METODI ALTERNATIVI
PER LA VALUTAZIONE DI :
IRRITAZIONE OCULARE,
IRRITAZIONE CUTANEA
E FOTO-TOSSICITA’
Marisa Meloni
CONTESTO NORMATIVO ed
utilizzo delle ALTERNATIVES
• COSMETICO
• REACH
• FARMACEUTICO
• DISPOSITIVI MEDICI
IRRITAZIONE
CUTANEA e OCULARE
FOTO-TOSSICITA’
• Protocolli
• Parametri
• Interpretazioni
• Sistema di Qualità-GLP
SITOX 5 GIUGNO 2012
CONTESTO NORMATIVO : COSMETICO
DIVIETO DI TEST SU ANIMALI
DIVIETO DI TEST SU ANIMALI
- Prodotti cosmetici finiti
- Ingredienti
nei casi in cui i Metodi Alternativi sono
a) convalidati
b) previsti dalla legislazione EU
Tutti gli endpoints
di Sicurezza per l’uomo
per i quali sono disponibili
Metodi Alternativi
2009
2004
2013
DIVIETO DI COMMERCIALIZZARE
- Prodotti cosmetici finiti
testati su animali
- Ingredienti testati su animali
nei casi in cui i Metodi Alternativi sono
a) convalidati
b) previsti dalla legislazione EU
Endpoints di
Sicurezza per l’uomo
con l’eccezione di
• Tossicità ripetuta
• Carcinogenesi
• Sensibilizzazione
• Tossicità riproduttiva
• Tossico-cinetica
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CONTESTO NORMATIVO : CHIMICO
"
"
"
"
"
&
Regolamento REACH :1° Giugno 2008
Innocuità per uomo ed ambiente
Lista di saggi : Allegati VII-X-XI
Concetto di metodi idonei = Suitables
Elaborati sufficientemente bene secondo criteri per lo sviluppo di test
riconosciuti a livello internazionale per l immissione di un saggio nel processo
di pre-convalida
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CONTESTO NORMATIVO :
FARMACEUTICO
"
"
"
"
Nessun obbligo Normativo cogente
Esigenza per Hazard identification e Safety
Pre-clinica : in aumento
Articolo 47, DIRETTIVA 2010/63/UE del
22.09.2010
"
La Commissione e gli Stati membri contribuiscono allo sviluppo e alla
convalida di approcci alternativi idonei a fornire lo stesso livello, o un
livello più alto d informazione di quello ottenuto nelle procedure che usano
animali, ma che non prevedano l uso di animali utilizzino un minor
numero di animali o che comportino procedure meno dolorose, e prendono
tutte le misure che ritengono opportune per incoraggiare la ricerca in
questo settore.
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I metodi alternativi convalidati :
dove non sono applicabili
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METODO ALTERNATIVO
LINEA GUIDA
(inclusi in Annex V,
Direttiva 67/548/EEC)
CLASSIFICAZIONE
Local Lymph Node Assay for
skin sensitization (LLNA)
OECD TG 429
(Luglio 2010)
SENSIBILIZZANTE
H317 (EU CLP)
3T3 NRU phototoxicity test
OECD TG 432
(Aprile 2004)
FOTOTOSSICO
(PIF !5; MPE ! 0,1)
SKIN CORROSIVITY TEST
EpiSkinTM / EpiDermTM /
Skinethic
OECD TG 431
(Aprile 2004 /Novembre
2006/Giugno 2009)
CORROSIVO
R35 e R34 (EU DSD)
H314 (EU CLP)
Rat TER skin corrosivity test
OECD TG 430
(Aprile 2004)
CORROSIVO
R35 e R34 (EU DSD)
H314 (EU CLP)
SKIN IRRITATION TEST
EpiSkinTM / EpiDermTM /
Skinethic
OECD TG 439
(Luglio 2010)
IRRITANTE CUTANEO
R38 (EU DSD)
H315 (EU CLP)
In vitro tests for
percutaneous absorption
OECD TG 428
(Aprile 2004)
Bilancio di Massa dell’attivo
100% ± 10%
In vitro Genotoxicity Tests
OECD TG 471, 473, 476
etc.
