ERRORE NELL`ANALISI E VALUTAZIONE DEL DATO ANALITICO
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ESPRESSIONE DEL DATO ANALITICO E’ impossibile effettuare una analisi chimica con risultati privi di incertezza, è quindi necessario determinare il grado di incertezza associato alla misura per ogni campione analizzato. Passaggio assolutamente necessario è stabilire quale è il massimo errore tollerabile nella misura! Come si esprime una misura? Chimica Analitica- STA- Compagnone 1 I dati I dati sono delle informazioni elementari che descrivono aspetti particolari di un fenomeno dati di un individuo: Altezza, peso, colore pelle, concentrazione composti chimici nel sangue, composizione DNA, taglia abiti e calzature,… I dati possono essere qualitativi o quantitativi Di per se un dato non ha significato. E’ necessaria una forma di analisi che correli il dato con qualche aspetto “significativo” del campione stesso in modo da aumentare la “conoscenza” p.es. per dare senso alla composizione chimica del sangue è necessario un modello del corpo umano e delle azioni delle patologie. dato Informazione analisi Chimica Analitica- STA- Compagnone Conoscenza modello 2 Tipologie di dati Quantitativi Valore numerico ed unità di misura La temperatura dell’acqua è 400.0 K I dati quantitativi sono la base della scienza galileiana e delle cosiddette “hard sciences”: le discipline basate su dati rigorosi connessi tra loro da modelli matematici. Qualitativi Etichette, descrittori, categorie Generalmente sono espressi verbalmente “l’ acqua è calda” Dati standardizzabili e riproducibili con difficoltà (es. analisi sensoriale) Dati discreti: Range (intervallo) limitato e valori pre-definiti Dati continui Range limitato ma valori continui I limiti strumentali possono dar luogo a discretizzazioni (p.es.conversione Analogico-Digitale) Chimica Analitica- STA- Compagnone 3 Dati Univariati Molti procedimenti analitici producono dati univariati in cui cioè il dato sperimentale dipende da una sola variabile Misura di una singola variabile incognita Controllare le interferenze Tenere costanti tutte le condizioni sperimentali tranne la variable target (bersaglio) Richiede una preparazione elaborata del campione per isolare solo la variabile da misurare Un dato univariato è espresso con uno scalare e una unità di misura. La misura di una resistenza elettrica è 100KΩ Il peso di una mela è 80g La concentrazione di K+ in un campione di acqua è 1.02 mg/l (procedura analitica!) Chimica Analitica- STA- Compagnone 4 Tra gli errori che si commettono bisogna considerare quelli strumentali ©Gary Christian, Analytical Chemistry, 6th Ed. (Wiley) pipette di vetro ed automatiche . Chimica Analitica- STA- Compagnone 5 e dell’operatore! ©Gary Christian, Analytical Chemistry, 6th Ed. (Wiley) Chimica Analitica- STA- Compagnone 6 Le bilance moderne sono elettroniche. Sono calibrate con masse note. Le bilance analitiche comuni sono sensibili a 0.1 mg. Devono essere accompagnate da certificati di taratura forniti dalle ditte produttrici. ©Gary Christian, Analytical Chemistry, 6th Ed. (Wiley) Bilancia analitica elettronica. Chimica Analitica- STA- Compagnone 7 Criterio fondamentale della analisi dati I dati sono rappresentati in spazi vettoriali euclidei Ad ogni osservabile viene fatta corrispondere una dimensione dello spazio ed è associato un vettore di base. Il sistema di riferimento dello spazio vettoriale è costituito da una base di vettori ortonormali pari al numero degli osservabili descritti. Questa assunzione è ovvia per i dati univariati: Rappresentazione cartesiana Esempio: sensore di glucosio (procedura analitica semplice) Il sensore [mA] • • Spazi delle variabili • • • Risposta strumentale Corrente elettrica [mA] [mg/l] • • Conc. di glucosio [mg/l] • • • Chimica Analitica- STA- Compagnone [mA] • Variabile da misurare • • • • [mg/l] 8 I parametri caratteristici degli strumenti: 1. La curva di risposta Formalmente uno strumento descrive una mappatura dallo spazio del misurando allo spazio del segnale d’uscita. Se questi spazi hanno