Le applicazioni attuali delle biotecnologie NON OGM nel

Le applicazioni attuali delle biotecnologie
NON OGM
nel settore alimentare
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I MICRORGANISMI E GLI ALIMENTI
Streptococcus thermophilus
Quanti microrganismi ingeriamo
con gli alimenti?
Si ingeriscono anche vivi?
Lactobacillus delbruecki bulgaricus
Penicillium roqueforti
Bifidobacterium bifidum
Saccharomyces cerevisiae
La MICROBIOLOGIA ALIMENTARE può essere considerata una branca dell’ECOLOGIA MICROBICA
Al fine di gestire al meglio le condizioni di crescita e le attività metaboliche dei
microrganismi per l’ottenimento di alimenti sono necessarie una serie di informazioni
inerenti a:
• L’identità tassonomica, cioè il numero delle specie, e il
grado di diversità biologica dei ceppi che colonizzano
l’alimento in ogni stadio del processo produttivo, dalla materia
prima al prodotto finito;
• dati quantitativi che descrivono l’andamento delle
popolazioni di specie e ceppi microbici durante le diversi
fasi del processo produttivo;
•distribuzione spaziale delle specie microbiche nel prodotto;
• effetto dei fattori intrinseci e di processo-conservazione che
possono influenzare la crescita, la sopravvivenza e le attività
metaboliche microbiche;
La valutazione del grado di diversità biologica rimane sempre
una stima della reale diversità microbica esistente sia per la
difficoltà di recuperare le specie presenti a bassa concentrazione
nel campione, sia per l’annoso problema delle specie non
coltivabili.
CARATTERIZZAZIONE GENETICA E FENOTIPICA DI MICRORGANISMI DI INTERESSE ALIMENTARE
• L’ identità tassonomica e il grado di diversità biologica …
Identificazione a livello di genere e specie,
secondo un approccio POLIFASICO
ovvero di un approccio basato su
valutazioni fenotipiche e genotipiche.
GENOTIPO
(per identificare la specie)
Analisi filogenetica basata sulla
sequenza del gene 16S rRNA del
ceppo isolato.
Variabilità fenotipica tra
ceppi che appartengono
alla stessa specie
L’ identificazione appropriata di una
specie batterica avviene essenzialmente
attraverso analisi molecolari … ma non è
mai una pratica semplice e scontata !
… perché la definizione di specie batterica
non ha “contorni definiti”
... perché non è così raro individuare ceppi
batterici che appartengono a specie
o generi non ancora descritti
Come procedere quando devo identificare un numero elevato
di ceppi isolati da un determinato prodotto alimentare?
GENOTIPO
(per ottenere gruppi omogenei di ceppi appartenenti alla stessa specie)
ARDRA (Amplified Ribosomal
Restriction Analysis)
Tecniche molecolari basate sulla
reazione a catena della polimerasi
(PCR) e quindi su informazioni presenti
a livello del genoma batterico.
DNA
ITS (Internal Transcribed ribosomal
Spacer analysi)
RAPD (Random Amplified Polimorphic
DNA fingerprinting analysis)
Rep-PCR (Repetitive Elements PCR)
PCR-based
(AFLP)
fingerprinting
methods
Potere
di
risoluzione
Ceppi
Isolati
in coltura
pura
16S rRNA
Specie D e E
Specie B e C
Specie A
Potere
di
risoluzione
ITS (16S-23S rRNA)
Specie D e E
Specie B
Specie C
Specie A
RAPD, rep-PCR, etc.
Specie D
Specie E
Specie B
Specie C
Specie A
Specie A
La CARATTERIZZAZIONE GENOTIPICA ottenuta a livello di CEPPO
Mette in evidenza una
VARIABILITA’ GENOTIPICA
NON NECESSARIAMENTE
CORRISPONDENTE ALLA
VARIABILITA’ FISIOLOGICA
e alle caratteristiche
TECNOLOGICHE del ceppo
Indispensabile una caratterizzazione FENOTIPICA
Metabolismo
Energetico
Primario
(Respirazione
e/o
Fermentazione).
Questa informazione si può considerare
acquisita contemporaneamente all’identificazione molecolare a
livello di specie.
Caratterizzazione delle attività metaboliche di interesse
tecnologico. Spesso si tratta di caratteristiche dei singoli
ceppi piuttosto che della “specie”.
Potere
di
risoluzione
Metabolismo del
LATTOSIO/Galattosio
Sistema PROTEOLITICO
Caratterizzazione delle
attività metaboliche di
interesse tecnologico.
