CORSO DI MICROBIOLOGIA GENERALE
a.a. 2016-2017
Le endospore batteriche
Dott.ssa Annalisa Serio
Dott.ssa Clemencia Chaves-López
• Cosa sono le endospore
• Come si formano
• Meccanismi di regolazione della
sporificazione
• Microrganismi produttori
• Importanza degli sporigeni negli alimenti
• Visualizzazione al microscopio
Ferdinand Cohn
(1821-1898)
- Biologo tedesco, fondatore della
microbiologia
e
batteriologia
moderna.
- Classificò i batteri secondo la forma
in sferiche, cocchi, bacilli e spirali.
- Dimostro che Bacillus può cambiare
da forma vegetativa a stato di
endospore quando le condizioni
ambientali solo avverse.
???
• Cosa sono le endospore?
Sono strutture dormienti nonriproduttive che si presentano in una
tappa del ciclo vitale di alcuni generi
batterici appartenenti al phylum
Firmicutes.
- sono differenziate dal resto di
cellule vegetative per uno stato
metabolico
pressochè
fermo
(criptobiotico) nonchè per un’elevata
resistenza agli agenti aggressivi
ambientali
- sono caratterizzate da una struttura particolare.
La criptobiosi è uno stato di vita ametabolico (vita
sospesa) nel quale entrano alcuni organismi semplici
in risposta a condizioni ambientali avverse, quali
essiccazione, congelamento, e mancanza di ossigeno.
Nello stato criptobiotico, tutti i processi metabolici
si fermano, impedendo la riproduzione, lo sviluppo e
la riparazione.
• A cosa servono le endospore?
Sono resistenti a:
1. Alte temperature
2. Radiazioni UV, gamma,
3. Disinfettanti
4. Essiccamento
La funzione primaria è quella di assicurare
la sopravvivenza del batterio durante i
periodi di stress ambientale.
• Come si formano?
1. Ogni cellula ha un distinto programma di
espressione di geni che sono governati da una
serie di fattori di trascrizione che agiscono in
modo specifico.
2. Le cellule comunicano tra loro per potere
formare la spora
• Principali passi nella formazione della
spora
sporulazione
Ciclo vegetativo
Divisione
assimetrica
Cellula madre
prespora
Incapsulamento
della prespora
germinazione
• Fattori di trascrizione che dirigono il
processo della sporulazione
La formazione di spore implica la produzione di numerose
nuove strutture, enzimi e metaboliti, assieme alla
scomparsa
di
numerosi
componenti
della
cellula
vegetativa.
Affinchè ciò si attui deve essere attivata una serie di
geni, i cui prodotti determinano la formazione e la
composizione finale della spora mentre un’altra serie di
geni, quelli necessari alle funzioni della cellula
vegetativa, deve essere inattivata.
Fig. 2 Coupling of gene transcription and morphogenesis
• Fattori di trascrizione che dirigono il
processo della sporulazione
Le endospore sono il risultato di una strategia
evolutiva adattativa
sporulazione
Cambiamenti:
- Genetici
- Morfologici
- Strutturali
C, N, P scendono
sotto una soglia
Privazione di nutrienti
La sporulazione è un processo molto raffinato che è
comparso evolutivamente in una linea filogenetica di
batteri Gram-positivi, e che ha consentito a questo
gruppo di sopravvivere durante lunghi periodi di carenza
Quorum sensing
E’ un sistema di regolazione trascrizionale in risposta alle fluttuazioni
della densità cellulare dei batteri, ovvero un meccanismo che molte
cellule batteriche della stessa specie utilizzano per comunicare tra di
loro.
Questo meccanismo comporta la produzione e rilascio di molecole
segnalatrici chiamate autoinduttori che incrementano come funzione
della densità cellulare.
Quorum sensing
L’induttore diffonde all'esterno della cellula originaria, e può così
entrare nel citoplasma di altre cellule adiacenti. Se la concentrazione di
molecola segnale all'interno di cellule della popolazione batterica è alta,
questa molecola si legherà all'attivatore trascrizionale, che a sua volta
attiverà o reprimerà una serie di geni, determinando l'attivazione o lo
spegnimento di vie metaboliche o processi cellulari specifici.
