L. monocytogenes

Caratterizzazione dei fattori di virulenza di
Listeria monocytogenes e delle tossine botuliniche
Giovanna Franciosa
[email protected]
Workshop: Focus su Sicurezza d’Uso
e Nutrizionale degli Alimenti
Roma 21-22 novembre 2005, ISS
Listeria monocytogenes
Asporigeno
Microaerofilo
Produce fattori di virulenza
Clostridium botulinum
Sporigeno
Anaerobio obbligato
Neurotossigeno
Patogenesi della listeriosi umana
Meccanismo infettivo di L. monocytogenes
Principali fattori di virulenza che governano il
meccanismo infettivo di L. monocytogenes
Fattore
Ruolo
InlA
Adesione epitelio GI e placentare
InlB
Adesione epatociti ed altre cellule
Hly
Citolisina; lisi vacuolo
PI-PLC Fattore accessorio lisi vacuolo I
ActA
Mpl
Movimento intra- ed inter-cellulare
Attivazione PC-PLC
PC-PLC Fattore accessorio lisi vacuolo II
PrfA
Regolatore positivo trascrizione
GENI
GENI VIRULENZA
VIRULENZA
Listeriosi invasiva e gastroenterica
Invasiva
Gastroenterica
SNC e placenta
Tratto Gastrointestinale
Popolazione ad alto rischio
(immuno-compromessi, anziani,
donne in gravidanza, neonati)
Persone che non presentano
fattori di predisposizione
Dose infettiva: bassa
Dose infettiva: alta
Tempo medio d’incubazione
2-3 settimane
Tempo medio d’incubazione
12-24 ore
Episodi di gastroenterite associati a
L. monocytogenes
Luogo
Anno
Numero di casi
Veicolo
Rif.
Giappone
2001
38
Formaggio
Kawamoto et al., 2004
Svezia
2001
48
Latticini
Carrique-Mas et al., 2003
USA
2001
16
Sandwich tacchino
Frye et al., 2002
Australia
2000
31
Carni ready-to-eat
Sim et al., 2002
Finlandia
1999
5
Trota
Miettinen, 1999
Italia
1997
1566
Insalata di mais
Aureli et al., 2000
Canada
1996
1
Polpa di granchio
Farber et al., 2000
Danimarca
1996
3
Sconosciuto
Heitmann et al., 1997
USA
1994
45
Latte al cioccolato
Dalton et al., 1997
Italia
1993
18
Insalata di riso
Salamina et al., 1996
USA
1989
10
Gamberi
Riedo et al., 1994
Ceppi di L. monocytogenes paragonati
per caratteristiche di virulenza
30 CEPPI TOTALI
27 CLINICI
9 di sierotipo 1/2b
6 INVASIVI
1 da un outbreak
5 da casi sporadici
3 GASTROENTERICI
3 NON-UMANI
18 di sierotipo 4b
16 INVASIVI
Ceppo ScottA
15 da casi sporadici
ATCC 15313, n.s., avirulento
2 GASTROENTERICI
ATCC 43248, 1/2a
avirulento
L 254 (Italia)
L 90 (Italia)
L 285, n.s.
G6006 (USA)
F60594 (Danimarca)
C1340 (Canada)
Valutazione della virulenza dei
ceppi di L. monocytogenes
Approccio molecolare
Test di virulenza
in vivo su topini
inoculo (i.p.)
PCR-RFLP di 8 principali
geni associati alla virulenza intra-peritoneale
(VAG)
tipizzazione PFGE
inoculo (i.g.)
intra-gastrico
M
L90
F60594
L645
L864
L958
L959
L448
L599
L349
L337
L339
L340
L344
L335
L67
ScottA
L439
L66
M
Prodotti PCR di ActA ristretti con DraI
Ceppi
Ceppi
4b
Ceppi 4b
4b
800 bp
700 bp
400 bp
Ceppi
Ceppi
1/2b
Ceppi 1/2b
1/2b
500 bp
L285
ATCC43248
C1340
G6006
L254
L941
L330
L364
L312
L310
L2818
M
300 bp
Ceppi
Ceppi
avirulenti
Ceppiavirulenti
avirulenti
Ceppi 4b
Ceppi
avirulenti
Ceppi 1/2b
M
L364
L941
L254
G6006
C1340
M
L2818
L310
L312
L330
M
ATCC15313
ATCC43248
F60594
L285
L90
L958
L959
L864
L645
L599
L448
L349
L344
L340
L339
L337
L335
L67
L66
L439
ScottA
M
Profili PFGE con ApaI
Sc
ot
tA
L L 9 (4
28 0 b)
1
L 8 ( (4b
25 1/ )
4 2b
Sc (1/2 )
b
ot
tA )
L L 9 (4
28 0 b)
1
L 8 ( (4b
25 1/ )
4 2b
Sc (1/2 )
b
ot
tA )
L L 9 (4
28 0 b)
1
L 8 ( (4b
25 1 / )
4 2b
(1 )
/2
b)
Log10 CFU/g organ
Conte batteriche recuperate
negli organi dei topi inoculati i.g
i.g..
