Stefania Comes - IGB-CNR

Stefania Comes
Tecnica che permette di analizzare la presenza di carboidrati e proteine/peptidi
in cellule mediante il legame di un anticorpo con specifici epitopi
Analisi fenotipica di una popolazione cellulare
Per rivelare il legame antigene-anticorpo esistono:
Metodi
diretti
indiretti
AbII
AbI
epitopo
M
Marcatore (Enzima, fluorocromo, etc)
AbI
epitopo
Fluorocromo
Composto policiclico aromatico con
estesa coniugazione di doppi legami
Fluoresceina
FITC
Texas red
Loss of Energy
2
Excitation
Emission
1
3
Emitted light
Stato elettronico fondamentale
Alexa fluor 594
λecc = 590 nm
λem = 617 nm
Emette nel rosso
+ fotostabile del texas red
Alexa fluor 488
λecc = 494 nm
λem = 517 nm
Emette nel verde
+ fotostabile del FITC
mESCs (TBV) su feeder
OCT4
SSEA-1 (antigene embrionale stadio specifico 1)
L’epitopo SSEA-1 è
espresso nelle mESCs
ma non nelle hESCs
SSEA-1/DAPI
Differenziamento cardiaco
in goccia pendente
(Hanging Drop Method)
t0
days
t7-t9
Marker di
pluripotenza
OCT4
SSEA-1
Inizio attività contrattile
t13
α-actinina
α -tropomiosina
α/β MHC
MLC2 a/v
α-tropomiosina /DAPI
MHC/DAPI
10x
20x
α-actinina/DAPI
40x
t0
t2-4
t8
t12
days
Nestina
β III-tubulina
NF-M (neurofilamento-subunità media)
NF-L (neurofilamento-subunità leggera)
Markers neuroni
GFAP (proteina fibrillare acida della glia)
Marker glia
GFAP/DAPI
10x
βIII tubulina /DAPI
8°giorno differenziamento
20x
40x
13° giorno differenziamento
astrociti
12° giorno differenziamento
neuroni
Immunofluorescenze doppie
Nestin/NF-M/DAPI
10x
8°giorno differenziamento
βIII tub/GFAP/DAPI
20x
13°giorno differenziamento
AbI: monoclonale anti- Nestin/
Ab II: anti-mouse red Alexa fluor 594
AbI: monoclonale anti- β III tubulina/
Ab II: anti-mouse red Alexa fluor 594
AbI: policlonale anti – NF-M/
Ab II: anti-rabbit green Alexa fluor 488
AbI: policlonale anti- GFAP/
Ab II: anti-rabbit green Alexa fluor 488
13°giorno di differenziamento
• Fissazione (Para 4%, metanolo/acetone)
• Permeabilizzazione (metanolo/acetone, Triton X-100, Tween-20)
• Mascheramento siti aspecifici (BSA, NGS..)
• Incubazione Ab primario
• Incubazione Ab secondario coniugato con fluorocromo
• Colorazione dei nuclei con DAPI
Cellule indifferenziate
OCT4 e SSEA-1
Differenziamento cardiaco 12gg
Differenziamento neurale 12gg
MHC (catena pesante della miosina)
NF-M (Neurofilamento- subunità media)