GENOTOSSICO
In Vitro Mammalian Cell
Micronucleus test
OECD TG 487
(Luglio 2010)
GENOTOSSICO
EU DSD (European Dangerous Substances Directive)
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SISTEMI DI CLASSIFICAZIONE
EU DSD = EUROPEAN DANGEROUS SUBSTANCES DIRECTIVE
EU CLP = EUROPEAN REGULATION 1272/2008
for CLASSIFICATION, LABELLING & PACKAGING
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IRRITAZIONE CUTANEA :OECD TG439
ALTERNATIVA DI SOSTITUZIONE DEL
DRAIZE RABBIT TEST:
OECD TG404 ACUTE DERMAL IRRITATION
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DESCRIZIONE
IRRITAZIONE PRIMARIA CUTANEA
OBIETTIVO
Alterazioni reversibili della pelle in seguito ad
applicazione acuta
STATO
Alternativa di sostituzione convalidata
OECD 439
MODELLO BIOLOGICO
EPIDERMIDE RICOSTRUITA (3 diversi
protocolli)
ENDPOINT IN VIVO
ALTERAZIONE DELLA FUNZIONE BARRIERA,
ROSSORE, EDEMA
ENDPOINT IN VITRO
VITALITA’ CELLULARE con test MTT
CAMPO DI APPLICAZIONE
TUTTI INGREDIENTI
ECCETTO AEROSOL /GAS
IMPIEGO NELLA VALUTAZIONE
HAZARD IDENTIFICATION
R38 (EU DSD) / H315 (EU CLP)
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METODO
IRRITAZIONE PRIMARIA CUTANEA
MODELLO BIOLOGICO
EPISKIN
CONTROLLO POSITIVO
SDS 5% con RIDUZIONE 80 % VITALITA’
DS < 18%
CONTROLLO NEGATIVO
PBS
TEMPO DI CONTATTO
15MIN + 42 H POST INCUBAZIONE
ENDPOINT IN VITRO
VITALITA’ CELLULARE -MTT TEST
MODELLO PREDITTIVO
> 50% VITALITA’ = NON IRRITANTE (NI)
In caso di valori borderline e se 50%
IL-1! RILASCIATA < 50 pg/mL (NI)
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METODO
IRRITAZIONE PRIMARIA CUTANEA
MODELLO BIOLOGICO
RHE SKINETHIC
CONTROLLO POSITIVO
SDS 5%
CONTROLLO NEGATIVO
PBS
PROTOCOLLO
42 min + 42H POST INCUBAZIONE
ENDPOINT IN VITRO
VITALITA’ CELLULARE- MTT TEST
MODELLO PREDITTIVO
> 50% VITALITA = NON IRRITANTE (NI)
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METODO
IRRITAZIONE PRIMARIA CUTANEA
MODELLO BIOLOGICO
EPIDERM
CONTROLLO POSITIVO
TRITON 1%
CONTROLLO NEGATIVO
PBS
PROTOCOLLO
60 min + 42H POST INCUBAZIONE
ENDPOINT IN VITRO
VITALITA’ CELLULARE MTT - ET 50
MODELLO PREDITTIVO
> 50% VITALITA = NON IRRITANTE (NI)
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3 METODI A CONFRONTO
ESAC
Replacement of
Draize test for skin irritation:
Cat2/No cat
(EU TM B.46 & OECD TG 439)
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CORROSIVITA CUTANEA:
OECD TG 431
OECD TG 430 ….
