REGOLAZIONE GENICA DELLA GRELINA NELLA SPIGOLA

Biol. Mar. Mediterr. (2008), 15 (1): 213-216
G. Terova, S. Rimoldi, R. Gornati, G. Bernardini, M. Saroglia
Dipartimento di Biotecnologie e Scienze Molecolari (DBSM), Università dell’Insubria,
Via Dunant, 3 - 21100 Varese, Italia.
[email protected]
REGOLAZIONE GENICA DELLA GRELINA
NELLA SPIGOLA (DICENTRARCHUS LABRAX) IN RISPOSTA
ALLE FLUTTUAZIONI NELLA DISPONIBILITÀ DELL’ALIMENTO
REGULATION OF GHRELIN GENE EXPRESSION
IN SEA BASS (DICENTRARCHUS LABRAX) IN RESPONSE
TO FLUCTUATIONS IN FOOD AVAILABILITY
Abstract - Ghrelin is a novel appetite-inducing peptide hormone secreted by the stomach. Using molecular cloning techniques we sequenced the full-length cDNA for ghrelin in sea bass (Dicentrarchus labrax)
and deposited it in GenBank under the accession n° DQ665912. We also analyzed fasting-induced changes
in the expression of ghrelin mRNA, using real-time RT-PCR. Our results revealed that ghrelin was highly
expressed in the stomach with much lower levels of expression in the proximal intestine and brain. Levels
of ghrelin mRNA in the stomach were upregulated under conditions of negative energy balance, such as
starvation, and downregulated during positive energy balance, such as refeeding. These findings offer new
information about the sea bass ghrelin gene expression and support a role of this orexigenic hormone in
the regulation of food intake in sea bass.
Key-words: Sea bass, gene expression, aquaculture, ghrelin, real-time PCR.
Introduzione - Il senso di appetito e di sazietà nel pesce, come negli altri vertebrati, appare essere regolato da complessi meccanismi che coinvolgono complicate
interazioni tra il cervello e i segnali periferici. Perfino nei mammiferi, dove questi meccanismi sono stati studiati per decenni, non sono ancora stati completamente chiariti
(Volkoff et al., 2005).
Secondo un modello proposto recentemente esiste un sistema centrale dell’alimentazione che controlla la quantità di cibo assunto. Questo sistema coinvolge specifici
nuclei dell’ipotalamo ed elabora le informazioni ricevute da due principali sistemi periferici: un sistema a breve termine, che trasmette segnali di sazietà o appetito, ed un
sistema a lungo termine che invia all’ipotalamo informazioni sul livello delle riserve
energetiche corporee. Un elemento chiave di questo processo di comunicazione sembra
essere la grelina, un ormone di recente identificazione (Kojima et al., 1999), meglio
conosciuto come ormone dell’appetito in quanto tra i suoi compiti c’è quello di inviare
al cervello l’input della sensazione della fame. La grelina è un piccolo peptide di 28
amminoacidi prodotto principalmente dallo stomaco ma sintetizzato anche nel cervello che svolge un ruolo molto importante nel controllo del rilascio dell’ormone della
crescita da parte dell’ipofisi e nella stimolazione dell’appetito. Per quanto riguarda i
pesci, la grelina è stata clonata e purificata solo di recente in alcune specie e gli studi
fino ad ora effettuati, sono a favore di un’azione oressante di questo peptide. Tuttavia
l’esatto ruolo di questo ormone nei teleostei ed il meccanismo della sua regolazione,
sono ancora in gran parte sconosciuti.
La nostra ricerca nella spigola (Dicentrarchus labrax), una specie di interesse economico per l’acquacoltura del Mediterraneo, è finalizzata ad identificare geni candidati, coinvolti nel fenomeno della “crescita compensatoria” (il balzo di crescita, insolitamente veloce, che si verifica nel pesce alimentato dopo un periodo di digiuno). A
questo proposito abbiamo isolato in precedenza le sequenze codificanti per un numero
di geni ed abbiamo valutato gli effetti del digiuno prolungato e della successiva rialimentazione degli animali sui livelli dei loro trascritti (Terova et al., 2006, 2007, 2008).
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In questa ricerca abbiamo approfondito ulteriormente l’argomento testando l’eventuale coinvolgimento del gene codificante la grelina nel meccanismo della crescita
compensatoria.
