Laboratorio di Biologia Molecolare Prof. Francesco ANIELLO Perchè la regolazione genica? Perchè durante lo sviluppo embrionale? La cellula detiene l’informazione genetica contenuta nel nucleo Durante lo sviluppo embrionale, da una singola cellula fecondata (zigote), che contiene l’intero patrimonio genetico dell’individuo, si sviluppa un organismo intero costituito da più cellule, tutte generate dal singolo zigote, e tutte contenenti lo stesso patrimonio genetico. Il cromosoma Il DNA Il nucleo Memoria chimica del vivente i geni Espressione genica -> Funzioni (colore degli occhi Embrione di Danio rerio (1-2-4 blastomeri e a 5 giorni di sviluppo) Ciascuna delle cellule dell’organismo sviluppato da questo zigote esprimerà un insieme di geni diverso, nel tempo e nello spazio, in rapporto alla funzione della cellula (es: le cellule che formeranno lo scheletro esprimono geni diversi dalle cellule che formano l’occhio, etc). Un embrione in sviluppo rappresenta quindi una collezione dinamica di cellule, tutte aventi lo stesso patrimonio genetico ma che esprimono geni diversi: un embrione rappresenta un esperimento vivente di regolazione genica resistenza a una malattia) I meccanismi molecolari che governano la regolazione genica, anch’essi codificati nel genoma, determinano quali geni (funzioni) vengono espressi ad un ogni dato momento della vita di una cellula Come si studia la regolazione genica? Ciona intestinalis Danio rerio Negli embrioni di ascidie: Negli embrioni di pesci: Mediante microiniezione Mediante elettroporazione Mediante microiniezione La microiniezione in embrioni di pesci è una tecnica molto efficace per lo studio della funzione genica mediante l’analisi dell’attività transiente di molecole sintetiche o mediante la generazione di linee transgeniche stabili Iniezione di un colorante fluorescente nelle uova fecondate di Ciona intestinalis 2. Fecondazione 1. Decorionazione 2n spermatozoi n n 2n n n n n n n n 3.Elettroporazione 2n 2n ot or e 2n GFP 2n pr om Uova fecondate e decorionate + Impulso elettrico 50V, 800mF Apparato per la microiniezione Stadio di una cellula Pr om o to re uova LacZ Vettore di espressione Gli embrioni dopo trasfezione vengono coltivati fino allo stadio di sviluppo di interesse Apparato per la microiniezione Embrione a 24 h 64 cellule Espressione del gene reporter GFP nell’endoderma di una larva di C. intestinalis Mediante ibridazione in situ neurula tailbud larva Espressione del gene reporter LacZ nell’endoderma di C. intestinalis a vari stadi di sviluppo embrionale L’ibridazione in situ è una tecnica che permette la localizzazione cellulare dell’mRNA mediante la sintesi di una sonda ad RNA antisenso opportunamente marcata, l’identificazione avviene grazie all’uso di un anticorpo legato ad un’attività enzimatica. Nella Rana esculenta: Relaxina 3b Recettore LGR7 Recettore LGR8 a 48 h di sviluppo a 24 h di sviluppo a 48 h di sviluppo Ibridazione in situ su sezioni istologiche Principali aree di ricerca Meccanismi molecolari del controllo dell’espressione genica durante l’embriogenesi. Isolamento e caratterizzazione di geni contenenti omeobox in Ciona intestinalis. Identificazione di specifici trascritti durante la gametogenesi di Rana esculenta. Studio dell’espressione di specifici trascritti durante l’embriogenesi di Danio rerio. Ibridazione in situ della Relaxina nel testicolo di Rana esculenta del mese di Marzo (A); del mese di Settembre (B); controllo (C). I, Interstizio; SPZ, spermatozoi.