Acidi nucleici “artificiali”

Acidi nucleici “artificiali”: strumenti
chimici per la biologia
Prof. Roberto Corradini - Università di Parma
Istituto “Fermi” Mantova, 12 Dicembre 2011
http://www.chemistry2011.org
http://lschimica.unipr.it
http://www.progettolaureescientifiche.eu/
http://www.chimica2011.it/
Chimica
Studia la composizione della materia a partire
dalle particelle più semplici (atomi)
Studia la diversità degli atomi
Studia il modo in cui gli atomi si uniscono per
formare molecole
Studia le proprietà delle molecole
Studia il modo di trasformare le molecole
Studia il ruolo delle molecole negli organismi
viventi
CHIMICA DI SINTESI
BIOLOGIA MOLECOLARE
1955-prima sintesi di DNA artificiale
Anni ‘60-sintesi in fase solida-sintesi di
oligomeri
1953-Scoperta della
struttura del DNA da parte
di Watson e Crick
Anni ‘70-ottimizzazione della sintesi
chimica
Primi anni ‘60-decodifica
del codice genetico
Anni ’80-Automazione
Primi anni ’90 lancio del
progetto genoma
Anni ’90-Produzione commerciale
Varie modificazioni disponibili
DNA
POST-GENOMIC ERA
RNA e DNA di sintesi sono strumenti
comuni
2000 completamento del
sequenziamento del
genoma umano
POST-GENOMIC ERA
ACIDI NUCLEICI
Nucleobase
Base
Zucchero (ribosio o deossiribosio)
Base
Base
R
O
O
O
P
O
O
N
N
Adenina (A)
R
O
DNA, RNA
OH
O
O
NH2
N
N
P
R = H, OH
O
O
O
NH2
R
O
O
fosfato
N
N
N
O
Citosina (C)
N
O
NH
N
NH2
Guanina (G)
NH
N
O
O
Timina (T)
NH
N
O
Uracile (U)
Complementarietà delle basi
H
N H
N
N
O
O
N
O
N
H
N
N
O
O
O
O
O
Legami a idrogeno
T
A
H
N
O
O
N
H N
O
N
H
N
N
N
N H
O
O
O
H
O
G
C
O
Filamenti con sequenze
complementari
A T
A
T
A
T
G
Doppia elica
C
G
C
C
G
Filamenti con sequenze
Non complementari
A
G
A
G
G
T
G
A
C
T
A T
G C
G C
C G
Le basi del DNA funzionano
come lettere di un codice che
può essere “letto” in base alla
complementarietà
Non si forma
(è meno stabile)
IL DNA FUNZIONA DA “STAMPO” PER LA
SINTESI DI DNA O RNA
COMPLEMENTARE SEGUENDO QUESTO
SCHEMA
Coppie di basi
SOLCO MAGGIORE
SOLCO MINORE
Passo dell’elica: 10 coppie di basi
Distanza fra le coppie di basi 3.4 Å
Diametro esterno: 20 Å
Scheletro ribosio-fosfato
Funzione di DNA e RNA
SEQUENZA DI BASI
Conservazione
dell’informazione genetica
DNA a doppia elica
Replicazione
SEQUENZA DI BASI
Trascrizione
SEQUENZA DI BASI
Espressione
dell’informazione genetica
Trasmissione dell’informazione genetica
alle generazioni successive
mRNA
Traduzione
SEQUENZA DI AMMINO ACIDI
Proteine
Molecole funzionali (fenotipo)
Non tutti i geni vengono espressi : Nature ou nurture?
Sintesi di DNA
OH
PG
PG
H
Base
O
O
O
O
O
O
O
Base
Base
Base
O
O
O
O
O
O O
O
O
PG
H
P
P
P
O
O
O
O
GU
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
P
Base
Base
Base
Base
O
O
O
O
O
O
O
P
P
P
OH
O
O
GU
O
O
O
P
Base
O
O
Base
O
HO
OPERAZIONI RIPETUTE CICLICAMENTE: SI PRESTA AD AUTOMAZIONE
SINTESI AUTOMATICA
OLIGONUCLEOTIDI (DNA) COMMERCIALI
E-mail order
Consegna
entro due giorni
Spedizione
Operatore
Controllo di qualità
Purificazione
Certificazione
Acidi nucleici di sintesi
Si possono sintetizzare frammenti di DNA contenenti fino a 150 basi
Il genoma umano contiene circa 3 miliardi di coppie basi.
