anche altri
Saggi di sensibilit
à:
sensibilità
MIC
 Il cardine di tutti i saggi di
sensibilit
à (ovviamente dei metodi
sensibilità
fenotipici, ma indirettamente anche
degli altri) è la MIC
MIC
 La MIC è alla base
della determinazione
dei breakpoint
 I breakpoint servono
per interpretare i saggi
di sensibilit
à
sensibilità
Seregno, 20 dicembre
2010
Breakpoint:
• Interpretazione qualitativa della MIC,
classificando il ceppo batterico come
Sensibile, Intermedio o Resistente al
farmaco saggiato
• Deriva dall’armonizzazione di più
informazioni:
– Distribuzione MIC dei principali microrganismi
– Dati di PK/PD e modelli di simulazione
– Dati di esito clinico
COME SI INTERPRETA
L’ANTIBIOGRAMMA?
I valori delle MIC vengono poi rapportati a
valori soglia
( MIC breakpoint ) fissati da
Istituzioni Scientifiche Internazionali per le
diverse combinazioni microrganismo-antibiotico.
Attraverso il confronto con i breakpoint, i
risultati ottenuti possono essere tradotti nelle
cosiddette categorie di interpretazione:
– S (sensibile)
– I (intermedio)
– R (resistente)
Isolati da tutti i materiali:
Medicine AOUI
2010
2011
Rianimazione AOUI: isolati da RESPIRATORI (%
isolati)
100%
80%
Gram- fastidiosi
60%
Funghi filamentosi
Gram+
40%
Gram- ferment
Gram- non ferment
20%
0%
2008
2009
2010
Medicine AOUI: isolati da Respiratori
100%
80%
Gram- fastidiosi
60%
Funghi filamentosi
Gram+
40%
Gram- ferment
20%
Gram- non ferment
0%
2010
2011
Pneumococco
• Problematica principale è la
resistenza a Penicillina, dovuta a
modifiche del bersaglio: le PBP hanno
ridotta affinità.
EARSS
Report 2008
Streptococcus pneumoniae:
non sensibilità alla penicillina
Streptococcus pneumoniae: isolati
2010-2011
Differenze fra CLSI ed EUCAST?
Streptococcus pneumoniae (totale isolati 42/44): sensibilità (%).
LINEZOLID
VANCOMICINA
TEICOPLANINA
trimestre 2010
LEVOFLOXACINA
trimestre 2011
CLINDAMICINA
ERITROMICINA
PENICILLINA
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
POLMONITE PNEUMOCOCCICA: Breakpoint per
PENICILLINA in base alla dose usata in terapia
PENICILLINA - Polmonite pneumococcica
S ≤ 0,5 mg/L
Se si usa dose 1.3 g x 4
R > 2,0 mg/L
POLMONITE PNEUMOCOCCICA:
Breakpoint per PENICILLINA in base alla
dose usata in terapia
PENICILLINA - Polmonite pneumococcica
S ≤ 1 mg/L
Se si usa dose 2.4 g x 4 o
1.3 g x 6
R > 2,0 mg/L
POLMONITE PNEUMOCOCCICA: Breakpoint
per PENICILLINA in base alla dose usata in
terapia
PENICILLINA - Polmonite pneumococcica
S ≤ 2 mg/L
Se si usa dose 2.4 g x 6
R > 2,0 mg/L
AMPICILLINA - Streptococcus
pneumoniae
ECOFF ≤ 0,064 mg/L
S ≤ 0,5 mg/L
R > 2,0 mg/L
Isolati Sensibili
ad Ampicillina
(MIC ≤0.5
mg/L) possono
essere riportati
sensibili ad
Ampicillina,
Amoxicillina e
Piperacillina
(con o senza
inibitori di Betalattamasi)
CEFALOSPORINE - Streptococcus
pneumoniae
S ≤ 0,5 mg/L
R > 2 mg/L
Per questi BP può essere
necessario aumentare dosaggio
Cefotaxime,
Ceftriaxone,
Cefepime: finora
non sono mai
stati riportati
ceppi con MIC
superiori ai
breakpoint di
sensibilità. Se si
riscontrassero
ceppi con MIC
superiori al
Breakpoint di
Sensibilità ocorre
far controllare I
risultati ma anche
sconsigliare l’uso
del farmaco.
MEROPENEM - Streptococcus
pneumoniae
MEROPENEM - Meningite pneumococcica
S ≤ 0,25 mg/L
R > 1 mg/L
MEROPENEM - Infezioni diverse da Meningite
S ≤ 2 mg/L
R > 2 mg/L
Meropenem è il
solo farmaco
carbapenemico
utilizzabile in caso
di meningite. I
Breakpoint in
questo caso sono
S ≤0.25 mg/L e R
>1 mg/L.
CARBAPENEMI - Streptococcus
pneumoniae
S ≤ 2 mg/L
R > 2 mg/L
Carbapenemi:
finora non sono
mai stati riportati
ceppi con MIC
superiori ai
breakpoint di
sensibilità. Se si
riscontrassero
ceppi con MIC
superiori al
Breakpoint di
Sensibilità ocorre
far controllare I
risultati ma anche
sconsigliare l’uso
del farmaco.