Materiali e metodi - Un mese prima dell’inizio dell’esperimento, 140 esemplari di
branzino sono stati mantenuti in 4 vasche di vetroresina del volume di 2 m3 ciascuna,
con 35 pesci per vasca, per acclimatarsi. All’inizio della sperimentazione tutti gli animali sono stati pesati e biometrizzati, quindi assegnati “ad random” a ciascuno dei
due trattamenti. I pesci in due delle quattro vasche sono stati alimentati ad apparente
sazietà (controlli) per tutta la durata dell’esperimento, mentre quelli nelle altre due
sono stati privati del mangime per 35 giorni e poi rialimentati “ad libitum” per 21
giorni, con lo stesso tipo di mangime utilizzato prima del digiuno. Cinque pesci da
ciascun gruppo sperimentale sono stati campionati ai seguenti punti tempo: prima del
digiuno (day 0), 4 giorni dopo l’inizio del digiuno, alla fine del periodo di digiuno, e
successivamente a 4, 14, e 21 giorni dall’inizio della rialimentazione. Per le analisi di
biologia molecolare sono stati prelevati stomaco, intestino prossimale, fegato, muscolo
e cervello. Tutti i pesci sono stati inoltre pesati alla fine del periodo del digiuno e dopo
21 giorni di rialimentazione.
Per le analisi molecolari, dopo l’estrazione dai tessuti prelevati, l’RNA totale è
stato retrotrascritto a cDNA ed utilizzato come templato per le successive reazioni di
amplificazione mediante PCR. Un’aliquota di ogni prodotto di amplificazione di PCR
è stata poi sottoposta ad elettroforesi su gel di agarosio. Le bande di interesse sono
state estratte dal gel, clonate e sequenziate. Le estremità 5’e 3’ terminale del cDNA
sono state amplificate utilizzando le tecniche della 5’ e 3’ RACE. Il numero di copie
di trascritto del gene della grelina è stato quantificato in modo assoluto via one tubetwo step Taqman® Real-time RT-PCR, utilizzando delle curve standard costruite con
opportuni campioni a numero noto di copie di mRNA di questo gene.
Risultati - L’effetto della rialimentazione sulle performances di crescita della spigola. All’inizio della sperimentazione il peso medio delle spigole era 120,11±4,47 g
per il controllo e 117,58±3,58 g per il gruppo designato al trattamento. Dopo 35
giorni i pesci privati del cibo hanno mostrato un significativo calo del peso corporeo
(100,38±3,38 g) rispetto ai controlli che durante lo stesso periodo di tempo sono stati
alimentati ad apparente sazietà e che avevano raggiunto dopo 35 giorni un peso pari
a 134,03±2,31 g. Durante il successivo periodo di rialimentazione i pesci non alimentati hanno aumentato il loro peso corporeo a 143,69±4,57 g, compensando la perdita
causata dal periodo di digiuno e raggiungendo il peso dei controlli (145,74±4,31 g).
Clonaggio e sequenziamento della grelina. L’intera sequenza codificante per la grelina
è stata isolata e poi depositata in banca genica con il numero di accesso n° DQ665912.
Tale sequenza è costituita da 798 bp, comprende una regione non-tradotta in 5’ di
89 bp, un’open reading frame di 324 bp e una regione non-tradotta in 3’ di 385 bp,
completa del segnale di poliadenilazione (AATAAA). Questa sequenza codifica per la
progrelina, un peptide di 108 aa, con una massa molecolare teorica di 22 kDa.
Quantificazione dell’espressione genica della grelina. Questa analisi ha rilevato alti
livelli di espressione della grelina nello stomaco e, molto più bassi nell’intestino prossimale e nel cervello. Il digiuno per 5 settimane ha significativamente aumentato il
numero delle copie del trascritto (p<0.05) nello stomaco, mentre 4 giorni di digiuno
non hanno portato ad un incremento significativo di tali livelli i quali non risultano
diversi dai controlli. Il successivo recupero dal digiuno è stato associato ad un significativo aumento nei livelli di trascritto della grelina, rispetto ai controlli fino al 4°
giorno di rialimentazione. Successivamente, a 10 giorni dall’inizio della rialimentazione
il trascritto è diminuito rispetto al precedente valore, ma è rimasto ancora significa-
Regolazione genica della grelina nella spigola in risposta alle fluttuazioni nella disponibilità dell’alimento
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tivamente più alto del controllo per poi ritornare ai livelli originali dopo 21 giorni.
Non sono state invece evidenziate differenze nei livelli di espressione della grelina nel
cervello e nell’intestino prossimale tra i punti tempo di campionamento.
