Dal Genotipo al Fenotipo

Dal Genotipo al Fenotipo
Dal Fenotipo normale al Fenotipo patologico
Regolazione dell’espressione genica
Figure 7-1 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Una cellula differenziata contiene
tutte le informazioni genetiche
necessarie a dirigere la formazione
di un organismo completo
Figure 7-2a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 7-2b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Tipi cellulari diversi sintetizzano
serie diverse di proteine
Proteine costitutive
Geni housekeeping
•Proteine strutturali dei cromosomi
•RNA polimerasi
•Proteine ribosomali
•Enzimi della glicolisi
•Proteine del citoscheletro
Proteine del differenziamento
•Emoglobina
•Insulina
Figure 7-2c Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Geni regolati
Determinazione
dell’espressione di
1800 geni differenti
in vari tipi di cancro
(RNA-tecnica microarray)
Figure 7-3 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Proteine presenti in due differenti umani
(elettroforesi bidimensionale di proteine)
In rosso sono colorate le proteine comuni
in blu quelle specifiche
Figure 7-4 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Regolazione dell’espressione genica
Organizzazione della cromatina
Punto 1
Inizio della trascrizione
L’ inizio della trascrizione è controllato mediante:
• Sequenze di DNA
regolazione) (cis – acting)
(promotori
–
sequenze
di
• Alle quali si legano delle proteine chiamate Fattori di
Trascrizione (generali o specifici) (trans – acting)
transcription factors
PROMOTER
Proteine che legano il DNA
I Fattori di Trascrizione sono generalmente
proteine bi-modulari caratterizzate:
1. da specifici domini che hanno la
capacità di legare il DNA
2. da domini in grado di interagire con
specifici ligandi che possono attivare o
reprimere la trascrizione
Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare
Proteina a “dito di zinco”
Nonostante siano conosciuti molti dei siti a cui si
legano i differenti TF
resta ancora tanto da scoprire sulle regioni con
funzione di regolazione nel nostro genoma
Differenti tecniche ci permettono di scoprire le
proteine regolatrici e la sequenza delle regioni
regolatrici a cui sono legate
ESEMPI
•Cromatografia per affinità
•Footprinting del DNA
(identifica le proteine)
(identifica le sequenze nucleotidiche)
Conserved non genic sequence
Emmanouil et al. (2005) Nature Reviews Genetics
Conserved non genic sequence
Emmanouil et al. (2005) Nature Reviews Genetics
Regolazione nei procarioti
Il gene dei procarioti è policistronico
Gruppi di geni che codificano per enzimi coinvolti in
una stessa via metabolica vengono trascritti
contemporaneamente.
Questo meccanismo permette di
controllare l’espressione genica in modo coordinato
questi gruppi di geni vengono chiamati operoni
Operone Triptofano
Controllo negativo della trascrizione
Repressore del Triptofano
Figure 7-35 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Operone Lattosio
Jacob e Monod (1961)
L’operone Lac codifica per le proteine
necessarie per il trasporto del lattosio
all’interno della cellula e per la sua
demolizione
1. Beta-galattosidasi
2. Permeasi
3. Transacetilasi
Il controllo negativo dell’operone lac
In assenza di lattosio
non è necessaria la
trascrizione
dell’operone.
Un repressore si lega
al promotore ed
inibisce il legame
DNA-RNA pol.
In presenza di lattosio
il disaccaride si lega al
repressore
inattivandolo e la
trascrizione può partire.
Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare
Il controllo positivo dell’operone lac
Quando i livelli di glucosio si
abbassano è necessaria la
degradazione del lattosio.
Bassi livelli di glucosio attivano
l’adenilato ciclasi che converte ATP
in cAMP.
Il cAMP si lega ad una proteina
CAP (proteina attivatrice dei
cataboliti) che attiva la trascrizione
Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare
Eucarioti
• Presenza di cromatina
• Fattori Generali di Trascrizione
• Differente organizzazione genica
• Differenziamento cellulare
Eucarioti
Figure 7-44 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Differenti Fattori di Trascrizioni Specifici (STF) sono
presenti in differenti tipi cellulari.
Questi permettono specifici patterns di espressione
genica che conferiscono la specificità cellulare.
Dei 22.000 geni umani dal 5% al 10% codifica per STF
La trascrizione di singoli geni è accesa o
spenta nelle cellule da proteine regolatrici.
