PROTOCOLLO DEL PROGETTO DI RICERCA
Titolo
Diagnosi differenziale di albinismo oculare ed oculocutaneo nella popolazione
italiana: percorso diagnostico multidisciplinare e caratterizzazione genetica
mediante lo studio molecolare dei geni noti associati
Descrizione
L’Albinismo è una patologia rara (RCG040) caratterizzata da un’assenza o da una riduzione della
biosintesi di melanina, associata a ipopigmentazione generale ed a specifiche alterazioni oculari,
quali ridotta acuità visiva, nistagmo, traslucenza iridea, fondo ipopigmentato e fovea ipoplastica,
derivanti da riduzione di pigmento durante lo sviluppo dell’occhio. L’incidenza media mondiale è di
1/17.000.
Questa malattia comprende differenti forme patologiche dovute a difetti distinti del “pathway” di
biosintesi della melanina. Il fenotipo albino è anche presente in alcune sindromi tra cui la sindrome di
Hermansky-Pudlak la cui manifestazione clinica nei primi anni di vita è sovrapponibile a quella della
patologia oculocutanea.
L’ Albinismo Oculocutaneo (OCA) viene classificato in tirosinasi-negativo e tirosinasi-positivo. L’ OCA
tirosinasi - negativo è caratterizzato da completa assenza di pigmento e viene indicato come sottotipo
OCA1A. L’OCA tirosinasi – positivo è invece caratterizzato da riduzione nella pigmentazione dovuta a
deficit parziale del metabolismo della melanina. Mutazioni in diversi loci genici sono state associate ai
differenti sottotipi tirosinasi–positivo:OCA1B , OCA2, OCA3 ed OCA4.
La forma OA presenta una ridotta sintesi di melanina solamente nell’epitelio pigmentato della retina
senza coinvolgimento di ipopigmentazione cutanea o pilifera.
L’Albinismo Oculocutaneo di tipo 1 (OCA1) ha una prevalenza di circa 1:40.000 nella maggior parte
della popolazione. E’ causato da alterazioni nel gene della tirosinasi (TYR), localizzato sul
cromosoma 11q14.2 e composto da 5 esoni. Mutazioni inattivanti la proteina determinano il sottotipo
tirosinasi-negativo, mentre mutazioni missense che determinano un’attività residua variabile dal 1 al
10% sono associate alla forma tirosinasi-positivo OCA1B con ampia variazione del fenotipo.
La prevalenza di OCA2, associata a difetti del gene P, è circa 1:36.000 negli USA ma è circa
1:10.000 tra gli Afro-Americani. In alcuni punti del Sud dell’Africa gli affetti sono 1:3.900. Il gene P sito
nella regione 15q11.2-q12, è composto da 24 esoni e codifica per una proteina integrale di membrana
nei melanosomi. La mutazione più comune è una delezione di 2.7 kb del gene P.
La forma OCA3, (sottotipo Rufous) , mostra una prevalenza nella popolazione Africana di 1:8.500
individui, mentre è rara e poco studiata tra la popolazione Caucasica e tra quella Asiatica. E’ causata
da mutazioni nel gene TYRP1 (Tyrosine-related protein 1), localizzato sul cromosoma 9p23 e
composto da 8 esoni.
Mutazioni nel gene MATP, mappato sul cromosoma 5p13.3 e composto da 7 esoni, causa la forma
OCA4. Sono state riscontrate alterazioni in questo gene in circa 5-8% dei pazienti tedeschi affetti da
Albinismo e nel 18% dei pazienti giapponesi. Il suo prodotto è una Proteina associata ad un
Trasportatore di Membrana.
L’Albinismo Oculare di tipo 1 (OA1) ha una segregazione X-linked ed una prevalenza di 1:50.000
negli USA. Questa patologia è causata da mutazioni nel gene GPR143, localizzato sul cromosoma
Xp22.3, composto da 9 esoni ed espresso nella pelle e nelle cellule dell’epitelio pigmentato della
retina, nelle quali i melanosomi sono più grandi del normale.
L’iter diagnostico della patologia comprende la visita oculistica pediatrica in seguito al riscontro del
sintomo più evidente quale il nistagmo, la consulenza genetica, la visita dermatologica ed il test
molecolare. Nelle forme di OCA tirosinasi positive, per poter fare una diagnosi differenziale nei
confronti della sindrome di Hermansky-Pudlak, il test di aggregazione piastrinica potrebbe identificare
forme non pure di albinismo oculocutaneo.
Orphanet Database.
http://www.orpha.net/data/prj/ID91149IT.pdf
Stato dell’arte
Attualmente non esiste un centro di riferimento nazionale in cui si possa offrire a questi pazienti un
piano diagnostico adeguato e completo e in cui si effettuino tutte le indagini genetiche ad oggi
possibili per la caratterizzazione dei pazienti albini in Italia.
