Life Sciences
Metodologie di screening per il
monitoraggio delle acque
sotterranee.
La tecnica rapida
di controllo
Microbiologico
di bioluminescenza
Dr.ssa Lucia Ceresa
European Marketing Manager
Rapid Microbiology
Filtration. Separation. Solution. SM
I metodi tradizionali vs. quelli rapidi
¾I metodi convenzionalmente adottati:
¾conta in “ufc” (assumendo 1 cell = 1 ufc),
¾risultati tipicamente non prima di 3 - 7 giorni.
¾ I metodi rapidi hanno dimostrato una
sensibilità e un’accuratezza estremamente
elevate. Sono risultati al confronto:
¾spesso superiori (“objectionable organisms”)
¾in grado di rispondere all’esigenza di ottenere
risultati accurati in tempi molto ristretti,
¾una reale alternativa ai metodi in uso,
¾un “nuovo” parametro e strumento di controllo
oggi inesistente.
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Tecnologie di Microbiologia rapida
¾ La bioluminescenza è, fra le tecnologie rapide,
quella in grado di fornire una valutazione
immediata della contaminazione, analizzando
la presenza di ATP, quale indicatore di un
metabolismo cellulare attivo.
¾ La quantità di fotoni
emessa dalla reazione
enzimatica è
direttamente proporzionale
alla quantità di ATP
presente nel campione
e dunque ai microrganismi.
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Accettabilità del metodo
Standard Methods for the Examination of
Water and Wastewater
(20th edition – 1998) – Rapid detection
Methods (9-22)
¾ 9211 C.1 Bioluminescence Test
(Total Viable Microbial Measurement)
¾ >The firefly luciferase test for ATP in living cells is based
on the enzymatic reaction”<
¾ >For monitoring microbial populations in water, the ATP
assay is limited primarily by the need to concentrate
bacteria from the sample to achieve the minimum ATP
sensitivity level, which is 105 cells/ml<
¾ >When combined with membrane filtration of 1L sample,
ATP assay can provide the sensitivity level needed<
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Le linee guida di riferimento
¾ PDA Technical Report 33
‘Evaluation and Implementation of New
Microbiological Testing Methods - (June 2000)’
¾ USP Pharmacopoeial Forum Vol. 29
(Jan.–Feb. 2003) <1223> IN-PROCESS REVISION
‘Validation of Alternative Microbiological Methods’
¾ Pharmaeuropa Vol. 16 n° 4
(October 2004) <5.1.6.> ‘Alternative
Methods for control of Microbiological Quality’
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FDA approva la bioluminescenza
¾ Questo specifico protocollo di
presenza/assenza sulla base della
valutazione della bioluminescenza con il
sistema Pallchek™, è stato approvato da
parte dell’FDA su due diverse applicazioni:
¾ rilascio di un prodotto farmaceutico
non-sterile,
¾ monitoraggio dell’acqua (WFI).
¾ L’utilizzo in routine della nuova tecnologia
ha inoltre pienamente superato l’ispezione
da parte delle autorità.
