MAPPA DEL GENE NOS DEL CEFALOCORDATO

Biol. Mar. Mediterr. (2007), 14 (2): 388-389
M.A. Basile, F.P. Patti
Lab. di Ecologia del Benthos, Stazione Zoologica “A. Dohrn”,
Punta S. Pietro, 1 - 80070 Ischia (NA), Italia.
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MAPPA DEL GENE NOS DEL CEFALOCORDATO
BRANCHIOSTOMA LANCEOLATUM
NOS CODING MAP GENES OF THE CEPHALOCHORDATE
BRANCHIOSTOMA LANCEOLATUM
Abstract – In this study is reported a preliminary bioinformatics analysis based on the Nitric oxide
synthase gene family and conducted on a small population of Branchiostoma lanceolatum (Cephalochordata) from the Gulf of Naples. Specific primers were used to amplify the putative NOS gene-coding region
and the sequences were then used to construct the hypothetic map of the gene.
Key-words: Branchiostoma lanceolatum, nitric oxide synthase, gene modeling map.
Introduzione – L’enzima Ossido Nitrico Sintase (NOS) è presente in tutti gli
organismi viventi, dai poriferi ai cordati. La molecola è stata scoperta anche negli
invertebrati (cnidari, molluschi, anellidi, artropodi ed echinodermi). La NOS degli
invertebrati, molto simile a quella dei mammiferi, è caratterizzata da tre isoforme:
neuronale (nNOS), inducibile (iNOS) ed endoteliare (eNOS). Obiettivo principale del
presente lavoro è quello di costruire una ipotetica, parziale mappa del gene NOS di
Branchiostoma lanceolatum (Berril, 1955) attraverso il confronto con i dati di sequenze
presenti in GenBank e con riferimento al genoma di B. floridae disponibile in rete
(http://genome.jgi-psf.org/Brafl1/Brafl1.home.html).
Materiali e metodi - Dieci individui di Branchiostoma lanceolatum sono stati campionati in località Santa Lucia (Golfo di Napoli) ad una profondità di circa 15 metri
in un sedimento sabbioso. Nella fase iniziale del progetto sono stati utilizzati quattro primers costruiti sulla base della sequenza nNOS di S. officinalis (Scheinker et
al., 2005): 756f (5’-gtgtttgatgcccgtcatat-3’), 1230r (5’-gtgcccatgtaccagccrytgaa-3’), 1230f
(5’-ttcaryggctggtacatgggcac-3’), 1815r (5’-gcatgcctgaatatttcaca-3’). Due primers specifici per B. lanceolatum (756f e 1230r) sono stati successivamente costruiti analizzando
la sequenze di B. floridae (AY582749) e risolvendo in tal modo le ambiguità per le
basi degenerate dei primers costruiti su seppia: 756f_mod (5’-ttgtttgacgcccgtgacgt-3’),
1230r_noDeg (5’-gtgcccatgtaccagccgctgaa-3’).
Risultati - Il confronto con la sequenza del gene NOS di Apis mellifera (Genbank
NM001012962) ha fornito la precisa distanza fra i vari elementi costitutivi del gene
NOS di B. lanceolatum. Lo schema riportato in Fig. 1a è stato disegnato partendo
da una porzione di 794 bp del totale mRNA costituito da 4 esoni pari a 548 bp
e tre introni di 246 bp (Watanabe et al., 2005). Grazie alle informazioni ottenute
analizzando le sequenze di B. lanceolatum sono state inoltre effettuate delle ricerche
in banche dati sui soli organismi per i quali fosse presente una annotazione del tratto
del gene NOS in esame. Da tale ricerca sono emerse dodici specie sia di vertebrati che
di invertebrati con le quali è stato costruito un cladogramma in cui risultano evidenti
due gruppi principali (Fig. 2b). L’unica sequenza dell’isoforma inducibile (4) ricade
all’interno del clade meno uniforme, con un gruppo minore costituito da vertebrati
superiori ed uno maggiore caratterizzato da tre insetti ed un mollusco. Il secondo
clade, più omogeneo, è costituito da forme neuronali del gene NOS: di uno cnidario,
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due insetti, un mollusco e due cefalocordati, B. lanceolatum e B. floridae. Tutti i nodi
sono supportati da valori di bootstrap maggiori di 60.
Fig. 1 - (a) Ricostruzione della mappa genetica di una porzione di 700bp del nDNA della NOS di
B. lanceolatum (nella foto del minigel di agarosio la prima linea corrisponde al marcatore,
la seconda è il controllo negativo, la terza rappresenta il prodotto di amplificazione con
756f_mod e 1230r_noDeg di circa 700bp). (b) Cladogramma costruito con “maximum parsimony analysis”: (1) Danio rerio AY211528, (2) Mus musculus BC083183, (3) Homo sapiens
NM000620, (4) Aplysia californica AY043287, (5) Drosophila melanogaster NM078817, (6)
Manduca sexta AF062749, (7) Bombyx mori AB071182, (8) Sepia officinalis AY582749, (9)
Anopheles stephensi AY583529, (10) Apis mellifera NM001012962, (11) Discosoma striata
AY036119, (12) Branchiostoma floridae AF396968, (13) Branchiostoma lanceolatum. In
grassetto i numeri di accesso delle sequenze di Genbank.
(a) Reconstruction of B. lanceolatum 700bp nDNA fragment NOS genetic map. (In the agarose minigel picture, the first line from the left is the marker, the second line is the negative control and the last
line is the 756f_mod-1230r_noDeg PCR product of about 700bp). (b) Maximum parsimony cladogram.
In bold the Genbank accession numbers.
Conclusioni - Wang et al. nel 2001, esaminando i dati del lavoro di duplicazione
del genoma di Hughes et al., dove i geni NOS erano confrontati con i cluster Hox,
concludono che nell’analisi filogenetica un evento di duplicazione genica poteva essere
avvenuto prima della differenziazione tra protostomi e deuterostomi e che il confronto
tra diversi modelli diveniva il presupposto necessario per formulare ipotesi evolutive.
Il presente lavoro ha permesso la costruzione di una mappa ipotetica di una regione
del genoma di anfiosso fondamentale per lo studio evolutivo di quei caratteri che possono essere la chiave di lettura dell’origine dei vertebrati.
Bibliografia
HUGHES A.L., DA SILVA J., FRIEDMAN R. (2001) - Ancient genome duplications did not structure the human Hox-bearing chromosomes. Genome Res., 11: 771-780.
SHEINKER V., FIORE G., DI CRISTO C., DI COSMO A., D’ISCHIA M., ENIKOLOPOV G.,
PALUMBO A. (2005) - Nitric oxide synthase in the nervous system and ink gland of the cuttlefish Sepia officinalis. Molecular cloning and expression. Biochem Biophys Res Commun, 338 (2):
1204-1215.
WANG T., WARD M., GRABOWSKI P., SECOMBES C.J. (2001) - Molecular cloning, gene organization and expression of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) inducible nitric oxide synthase
(iNOS) gene. Biochem. J., 358: 747-755.
WATANABE T., SHIGA T., YAMAMOTO T., SUZUKI N., ITO E. (2005) - Apis mellifera AmNOS
mRNA for nitric oxide synthase: (dati Genebank non pubblicati).