Streptococcus pneumoniae e fluorochinoloni
Nota 2:
i ceppi wild-type non sono considerati sensibili alla ciprofloxacina e sono
pertanto classificati come “intermedio” (breakpoint di sensibilità per la
ciprofloxacina inferiore/uguale a 0.12 mg/L)
Streptococcus pneumoniae e fluorochinoloni
Se R a Ciprofloxacina [mutazione singola]
riportare un warning per i fluorochinoloni
Se R a Levofloxacina [mutazioni multiple]
refertare R a tutti i fluorochinoloni
Klebsiella pneumoniae: isolati 2010-2011
Medicine
Rianimazione
Klebsiella pneumoniae(totale ceppi 223/229): sensibilità (% )
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
AMIKACINA
AMOX / AC-CLAV
CEFEPIME
CEFOTAXIME
CEFTAZIDIME
LEVOFLOXACINA
COLISTINA
trimestre 2010
GENTAMICINA
trimestre 2011
ERTAPENEM
IMIPENEM
MEROPENEM
PIPER+TAZOBACTAM
TIGECICLINA
TRIM.+SULFAMET
Klebsiella pneumoniae produttrice di carbapenemasi
KPC: isolati da materiali Respiratori in Rianimazione
ESBL in
rianimazione
ESBL in Medicina
Primi isolamenti KPC
KPC ormai quotidiana!!!
Resistenza emergente ai carbapenemi nelle
Enterobacteriaceae
ESBL o
produzione di AmpC
+
perdita di porine
Produzione di
metallo-β-lattamasi
(VIM, IMP)
89 Klebsiella spp.
59 Enterobacter spp.
(isolati non sensibili ai carbapenemi)
Woodford et al., JAC 2007; 50:582
Klebsiella pneumoniae
resistente ai carbapenemi
EARSS 2008
Produzione di
carbapenemasi a
serina
(KPC, SME, IMI)
Negli enterobatteri KPC-positivi,
la MIC per i carbapenemi varia
da 0.25 mg/L a valori superiori a 32 mg/L
MBL E-Test
• Striscia con due metà
– Imipenem
– Impinem + EDTA
• Positivo con una riduzione di MIC in presenza del
chelante
– Rapporto ≥ 8
– Riduzione di 3 diluizioni
Altri casi di positività del
MBL E-test
KPC
• K Klebsiella pneumoniae
• P producing
• C carbapenemase (cahos)
• Carbapenemase di classe A
– Non inibita dall’EDTA
Test di Hodge modificato
Diluizione inoculo
1/10
Opzioni terapeutiche?
Pseudomonas aeruginosa isolati da materiali
respiratori: % Resistenza (2010-2011)
Medicina
Rianimazione
Pseudomonas aeruginosa (totale isolati 207/156): sensibilità (% )
0
20
40
60
80
100
AMIKACINA
AZTREONAM
PIPER+TAZOBACTAM
CEFEPIME
CEFTAZIDIME
CIPROFLOXACINA
COLISTINA
GENTAMICINA
IMIPENEM
MEROPENEM
POLIMIXINA B
TICAR/AC-CLAV
TOBRAMICINA
trimestre 2010
trimestre 2011
Eucast
CLSI
CLSI
EUCAST
S. aureus isolato da materiali respiratori: %
Resistenza (2010-2011)
Medicine
Rianimazione
MRSA isolati da emocolture- AOI Verona- tutti i reparti
40
35
33,6
30
22,7
22,4
25
MRSA isolati da emocolture ICU- AOI Verona-
20
resistenza oxacillina
15
60
10
50
5
48,5
37,5
40
0
2008
2009
2010
29,4
30
MRSA isolati da BASP-BAL- AOI Verona-
20
70
60
50
resistenza oxacillina
10
0
43,9
48,52008
54
2009
35,5
40
57,7
2010
41,3
BASP
BAL
30
20
10
0
2008
2009
2010
Staphylococcus aureus (totale isolati 794/834): sensibilità (%)
0
20
40
60
80
100
OXACILLINA
LEVOFLOXACINA
CLINDAMICINA
GENTAMICINA
LEVOFLOXACINA
COTRIMOXAZOLO
ERITROMICINA
RIFAMPICINA
TEICOPLANINA
LINEZOLID
VANCOMICINA
trimestre 2010
trimestre 2011
Distribuzione MIC S.aureus
BP: S <=1
R: 256
Quindi in conclusione…
Quale l’approccio
microbiologico?
• Fase pre-analitica (raccolta e trasporto
campione)
• Fase analitica-diagnostica: se e chi è il
patogeno?
• Test di Sensibilità
• Epidemiologia, Resistenze e problematiche
correlate
Con la speranza di riuscire ad essere
sempre più veloci!!!
Grazie per l’attenzione!