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Il sistema
Il sistema di Microbiologia
Rapida Pallchek consiste in:
¾ KIT di REAGENTI:
¾Soluzione Extractant
(pronta all’uso)
¾Reagente bioluminescente
(enzima/subtrato) da
attivare/ricostituire prima
dell’uso
¾ Luminometro Pallchek che
permette di QUANTIFICARE i
fotoni emessi durante la
reazione
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TM
Pallchek
Corrispondenza
ATP
RLU
RLU
ATP
Diluizioni seriali 1:10 a partire da: 7.25x10-7M di soluzione standard ATP
HS kit
RLU’s
SS kit
1x E 7
1x E 6
1x E 5
1x E 4
HS kit / SAMPLE = 100 µl
1x E 3
y = 2E+17x
R 2 = 0.9981
SS kit / SAMPLE = 100 µl
0.0.9807
y = 3E+16x
R 2 = 0.9983
1x E 2
0.9826
1x E 1
1x 10-17
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1x E-16
1x E-15
1x E-14
Moli di ATP
1x E-13
1x E-12
1x E-11
Lo strumento
Il luminometro PallchekTM
prodotto da Pall Corporation,
utilizza un fotomoltiplicatore
estremamente sensibile per
misurare I fotoni emessi dalle
reazione di bioluminescenza
Lo strumento è dotato di una chiave di sicurezza per evitare
qualsiasi manipolazione dei dati
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La misurazione della luce
I risultati della lettura compaiono sul display dello
strumento come Relative Light Units (RLU) e vengono
anche simultaneamente stampati
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TM
Pallchek :
reading cycle
1. Accensione dello strumento – Auto check
<PALLCHEK v: 3.3>
<Please Wait>
<001: 4.5E2>
<READY TO COUNT>
2 Lo strumento viene posto sulla piastra di lettura
3 Con una leggera pressione verso il basso viene attivato il
vuoto
4 <Pumping> – controllo tenuta
5 <Checking> – controllo dell’assenza di interferenza di luce
esterna
6 <Counting> – LETTURA (Bioluminescent reaction reading)
<002
1.2E2>
7 Visualizzazione risultato:
• <READY TO COUNT>
9 Rilascio del vuoto
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• Tempo complessivo circa 20 secondi
La bioluminescenza:
applicazioni
¾ La valutazione dell’ ATP può essere
usata per valutare una contaminazione
presente come “total bioburden” sia
come metodo “qualitativo” sia
come “quantitativo” ma non
permette di risalire
all’ identificazione
RLU
del contaminante
cfu
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Metodo quantitativo:
Risultati in 1 minuto
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Metodo quantitativo: 1 minuto
CAMPIONAMENTO
Analisi del CAMPIONE tal quale
o
Concentrazione del CAMPIONE / MF
Filtrazione e massimo recupero su membrana
ESTRAZIONE dell'ATP (lisi cellulare)
Reazione ENZIMATICA Luciferina/luciferasi
Misurazione strumentale dell'emissione LUMINOSA (RLU)
Valutazione IMMEDIATA della presenza di ATP
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Metodi analitici quantitativi
¾ Risultati immediati: in 1 minuto.
¾ campioni tal quali con circa > 10 ufc.
¾ lettura immediata del campione, con tipiche
applicazioni quali ad esempio:
¾Controllo e titolazione delle sospensioni
microbiche
¾Controllo di materie prime
¾Validazione dell’attività antimicrobica
(sanitizzanti)
¾Validazione dell’efficacia dei conservanti
¾Monitoraggio fermentazioni “in-process”
¾Tutti i tipi di acque, compresa la purificata
¾Monitoraggio ambientale e del personale
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Valutazione quantitativa sul tal quale
Aggiunta del campione tal quale sul supporto
1
2. REAZIONE di BIOLUMINESCENZA - (fase 1)
Aggiunta del 1° reagente:
15 secondi
¾ 100 μl di extractant
2
3. REAZIONE di BIOLUMINESCENZA - (fase 2)
Aggiunta del 2° reagente:
5 secondi
¾ 100 μl di reagente bioluminescente
3
4. LETTURA del CAMPIONE BIOLUMINESCENTE
Rilevamento dell’ATP con lo strumento Pallchek
4
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RISULTATO in 1 MINUTO
Valutazione quantitativa su campione filtrato
A.
Preparazione dei campioni
Concentrazione del campione su
membrana.