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
p < 0.05
intestine
liver
spleen
Listeria monocytogenes sierotipo 4b
Markers
per ECII
ECI
+
ECI4b - +
Altri
Altri 4b - ECII
ECII
-
+
- +
- -
85M
85M
133
133
Markers
per ECI
17B
17B
CLONI EPIDEMICI (EC)
+
- +
- -
Markers specifici dei cloni epidemici
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9 M 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M
bp
2000
1500
750
250
A
ECI-specific markers
B
ECII-specific markers
Distribuzione dei markers epidemici fra i ceppi di
L. monocytogenes 4b isolati in Italia
81 ceppi analizzati
14 ECI
34.6%
14 ECII
6/32 clinici (18.7%)
7/32 clinici (28%)
7/44 alimentari (15.9%)
6/44 alimentari (13.6%)
1/5 ambientale (20%)
1/5 ambientale (20%)
Studio del fattore di virulenza Internalina
(InlA)
Internalin-mediated Listeria invasion
Internalina
Internalina:: forma intera e forma troncata
InlA intera
InlA troncata
Internalina dei ceppi clinici di
L. monocytogenes isolati in Italia
65 ceppi analizzati
mediante Western blotting
7 producono internalina troncata
FARMACO
Beauty
BOTULISMO
TOSSINA
TOSSINABOTULINICA
BOTULINICA
the Beast…
and
COSMETICO
ARMA BIOLOGICA
Struttura e meccanismo d’azione
della tossina botulinica
Tossine botuliniche e targets
Cluster genici codificanti per i
“complessi tossici”
Struttura del cluster genico per la tossina
botulinica di tipo A ((bont/A)
bont/A)
Tipo A1
Tipo A2
ha70
ha17 ha33 botR/A
orfX2 orfX1 botR/A p47
ntnh
ntnh
bont/A1
bont/A2
Prodotti
da C.
PCR di ha33 e p47
botulinum tipo A
bp
62A
1882
2776
3517
1903
588
5277
3054
CL130
CL91
CL29
62A
1882
3517
588
2776
1903
5277
1636
1018
506
ha33
(774 bp)
p47
(1236 bp)
CL130
CL91
CL29
Pattern di restrizione con XbaI dei
prodotti PCR di bont/A
bp
62A
1757
1839 1882
1903
3517
2171
588
CL91 S157CL130 CL186 CL127 CL29 CL104
bp
2500
2 000
1500
Tipo A1
Tipo A2
800
Cluster genico di bont/A
Strains
ha33 gene
p47gene
bont/A
RFLP type
bont/A
gene cluster
+
−
−
−
+
+
A1
A2
A1
1
2
3
+
+
+
+
A2
A1
2
3
+
+
+
+
A1
A2
3
2
C. botulinum type A
10 (U.S.)
33 (Italy)
2 (U.S.)
C. botulinum type Ab
4 (Italy)
1 (U.S.)
C. botulinum type A(B)
5 (U.S.)
1 (U.S.)
Strategia di Sequenziamento
Cluster genico di BoNT/A (CEPPO C. botulinum “MASCARPONE”)
K2
Frammento 1: ~ 5Kb
K33
NT1
Frammento 2: ~ 5Kb
K6
NT1
K2
11
1
12
2
3
13
14
4
6
15
5
16
8
7
18
19
9
10
17
20
K33
K6
Orfs individuati nella sequenza del ceppo
“Mascarpone” (10,6 Kb)
ORF
Nucleotidi
Aminoacidi
% identità
ceppo
Kyoto-F (A2)
% omologia
ceppo
Kyoto-F (A2)
% identità
ceppo
NCTC2916 (A1)
% omologia
ceppo
NCTC2916 (A1)
ORFX2
(parziale)
631
210
100
100
97
99
ORFX1
429
142
88
90
99
99
botR
537
178
92
96
97
98
p47
1251
416
95
98
81
87
NTNH
3480
1159
95
97
92
95
boNT/A
3891
1296
99
99
89
94
Ruoli delle proteine accessorie
• Protezione della tossina nel tratto gastrointestinale
• Legame alle pareti intestinali
• Interazione con i residui di carboidrati sui globuli rossi
• Ruolo nella stabilità dell’agente terapeutico
Differenze nella sequenza aminoacidica
della tossina botulinica tipo A
• Diverse proprietà antigeniche
• Diversità nel riconoscimento del recettore?
Ringraziamenti
Paolo Aureli
Francesca Floridi
Laura Toti
Antonella Maugliani
Concetta Scalfaro