Corso di Laurea Magistrale in Scienze Viticole ed Enologiche

Corso di Laurea Magistrale in Scienze Viticole ed Enologiche
Double Master Degree Program “Vitis-Vinum” - Master of Science (M.Sc.) in
Viticulture and Enology
Differenziazione e valutazione dell’attività laccasica di quattro ceppi diversi di
Botrytis cinerea
Titolo originale: Differentiation and Assessment of Laccase Activity of Four
Different Botrytis cinerea Strains
Relatore: Prof. Vittorino Novello
Correlatore: Prof. Doris Rauhut
Candidato: Enrico Simonini
A.A. 2014/2015
Obiettivi dello studio
La sperimentazione di laboratorio effettuata e qui descritta è stata condotta presso la Hochschule
Geisenheim University grazie alla collaborazione del Dipartimento interno di Microbiologia e Biochimica. Il
primo e fondamentale passaggio di questo lavoro è rappresentato dall’elaborazione di un metodo
sperimentale in grado di consentire la differenziazione e lo studio dell’attività laccasica di diversi ceppi, ed
in grado di restituire costantemente risultati ripetibili. Questa fase di sviluppo ha richiesto l’applicazione di
numerose strategie metodologiche che hanno necessitato progressive analisi e valutazioni, in modo da
ottenere un metodo ottimizzato e il più possibile privo di inconvenienti. L’elaborazione del metodo ha
come ulteriore proposito quello di poter essere utilizzato in futuro per approfondire lo studio di laccasi
prodotte da B. cinerea.
In seguito allo sviluppo della procedura idonea, si è passati alla sua attuazione pratica su quattro ceppi
diversi di B. cinerea. In particolare si è trattato di valutare il parametro dell’attività laccasica basandosi
sull’applicazione di un metodo fotometrico, e di evidenziare l’eventuale correlazione tra tale produzione di
laccasi ed il reale sviluppo del microorganismo fungino principalmente tramite la valutazione
dell’incremento in peso del micelio.
Aspetti generali della sperimentazione
I ceppi utilizzati durante l’intero processo sperimentale furono isolati nel 2008 presso vigneti
coltivati a Riesling nella regione Rheingau in Germania, e sono stati scelti per questo esperimento in
funzione del loro differente sviluppo su mezzo di coltura PDA (Potato Dextrose Agar). Bio organic 4,
Biodynamic 4.2, Biodynamic 1.1 e Integrated 2 furono i nomi loro assegnati, in funzione della diversa
modalità di gestione viticola degli appezzamenti di provenienza.
Considerando la procedura generica elaborata al fine di giungere alle valutazioni oggetto di studio,
il primo passaggio è costituito nella ricoltivazione del microorganismo in mezzi culturali quali PDA e MA
(Malt Agar), e incubazione a 24 °C. In seguito, ogni ceppo è stato inoculato separatamente in mosto di uve
Riesling precedentemente corretto con CuSO4 × 5H2O e acido gallico in quantità ben definite. Tali additivi
sono considerati i principali induttori dell’attività laccasica da parte del fungo, e sono pertanto ritenuti
indispensabili al fine di ottenere produzioni di laccasi a livelli misurabili dal metodo fotometrico applicato.
In seguito, le misurazioni dell’attività laccasica sono state condotte lungo un periodo di almeno tre
settimane con frequenza di due analisi per settimana.
La fase di inoculo ha rivestito una notevole importanza per via delle numerose strategie adottate,
ognuna volta a limitare le problematiche progressivamente riscontrate. Questa fase ha effettivamente
costituito parte integrante dell’ottimizzazione di un metodo sperimentale adattabile a diversi ceppi. Ad
ognuna delle strategie di inoculo elaborate e di seguito descritte, è seguita la completa valutazione
dell’attività laccasica prodotta e della sua correlazione con lo sviluppo fungino. Infatti, esclusivamente
tramite l’applicazione dell’intera procedura e la reale analisi dei risultati è possibile definire la bontà o
meno di un approccio scientifico. L’attività laccasica è stata misurata per mezzo del test con siringaldazina
elaborato da Grassin e Dubourdieu nel 1989. Esso si basa su una reazione di ossidoriduzione tra tale
substrato fenolico e le laccasi sintetizzate dal fungo, che conduce alla variazione colorimetrica misurata
immediatamente tramite spettrofotometro.
I dati ottenuti da tale analisi sono stati analizzati dal punto di vista statistico prima di tutto
verificando le assunzioni di normalità ed omoschedasticità (Kolmogorov-Smirnov test), e successivamente
conducendo l’ANOVA ed i relativi test post-hoc qualora le stesse fossero rispettate. L’ANOVA è stata
condotta con  = 0,05 per individuare differenze tra più di due gruppi. Nel caso in cui l’omogeneità delle
varianze fosse violata, è stato applicato il test Brown-Forsythe. Infine, in caso di violazione di entrambe le
assunzioni, è stato condotto il test di Friedman.