Gli attivatori e i repressori agiscono con una
varietà di meccanismi
causando generalmente:
• La modificazione locale della struttura della
cromatina
• L’assemblaggio dei fattori generali di
trascrizione al promotore
• Il reclutamento della RNA polimerasi
DNA PACKAGING
Chromatin structure is hyerarchic
NUCLEOSOME
Heterochromatin (more compact organization)
Euchromatin (less compact organization)
2 differenti meccanismi permettono agli eucarioti
di controllare l’espressione coordinata di geni
multipli
1)Diversi TF agiscono sullo stesso gene
2)Lo stesso TF agisce su differenti geni
Figure 7-50a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Complessi proteici differenti si legano a
regioni regolatrici di uno stesso gene
influenzando l’inizio della trascrizione
L’espressione di una singola proteina regolatrice può
scatenare l’espressione di un intera batteria di geni a
valle
Complex Mammalian Gene Control Regions
One example of a complex mammalian regulatory
region is found in the human β-globin gene, which
is expressed exclusively in red blood cells and at a
specific time in their development
Hb-A (2α - 2β)
HbA-2 (2α – 2δ)
HbF (2α - 2γ)
Hb embrionale (2ζ – 2ε)
Complex Mammalian Gene Control Regions
The human β-globin gene is part of a cluster of globin genes.
Moreover, each gene is turned on at a different stage of
development. The entire cluster appears to be subject to a shared
control region called a locus control region (LCR)
Complex Mammalian Gene Control Regions
The LCR appears to act by controlling chromatin
condensation, and its importance can be seen in
patients with a certain type of thalassemia
MiRNA & SiRNA
Small RNAs With a Big Role in
Gene Regulation
MicroRNAs (miRNAs) are a family of 21–25-nucleotide
small RNAs that, at least for those few that have
characterized targets, negatively regulate gene expression
at the post-transcriptional level
WHAT IS A microRNA?
MicroRNAs (miRNAs) are endogenous ~22 nt long
RNAs that can play important regulatory roles
in animals and plants by targeting mRNAs for
cleavage or translational repression.
By this way they can influence the output
of many protein-coding genes.
[David P. Bartel, Cell, Vol. 116, 281–297,
January 23, 2004]
Members of the miRNA family were initially discovered
as small temporal RNAs (stRNAs) that regulate
developmental transitions in Caenorhabditis elegans
miRNAs FEATURES
• Le sequenze nucleotidiche dei miRNA si sono
conservate nel corso dell’evoluzione
• I loro geni possono essere localizzati sia in regioni
intergeniche che all’interno di geni di seconda classe (di
solito in introni o in esoni non tradotti;
• Vengono trascritti (RNA pol II) quindi in modo
indipendente o contemporaneamente al gene che li ospita
• Molte volte troviamo cluster di geni
miRNA GENOMICS: INTERGENIC; INTRONIC; EXONIC AND…
Zhao Y and Srivastava D, 2007
miRNAs FEATURES
• Effettuano un meccanismo di “hetero-silencing
degradando il messagero target o bloccando la traduzione;
• Lo stesso miRNA può avere come bersaglio differenti
mRNAS;
• Differenti miRNAs possono avere come bersaglio lo
stesso mRNA.
FAVOURITE miRNA TARGETS
Fraction of
miRNA target
Ligands
9.1% (3/33)
Cell-surface
receptors
31.2% (122/391)
Intracellular central
signaling proteins
18.8% (15/80)
Nuclear proteins
50.0% (19/38)
Cui Q. er al, 2006 modified
microRNA BIOGENESIS: IT’S A LONG WAY!
Il processo di maturazione dei miRNA è estremamente complesso
TRASCRIZIONE
Pri-miRNA
MATURAZIONE NUCLEARE
Pre-miRNA
TRASPORTO NEL CITOPLASMA
MATURAZIONE CITOPLASMATICA
miRNA maturo
MAIN FUNCTIONS OF miRNAs
• Cell proliferazion;
• Cell death;
• Fat Metabolism
In Flies
(Brennecke et al., 2003; Xu et al., 2003)
• Neuronal patterning
In Nematodes
(Johnston and Hobert, 2003)
• Modulation of Hematopoietic
Lineage differentiation
In Mammals
(Chen et al., 2004)
• Control of Leaf and Flower
Development
In plants
(Palatnik et al., 2003)
microRNA FUNCTIONS
miRNAs HAVE IMPORTANT FUNCTIONS INCLUDING
CONTROL OF CELL DEATH, CELL PROLIFERATION, AND FAT
METABOLISM; NEURONAL PATTERNING; MODULATION OF
HEMATOPOIETIC LINEAGE DIFFERENTIATION, AND CONTROL
OF LEAF AND FLOWER DEVELOPMENT.
microRNA FUNCTIONS: SOME EXAMPLES
miR-125b CONTROLS PROLIFERATION OF DIFFERENTIATED CELLS;
miR-181 IS INVOLVED IN THE DIFFERENTIATION OF
MAMMALIAN HAEMATOPOIETIC CELLS TOWARDS THE B-CELL
LINEAGE;
miR-375 IS INVOLVED IN MAMMALIAN PANCREATIC ISLET-CELL
DEVELOPMENT AND IN THE REGULATION OF INSULIN SECRETION;
miR-143 IS INVOLVED IN MAMMALIAN ADIPOCYTE DIFFERENTIATION;
miR-1 PARTICIPATES IN MAMMALIAN HEART DEVELOPMENT
microRNAs AND CANCER
microRNAs CAN FUNCTION AS TS AND OG