Caratteristiche dei singoli
ceppi piuttosto che della
“specie”.
L’AUTOLISI
La produzione di AROMI
La sintesi di
ESOPOLISACCARDI
La produzione di
MOLECOLE ad ATTIVITA’
ANTIBATTERICA
La RESISTENZA AI
BATTERIOFAGI
Effetti diretti sulla
velocità di acidificazione
S. thermophilus non
utilizza il galattosio
derivato dall’idrolisi del
lattosio e il suo accumulo
nella matrice alimentare
può facilitare lo sviluppo
di microrganismi
alterativi
Metabolismo del
LATTOSIO/Galattosio
?
In alcuni casi si preferisce
selezionare ceppi incapaci di
utilizzare il lattosio (L. delbrueckii
per produzione di yogurt)
Effetti diretti sulla
velocità di acidificazione
Effetti indiretti sul
processo di maturazione
dei formaggi
(endopeptidasi)
Sistema PROTEOLITICO
Modulare lo sviluppo di
sapori amari dovuti alla
formazione di peptidi
conteneti amminoacidi
idrofobici (Leu, Phe e
Pro)
Può determinare la
formazione di peptidi
BIOATTIVI a partire
dall’idrolisi delle proteine
del latte (Inibitori
dell’ACE e casomorfine)
L’AUTOLISI
Effetti diretti sul processo
di maturazione dei
formaggi. Inoculi con
ceppi selezionati autolitici
riducono i tempi del
processo di maturazione.
endopeptidasi
La produzione di AROMI
Effetti diretti sulle qualità
organolettiche del prodotto
finito.
(Enzimi coinvolti nel
catabolismo degli amminoacidi,
glutammato-deidrogenasi,
transaminasi, idrossimetiltransferasi)
Diacetile, acetaldeide etc.
La sintesi di
ESOPOLISACCARDI
Effetti diretti sulla texture del
prodotto fermentato (Yogurt).
Consente di ridurre la % di
sostanza grassa.
La produzione di
MOLECOLE ad ATTIVITA’
ANTIBATTERICA
Si tratta di molecole di sintesi
proteica (batteriocine),
direttamente coinvolti nel
processo di fermentazione, e in
grado di contrastare lo
sviluppo di microrganismi
alterativi o patogeni.
Rappresentano un valore
aggiunto nelle caratteristiche di
una coltura starter.
ceppo batterico
pro-tecnologico
batteri patogeni
e/o alterativi
La RESISTENZA AI
BATTERIOFAGI
Importante sia in fase
produttiva di biomasse da
utilizzare come starter che in
fase di caseificazione
In alcuni casi l’induzione di un
ciclo litico viene sfruttato per
accelerare il processo di
maturazione dei formaggi
L’adesione alle cellule
epiteliali intestinali delle
specie PROBIOTICHE
… una delle condizioni
“essenziali” per definire un
ceppo probiotico
Adesione di Bifidobacterium bifidum NAB1 su cellule
epiteliali intestinali coltivate in vitro (Caco-2 cell layer)
Lactobacillus sp.
B. Bifidum NAB1.
B. Bifidum NAB1.
B. Bifidum NAB1
Un aiuto dal sequenziamento dei genomi microbici
genomi di piccole dimensioni (1,8 – 3 Mbp)
il background culturale (biologia molecolare, genetica,
biotecnologie) consente una loro “facile” annotazione
… posso prevedere cosa “sa
fare” un microrganismo sulla
base della sequenza del suo
genoma …
attribuire a ciascun gene
una “funzione” nel
metabolismo cellulare
Streptococcus thermophilus - genome
La variabilità genetica e la “biodiversità” esistenti nel mondo microbico
consentono, nella maggior parte dei casi, di individuare il microrganismo
(ceppo) più adatto ad un determinato processo produttivo
… quando ciò non è possibile … la selezione di mutanti “naturali”
rappresenta un ottimo strumento per ottenere il “nuovo”
microrganismo con le caratteristiche desiderate …
… in ogni caso la costruzione di microrganismi geneticamente
modificati può aiutare (in laboratorio) a comprendere le funzioni
di singoli geni o gruppi di geni nel metabolismo cellulare e il loro
contributo “tecnologico” …
… esistono tecnologie Food-Grade per ottenere
microrganismi ricombinanti …ma non sono attualmente
accettate dai consumatori perché …