Metodi applicati
Tra le diverse tecniche di inoculo studiate, quella degna di maggiore nota ha utilizzato piccoli dischi
di agar ritagliati dalla porzione più esterna delle piastre Petri sulle quali il fungo era stato in precedenza
coltivato. In particolare il primo approccio ha utilizzato un singolo disco di agar con diametro di 0,4 cm
come inoculo in 200 ml di mosto, ma l’attività laccasica è risultata pressoché non misurabile
presumibilmente per l’eccessiva diluizione nel mezzo. Si è pertanto scelto di raddoppiare la fonte di inoculo
(utilizzando due dischi da 0,4 cm per ogni campione), peraltro riducendo la quantità di mosto a 100 ml per
replica. Tramite questi miglioramenti si è riusciti ad ottenere ottimi livelli di produzione dell’enzima con
entrambi i ceppi utilizzati in questo caso (Bio organic 4 e Biodynamic 4.2). D’altro canto, i dischi di agar qui
utilizzati sono stati spesso soggetti alla sommersione nel mosto, con il conseguente mancato sviluppo dei
miceli in superficie e l’impossibilità nel condurre studi sul loro progressivo incremento in termini di peso.
Al fine di risolvere quest’ultimo inconveniente si è deciso di scartare l’approccio con dischi di agar,
prediligendo l’inoculo condotto mediante sospensione conidica. Questa strategia consiste nella
preparazione di tale sospensione per ogni ceppo, procedendo quindi all’inoculo in ragione di 2 x 105 conidi
per replica. Questa procedura, nonostante si sia dimostrata in grado di identificare la correlazione diretta
tra la produzione di laccasi e lo sviluppo fungino, non è stata ritenuta idonea come procedura sperimentale
poiché inadatta all’applicazione su alcuni ceppi.
La metodologia finale di inoculo applicata in alternativa alle precedenti, ha permesso di raggiungere
risultati maggiormente ripetibili, risolvendo al contempo la maggior parte delle problematiche. Essa ha
sfruttato l’inoculo mediante dischi di agar con superficie di 1,2 cm, limitando in questo modo la loro
sommersione e consentendo la corretta valutazione.
Risultati
Per mezzo dell’applicazione del suddetto approccio finale si è riusciti a dimostrare che le differenze
tra ceppi sono realmente presenti dal punto di vista della produzione di laccasi. Tali differenze sono
evidenziate sia da diverse cinetiche di attività laccasica, sia da diverse intensità. A titolo esemplificativo,
l’attività enzimatica del ceppo Bio organic 4 si è dimostrata molto precoce e al tempo stesso rapida nel
giungere ad azzerarsi, a differenza di quella di Biodynamic 1.1 caratterizzata da un incremento progressivo
oltre che da una persistenza maggiore nel tempo. Da ciò si può concludere che le differenze genetiche tra i
ceppi abbiano una fortissima influenza nella biosintesi dell’enzima oggetto di studio.
Inoltre, è stato possibile individuare differenze in termini di attività laccasica in funzione della
temperatura di incubazione dei diversi campioni (incubati a 25 °C e 18 °C). Effettivamente è stato
dimostrato che la temperatura influisce sulla produzione dell’enzima strettamente in funzione del ceppo
studiato. Infatti, mentre alcuni ceppi mostrano maggiore attività laccasica ad alte temperature, altri
seguono il comportamento opposto. Inoltre la temperatura ha mostrato un forte impatto anche dal punto
di vista della crescita miceliare, considerando la temperatura maggiore come favorevole il suo sviluppo.
In conclusione è stato possibile confermare ulteriormente come l’attività laccasica sia direttamente
correlata con lo sviluppo fungino.
Prospettive future di studio
In termini di prospettive di studio, potrebbe essere interessante valutare nuovi parametri che
influenzano l’attività laccasica, in modo da riportare un quadro esaustivamente completo di questo
argomento. A titolo esemplificativo, la valutazione dell’effetto di diversi pH del mezzo culturale sulla
produzione e stabilità nel tempo delle laccasi, potrebbe condurre a risultati interessanti. Allo stesso modo
anche l’impatto su di esse della diversa composizione zuccherina, acidica o azotata del mosto costituirebbe
un ulteriore approfondimento.
Infine, noto il ruolo come fattore patogenetico generalmente attribuito alle laccasi, sarebbe
notevole l’analisi della relazione tra la produzione di tali enzimi ed il reale tasso di infezione di B. cinerea in
vigneto.