Gli stadi della sporulazione
Il processo dura 8 ore
Endospore Cycle, Step 1
Cellula batterica vegetativa
Endospore Cycle, Step 2
Replicazione del patrimonio genetico
Nelle prime fasi del
processo di sporulazione è
frequente la produzione
da parte dello sporangio
di piccoli peptidi ad
attività antibatterica
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Inizio della sporulazione
EDF-1: è un fattore di
differenziamento
extracellulare.
Si lega al batterio e segnala
ad esso di iniziare il processo
di sporulazione.
La ridotta concentrazione di
GTP
(fattore
di
differenziamento
intracellulare) rappresenta il
segnale
biochimico
intracellulare che dà l’avvio
alla sporulazione.
Endospore Cycle, Step 3
- Divisione del DNA
- Attivazione di SpoOA
- Sintesi del fattore sH
(specifico per il primo
gruppo
di
geni
della
sporulazione)
- Formazione del setto di
divisione asimmetrico, primo
evento irreversibile
Il setto presumibilmente contiene peptidoglicano il quale è
idrolizzato prima dello stadio 4
Endospore Cycle, Step 4
Spora
Cellula madre
Ciascun nucleoide è circondato da una propria membrana
Endospore Cycle, Step 5
Formazione
della
PRESPORA e della CELLULA
MADRE
- Sintesi di SpoIIID
(proteina binding del DNA)
- Localizzazione di σE
nella cellula madre
- Localizzazione di σ F
nella prespora
Endospore Cycle, Step 6
-La prespora è inglobata da
una
doppia
membrana
citoplasmatica
Sintesi
delle
piccole
proteine acido solubili (SASP)
nella prespora.
- La prespora sintetizza i
componenti
della
PARETE
SPORALE
- La cellula madre sintetizza
i componenti della CORTEX
(peptidoglicano modificato e
acido dipicolinico).
- La molecola del DNA della
cellula
madre
viene
degradato.
Endospore Cycle, Step 7
- Sintesi di GerE (proteina bindig del DNA).
-La cellula madre completa la sintesi dei componenti della corteccia e
sintetizza i componenti delle tuniche sporali.
-- la corteccia delle spore è composta principalmnete di peptidoglicano
che è diverso da quello della cellula vegetativa
Endospore Cycle, Step 9
A volte può essere presente uno strato ancora più esterno
detto esosporio. La porzione vegetativa della cellula madre
viene degradata e la spora rilasciata.
Endospore Cycle, Step 8
All’esterno della membrana più esterna vengono sintetizzate le
tuniche
GERMINAZIONE
In presenza di appropriate condizioni ambientali è possibile
il passaggio inverso da spora a cellula vegetativa
GERMINAZIONE
A) Attivazione
Stadio caratterizzato dalla distruzione degli involucri esterni. E’ un
processo reversibile.
- Calore (60-65°C per 10')
- pH basso
- Sostanze riducenti (mercaptoetanolo).
B) Germinazione
Si ha perdita della rifrangenza, della resistenza al calore
ed agli agenti fisici e chimici.
C) Esocrescita
Caratterizzata dalla sintesi degli RNA (tRNA,
RNA ribosomiale, mRNA) e delle proteine.
La sintesi dei DNA inizia verso la fine dell'esocrescita.
Sporulazione
Germinazione
-Termine della crescita vegetativa
-Formazione del filamento di cromatina
-Formazione del setto sporale
-Sintesi della corteccia
-Aumento della rifrangenza
-Sintesi di acido dipicolinico e ioni Ca2+
-Sintesi dei coats
-Resistenza agli agenti fisici e chimici
-Resistenza al calore
-Diminuzione delle affinità tintoriali
-Lisi della cellula madre e liberazione
della spora matura
-Perdita della resistenza al
calore
-Perdita di acido dipicolinico ed
ioni Ca++
-Diminuzione della rifrangenza
-Aumento della cromatofilia
-Diminuzione della resistenza
agli agenti fisici e chimici
-Inizio del metabolismo
Gli involucri della spora batterica
Dall’esterno verso l’interno:
Esosporio: rivestimento superficiale sottile e delicato di natura
fosfolipidica, simile alla membrana citoplasmatica. Contiene basse
concentrazioni di acidi teicoici, acido diaminopimelico e
glucosammina. Quando presente determina massima rifrangenza
e completa impermeabilità ai coloranti.
Tunica sporale esterna e Tunica sporale interna: spesso strato
proteico (impermeabile, resistente agli agenti chimici).
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Dall’esterno verso l’interno:
Corteccia: formata da peptidoglicano lasso (occupa anche ½
volume spora e conferisce resistenza fisica).