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DESCRIZIONE
CORROSIVITA’ CUTANEA
OBIETTIVO
Alterazione irreversibile conseguente
all’applicazione acuta
STATO
Alternativa di sostituzione OECD 431
MODELLO BIOLOGICO
• EPIDERMIDE RICOSTRUITA
• PELLE RATTO
ENDPOINT IN VIVO
Perdita FUNZIONE BARRIERA
ENDPOINT IN VITRO
VITALITA’ CELLULARE /TEER
CAMPO DI APPLICAZIONE
INGREDIENTI (specifiche)
IMPIEGO NELLA VALUTAZIONE
HAZARD IDENTIFICATION
R35 E R34 (EU DSD) / H314 (EU CLP)
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IRRITAZIONE OCULARE
TG OECD 405 IN VIVO DRAIZE TEST (RABBIT)
Eye irritation: is the production of changes in the eye
following the application of a test substance to the anterior
surface of the eye, which are fully reversible within 21 days of
application.
EU classification:
• NI
= non-irritant
• R36 (EU DSD)/ CAT 2 (EU CLP) =
irritating to eyes
• R41 (EU DSD)/ CAT 1 (EU CLP) =
risk of serious damage to eyes
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Replacement Alternatives:
ESAC statement April 2007
and ICCVAM retrospective validation
Classification!"!Severe (R41)/ Irritants (R36)!!
•
•
BCOP : BOVINE CORNEAL OPACITY and PERMEABILITY
ICE : ISOLATED CHICKEN EYE!&
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Irritazione oculare
• BCOP ed IRE applicabili solo per
classificazione R41: distinzione tra
fortemente irritanti ed irritanti
• Pre-convalida su Human Corneal
Epithelium sponsorizzata da Colipa per
discriminare tra irritanti e non irritanti (dal
2008).
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IRRITAZIONE OCULARE :HCE MODEL
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METODO
MODELLO BIOLOGICO
IRRITAZIONE OCULARE
HCE HUMAN CORNEAL EPITHELIUM
COLIPA ECVAM PRE-VALIDATION
2008-2012
CONTROLLO POSITIVO
ETANOLO
CONTROLLO NEGATIVO
SOLUZIONE SALINA
PROTOCOLLO
1H +16H POST INCUBAZIONE
ENDPOINT IN VITRO
VITALITA’ CELLULARE
MODELLO PREDITTIVO
>50% NON IRRITANTE
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FOTOTOSSICITA : OECD 432
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DESCRIZIONE
FOTOTOSSICITA’ 3T3 NRU
OBIETTIVO
Identificare composti foto-tossici in
seguito ad esposizione a una dose non
citotossica di radiazione UVA: 5J /cm2
STATO
Alternativa di sostituzione OECD 432
MODELLO BIOLOGICO
BALB 3T3 - fibroblasti murini
ENDPOINT IN VITRO
Vitalità cellulare tramite
Neutral Red Uptake
CAMPO DI APPLICAZIONE
SOSTANZE CHIMICHE IDROSOLUBILI O
OPPORTUNAMENTE SOLUBILIZZATE
IMPIEGO NELLA
VALUTAZIONE
Potenziale fototossico: PIF >2
(Photo Irritation Factor)
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PROCEDURA
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Confronta l’effetto di una sostanza in presenza ed in assenza di UVA
AD UNA SINGOLA CONCENTRAZIONE
quella che determina citotossicità nel 50% delle cellule = EC 50.
PIF = EC50 (–UVA) / EC50 (+UVA)
SOSTANZA CON POTENZIALE FOTOTOSSICO: PIF = > 5.0
SOSTANZA CON PROBABILE POTENZIALE FOTOTOSSICO:
PIF > 2.0 e < 5.0
CONTROLLO POSITIVO: CLORPROMAZINA - PIF > 6
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SOSTANZA CON POTENZIALE FOTOTOSSICO
MPE > 0.150
SOSTANZA CON PROBABILE POTENZIALE FOTOTOSSICO MPE > 0.100 e < 0.150.
SOSTANZA NON FOTOSSICA MPE < 0,1
Tale modello sopperisce ai limiti del modello PIF nei casi in cui sia impossibile
ottenere una EC50.