dimensione 1, lo strumento è rappresentabile attraverso una funzione V=f(M). Questa funzione è detta risposta I/O o caratteristica dello strumento, rappresenta il parametro fondamentale per caratterizzarlo. La conoscenza della curva di risposta permette di usare lo strumento per una qualsiasi misura: dalla misura di V si evince una stima del misurando M La curva di risposta si ottiene attraverso un processo di taratura. Misurando M strumento Segnale V Regione V non-lineare saturazione Regione lineare Chimica Analitica- STA- Compagnone M9 I parametri caratteristici degli strumenti: 2. Reversibilità La reversibilità esprime la capacità dello strumento di misura di seguire, con una dinamica tipica dello strumento stesso, le variazioni del misurando. In particolare, uno strumento è reversibile se al cessare della sollecitazione del misurando la risposta si annulla. Integrale “dosimetro” reversibile M M t V mono-uso “disposable” M t V t Chimica Analitica- STA- Compagnone t V t t 10 I parametri caratteristici degli strumenti: 3. Sensibilità La sensibilità è definita come il rapporto tra la variazione del segnale e la variazione del misurando. Definisce la capacità dello strumento di misura di seguire le variazioni del misurando Matematicamente, si esprime come la derivata della curva di risposta dello strumento dV S dM Nella regione di non linearità, S è funzione del misurando. Nella regione di linearità S è massima, perciò sono massime le prestazioni dello strumento Chimica Analitica- STA- Compagnone V M Regione Regione lineare non-lineare saturazione S M 11 I parametri caratteristici degli strumenti: 4. Risoluzione La risoluzione è legata all’esistenza degli errori di misura e del rumore. Per questo motivo, il segnale del sensore non è una grandezza deterministica ma ha una componente aleatoria: V±dV. Dove dV esprime tutti gli errori di misura dV è limitato inferiormente dal rumore elettronico del segnale V. La risoluzione esprime come l’incertezza dV si traduce in una incertezza dM sulla misura del misurando. Vout Vnoise Nella regione lineare: resoluti on lim S Vout Vnoi se S dM V±dV tan S M±dM • • dV S dV dM • M La risoluzione dipende dalla sensibilità. In strumenti con sensibilità più alta gli errori di misura influiscono di meno sulla stima del misurando. La definizione vale anche per strumenti non lineari, se nell’intervallo dV la curva è assimilabile ad una retta. Chimica Analitica- STA- Compagnone 12 I parametri caratteristici degli strumenti: 5. Limite di rivelazione La risoluzione calcolata per un segnale uguale a 0, definisce il limit of detection (LOD) dello strumento. La definizione traduce il fatto che non può esservi misura inferiore al suo errore. Quando l’errore di misura raggiunge il suo limite inferiore, il rumore elettronico Vn, si ha il limite di rivelazione teorico. Si definisce un LODconvenzionale= (p.es 3 volte rumore di fondo ) tan S Vn LOD Vn LOD S dV dM M Chimica Analitica- STA- Compagnone 13 Analisi dati: deterministica o statistica Il dato in quanto risultato di una misura è un’entità stocastica Questo è un concetto fondamentale delle scienze sperimentali Ripetendo N volte “la stessa misura” si ottengono N valori differenti Se non si ottengono valori differenti lo strumento di misura ha una risoluzione non adeguata. Esempio: Se si misura 5 volte la lunghezza di un asse con diversi strumenti si ottiene: Strumento Risoluzione Misure [cm] Metro da sarta 1 cm 120, 120, 120, 120, 120 Metro da falegname 1 mm 119.8, 119.9, 120.1, 120.0, 120.2 Calibro 0.1 mm 119.84, 120.31, 119.83, 120.10, 120. 