Analisi dati MLPA con il nuovo Coffalyser.NET

Analisi dei dati MLPA con il nuovo
Coffalyser.NET™
MRC-Holland
Contenuti
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Che cos’è il Coffalyser.NET™
Analisi dei frammenti e del Copy number
Interpretazione dei dati
Che cos’è il Cofffalyser.NET™
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Software gratuito
Semplice installazione tramite link online
Analisi dei “raw data” dai sequenziatori
Normalizzazione dei segnali dei picchi delle sonde (alleli)
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Copy number
Analisi di Metilazione
RNA
Vantaggi del Coffalyser.NET™
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Analisi semplice in 2 step seguiti da controlli di qualità
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Collegamento diretto al database MRC-Holland
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Fragment analysis
Comparative analysis
Informazioni sulle “Sheet” e “Size markers”
Metodi di analisi (impostazioni)
Possibilità di importare vari formati di file direttamente
dai sequenziatori
Riconoscimento affidabile dei segnali
Opzioni avanzate di analisi
Efficiente stoccaggio dei dati e facilità di accesso
Componenti Coffalyser.NET™
3. Database MRCHolland
1. Coffalyser SQL
Database
2. Coffalyser
Client Software
Coffalyser Database nel Client
Analisi dei dati di un esperimento (workflow)
Normalizzazione
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I segnali dei picchi sono relativamente proporzionali al
numero delle sequenze target presenti in ogni campione
Le sequenze target di tutte le sonde nei campioni
reference devono avere un numero di copie normale
(diploide)
Le sequenze target delle sonde reference nei campioni
testati devono avere un numero di copie normale
(diploide)
Strategia di normalizzazione
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La costante normalizzante (sonde di riferimento) rimane
relativamente uguale in tutti i campioni
Rimuove effetti sistematici e mette i dati di campioni diversi
su una scala comune
SampleTP(? copies ) / RP (2copies )
RatioTPs 
reference TP(2copies ) / RP (2copies )
CopyNumberTPs  2 * ( RatioTPs )
Robustezza aumentata
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Ogni sonda di riferimento sarà usata per normalizzare
ognuna delle sonde testate.
La media di tutte le ratio prodotte sarà usata come ratio
finale.
(RSQ)
Campioni di riferimento multipli
Normalizzazione
Confini arbitrari + statistiche
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Le aberrazioni possono essere riconosciute con una
maggiore sicurezza combinando la valutazione della ratio
con la variazione stimata per ogni sonda sui campioni di
riferimento.
Uso di distribuzioni per tipo di campioni
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Per campioni con lo stesso profilo genomico, ci
aspettiamo una ratio delle sonde che segue una
distribuzione normale.
Per questo motivo ci aspettiamo che tutte le sonde che
hanno come target le sequenze con un numero di copie
normali debbano essere intorno a 1.
Distribuzione dei campioni di riferimento
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I campioni di riferimento forniscono una buona
indicazione riguardo alla riproducibilità delle sonde MLPA.
Statistiche di distribuzione sui campioni di
riferimento
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Stima degli intervalli di confidenza del 95% per campioni
Media delle ratio delle sonde
dello stesso tipo
[campioni di riferimento]
Deviazione standard
Uso delle boxplots
Visualizzazione degli intervalli di confidenza
Sonde variabili
Alta sicurezza sui risultati delle sonde (<<*)
Ratio media
Campione testato
Intervallo di affidabilità del
95% per un campione testato
Ratio media
Campioni di riferimento
Intervallo 95% di campioni di rif.
Intervallo normale arbitrario
Bassa affidabilità sui risultati delle sonde
(<*)
Intervallo di affidabilità del
95% sul campione testato
Intervallo arbitrario normale
95% intervallo dei campioni di riferimento
Area ambigua
Interpretazione delle ratio calcolate
Campioni di riferimento
intervallo affidabilità 95%
Campioni di riferimento
intervallo affidabilità
68%
Segnale significativamente diminuito
ma sempre all’interno dei confini
(<<)
Segnale significativamente
diminuito ed oltrepassato il
confine arbitrario
(<<*)
Confini arbitrari
Diversi livelli di confronto
Tipi di campioni disponibili
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Distribuzione della probabilità
 Distribuzione dei campioni di riferimento (verde)
 Distribuzione dei campioni positivi (giallo)
 Distribuzione di tutti i campioni (blu)
Uso di riferimenti positivi(ME-028)