Il modello utilizza il Mean Photo Effect (MPE), una misura basata sul confronto delle
curve complete concentrazione-risposta. = MAGGIORE SENSIBILITA
Per l applicazione di tale modello si utilizza il Photo Prediction software versione 2.0*
*(Holzhutter, 2002) In Vitro Phototoxicity Testing: Development and Validation of a New
Concentration Response Analysis Software and Biostatistical Analyses Related to the Use of Various
Prediction Models"
!"#$%&'&(")(*$&+,-+&
LIMITI DEL METODO OECD 432
OECD TG 432 : 3T3BALB NRU-PHOTOTOXICITY ASSAY su monostrato di
fibroblasti murini ha alcune riconosciute
• non è adatto a valutare concentrazioni superiori a 1000 µg /ml
• non è adatto a valutare miscele complesse di ingredienti o formulazioni a
causa della loro non solubilità nel mezzo acquoso che porterebbe ad artefatti e/
o precipitazione della sostanza e quindi risultati non attendibili
• è un sistema biologico eccessivamente semplificato rispetto alla
complessità della reazione fototossica epidermica e non permette di tenere
conto
della distribuzione ed assorbimento della sostanza applicata
topicamente.
La linea guida OECD TG 432 indica chiaramente che :
in casi di risultati di potenziale fototossico discordanti ed in generale per la
valutazione di prodotti finiti sia necessario confermare il dato ottenuto con
il 3T3-NRU utilizzando un modello biologico diverso.
!"#$%&'&(")(*$&+,-+&
FOTOTOSSICITA’
Il metodo Episkin Phototoxicity Assay utilizza epidermide umana ricostruita in vitro
Medina et al.2001 : Assessment of the Phototoxic Potential of Compounds and
Finished Topical Products Using a Human Reconstructed Epidermis In
vitro molecular toxicology, vol 14 N° 3
Liebsch et al : 2005 Alternative Methods for Cosmetic testing ( Editors Chantra
Esckes and Valerie Zuang ) chapter 3.8 Uv-induced effects ATLA 33
Suppl131-146
Lelievre et al . 2007 Toxicology in vitro 977-995 .The Episkin phototoxicity
assay (EPA): Development of an in vitro tiered strategy using 17
reference chemicals to predict phototoxic potency
Una riduzione della vitalità
cellulare > 25% nei tessuti
irradiati classifica il prodotto
come foto-tossico.
!"#$%&'&(")(*$&+,-+&
GLP
LA COMPLIANCE GLP E SEMPRE RICHIESTA
QUANDO
IL METODO ALTERNATIVO CONVALIDATO O
IN CORSO DI CONVALIDA
VENGA UTILIZZATO
IN STUDI PER
LA CLASSIFICAZIONE REGOLATORIA
O PER LA REGISTRAZIONE
!"#$%&'&(")(*$&+,-+&
IMPLEMENTAZIONE DELLE OECD TG
Organization for Economic Cooperation and Development
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
INTRODUCTION
INITIAL CONSIDERATIONS
PRINCIPLE OF THE TEST METHOD
DESCRIPTION OF THE METHOD
PROCEDURE
DATA AND REPORTING
LITERATURE
DEFINITIONS
IMPLEMENTAZIONE LINEE GUIDA
NEL CENTRO DI SAGGIO > SOP
!"#$%&'&(")(*$&+,-+&
PROCEDURE OPERATIVE STANDARD
DIREZIONE DEL CENTRO DI SAGGIO
ESPERIENZA
AZIENDALE
Aggiornamento
continuo
Capitalizzare
esperienza aziendale
TECNICI
Strumento di training
SOP
Standardizzazione
Monitoraggio CN e CP
Creazione di
competenze e
responsabilità
Ruolo del QA:
- integrità dei dati
- compliance
Tracciabilità
degli studi
Successo della convalida interna
!"#$%&'&(")(*$&+,-+&
I metodi alternativi … anche nella
Ricerca
QUID MENSURA MENSURATUR UT QUOD NON MENSURATUR
“Misura
quello che è misurabile e
rendi misurabile ciò che non lo è”
Galileo Galilei,1564-1642