34 Micrometro 0.01 mm 119.712, 120.032, 119.879, 120.320, 119.982 Interferometro laser 0.5 µm 119.9389, 120.0032, 119.8643, 119.3492, 120.2010 All’aumentare della risoluzione strumentale il dato diventa da deterministico stocastico Chimica Analitica- STA- Compagnone 14 Analisi Statistica La statistica è quella parte della matematica che mette in relazione grandezze rappresentate da distribuzioni di probabilità. Esempio: La misura dell’asse precedente non ha un valore vero assoluto, ma appartiene ad una distribuzione che fissa la probabilità che eseguita una misura il valore sia compreso in un certo intervallo. Il concetto di probabilità è il concetto fondamentale della statistica. Essa è definita come: Pr obabilità casi favorevoli casi possibili Esempio: la probabilità tirando un dado “non truccato” di avere un valore è 1 (caso favorevole)/6 (casi possibili). Chimica Analitica- STA- Compagnone 15 Probabilità e Frequenza Ogni grandezza misurabile è caratterizzata da una distribuzione di probabilità i cui parametri sono stimabili attraverso misure sperimentali All’aumentare delle misure sperimentali i valori stimati approssimano i valori reali. Lo stimatore, calcolato cioè a partire dai dati sperimentali, della probabilità è la frequenza. Frequenza N favorevoli Pr obabilità N totali lim Frequenza N totali Chimica Analitica- STA- Compagnone 16 Distribuzioni di probabilità (PDF) Data una grandezza la distribuzione di probabilità, PDF(x), è una funzione del valore della grandezza estesa a tutti i valori possibili (da - a +). Per ogni valore essa definisce la probabilità di osservare il valore stesso. Poiché ogni strumento di misura ha una incertezza intrinseca derivante dal metodo di misura il risultato di una misura è espresso come intervallo x±∆x. Per cui la probabilità della misura è la somma delle probabilità di tutti i valori compresi tra x-∆x e x+∆x: xx p PDF x dx xx Ovviamente, poiché la misura esiste si ha la seguente regola di normalizzazione della PDF PDF x dx 1 Chimica Analitica- STA- Compagnone 17 Esempio: Risultati di un analisi di un campione contenente 30 ppm (mg/L) di rame(II) (Cu2+) 28.7; 30.2; 29.8; 29.5; 30.5; 30.1; _ N x (media-migliore stima del valore medio) = S xi / N = 29.8. i=1 mediana = (29.8 + 30.1) /2 = 29.95 ACCURATEZZA (accuracy): indica la vicinanza del valore espresso al suo valore vero o accettato come vero. E’ composta da PRECISIONE ED ESATTEZZA. Si esprime come incertezza della misura (errore relativo o assoluto). PRECISIONE (precision): Grado di concordanza fra risultati di prova indipendenti ottenuti con un procedimento di analisi in condizioni stabilite, indica la riproducibilità delle misure ottenute con lo stesso metodo. Si esprime mediante la deviazione standard (scarto tipo), la varianza o il coefficiente di variazione ( deviazione standard relativa). ESATTEZZA (trueness): indica la vicinanza della media dei valori ottenuti al valore vero o accettato come vero Chimica Analitica- STA- Compagnone 18 Errore assoluto = xi - xt; xt = valore vero Errore relativo = (xi - xt ) / xt 100 Esattezza scarsa Precisione scarsa p.es. (29.8 - 30.0) / 30.0 100 = - 0.67% Esattezza buona Precisione scarsa Tipi di errore: • errore casuale dispersione simmetrica dei dati • errore sistematico (bias) media diversa dal valore vero o accettato Esattezza scarsa Precisione buona • errore grossolano produce outliers Esattezza buona Precisione buona Chimica Analitica- STA- Compagnone 19 Distribuzione degli errori casuali (o indeterminati) a; b; c = 4; 10 e un numero grande di incertezze indeterminate (U) Chimica Analitica- STA- Compagnone 20 Media e Varianza La media e la varianza sono due grandezze fondamentali per descrivere una variabile statistica indipendentemente dalla forma funzionale della PDF. La media m è quel valore particolare di x per il quale si ottiene: m m PDF x dx PDF x dx La varianza (s2) è una grandezza che definisce “l’ampiezza” della PDF, definisce cioè la dispersione possibile dei valori della misura di x. In pratica, la probabilità di x è concentrata in un intervallo di valori la cui ampiezza è definita dalla varianza. La varianza è definita attraverso la PDF come mvalore vero: s 2 x m f x dx 2 Chimica Analitica- STA- Compagnone 21 Media Aritmetica come miglior stima del valore medio Data una sequenza di misure affette da errore si dimostra che la media aritmetica è una buona stima del valore atteso della misura stessa, cioè al valore medio della PDF della variabile misurata. Al crescere del numero delle misure la media aritmetica converge verso il valore medio (valore vero m): Dispersione quadratica media come miglior stima della varianza Data una sequenza di misure di x, la miglior stima della varianza della PDF che genera le misure è data dalla dispersione quadratica media, ovvero dalle medie del quadrato della differenza tra le singole misure ed il valore medio. La radice della varianza è detta deviazione standard ed è spesso usata per esprimere l’incertezza di una misura sperimentale. 