Nel laboratorio di Genetica Medica della nostra Azienda attualmente si analizzano, mediante
sequenziamento di quattro dei cinque geni noti, pazienti che provengono dall’Oculistica Pediatrica
dell’A.O. Niguarda Ca’ Granda di Milano e da diversi centri di oculistica e di consulenza genetica sul
territorio italiano. Per tutti viene redatto e firmato, dopo colloquio di consulenza genetica, un consenso
informato a cui segue un prelievo di sangue periferico. La popolazione dei pazienti è per la maggior
parte formata da bambini inferiori ai cinque anni d’età e quindi, là dove possibile, si effettua anche il
prelievo ai genitori dell’affetto per eventuali controlli successivi alla conferma dei risultati. Fra i
pazienti ad oggi analizzati per il gene TYR (la maggior parte di origine caucasica), il 38% sono
portatori di mutazioni, di cui 30% OCA1A. Nessuno dei soggetti indagati è portatore della delezione
dell’esone 7 del gene P. Nel 20% dei pazienti è stato analizzato il gene TYRP1 ed in un bimbo
nigeriano è stata identificata una mutazione nonsenso, mentre un paziente italiano si è rivelato
eterozigote composto per due mutazioni.
Fra i casi irrisolti, la compatibilità con una segregazione X-linked presente nel 6% dei casi è stata
verificata mediante l’analisi del gene GPR143, che ci ha permesso di individuare in un paziente una
delezione dell’esone 2. Tale delezione è stata ulteriormente verificata mediante analisi
semiquantitativa nella madre portatrice.
Materiali e Metodi
I pazienti devono inizialmente essere sottoposti alla visita clinica e strumentale presso l’Oculistica
Pediatrica per l’identificazione dei segni clinici caratteristici della patologia. Successivamente viene
effettuata la consulenza genetica, la firma del consenso informato ed il prelievo ematico. I pazienti
sono quindi visitati dal dermatologo che afferisce al Dipartimento di Medicina dell’Azienda. Tutti i
campioni raccolti verranno sottoposti al test di aggregazione piastrinica per la diagnosi differenziale
ed all’estrazione del DNA genomico tramite estrattore automatico. I geni TYR, P, TYRP1 e GPR143
sono amplificati con primers specifici e sequenziati direttamente su entrambe le catene di DNA con
un sistema di sequenziamento automatizzato. Nel caso di geni che presentano un numero di esoni
superiore ai 10, si utilizza lo strumento DHPLC per effettuare uno screening delle eventuali mutazioni
geniche.
Il gene TYR viene indagato in tutti i pazienti, ad eccezione di quelli che presentano un fenotipo
compatibile con una segregazione X-linked. Nei soggetti negativi o che presentano una sola
mutazione in questo gene, si procede all’analisi della delezione dell’esone 7 del gene P e in alcuni
soggetti anche a quella del gene TYRP1. Nei soggetti di sesso maschile compatibili con una
segregazione X-linked, si procede all’indagine del gene GPR143.
SCOPO del PROGETTO
Lo scopo primo è di offrire ai pazienti albini un percorso diagnostico completo (oculista, genetista,
dermatologo, ematologo, genetista di laboratorio) senza dover ricorrere a più strutture specialistiche
in diverse Aziende. Il test di aggregazione piastrinica permetterà nei casi positivi di indirizzare il
paziente anche ad un follow-up ematologico con le adeguate terapie necessarie. Inoltre poiché i
differenti tipi di Albinismo Oculo/Oculocutaneo sono causati da mutazioni in diversi geni, ma il
fenotipo non è sempre distinguibile, l’analisi molecolare completa dei geni ad oggi conosciuti e la
consulenza genetica forniscono un utile strumento di esaustiva diagnosi. Uno degli scopi del
seguente progetto è di continuare la diagnosi dei pazienti irrisolti e dei successivi, mediante l’analisi di
tutti i geni coinvolti nell’Albinismo Oculare ed Oculocutaneo, compresi tutti gli esoni del gene P ed il
gene MATP.
Questo servizio, mirato alla creazione di un unico centro di diagnosi per l’Albinismo, che
accorperebbe la parte oculistica con quella dermatologica e genetica, evitando al paziente il
peregrinare per laboratori diversi permetterà una valutazione epidemiologica molecolare
dell’albinismo in Italia ed una valutazione genotipo/fenotipo .
Orphanet Database.
http://www.orpha.net/data/prj/ID91149IT.pdf
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Protocole d`essai clinique