Laboratorio di Biologia Molecolare Prof. Francesco ANIELLO

Laboratorio di Biologia Molecolare
Prof. Francesco ANIELLO
Perchè la regolazione genica?
Perchè durante lo sviluppo embrionale?
La cellula detiene l’informazione
genetica contenuta nel nucleo
Durante lo sviluppo embrionale, da una singola cellula fecondata (zigote),
che contiene l’intero patrimonio genetico dell’individuo, si sviluppa un
organismo intero costituito da più cellule, tutte generate dal singolo zigote, e
tutte contenenti lo stesso patrimonio genetico.
Il cromosoma
Il DNA
Il nucleo
Memoria chimica
del vivente
i geni
Espressione genica ->
Funzioni (colore degli occhi
Embrione di Danio rerio
(1-2-4 blastomeri e a 5 giorni di sviluppo)
Ciascuna delle cellule dell’organismo sviluppato
da questo zigote esprimerà un insieme di geni
diverso, nel tempo e nello spazio, in rapporto
alla funzione della cellula (es: le cellule che
formeranno lo scheletro esprimono geni diversi
dalle cellule che formano l’occhio, etc).
Un embrione in sviluppo rappresenta quindi una
collezione dinamica di cellule, tutte aventi lo
stesso patrimonio genetico ma che esprimono
geni diversi:
un embrione rappresenta un
esperimento vivente di regolazione
genica
resistenza a una malattia)
I meccanismi molecolari che governano la regolazione genica,
anch’essi codificati nel genoma, determinano quali geni (funzioni)
vengono espressi ad un ogni dato momento della vita di una cellula
Come si studia la regolazione genica?
Ciona intestinalis
Danio rerio
Negli embrioni di ascidie:
Negli embrioni di pesci:
Mediante microiniezione
Mediante elettroporazione
Mediante microiniezione
La microiniezione in embrioni di pesci è una tecnica molto efficace per lo studio della
funzione genica mediante l’analisi dell’attività transiente di molecole sintetiche o
mediante la generazione di linee transgeniche stabili
Iniezione di un colorante
fluorescente nelle uova fecondate
di Ciona intestinalis
2. Fecondazione
1. Decorionazione
2n
spermatozoi
n
n
2n
n
n
n
n
n
n
n
3.Elettroporazione
2n
2n
ot
or
e
2n
GFP
2n
pr
om
Uova fecondate e decorionate
+
Impulso elettrico 50V, 800mF
Apparato per la microiniezione
Stadio di una cellula
Pr
om
o to
re
uova
LacZ
Vettore di espressione
Gli embrioni dopo
trasfezione
vengono coltivati
fino allo stadio di
sviluppo di
interesse
Apparato per la microiniezione
Embrione a 24 h
64 cellule
Espressione del gene reporter
GFP nell’endoderma di una
larva di C. intestinalis
Mediante ibridazione in situ
neurula
tailbud
larva
Espressione del gene reporter LacZ
nell’endoderma di C. intestinalis a vari stadi
di sviluppo embrionale
L’ibridazione in situ è una tecnica che permette la localizzazione cellulare dell’mRNA
mediante la sintesi di una sonda ad RNA antisenso opportunamente marcata,
l’identificazione avviene grazie all’uso di un anticorpo legato ad un’attività enzimatica.
Nella Rana esculenta:
Relaxina 3b
Recettore LGR7
Recettore LGR8
a 48 h di sviluppo
a 24 h di sviluppo
a 48 h di sviluppo
Ibridazione in situ su sezioni istologiche
Principali aree di ricerca
Meccanismi molecolari del controllo dell’espressione genica durante l’embriogenesi.
Isolamento e caratterizzazione di geni contenenti omeobox in Ciona intestinalis.
Identificazione di specifici trascritti durante la gametogenesi di Rana esculenta.
Studio dell’espressione di specifici trascritti durante l’embriogenesi di Danio rerio.
Ibridazione in situ della Relaxina nel testicolo di Rana esculenta del mese di Marzo (A); del mese di Settembre (B); controllo (C). I, Interstizio; SPZ, spermatozoi.