- A differenza della parete delle cellule vegetative, circa il 50%
di residui di acido N-acetilmuramico sono sostituiti da anelli di
acido d lattamico (lattami muramici) siti di attacco degli enzimi
della germinazione.
Formazione di legami crociati tra il peptidoglicano e il dipicolinato
di calcio. Ciò determina contrazione del peptidoglicano ed
eliminazione di acqua per “strizzamento”.
-E’ una struttura flessibile poiché il peptidoglicano sporale
contiene un basso numero di legami trasversi, rispetto a quello
della cellula vegetativa. Ciò è fondamentale per mantenere la
disidratazione sporale
- Non sono presenti acidi teicocici.
Parete del Core
Core (protoplasto): costituito da
costituenti cellulari essenziali come
nucleoide, ribosomi, citoplasma.Contiene
acido dipicolinico che stabilizza il DNA
• Generi che producono spore?
*Alicyclobacillus
Amphibacillus
*Bacillus
*Clostridium
**Delsulfotomaculum
Oscillospira
Pasteuria
Sporohalobacter
Sporolactobacillus
Sporosarcina
Sulfobacillus
Syntrosphora
**Thermoactinomyces
• Generi che producono spore?
• Importanza degli sporigeni negli alimenti
Resistenza delle spore ai trattamenti termici
L’applicazione di un trattamento termico seleziona le spore
Possono resistere fino a 150°C, anche se a 121°C (trattamento in
autoclave) le endospore delle specie più comuni tendono ad essere
rapidamente inattivate (ma con un rapporto t/T differente in
funzione di numerosi fattori, come vedremo nel Corso di
Microbiologia alimentare).
Endospore di batteri termofili possono
rimanere vitali in acqua bollente per 19
ore!
IMPORTANTE EFFETTUARE I
TRATTAMENTI DI STABILIZZAZIONE
TERMICA IN AUTOCLAVE!!!
Composizione della spora e resistenza
10-15% del peso secco è costituito da acido dipicolinico (nel core)
complessato con ioni calcio (sembra che stabilizzi il DNA).
Resistenza al calore: non sembra causata dall’ac. dipicolinico
(mutanti termoresistenti privi di ac. dipicolinico).
Sembra dovuta a piccole proteine specializzate acido-solubili che
legano il DNA al core, stabilizzandolo in forma più compatta e
proteggendolo da calore, essiccazione e raggi UV (SASP: small
acid-soluble proteins). Le SASP forniscono anche carbonio ed
energia per la germinazione.
Possibili cause della resistenza della spora
Stabilizzazione del DNA (ac. dipicolinico e
proteine acido-solubili).
Disidratazione del protoplasto.
Maggiore stabilità delle proteine legata a
fenomeni adattativi.
• Importanza degli sporigeni negli alimenti
Resistenza delle spore a sostanza chimiche
Tali agenti chimici possono includere
• sostanze chimiche presenti nell'ambiente
• radicali liberi prodotti da reazioni chimiche dentro
la spora.
Apparentemente il fattore maggiormente implicato
nella resistenza a molte sostanze chimiche è la
relativa impermeabilità della membrana che circonda il
core della spora. Pertanto l’ingresso degli agenti
chimici nella spora è molto basso.
Ci sono alcune evidenze sperimentali che mostrano
come la tunica sporale partecipi alla resistenza
chimica (Russell, 1982).
La disidratazione del nucleo della spora, potrebbe
impedire la reazione degli agenti chimici con i suoi
componenti con conseguente incremento della
resistenza.
La resistenza ai vari agenti chimici è acquisita in
stadi ben precisi della sporulazione.
• Importanza degli sporigeni negli alimenti
Il perossido d'idrogeno distrugge le cellule tramite
una varietà di meccanismi, il principale dei quali
consiste nella produzione di radicali liberi
(Imalay & Linn, 1988).
Esistono due teorie riguardanti l'incremento di
questo tipo di resistenza,
1. una sostiene che sia dovuta all'abbassamento
della permeabilità al perossido d'idrogeno,
2. altra sottolinea la protezione del DNA delle
spore dai radicali liberi da parte dei legami delle
proteine SASP (Setlow & Setlow, 1993b).