I nostri risultati dimostrano che nella spigola lo stomaco rappresenta il sito principale di espressione e produzione della grelina come è stato dimostrato anche nell’uomo
(Ariyasu et al., 2001), in pesce gatto (Ictalurus punctatus) e in tilapia (Oreochromis
mossambicus) (Parhar et al., 2003).
I livelli di espressione intestinale della grelina nella specie da noi utilizzata sono
simili a quelli riscontrati in pesce gatto e in tilapia, benché più bassi rispetto a quelli
trovati nel pesce rosso (Carassius auratus). Ciò può essere dovuto al fatto che il pesce
rosso non ha un vero stomaco differenziato e quindi, in questo caso, il tratto intestinale sostituisce lo stomaco come principale sito di espressione della grelina.
L’espressione della grelina nel cervello di spigola non è risultata significativa, in
accordo con quanto osservato in trota iridea (Oncorhynchus mykiss), pesce gatto, pesce
rosso e tilapia. Ciò suggerisce che in queste specie la grelina sintetizzata nel cervello
possa essere coinvolta nella regolazione dell’assunzione volontaria di cibo, pur non
giocando un ruolo di rilievo, come invece avviene con quella prodotta a livello dello
stomaco. Deboli segnali di mRNA per la grelina sono stati osservati nel cervello della
specie umana, oltre che di ratto e topo.
Il presente studio ha rilevato una “up-regulation” della grelina durante il digiuno
e una “down-regulation” durante la fase di rialimentazione, risultati questi che concordano con le interpretazioni precedenti sul ruolo della grelina e forniscono ulteriori prove sull’azione oressigenica di questo nuovo peptide gastrointestinale nei pesci.
Cambiamenti analoghi dei livelli di mRNA della grelina durante il digiuno sono risultati anche da studi condotti su ratti, uccelli e anfibi.
Nel pesce rosso, il digiuno ha indotto aumenti del trascritto della grelina nell’intestino entro il settimo giorno di digiuno, con incrementi significativi dei livelli di grelina
nel sangue, mentre un decremento postprandiale è stato registrato sia nei livelli di
mRNA della grelina nello stomaco, sia in quelli nel sangue (Unniappan et al., 2004).
Nella spigola le variazioni di espressione della grelina avvengono in un intervallo
di tempo piuttosto ampio se confrontato con quanto avviene in mammiferi ed uccelli,
dove si hanno cambiamenti significativi del trascritto già dopo 12-24 ore di digiuno.
L’andamento di espressione osservato in spigola è però simile a quello degli anfibi
e degli altri pesci teleostei. Nella rana toro, ad esempio, l’espressione nello stomaco
aumenta dopo 10 giorni di digiuno (Kaiya et al., 2006), mentre nella tilapia del Nilo
(Oreochromis niloticus) i livelli di trascritto della grelina non variano nemmeno dopo
7 giorni di privazione di cibo (Parhar et al., 2003). Queste differenze nelle risposte
al digiuno della grelina possono trovare spiegazione nelle differenze nel metabolismo energetico tra gli animali omeotermi (mammiferi e uccelli) ed eterotermi (rane e
pesci).
I pesci privati del cibo nel corso dell’esperimento hanno mostrato, durante la fase
di rialimentazione, una crescita più veloce rispetto ai controlli, compensando in questo
modo la perdita del peso causata dal periodo di digiuno. L’iperfagia innescata dal
periodo di digiuno nel nostro studio, è un esempio semplice, ma convincente della
regolazione dell’alimentazione. L’iperfagia è il meccanismo con cui la spigola ha compensato la diminuzione della crescita durante il digiuno. Il significativo incremento
della quantità di cibo ingerito ha portato ad una rapida crescita, nonostante non sia
stato osservato alcun miglioramento nell’efficienza di conversione.
Conclusioni - Abbiamo isolato e depositato in Banca genica (acc. n° DQ665912) la
sequenza completa codificante per la grelina nella spigola. Abbiamo inoltre dimostrato
che lo stato nutrizionale dell’animale influenza i livelli di espressione della grelina,
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inducendo una “up-regulation” in condizioni di bilancio energetico negativo e una
“down-regulation” in condizioni di bilancio energetico positivo, mentre non ha effetti
sull’espressione della grelina nell’intestino prossimale e nel cervello. Questi cambiamenti nei livelli di trascritto della grelina cibo-correlati sostengono l’ipotesi che essa
rivesta un ruolo importante nella regolazione dell’assunzione del cibo in spigola.
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