A
B. LAVAGGIO MEMBRANA
B
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Lettura dell’ATP con PallchekTM
1. Trasferimento della membrana sul supporto di
lettura
1
2. REAZIONE di BIOLUMINESCENZA - (fase 1)
Aggiunta del 1° reagente:
15 secondi
¾ 150 μl di extractant
2
3. REAZIONE di BIOLUMINESCENZA - (fase 2)
Aggiunta del 2° reagente:
5 secondi
¾ 100 μl di reagente bioluminescente
3
4. LETTURA del CAMPIONE BIOLUMINESCENTE
Rilevamento dell’ATP con lo strumento Pallchek
4
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RISULTATO in 1 MINUTO
Punto 2 - REAZIONE di
BIOLUMINESCENZA - (fase 1)
3
Rilascio di ATP
La soluzione “extractant” aggiunta al campione agisce
rapidamente con la componente fosfolipidica delle
membrane cellulari dei microrganismi presenti:
¾ l’ATP INTRACELLULARE è reso disponibile
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Punto 3 - REAZIONE di
BIOLUMINESCENZA - (fase 2)
3
Reazione con ATP
L’enzima LUCIFERASI e il suo substrato LUCIFERINA
(LH2):
¾ REAGISCONO immediatamente con l’ATP presente
LH2 + ATP + E
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Mg++
E-LH2-AMP + PPi
Punto 4 - LETTURA del CAMPIONE BIOLUMINESCENTE
QUANTIFICAZIONE dell’emissione luminosa:
Il complesso luciferina (LH2) viene ossidato dall’enzima
LUCIFERASI a ossiluciferina e si produce luce:
E-LH2-AMP + O2
oxyluciferina + hv + AMP + CO2
>>>Counting<<<
quantificazione accurata
dei fotoni emessi
(hv = bioluminescenza 562 nm)
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Punto 4 – Quantificazione dell’ ATP
RISULTATO della lettura
<Test number
004>
<4.7E6
RLU>
L’emissione luminosa viene espressa come:
Relative Light Units (RLU)
• Tempo complessivo di TEST: 20 secondi
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Proporzionalità: ATP vs RLU
e “ufc” vs. RLU
¾Proporzionalità della rilevazione dell’ATP estremamente elevata.
¾Analisi quantitativa,
quantitativa con valutazione immediata del campione
A. niger (ATCC 16404)
Diluizioni seriali
RLU
1,0E+06
y = 0,9331x - 0,1101
R2 = 0,9779
1,0E+05
1,0E+04
1,0E+03
1,0E+02
1,0E+01
1,0E+00
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106
105
104
103
102
cfu
RLU
CFU vs RLU
B. diminuta
RLU
cfu
CORRELAZIONE RLU vs.cfu
y = 0,9165x + 0,0734
2
R = 0,9867
107
106
105
RLU
104
linearità
103
102
101
0
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101 102
103
104
105
106
107
108
cfu
RLU
CFU vs RLU
cfu
cfu log
S. aureus
ATCC 6538 (1 ml)
Lineare (cfu log)
8
7
6
5
4
y = 0,9148x1,4492
3
R2 = 0,9985
2
1
0
0,0E+00
1,0E+00
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2,0E+00
3,0E+00
4,0E+00
5,0E+00
6,0E+00
7,0E+00
RLU
CFU vs RLU
cfu
P. aeruginosa ATCC 14207
1,0E+07
Log RLU
1,0E+06
1,0E+05
y = 0,477x0,9389
R2= 0,9896
1,0E+04
1,0E+03
1,0E+02
1,0E+01
1,0E+00
1,0E+00 1,0E+01 1,0E+02 1,0E+03 1,0E+04 1,0E+05 1,0E+06 1,0E+07
3x101
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3x102
3x103
3x104
Log cfu (agar plate)
3x105
3x106 cfu
RLU
CFU vs RLU
cfu
E. coli (colture in PBS)
1.00E+07
1.00E+06
1.0233
y = 0.6221 x
R2 = 0.9977
LOG RLU
1.00E+05
1.00E+04
1.00E+03
1.00E+02
1.00E+01
1.00E+01
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1.00E+02
1.00E+03
1.00E+04
LOG cfu
1.00E+05
1.00E+06
1.00E+07
Analisi di
“conta totale” su acqua potabile
1.0E+08
1.0393
y = 1E+07x
2
R = 0.9976
1.0E+07
1.0E+06
RLU
1.0E+05
1.0E+04
1.0E+03
1.0E+02
1.0E+01
1.0E+00
1.0E-06