LA TECNOLOGIA DI SINTESI DEL
DNA (O RNA) PERMETTE DI
PRODURRE EFFETTI A PARTIRE DA
SEQUENZE NON PRESENTI IN
NATURA E DI AVERE A
DISPOSIZIONE DNA PER
APPLICAZIONI TECNOLOGICHE O
PER PRODURRE BENI/SERVIZI
CHE IN NATURA NON ESISTONO
“Vita artificiale”
ANALOGHI DI OLIGONUCLEOTIDI
O
Base
O
O
O
O
P
O
Base
O
O
O
S
DNA
Base
O
HN
O
P
O
Phosphorothioate
P
O
Phosphoramidate
O
O
O
O
P
O
O
OR
O
O
O
2-O-alkyl-RNA
Base
O
Base
P
O
Base
N
O
O
O P N
O
Locked Nucleic
Acid (LNA)
Morpholino
ACIDI PEPTIDO NUCLEICI (PNA)
B
*
B
O
O
O
O
O
P
O
*
n
*
DNA
Nielsen PE, Egholm M, Berg RH,
Buchardt O. Science 1991; 254; 14971500
N
H
N
PNA
O
n
*
B
*
B
O
O
O
O
O
P
O
*
n
*
N
H
DNA
O
N
PNA
Formano con il DNA doppie eliche molto più stabili di
quelle naturali
Sono in grado di formare doppie eliche completamente
artificiali PNA:PNA
Sono in grado di distinguere meglio del DNA mutazioni
delle basi
Sono in grado di formare triple eliche
Hanno altissima resistenza alla degradazione in vivo
Si possono sintetizzare con una chimica simile a quella
utilizzata per ottenere proteine artificiali
n
*
Duplex PNA:DNA
Prima struttura ottenuta
mediante diffrazione a
raggi-X
Passo dell’elica: 16 bp
DNA è distorto
La conformazione del
PNA è conservata
V.
V. Menchise,
Menchise, G.
G. De
De Simone,
Simone, T.
T. Tedeschi,
Tedeschi, R.
R. Corradini,
Corradini, S.
S. Sforza,
Sforza, R.
R. Marchelli,
Marchelli, D.
D. Capasso,
Capasso,
M.
Saviano, C.
C. Pedone,
M. Saviano,
Pedone, submitted
Proc Nat Acad Sci USA, 2003, 100, 12021-12026.
Applicazioni di acidi nucleici
artificiali
DIAGNOSTICA
SONDE A DNA
Legami a idrogeno
specifici
Watson-Crick
SONDA AD ACIDO NUCLEICO
DNA O RNA
da analizzare
Segnale
Innesco di una reazione
“LETTURA” DELLA SEQUENZA
ACIDI NUCLEICI
(OLIGONUCLEOTIDI)
DI SINTESI
CON SEQUENZE DIVERSE
IN POSIZIONI PREFISSATE
DNA CHIPS
O MICROARRAYS
DIMENSIONI:
1 CM X 1 CM CIRCA
DNA O RNA
DA ANALIZZARE
(MARCATO CON
UN GRUPPO CHE
LO RENDE “VISIBILE”)
LEGAME CON LA
SEQUENZA
COMPLEMENTARE
LA POSIZIONE
INDICA QUALE E’ LA
SEQUENZA
COMPLEMENTARE
DNA Chips (microarrays)
Analisi differenziale dell’espressione
genica
Cellula sana
Cellula malata
mRNA
G1
G2
Ev1
Ev2
Ev3 Ev4
Ev5
ANALISI MULTIPLA DI OGM
Soia 0% OGM
Mais, 0% OGM
Mais MON810 OGM
Soia RR OGM
Mais Bt 11 OGM
Mais Bt 176 OGM
Mais GA21 OGM
Applicazioni di acidi nucleici
artificiali
SVILUPPO DI NUOVI FARMACI
= DNA ON
Fattori di trascrizione
Decoy
Anti-gene
RNA polimerasi
DNA
Filamento di
DNA
Trascrizione
Pre-mRNA
Splicing
mRNA
Anti-miR
miRNA
RISC attivazione
Anti-sense
Degradazione di
mRNA
traduzione
Proteina
Acidi nucleici come
potenziali farmaci
• Contro RNA o DNA virali (antivirali)
• Contro RNA o DNA batterici (antibiotici)
• Contro RNA o DNA di oncogeni (antitumorali)
• Contro malformazioni genetiche
• PROGETTAZIONE ALTAMENTE RAZIONALE
(BASATA SULLE SEQUENZE BERSAGLIO NOTE)
SI POSSONO COMBATTERE MALATTIE MOLTO DIVERSE CON LO
STESSO TIPO DI FARMACO
Strategia anti-gene in vivo
CONTROLLO
TRATTATO
• Topo di Controllo e topo trattato con PNA
(14 gg). Le frecce indicano il tumore
Oltre il farmaco
• Guidare il destino delle cellule
– Differenziamento
– Morte programmata (apoptosi)
• Terapia genica
– Modificare il patrimonio genetico introducendo
geni dall’esterno
• Riparazione genica
– Indurre la correzione di una aberrazione
Nanotecnologie basate su DNA
“There’s plenty of space at the bottom”
Feynman,1960
Approccio top-down: miniaturizzazione delle
lavorazioni
Approccio bottom-up :
autoassemblaggio (self assembly)
delle molecole
DNA Origami
DNA naturale
DNA artificiale
100 nm 100 nm
P.W.K. Rothenmund Nature 2006, 440, 297-302
100 nm
100 nm
Scala 1 : 2 1014
Sapere e saper fare
Rosangela Marchelli
Stefano Sforza
Tullia Tedeschi
Andrea Germini
Arnaldo Dossena
Filbert Totsingan
Alessandro Accetta
Alessandro Tonelli
Alessandro Calabretta
Andrea Faccini
Alex Manicardi
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GRAZIE PER L’ATTENZIONE