• Importanza degli sporigeni negli alimenti
Resistenza delle spore alle radiazioni
La tossicità chimica rappresenta solo uno dei diversi fattori che
influiscono sulla sopravvivenza delle spore. Fra i diversi agenti le
radiazioni UV e , alle quali i batteri, sia nelle acque che nei suoli, sono
sottoposti esercita un ruolo molto importante.
Diversamente dalle cellule in crescita, le spore non possono riparare i
danni determinati dalle radiazioni perché non hanno ATP.
Per la sopravvivenza alle radiazioni, le spore devono minimizzare il più
possibile sia
gli effetti letali
che quelle mutageni della radiazione.
Non è quindi sorprendente che le spore dormienti abbiano una
maggiore resistenza alle radiazioni. Tale fenomeno suggerisce che
nelle spore native il DNA si presenta saturo di proteine SASP tipo
alfa/beta che lo proteggono dall’attacco dei radicali idrolitici liberi.
Le fasi della germinazione
ATTIVAZIONE: riscaldamento a temperatura subletale.
Una delle ipotesi più accettabile per spiegare
il fenomeno dell’attivazione si riferisce alla rottura dei ponti
S-S delle proteine dei coats, responsabili della maggiore
permeabilità della spora attivata.
Se non si aggiungono gli induttori del processo di
germinazione, la spora non entra nella seconda fase.
GERMINAZIONE: (in presenza di nutrienti, es. alanina)
perdita di resistenza, rifrangenza, dipicolinato e SASP.
Assunzione di H2O e aumento di volume. Perdita della
termoresistenza e della resistenza all’essiccamento, al lisozima
e agli agenti chimici
ESOCRESCITA:
La
cellula
vegetativa
fuoriesce
completamente dagli involucri sporali e riprende la sua normale
attività metabolica.
divisione cellulare.
Sintesi
di
ac.
nucleici
e
proteine,
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Endospore
- Resistenza.
- Rifrangente al microscopio.
- Scarsa attività enzimatica
(metabolismo ridotto o assente).
- Contenuto di acqua 5-10%
- Insensibile al lisozima
- Dipicolinato di calcio
- Piccole proteine acide solubili(SASP)
- Sono prive dei composti altamente
energetici quali ATP e NADH.
- Contengono quantità significative di
3-fosfoglicerato (3-PGA ) 0.1-0.3%
del peso in secco.
- Alta concentrazioni di ioni divalenti
come Ca+2, Mg+2, Mn+2
Cellule vegetative
- Non resiste a calore, UV
etc
- Non rifrangente.
- Elevata
attività
enzimatica.
- Contenuto di acqua 8090%.
- Sensibile al lisozima.
- Non contiene dipicolinato
ne’ SASP.
- Presenti
molecole
altamente energetiche
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CARATTERISTICHE DIFFERENZIALI TRA SPORA E
CELLULA VEGETATIVA
Spora
Presenza di acqua
Cellula vegetativa
+
Affinità tintoriali
-
+
Rifrangenza
+
-
+
-
Resistenza al calore
+
-
Resistenza agli UV
+
-
Resistenza agli agenti
chimici
+
-
Presenza
di
dipicolinico
acido
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• Visualizzazione al microscopio
Posizione della spora nello sporangio
a.
b.
c.
d.
equatoriale
subterminale
terminale
terminale a bacchetta di tamburo
Morfologia
degli
sporigeni
caratterizzata
da:
1.
forma
della
spora
(sferica
o
ovale);
2. dimensione della spora (Ø > o = a quello della cellula);
3. posizione (equatoriale, subterminale o terminale)
BATTRIDI: spora equatoriale o subterminale, Ø
= a quello della cellula
CLOSTRIDI: spora equatoriale o subterminale, Ø
> di quello della cellula
PLETTRIDI: spora terminale, Ø > di quello della
cellula (bacchetta di tamburo)
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Colorazione della spora
Si utilizza il calore abbinato a
particolari colorazioni:
es. Colorazione di Shäffer e Fulton:
- stesura, essiccamento e fissazione
del preparato
- colorazione con sol. acquosa di
verde di malachite 5% per 30 sec,
scaldando fino a sviluppo vapori
- lavaggio con acqua
- colorazione di contrasto con sol.
acquosa di safranina 0,5% per 30
sec
- lavaggio e asciugamento
SPORE VERDE AZZURRO – FORME VEGETATIVE ROSA-BRUNO
46
Da: textbookofbacteriology.net
Da: faculty.lacitycollege.edu
Da: inst.bact.wisc.edu
Da: microbeworld.com
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