1 m lim N N N x i 1 i Chimica Analitica- STA- Compagnone 1 2 s N N 2 x m i i 1 22 Distribuzione Normale gaussiana La distribuzione di Gauss è la PDF più importante soprattutto per quanto riguarda le misure sperimentali. La distribuzione ha la seguente forma funzionale Dove µ è il valor medio e s2 la varianza La funzione è simmetrica attorno al valor medio Il valore di s determina la larghezza della curva. x m 2 1 f x exp 2s 2 2s • la media cade nel punto centrale di massima frequenza • la distribuzione delle deviazioni è simmetrica • diminuzione esponenziale nella frequenza all’aumentare delle deviazioni (le piccole incertezze sono osservate più spesso delle grandi) Chimica Analitica- STA- Compagnone 23 PDF normale come somma di processi casuali elementari Frequenza uscite da un dado a 10 facce Due dadi Un fenomeno è distribuito normalmente quando è costituito da un numero molto elevato (tendente a infinito) di processi casuali. Tre dadi Ndadi Quattro dadi Chimica Analitica- STA- Compagnone 24 Le curve gaussiane possono essere descritte mediante : la media della popolazione m la deviazione standard s popolazione di dati numero teorico infinito di misure campione di dati numero finito di dati Chimica Analitica- STA- Compagnone 25 z xm s •Per facilitare l’uso della distribuzione normale conviene ridurre la variabile eventuale ad una variabile ridotta con media nulla e varianza unitaria •In questo modo il calcolo della probabilità diventa indipendente dalla particolare natura della variabile e possono essere usate delle tabelle generali •Per ridurre la variabile è necessario conoscere il valore medio (µ) e la varianza (s2) della variabile stessa Chimica Analitica- STA- Compagnone 26 Esempio:gradi Brix in Pesche Supponiamo di avere misurato il contenuto in gradi brix di una popolazione di 31 pesche. 9.80 8.00 7.70 9.50 13.70 10.20 11.50 11.20 11.50 31 9.10 11.90 13.20 12.50 1 media x i 11.45 31 i 1 11.30 11.60 14.60 14.30 12.80 9.20 13.70 12.50 11.30 8.30 13.20 12.10 11.20 11.90 13.70 9.90 10.40 13.20 N 1 2 2 s xi 11.45 3.51 30 i 1 _ x tende a me s tende a s per un numero elevato di misure N-1 = numero di variabili indipendenti o gradi di libertà (un grado di libertà viene usato per calcolare la media) Chimica Analitica- STA- Compagnone 27 Gaussiana ed istogramma L’istogramma è una rappresentazione della frequenza con la quale in un esperimento si è verificato un valore compreso in un intervallo x±∆x Poichè la frequenza approssima la probabilità, l’istogramma è una approssimazione della PDF 10 9 8 Dati Brix nelle pesche 7 6 5 4 3 2 1 0 4 6 8 10 12 Chimica Analitica- STA- Compagnone 14 16 18 28 Tutti i parametri relativi alla precisione possono essere trovati tramite un semplice calcolatore o foglio excel! Inserire i dati – selezionare dalle funzioni numeriche dev. st.- sel. le caselle con i dati Risultati dell’analisi del campione di rame (II) (Cu2+) 28.7; 30.2; 29.8; 29.5; 30.5; 30.1; _ x (media) = 29.8 ppm; sx = 0.639 ; sx = 0.583 (m = 30 ppm) s2 = 0.408 ; CV (RSD) = 0.639 / 29.8 x 100 = 2.14% Deviazione standard relativa o coefficiente di variazione _ RSD (CV) = (s / x ) 100 attenzione alle cifre significative! Chimica Analitica- STA- Compagnone 29 Il numero di cifre significative è il numero di cifre necessario per esprimere i risultati di una misurazione consistenti con la precisione misurata Il numero 56.098 ha 5 cifre significative. 56.098 mm = 0.56098 dm = 0.056098 m sempre 5 cifre significative. Lo zero finale è sempre significativo! Moltiplicazione e divisione L’incertezza dell’ultima cifra è trasmessa nelle operazioni matematiche, nel calcolo si individua un numero chiave, quello con il minimo grado di certezza cioè con meno cifre significative e più piccolo in valore assoluto: 35.63 0.5481 0.05300 / 1.1689 = 88.5470578 il risultato è 88.55; le altre cifre non hanno senso se la grandezza del risultato è più piccola del numero chiave si può aggiungere una cifra su cui però si è incerti 42.68 891 / 132.6 0.5247 = 546.57 il risultato è 547 o 546.6Chimica Analitica- STA- Compagnone 30 Addizione e sottrazione Non si usa un numero chiave ed è importante determinare quante cifre saranno significative. p.es. peso formula di Ag2MoO4 15.9994 pesi atomici: Ag = 107.870; Mo = 95.94; O = il risultato è 375.68 e si può arrotondare alla seconda (o terza) cifra decimale prima dell’addizione Logaritmi Il numero su cui si deve operare e la mantissa del logaritmo hanno lo stesso numero di cifre significative una soluzione di 2.0 x 10-3 M di HCl ha un pH = -log[H+] = -(-3 + 0.30) = 2.70 Per aumentare l’accuratezza di una misura si può aumentare il numero chiave (p. es. tramite pesata) o misurarlo con una cifra in più (se possibile). Chimica Analitica- STA- Compagnone 31 Limiti ed intervalli di confidenza (fiducia) CL(limite di confidenza) di una singola misura per m= x zs di una media Ndi misure per m= x zs/N Chimica Analitica- STA- Compagnone 32 spesso s non è noto ed è necessario utilizzare una piccola serie di dati non solo per il calcolo della media ma anche della precisione. In questo caso si usa t invece di z dove: t = (x - m /s il limite di confidenza per la media di N replicati diventa _ CL per m = x ts / N (errore standard) t dipende sia dal livello di confidenza desiderato che dai gradi di libertà. I valori di t sono tabulati. Chimica Analitica- STA- Compagnone 33 Risultati dell’analisi del campione di rame (II) (Cu2+) 28.7; 30.2; 29.8; 29.5; 30.5; 30.1; _ x (media) = 29.8 ppm; sx = 0.639 ; ad un livello di confidenza all’80% m = 29.8 1.48 0.639 / 6 = 29.8 0.39 ad un livello di confidenza al 99% m = 29.8 4.03 0.639 / 6 = 29.8 1.05 Chimica Analitica- STA- Compagnone 34 Errore sistematico (bias) • errori strumentali (p.es. variazioni nel volume dispensato da una pipetta o nella tensione di alimentazione di strumenti) • errori di metodo (comportamento fisico e chimico non ideale di reagenti e reazioni) • errori personali (valutazione soggettiva dell’operatore) C’è un bias nella misura? Se mA = valore vero mB contiene un errore sistematico? Se la differenza mA- mB è dovuta ad errore casuale, deve essere inferiore ad un valore critico , ad un certo livello di probabilità, (ipotesi nulla ) se xv è il valore vero allora: x xv ts / N Se il valore è maggiore ho un errore sistematico, altrimenti non ho errore sistematico o è coperto dall’errore casuale Chimica Analitica- STA- Compagnone 35 Uso del test Q per il rigetto degli outliers (errori grossolani) Non ha valore assoluto e bisogna utilizzarlo con attenzione! Chimica Analitica- STA- Compagnone 36 Confronto tra due medie sperimentali p.Es verifica del contenuto di un costituente ottenuto su due materiali identici con lo stesso metodo. Se m1 e m2 sono le due medie sm1 s1 N1 sd2 sm1 sm 2 2 sm 2 s2 N 2 2 Varianza della differenza tra le medie (sd / Ntot ) 2 (s1 / N1 ) 2 (s2 / N 2 ) 2 La deviazione standard cumulativa è una buona stima della deviazione standard totale! Per cui N1 scum 2 (sd / Ntot )2 scum N1 N 2 / N1 N 2 se la differenza è inferiore al dato calcolato al livello di fiducia desiderato i materiali sono identici! N3 N2 (x x ) (x x ) (x x ) i 1 2 i 1 j 1 2 j 2 k 1 k 3 2 ...... N1 N 2 N 3 ...... N t Formula generale per s cumulativa x1 x2 tscum N1 N 2 / N1 N 2 Chimica Analitica- STA- Compagnone 37 Calibrazione Ogni metodo analitico è descritto da una funzione caratteristica che mette in relazione la grandezza d’uscita (segnale V) con la grandezza alla quale il metodo è sensibile (misurando-analita x) Nei casi più semplici, f è lineare: V f (x) V: segnale; e: sollecitazione; k: parametro funzionale del sensore V ke Il metodo è utilizzabile, cioè dal segnale si può stimare il misurando, solo quando sono noti sia la funzione caratteristica che I parametri funzionali. La stima dei parametri funzionali può essere ottenuta solo effettuando una operazione di calibrazione del metodo, cioè attraverso una serie di misure sperimentali ed applicando una regressione statistica. 38 Stima dei parametri funzionali La forma funzionale della caratteristica deve essere imposta a-priori Le deviazioni tra forma funzionale e dati sperimentali vengono interpretate come errori di misura. Per calibrare il sensore lo si deve sottoporre a sollecitazioni note. Quindi si deve essere in grado di generare valori noti del misurando con grande precisione (uso di standards) Da questa precisione dipende la bontà della calibrazione e quindi l’accuratezza delle misure sui campioni incogniti. Chiamiamo regressione la stima di parametri da dati sperimentali La regressione è una operazione statistica necessaria a causa della presenza degli errori di misura Gli errori di misura rendono le variabili misurate delle grandezze stocastiche dotate di una distribuzione di probabilità per cui il valore realmente osservato è solo una “occorrenza” del fenomeno. Il metodo generale per la regressione è il metodo dei minimi quadrati La soluzione ottimale è quella che rende minimo l’errore quadratico. 39 Metodo dei Minimi Quadrati-Least Squares Siano y ed x due grandezze misurabili in relazione funzionale tra loro y k1 k 2 x k3 x 2 k n x n 1 Esempio: polinomio Supponiamo di aver eseguito n misure xi,yi y gx; k1 ,,k m Se non ci fossero errori di misura, la relazione funzionale y=g(x) è esatta, quindi ci sono n equazioni per m incognite yi gxi ; k1 ,,k m N=m il sistema è risolvibile N>m le equazioni eccedenti n=m sono delle identità 40 Errori di misura la relazione funzionale non è esatta e: variabile aleatoria a media nulla yi g x exi ; k1 ,,k m eyi Criterio dei Minimi Quadrati: Tra i valori possibili dei parametri k si scelgono quelli che rendono massima la probabilità degli eventi osservati. Ipotesi 1: L’errore di misura alla risposta del sensore (metodo analitico) è molto più grande dell’errore con cui è nota la sollecitazione (errore di concentrazione nella preparazione degli standards) (Non è sempre vero!) eyi exi Ipotesi 2: la variabile y ha una distribuzione gaussiana con valor medio g(x) e varianza s La probabilità di ogni misura è quindi: 2 y g x i i 1 DPyi exp 2s i2 2s i Ipotesi 3: Gli n eventi osservati (misure) sono indipendenti tra loro (non sempre vero!). 41 La probabilità totale dell’insieme dei dati è quindi il prodotto della probabilità dei singoli eventi: La probabilità totale si chiama funzione di verosimiglianza (L) DP y1 yn n DPyi ,k Lyi ,k i 1 n L y1 yn ,k i 1 yi g x i ,k 1 exp 2s i 2s i2 2 tesi fondamentale dei minimi quadrati: il set di dati ha la probabilità massima. La probabilità massima si ottiene minimizzando la somma degli scarti tra valore ipotetico e misure. max DP max L min n y gx ,k i 1 2s i2 2 i i 42 Ipotesi 4: tutte le misure hanno uguale varianza s s La condizione di minimo si ottiene annullando la derivata rispetto ai singoli parametri funzionali sistema di m equazione in m incognite. n 2 yi gxi ,k1 km k1 i 1 n 2 y g x ,k k i i 1 m k m i 1 43 Minimi quadrati soluzione del caso lineare yi a xi b n xi xyi y a i 1 n n 2 2 xi x yi a xi b 0 a i 1 i 1 n n n 2 2 xi x xi yi y a xi b 0 b i 1 i i 1 i 1 b n 2 xi yi i 1 1 dove x N n 1 xi ; y N i 1 n y ; i i 1 44 Calibrazione su foglio .xls Concentrazione di Fe ppm Assorbanza gruppo 1 Assorbanza gruppo 2 Assorbanza gruppo 3 Media Deviazione Standard CV% 0 -0,032 -0,040 -0,004 -0,036 0,006 -15,7 0,1 -0,021 0,001 0,019 0,010 0,013 127 0,5 0,073 0,074 0,011 14,1 0,163 0,172 0,093 0,162 0,080 1 0,166 0,006 3,32 3 0,577 0,565 0,593 0,578 0,014 2,43 6 1,232 1,182 1,219 1,211 0,026 2,14 10 1,972 1,993 1,950 1,972 0,022 1,09 20 2,000 2,000 2,000 2,000 0,000 0,00 campione 1,084 1,301 1,319 1,235 0,131 10,6 x=(y+0.0341)/0.2068 1,400 Retta di taratura 1,200 1,000 ASSORBANZA y = 0,2068x - 0,0341 R² = 0,9997 0,800 0,600 Assorbanza campione 1,235 mg/L di Fe nel campione 6,14 Fattore di diluizione 1,82 Concentrazione reale di Fe nel campione mg/L 11,2 mg/L di terreno nel campione 1013 % di Fe nel terreno 1,10 0,400 0,200 0,000 0 1 2 3ppm Fe4 5 6 7 Chimica Analitica- STA- Compagnone R2 = coefficiente di determinazione indica la bontà della regressione rispetto al modello. Varia tra 0 e 1; se il numero si avvicina ad 1 il modello è corretto. Nelle regressioni lineari è il quadrato del coefficiente di correlazione R. 45 Correlazione lineare La correlazione è legata alla regressione lineare. In particolare una serie di misure relative a due grandezze assolutamente correlate sono definite come: Y Yi k X i •• • • • •• X Nel caso di correlazione parziale si può scrivere Yi k X i ei Esattamente come nel caso della regressione lineare Y ••• • • •• X La correlazione lineare esprime la deviazione dalla legge di linearità tra Y e X. 46 Coefficiente di correlazione lineare y R ( x x) ( y y ) ( x x) ( y y ) i i 2 i 2 i x Confronto tra 2 metodi analitici 0.90 < r < 0.95 retta (correlazione) discreta 0.95 < r < 0.99 buona r > 0.99 eccellente 47 MATERIALI CERTIFICATI DI RIFERIMENTO materiali di cui è nota la composizione ed è certificata da organismi internazionali vengono usati per la calibrazione dei metodi analitici, per valutare la performance del metodo e per controllare la qualità del dato analitico il loro uso consente una accuratezza migliore CARTE DI CONTROLLO si usano per controllare i risultati delle analisi in un lungo periodo di tempo per evitare l’insorgenza di errori sistematici Chimica Analitica- STA- Compagnone 48 Carta X = media di due ripetizioni Carta R = differenza di due ripetizioni se per due volte di seguito la misura dello standard (o CRM) è fuori dal livello di allarme (p.es. 3s) o se le misure tendono a stare soprattutto da un lato (10-15 volte) bisogna adottare delle procedure per la verifica del metodo Chimica Analitica- STA- Compagnone 49 Validazione “Conferma attraverso l’esame e l’apporto di evidenza oggettiva che i requisiti particolari per l’utilizzazione prevista siano soddisfatti” Quando? un metodo nuovo è sviluppato dal laboratorio normato ma utilizzato al di fuori del proprio scopo e campo di applicazione prefissato (p.es altra matrice) le performances di un metodo devono essere migliorate un metodo deve essere trasferito ad un altro laboratorio Devo confrontare un metodo con un metodo standard Il controllo di qualità non è soddisfacente per tempi lunghi DECISIONE 2002/657/CE Classificazione dei metodi analitici Metodi di conferma I metodi di conferma per i residui o i contaminanti organici forniscono informazioni sulla struttura chimica dell’analita. I metodi basati esclusivamente sull’analisi cromatografica senza l’uso della rivelazione spettrometrica non sono adeguati all’impiego come metodi di conferma senza il ricorso ad altri metodi. Se una singola tecnica non dispone di specificità sufficiente, la specificità desiderata deve essere ottenuta per mezzo di combinazioni di tecniche. Metodi di screening Non danno informazioni strutturali, in caso di non conformità è necessario analizzare il campione con un metodo di conferma PARAMETRI CARATTERISTICI DI UN METODO ANALITICO campo di applicazione (misurando-matrice) selettività-specificità accuratezza (ripetibilità, riproducibilità, esattezza) incertezza limite di rilevabilità (LOD) limite di quantificazione (LOQ) robustezza PROCESSO DI MISURAZIONE UN PROCESSO DI MISURAZIONE È IL PROCEDIMENTO PER IL QUALE, TRAMITE UNA SERIE DI MISURE RIPETUTE, SI RESTITUISCE IL VALORE VERO DELLA MISURA (VALORE SCONOSCIUTO) il valore vero è e resta sconosciuto, il processo di misurazione fornisce semplicemente, tramite l’espressione della media aritmetica la migliore stima del valore vero. Proprio per questo motivo il risultato analitico non è completo ne confrontabile con risultati di altri laboratori o con valori di riferimento, se non è accompagnato da un indicatore che quantifica le performances con il quale è stato ottenuto. per “performances” o qualità si intende la dispersione dei risultati ottenuti nella quantificazione del parametro che stima il valore vero. L’esistenza di un incertezza associata ad una misura, non implica un dubbio sulla validità della misura ma, al contrario, la conoscenza della stessa implica un aumento della significatività e della validità di tutte le informazioni che il risultato fornisce Campo di misura (validità) Intervallo tra il più alto e il più basso livello dell’analita determinabili con precisione ed accuratezza applicando il metodo stesso Il campo di misura (validità) è espresso nella stessa unità di misura dell’analita Dipende dallo scopo del metodo Specificità-Selettività analitica Abilità di misurare accuratamente l’analita in presenza di interferenti Specificità: Si riferisce ad un metodo che produce una singola risposta Selettività: si riferisce ad un metodo che produce più risposte (metodo separativo) Limite di rilevabilità (LdR=3*Sb/S ) • minore quantità di analita che può essere rilevata, ma non necessariamente determinata quantitativamente, nelle condizioni sperimentali del metodo, dipende dall’errore strumentale Sb = deviazione standard del valore del bianco (almeno 5 campioni) S =coefficiente angolare della curva di taratura Limite di quantificazione Minore concentrazione analitica che può essere determinata quantitativamente con accettabile precisione ed esattezza nelle condizioni sperimentali del metodo LdQ = 10*Sb/S Esattezza Grado di concordanza tra il valore medio ottenuto a partire da un grande insieme dì risultati di prova, e un valore dì riferimento accettato Confronto con un metodo analitico di ordine metrologico superiore Analisi di idonei materiali di riferimento certificati a diversi livelli di concentrazione Confronto con i valori attesi in studi collaborativi (circuiti interlaboratorio) Analisi di idonei campioni costruiti aggiungendo alla matrice quantità certificate di analita (Spike) a diversi livelli di concentrazione Ripetibilità concordanza tra risultati di prova indipendenti ottenutì con lo stesso metodo su materiali ídentici, nello stesso laboratorio, dallo stesso operatore, usando la stessa apparecchiatura e in intervalli di tempo brevi (stessa serie analitica) Riproducibilità concordanza tra risultati di prova indipendenti ottenuti con lo stesso metodo su materiali identici, in laboratori diversi, da operatori diversi, usando apparecchiature diverse e in intervalli di tempo diversi Robustezza Insensibilità a piccole variazioni dei parametri sperimentali Variazioni deliberate % solventi organici pH temperatura Flusso Incertezza di misura ….esplicitare l'intervallo di incertezza relativo ad una misura fornisce un'indicazione sulla qualità del risultato analitico presentato e sulle prestazioni del laboratorio per quel tipo di prova. Questa informazione può essere utilizzata dall'utente per decidere se affidare o meno la misura al laboratorio in funzione delle proprie esigenze analitiche. Ad esempio, un cliente che abbia la necessità di verificare la presenza di un inquinante in tracce nella merce di sua produzione, e verificarne la conformità con le normative vigenti, sarà orientato verso un laboratorio che effettui la misura con un intervallo di incertezza ristretto. Un altro può avere l'esigenza di controllare “grossolanamente” un parametro (ad esempio un controllo di qualità o un parametro indicatore specifico di un processo industriale ecc.) ritenendo sufficiente affidare la prova ad un laboratorio che indichi un risultato analitico con un intervallo di incertezza piuttosto largo. Tali argomentazioni concordano con i principi del libero mercato con cui il legislatore si è ispirato nella stesura delle normative di settore, sfociate poi con l'emanazione delle norme ISO 9000 ed UNI CEI 45000….. S.De Martin, C.Del Bianco; Boll.Chim.Igien. vol.52 (2001) Incertezza di misura stima legata ad un risultato di prova che caratterizza l'escursione dei valori entro cui si suppone che cada il valore vero del misurando - Ha le dimensioni di uno scarto tipo (deviazione standard) e si indica con ”U"