© Pall Corporation 2005
1.0E-05
1.0E-04
1.0E-03
1.0E-02
Diluizioni seriali di campione reale (acqua)
1.0E-01
1.0E+00
Vantaggi della bioluminescenza
Tradizionale conta in piastra
Conta su AGAR:
Risultato: in “ufc
Risultati: 3-7 giorni
”
TABC:
TYMC:
30-35°C (2-3 g)
20-25°C (5-7 g)
Risultato soggettivo:
BIOLUMINESCENZA
Reazione enzimatica
Risultato: in RLU
Risultato: 1 minuto
Risultato obiettivo
lettura dell’ OPERATORE STRUMENTALE:
enumerazione dei micro
organismi “coltivabili”
come ufc:
MTL superato: <limite in ufc
MTL fallito: >limite in ufc
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RLU dopo filtrazione su
membrana:
Test superato: <soglia in
RLU
Test fallito: >soglia in RLU
Metodo qualitativo:
presenza/assenza
Risultati in 1 minuto dopo
incubazione del campione
per 16-24 ore
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Campionamento
A) Concentrazione del CAMPIONE su membrana e inoculo in TSB
B) Inoculo diretto campione non filtrabile in TSB
C) Incubazione diretta del TAMPONE in TSB
D) Filtrazione polimero o gel membrana x campioni ARIA e inoculo in TSB
Dopo 16-24 ore
CONCENTRAZIONE del campione (filtrazione 8ml di TSB) massimo recupero su membrana
2ml di TSB per IDENTIFICAZIONE
ESTRAZIONE dell'ATP (lisi cellulare)
Reazione ENZIMATICA Luciferina/luciferasi
Misurazione strumentale dell'emissione LUMINOSA (RLU)
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Valutazione dell’ATP alla massima sensibilità (ufc=0)
Metodi analitici qualitativi
¾ Risultati dopo 16-24 ore
¾ campioni tipicamente con 0 ufc
¾ arricchimento in TSB, previsto per ottenere
un risultato inequivocabile, con tipiche
applicazioni quali ad esempio:
¾
¾
¾
¾
¾
¾
“acque estremamente pulite”
WFI,
prodotti preservati e prodotti sterili,
efficacia sterilizzazione su Indicatori Biologici
efficacia cicli di sanitizzazione
monitoraggi ambientali aree sterili, CRITICHE e
isolatori
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Metodi a confronto: campioni critici
CAMPIONAMENTO
METODO IN USO
NUOVO
Filtrazione o inclusione
su AGAR
CONTA delle colonie “ufc”
MISURAZIONE della luce RLU
RLU < valore soglia
non contaminato
colonie < 1 ufc
non contaminato
colonie > 1 ufc
>>contaminato<<
VALUTAZIONE VISIVA
3-7 GIORNI
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Inoculo in BRODO e CONCENTRAZIONE
del terreno su membrana
RLU > valore soglia
>>contaminato<<
VALUTAZIONE strumentale (RLU)
da CORRELARE: 1 GIORNO
Metodo di validazione vs routine
Metodo di presenza/assenza: risultati < 24 ore
Discriminazione evidente tra “assenza” e presenza.
S. aureus
1,0E+08
ATCC 6538
P. aeruginosa ATCC 9027
C. albicans
1,0E+06
RLU
A. niger
4.8 107
3.2 107 1.3 107 2.9 107
ATCC 10231
ATCC 16404
CAMPIONE TEST superato
1,0E+04
SOGLIA CONTAMINATO
1,0E+02
1.4 102
1.2
102
1.3 102
1.5 102
1.5 102
1.4 102
1,0E+00
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Testing Time 0
Testing Time 24 h
ATCC
Validazione della specificità
Gram
Escherichia coli
ATCC 25922
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Ralstonia picketti
ATCC 49129
Salmonella abony
NCTC 6017
Gram +
Micrococcus luteus
ATCC 9341
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228
Bacillus subtilis
ATCC 6633
Sporigeni +
Bacillus subtilis
ATCC 6633
Miceti:
LIEVITI:
Candida albicans
FILAMENTOSI - MUFFE:
Aspergillus niger
Penicillium notatum
© Pall Corporation 2005
ATCC 10231
ATCC 16404
ATCC 9179
