Proteine: funzioni principali
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Proteine: funzioni principali 1) La struttura (collagene e cheratina) 2) La catalisi (enzimi) 3) Il movimento (miosina ed actina) 4) Il trasporto (emoglobina e proteine di membrana) 5) La protezione (anticorpi) Amminoacidi Forma non ionizzata Un α-amminoacido Il carbonio α è asimmetrico (chirale) Forma ionizzata sale interno (zwitterione) Gli α-amminoacidi sono le unità molecolari (monomeri) che costituiscono le proteine (polimero) Insulina umana: una piccola proteina Gli amminoacidi proteici sono 20 ed hanno sempre chiralità L Gli a.a. differiscono per la catena laterale R Catene laterali non polari Catene laterali polari Catene laterali acide Catene laterali basiche Alcuni altri L-amminoacidi comuni metaboliti ormoni neurotrasmettitore Proprietà acido-basiche degli amminoacidi Basicità del gruppo guanidinico dell’arginina Basicità del gruppo imidazolico dell’istidina è in grado di accettare protoni Titolazione degli amminoacidi: curva di titolazione della glicina OH OH H2NCH2COO H3NCH2COO H3NCH2COOH H2O H2O PUNTO ISOELETTRICO Valore di pH al quale un amminoacido, un polipeptide o una proteina non posseggono una carica netta. pI = 1/2(pKa α-COOH + pKa α-NH3+) GLICINA pI = ½(2.35 + 9.78) = 6.06 Elettroforesi Tecnica analitica mediante la quale è possibile separare composti in base alle loro cariche elettriche Carta Campione Soluzione tampone Il colorante più usato per rivelare gli amminoacidi è la ninidrina La reazione con un amminoacido porta ad un’adeide e ad un composto colorato Anione di colore porpora Polipeptidi e proteine: il legame peptidico Polipeptidi e proteine Peptidi 2-10 amminoacidi (dipeptide, tripeptide, etc.) Oligopeptidi 11-19 amminoacidi Polipeptide 20-100 amminoacidi Proteina Più di 100 amminoacidi Tripeptide Ser-Phe-Asp legame peptidico legame peptidico Per convenzione una sequenza peptidica viene scritta iniziando da sinistra con l’amminoacido N-terminale (gruppo –NH3+ libero) e procedendo verso destra fino all’amminoacido C-terminale (gruppo –COO- libero). Struttura primaria di polipeptidi e proteine Rappresenta la sequenza degli amminoacidi lungo la catena polipeptidica (ovvero l’ordine con cui sono legati) a.a N-terminale a.a. C-terminale Come si fa a stabilire la struttura primaria? Analisi qualitativa-quantitativa degli a.a Si procede in due tappe Analisi della sequenza degli a.a. Analisi quantitativa degli amminoacidi Indica di che tipo sono gli amminoacidi ed in che quantità sono presenti nel polipeptide: Idrolisi acida Miscela di amminoacidi: si analizza per cromatografia a scambio ionico HCl 6M, 110°, 24-72 ore Colonna cromatografica Miscela di amminoacidi Analizzatore di amminoacidi L’analizzatore fornisce un grafico (cromatogramma) Analisi di una miscela di amminoacidi pH 3.25 treonina Serina Ac. glutammico pH 4.25 metionina isoleucina valina leucina alanina fenilalanina glicina Ac.aspartico prolina cistina tirosina pH 5.28 fenilalanina tirosina lisina istidina arginina Con questa analisi stabiliamo quali sono gli amminoacidi e in che quantità relative sono presenti nel polipeptide Analisi della sequenza di un polipeptide Avviene in più fasi: I Idrolisi parziale (specifica) Agente enzimatico o chimico II Separazione Metodi cromatografici A III sequenziamento B sequenziamento C sequenziamento Il bromuro di cianogeno come agente chimico A sequenziamento Il sequenziamento utilizza la degradazione di Edman Si basa sulla reazione selettiva e sul distacco del solo amminoacido Nterminale Si isola e si identifica Si ripete la degradazione di Edman Ripetendo degradazione di Edman sul peptide residuo (più corto di un a.a.) si identifica l’a.a. successivo. Si procede così per tutti gli a.a. (max 50-100) A B C Cosi facendo, si possono identificare le sequenze dei tre frammenti peptidici A,B,C. Tuttavia non sappiamo in che ordine sono legati tra loro. A B C ? A C B ? B A C ? Per conoscere l’ordine con cui i frammenti A, B, C, sono legati tra loro si ripete il processo di sequenziamento sull’intero peptide utilizzando un enzima o agente chimico diverso I Idrolisi parziale (specifica) Diverso agente enzimatico o chimico Separazione Metodi cromatografici II A’ III sequenziamento B’ sequenziamento Dal paragone dei risultati del primo sequenziamento con il secondo è possibile risalire ai “punti di giunzione” tra i frammenti peptidici A, B, C, (ed anche A’ e B’) e quindi individuare l’esatta sequenza dell’intero peptide. A B C A’ B’ si deduce sequenza completa FORME TRIDIMENSIONALI DI POLI PEPTIDI E PROTEINE Geometria del legame peptidico Il legame ammidico ha un carattere parziale di doppio legame: la rotazione intorno ad esso è impedita. La rotazione impedita intorno al legame peptidico crea due possibili configurazioni (cis e trans) – (Diastereoisomeria) cis Questo aspetto influenza molto secondaria e terziaria delle proteine. trans le strutture Struttura secondaria di una proteina Descrive le sistemazioni ordinate (conformazioni) assunte dagli amminoacidi in particolari regioni di un polipeptide o di una proteina Legame idrogeno I legami idrogeno tra gruppi ammidici stabilizzano la conformazione di un polipeptide o di una proteina. Pauling propose due tipi di strutture secondarie: Struttura ad ad Struttura elica αα elica Conformazione Conformazione foglietto ββ aa foglietto ripiegato ripiegato Struttura ad ad αα elica elica Struttura Legami idrogeno intracatena N-H O=C Asse dell’elica -R 1) L’elica è destrorsa. 2) Vi sono 3.6 a.a. per ogni giro d’elica. 3) I legami peptidici sono planari e trans. 4) N-H punta verso il basso, mentre C=O verso l’alto. 5) Il legame H si stabilisce tra due a.a. che distano 4 unità. 6) I gruppi -R puntano verso l’esterno. Conformazione ββ aa foglietto foglietto ripiegato ripiegato Conformazione C-terminale N-terminale N-terminale C-terminale C-terminale Ci sono legami idrogeno intercatena -R N-terminale 1) Le catene sono adiacenti e corrono in direzioni opposte (antipar.) 2) I legami peptidici sono planari e trans. 3) I gruppi N-H e C=O puntano ciascuno verso l’altro e giacciono sullo stesso piano. 4) In ciascuna catena i gruppi –R si alternano verso l’alto e verso il basso Struttura terziaria di una proteina Si riferisce al tipo di avvolgimento complessivo e alla sistemazione nello spazio di tutti gli atomi di una singola catena polipeptidica. Struttura terziaria della mioglobina. Si individuano alcuni tratti con struttura α. Oltre ai legami idrogeno la struttura terziaria di una proteina è “tenuta insieme” anche da legami disolfuro: Insulina umana Catene laterali di cisteine Ox Red Legame disolfuro Struttura quaternaria di una proteina La possiedono le proteine formate da più di una catena polipeptidica. Indica la disposizione reciproca delle catene nello spazio:
