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Determinazione dei livelli serici di Leptina, Grelina e Obestatina in pazienti Down: Studio
Preliminare
INTRODUZIONE
Alterazioni in termini di bilancio energetico, comportamento alimentare e la conseguente elevata
frequenza di obesità sono caratteristiche distintive di varie sindromi genetiche. Recentemente sono
stati scoperti tre ormoni, la leptina, la grelina e l’obestatina, che intervengono nel regolare
l’omeostasi energetica e sono correlati con le alterazioni ponderali e staturali del bambino. La
leptina è secreta in misura maggiore dagli adipociti, ed esplica la propria azione grazie
all’interazione con specifici recettori localizzati a livello ipofisario, regolando il peso corporeo
(1,2). L’ormone grelina, prodotto dalle cellule giacenti a livello del fondo gastrico, agisce
stimolando l’appetito tramite l’interazione con specifici recettori localizzati a livello ipotalamico
(3). Il gene che codifica per l’ormone grelina interviene nella codifica di un secondo ormone
“obestatina”, che tuttavia esplica un’azione opposta a quella esercitata dall’ormone grelina (4). La
valutazione dei livelli sierici di leptina e ghrelina è stata effettuata in soggetti con la sindrome di
Prader-Willi e la leptina nella sindrome di Turner. Da una valutazione della letteratura si evince che
solo due lavori hanno valutato i livelli sierici di leptina e ghrelina nei soggetti con sindrome di
Down (SD), mentre l’obestatina non è mai stata dosata. Il ruolo di tali ormoni nella sindrome di
Down potrebbe essere correlato all’elevata incidenza di sovrappeso ed obesità.
Lo scopo di tale studio è quello di valutare i livelli sierici di leptina, grelina e obestatina in pazienti
pediatrici con sindrome di Down, per approfondire i meccanismi patogenetici dell’aumentato
rischio di obesità, al fine di migliorare la qualità di vita di tali pazienti sindromici, riducendo le
complicanze a lungo termine.
MATERIALI E METODI
Abbiamo reclutato 8 bambini con sindrome di Down di età compresa tra 2-10 anni (età media 5,3
anni), 5 di sesso maschile e 3 di sesso femminile, prepuberi. La metà presentava una cardiopatia
congenita, sottoposta o meno a trattamento chirurgico.
Il 70% era affetto da ipotiroidismo subclinico, non sottoposti a terapia sostitutiva. I soggetti presi in
esame presentavano un BMI nella norma compreso tra 18-20 così come il gruppo controllo,
pertanto bambini normopeso.
La diagnosi di Sindrome di Down è stata confermata dall’esame citogenetico, con riscontro di
trisomia 21 libera. Tutti i soggetti in studio venivano seguiti in follow up presso la UOC di Genetica
ed Immunologia Pediatrica di Messina.
I criteri di esclusione:
1) patologia neoplastica, inclusa la leucemia;
2) resezione intestinale.
E’ stato raccolto il consenso informato da parte dei genitori, in modo da approvare ed iniziare lo
studio sperimentale.
Sono stati valutati gli indici antropometrici: peso, altezza, BMI, ottenuto dividendo il peso in
chilogrammi per altezza in metri quadri.
Il gruppo di controllo era costituito da 10 bambini (4 femmine e 6 maschi, età media 5.7 anni).
Il dosaggio sierico degli ormoni leptina, grelina e obestatina è stato effettuato mediante ELISA.
Sono stati raccolti campioni di sangue periferico in provette eparinate sia dai soggetti sani che dai
pazienti affetti da SD. Il siero è stato raccolto dopo una centrifugazione delle provette e conservato
a – 70*C. Il test ELISA è specifico e sensibile: un anticorpo è coattato sui pozzetti di una
micropiastra. I reagenti standard ed i campioni si depositano nelle wells e l’ormone in essi
contenuto si lega all’anticorpo coattato. Dopo un periodo di incubazione e dei lavaggi con apposito
tampone salino, si procede ad aggiungere un anticorpo umano biotinilato: si crea così una struttura
a sandwich del tipo anticorpo-antigene- anticorpo. Successivamente si aggiunge una perossidasi
marcata con perossidasi di rafano, si lascia incubare, si rimuove l’eccesso col lavaggio e viene
dispensato il substrato TMB nei pozzetti. L’incubazione col substrato si effettua al riparo da
sorgenti luminose. La reazione prodotta dal complesso perossidasi-TMB è colorimetrica: si
evidenzia una miscela blu. Depositando una stop solution si avrà il viraggio dal blu al giallo. A
questo punto si effettuerà la lettura col lettore per piastra ELISA a 450 nm. Si avranno così dei dati
che rielaborati dal software indicheranno la concentrazione degli ormoni in correlazione alla densità
ottica misurata.
I dati statistici sono stati sintetizzati indicando il valore della media e della deviazione standard per
ogni parametro indicato ed elaborati con l’ausilio del test t student. Sono stati ritenuti significativi
valori in cui la variabile P calcolata dal confronto tra il gruppo controllo e quello dei pazienti per
ciascun dosaggio assumeva valori inferiori a 0,01 (P< 0,01).
RISULTATI
Il dosaggio sierico degli ormoni nel nostro campione di soggetti con Sindrome di Down ha mostrato
i seguenti valori espressi in media ± deviazione standard: leptina: 8.94 ± 5.18 pg/ml; grelina: 485.19
± 32.38 pg/ml); obestatina 196.82 ± 11.6 pg/ml.
I livelli sierici degli ormoni, espressi in media ± deviazione standard, nella popolazione di controllo
erano i seguenti: leptina: 8.31 ± 2.49 pg/ml; ghrelina: 482.6 ± 34.5 pg/ml); obestatina 201.7 ± 11.4
pg/ml.
Nel nostro studio non abbiamo individuato variazioni statisticamente significative dei livelli sierici
di leptina, ghrelina e obestatina nei soggetti con SD (p>0.05).
MEDIA
DS
CV
DEVIANZA
DISCUSSIONE
Leptina
(controlli)
8,31
2,49186
29,98629
117,978
Leptina
(Down)
8,94
5,183618
57,9823
510,528
Grelina
(controlli)
482,635
34,5211
7,152632
22642,43
Grelina
(down)
485,19
32,38352
6,6744
19925,16
Obestatina
(controlli)
201,741
11,46371
5,682389
2496,915
Obestatina
(Down)
196,82
11,6037
5,895591
2558,272
In letteratura sono stati riportati diversi studi sul ruolo della leptina, grelina e obestatina nel regolare
l’omeostasi energetica e l’assunzione del cibo. E’ noto che i suddetti ormoni intervengono nel
complesso network neuroendocrino alla base della patogenesi della obesità. La leptina è un
importante regolatore anoressizzante, che circola in due forme: quella libera, attiva, e la forma
frazionata, legata al recettore della leptina solubile, la cui biodisponibilità partecipa anche nel
regolare la sua azione. Studi recenti condotti su uomini obesi e non-obesi hanno dimostrato una
correlazione positiva tra concentrazioni seriche di leptina e percentuale di grasso corporeo e la
maggiore presenza di ob-mRNA nel tessuto adiposo di soggetti obesi a confronto con individui
snelli (5). In realtà, l’aumento volumetrico degli adipociti a causa dell’accumulo di trigliceridi
stimola la produzione e secrezione di leptina, che segnala al cervello le condizioni attuali
nutrizionali del corpo. Esperimenti condotti sull’animale e sull’uomo, sia mediante clonazione del
gene (ob) sia mediante somministrazione di leptina, hanno dimostrato la drammatica riduzione
nell’assunzione di cibo e la riduzione del peso corporeo fino al 50% dopo un mese di cura (5). La
grelina è coinvolta in reti neuroendocrine che regolano il bilancio energetico in almeno due modi:
1) come un ormone periferico secreto dallo stomaco che, insieme ad altri segnali, come l'insulina,
informa il SNC della riduzione delle riserve energetiche al fine di aumentare lo stimolo oressigenico
e ridurre il dispendio energetico 2) come un neuropeptide ipotalamico che potrebbe svolgere un
ruolo complementare nella regolazione dell’omeostasi energetica (6,7). Studiando la sintesi della
grelina, si è scoperta la presenza di un’altra proteina della quale si ignorava l’esistenza: l’obestatina,
coinvolta nel network neuroendocrino che regola il bilancio energetico. Alcuni ricercatori hanno
somministrato l’obestatina a topi di laboratorio. In seguito all’iniezione di ormone nell'addome e nel
cervello, i topi hanno dimezzato la quantità di cibo ingerita e hanno smesso di guadagnare peso.
L’obestatina è sintetizzata dalla medesima sequenza genica della grelina, ma con funzioni opposte:
l’obestatina è infatti una sorta di anti-grelina (4).
L’introduzione di cibo comporta un incremento delle scorte adipose ed un incremento della
secrezione di leptina, che riduce il senso della fame e aumenta la spesa energetica (termogenesi
adattativa), mantenendo il peso corporeo. Al contrario, il digiuno comporta una riduzione delle
scorte adipose ed una riduzione della secrezione di leptina, con aumento del senso della fame e
diminuzione della spesa energetica, ed aumento del peso corporeo. Nel soggetto obeso esistono
elevati livelli di leptina, che non influenzano lo stato delle riserve energetiche. Questo ha portato
alla formulazione del termine leptino-resistenza (concetto analogo a quello di insulino-resistenza),
per cui non funziona più il meccanismo di controllo delle riserve di grasso. Nonostante non si
conoscano ancora con precisione i meccanismi che portano a tale degenerazione è possibile
affermare che esistono forti evidenze a supporto del fatto che soggetti in sovrappeso e affetti da
obesità diventino leptino-resistenti (8). I livelli di ghrelina sono aumentati in alcune condizioni
morbose quali l’anoressia nervosa, la cachessia cardiaca e tumorale, il diabete mellito di tipo I o
ancora il grelinoma (carcinoide intestinale). Al contrario, i livelli ematici di ghrelina risultano ridotti
in condizioni quali l’obesità, la gastrectomia totale, il by-pass gastrico, l’ipertiroidismo e la
sindrome di Cushing. In tutte le forme di obesità i livelli di grelina risultino ridotti (9).
Diversi autori hanno ipotizzato e studiato il coinvolgimento di tali ormoni nella patogenesi
dell’obesità in bambini affetti da sindromi genetiche, tra cui Prader Willi e sindrome di Down.
Numerosi sono gli studi effettuati su bambini affetti da sindrome di Prader Willi, nella quale
l’obesità è un segno clinico maggiore e patognomonico, secondario ad una condizione di iperfagia.
In tali soggetti la leptina si presenta aumentata, mentre la grelina è ridotta. E’ interessante notare
come in tutte le forme di obesità i livelli di grelina risultino ridotti ad esclusione della sindrome di
Prader-Willy (9). In un recente studio condotto su 40 bambini dai 2 mesi ai 17 anni affetti da
Sindrome di Prader-Willy si è osservato come i livelli plasmatici di grelina risultavano essere
aumentati in ogni fascia di età, anche durante il primo anno di vita, e comunque anche prima che
questi soggetti sviluppassero obesità (10). E’ stato ipotizzato che l’aumento della grelina sia alla
base della iperfagia del soggetto con sindrome di Prader-Willi e che l’obesità sia una sua
conseguenza. In letteratura, la valutazione dei livelli sierici di leptina e grelina nei soggetti con
sindrome di Down è stata effettuata solo in due lavori. Proto C e collaboratori nel 2007 hanno
effettuato uno studio su 7 donne obese affette da sindrome di Down, 5 donne obese affette da
sindrome di Prader Willi, 7 donne obese e 7 di peso normale sane. I soggetti con sindrome di Prader
Willi hanno mostrato valori di leptina corrispondenti al loro grado di obesità, i soggetti con
sindrome di Down invece livelli di leptina ridotti. Gli autori ipotizzano che i soggetti con sindrome
di Down potrebbero avere un difetto nella secrezione della leptina, che spiegherebbe in parte
l’obesità in tale sindrome (11). Lo studio di leptina e grelina nei bambini con Sindrome di Down è
stato effettuato solo in un lavoro del 2008. Gli autori hanno valutato le concentrazioni sieriche di
questi ormoni in 35 bambini prepuberi con Sindrome di Down, evidenziando un aumento
statisticamente significativo della leptina, che si comporterebbe come nei bambini obesi, associata
positivamente alla percentuale di grasso corporeo. Nei bambini con sindrome di Down la
correlazione con il grasso corporeo è comunque maggiore dei bambini obesi di controllo. Mentre i
livelli di grelina non mostrano variazioni significative, l’aumento della leptina è segno di leptinoresistenza presente nei bambini con Sindrome di Down, che presentano una nota predisposizione
alla obesità. Considerando che tale studio è stato condotto tra fratelli e che bambini con Sindrome di
Down hanno tre copie del cromosoma 21, gli autori ipotizzano che l’alterazione genetica di base
potrebbe spiegare la resistenza leptinica più severa. (12)
A differenza di quanto riportato dagli autori precedenti, i dati preliminari del nostro studio
evidenziano livelli sierici di leptina, grelina e obestatina non significativamente alterati rispetto al
gruppo controllo. Tale evidenza supponiamo sia correlata al fatto che i nostri bambini prepuberi con
SD erano normopeso. Ci sembra verosimile ritenere che il bambino affetto da Sindrome di Down
tende a mimare il comportamento di un bambino con normale corredo cromosomico, i cui livelli di
grelina, leptina, obestatina, sono direttamente correlati alla quantità di grasso corporeo e pertanto al
BMI del soggetto, senza una leptina resistenza che potrebbe essere geneticamente predeterminata.
E’ verosimile che l’aumentata incidenza di obesità nei bambini con SD non sia influenzata da
alterazioni del network neuroendocrino che regola il bilancio energetico, ma da una non corretta
educazione nutrizionale associata ai problemi cognitivo-comportamentali propri della sindrome. La
normalità del BMI e dei risultati nel nostro campione di soggetti con sindrome di Down supportano
l’osservazione che una corretta presa in carico, un periodico follow up ed una sensibilizzazione
positiva dei genitori di questi soggetti permette di prevenire le complicanze e migliorarne la qualità
di vita. Questi dati preliminari comunque necessitano di ulteriori conferme su un campione più
ampio.
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