Ceresa - Arpa Umbria
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Life Sciences Metodologie di screening per il monitoraggio delle acque sotterranee. La tecnica rapida di controllo Microbiologico di bioluminescenza Dr.ssa Lucia Ceresa European Marketing Manager Rapid Microbiology Filtration. Separation. Solution. SM I metodi tradizionali vs. quelli rapidi ¾I metodi convenzionalmente adottati: ¾conta in “ufc” (assumendo 1 cell = 1 ufc), ¾risultati tipicamente non prima di 3 - 7 giorni. ¾ I metodi rapidi hanno dimostrato una sensibilità e un’accuratezza estremamente elevate. Sono risultati al confronto: ¾spesso superiori (“objectionable organisms”) ¾in grado di rispondere all’esigenza di ottenere risultati accurati in tempi molto ristretti, ¾una reale alternativa ai metodi in uso, ¾un “nuovo” parametro e strumento di controllo oggi inesistente. © Pall Corporation 2005 Tecnologie di Microbiologia rapida ¾ La bioluminescenza è, fra le tecnologie rapide, quella in grado di fornire una valutazione immediata della contaminazione, analizzando la presenza di ATP, quale indicatore di un metabolismo cellulare attivo. ¾ La quantità di fotoni emessa dalla reazione enzimatica è direttamente proporzionale alla quantità di ATP presente nel campione e dunque ai microrganismi. © Pall Corporation 2005 Accettabilità del metodo Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (20th edition – 1998) – Rapid detection Methods (9-22) ¾ 9211 C.1 Bioluminescence Test (Total Viable Microbial Measurement) ¾ >The firefly luciferase test for ATP in living cells is based on the enzymatic reaction”< ¾ >For monitoring microbial populations in water, the ATP assay is limited primarily by the need to concentrate bacteria from the sample to achieve the minimum ATP sensitivity level, which is 105 cells/ml< ¾ >When combined with membrane filtration of 1L sample, ATP assay can provide the sensitivity level needed< © Pall Corporation 2005 Le linee guida di riferimento ¾ PDA Technical Report 33 ‘Evaluation and Implementation of New Microbiological Testing Methods - (June 2000)’ ¾ USP Pharmacopoeial Forum Vol. 29 (Jan.–Feb. 2003) <1223> IN-PROCESS REVISION ‘Validation of Alternative Microbiological Methods’ ¾ Pharmaeuropa Vol. 16 n° 4 (October 2004) <5.1.6.> ‘Alternative Methods for control of Microbiological Quality’ © Pall Corporation 2005 FDA approva la bioluminescenza ¾ Questo specifico protocollo di presenza/assenza sulla base della valutazione della bioluminescenza con il sistema Pallchek™, è stato approvato da parte dell’FDA su due diverse applicazioni: ¾ rilascio di un prodotto farmaceutico non-sterile, ¾ monitoraggio dell’acqua (WFI). ¾ L’utilizzo in routine della nuova tecnologia ha inoltre pienamente superato l’ispezione da parte delle autorità. © Pall Corporation 2005 Il sistema Il sistema di Microbiologia Rapida Pallchek consiste in: ¾ KIT di REAGENTI: ¾Soluzione Extractant (pronta all’uso) ¾Reagente bioluminescente (enzima/subtrato) da attivare/ricostituire prima dell’uso ¾ Luminometro Pallchek che permette di QUANTIFICARE i fotoni emessi durante la reazione © Pall Corporation 2005 TM Pallchek Corrispondenza ATP RLU RLU ATP Diluizioni seriali 1:10 a partire da: 7.25x10-7M di soluzione standard ATP HS kit RLU’s SS kit 1x E 7 1x E 6 1x E 5 1x E 4 HS kit / SAMPLE = 100 µl 1x E 3 y = 2E+17x R 2 = 0.9981 SS kit / SAMPLE = 100 µl 0.0.9807 y = 3E+16x R 2 = 0.9983 1x E 2 0.9826 1x E 1 1x 10-17 © Pall Corporation 2005 1x E-16 1x E-15 1x E-14 Moli di ATP 1x E-13 1x E-12 1x E-11 Lo strumento Il luminometro PallchekTM prodotto da Pall Corporation, utilizza un fotomoltiplicatore estremamente sensibile per misurare I fotoni emessi dalle reazione di bioluminescenza Lo strumento è dotato di una chiave di sicurezza per evitare qualsiasi manipolazione dei dati © Pall Corporation 2005 La misurazione della luce I risultati della lettura compaiono sul display dello strumento come Relative Light Units (RLU) e vengono anche simultaneamente stampati © Pall Corporation 2005 TM Pallchek : reading cycle 1. Accensione dello strumento – Auto check <PALLCHEK v: 3.3> <Please Wait> <001: 4.5E2> <READY TO COUNT> 2 Lo strumento viene posto sulla piastra di lettura 3 Con una leggera pressione verso il basso viene attivato il vuoto 4 <Pumping> – controllo tenuta 5 <Checking> – controllo dell’assenza di interferenza di luce esterna 6 <Counting> – LETTURA (Bioluminescent reaction reading) <002 1.2E2> 7 Visualizzazione risultato: • <READY TO COUNT> 9 Rilascio del vuoto © Pall Corporation 2005 • Tempo complessivo circa 20 secondi La bioluminescenza: applicazioni ¾ La valutazione dell’ ATP può essere usata per valutare una contaminazione presente come “total bioburden” sia come metodo “qualitativo” sia come “quantitativo” ma non permette di risalire all’ identificazione RLU del contaminante cfu © Pall Corporation 2005 Metodo quantitativo: Risultati in 1 minuto © Pall Corporation 2005 Metodo quantitativo: 1 minuto CAMPIONAMENTO Analisi del CAMPIONE tal quale o Concentrazione del CAMPIONE / MF Filtrazione e massimo recupero su membrana ESTRAZIONE dell'ATP (lisi cellulare) Reazione ENZIMATICA Luciferina/luciferasi Misurazione strumentale dell'emissione LUMINOSA (RLU) Valutazione IMMEDIATA della presenza di ATP © Pall Corporation 2005 Metodi analitici quantitativi ¾ Risultati immediati: in 1 minuto. ¾ campioni tal quali con circa > 10 ufc. ¾ lettura immediata del campione, con tipiche applicazioni quali ad esempio: ¾Controllo e titolazione delle sospensioni microbiche ¾Controllo di materie prime ¾Validazione dell’attività antimicrobica (sanitizzanti) ¾Validazione dell’efficacia dei conservanti ¾Monitoraggio fermentazioni “in-process” ¾Tutti i tipi di acque, compresa la purificata ¾Monitoraggio ambientale e del personale © Pall Corporation 2005 Valutazione quantitativa sul tal quale Aggiunta del campione tal quale sul supporto 1 2. REAZIONE di BIOLUMINESCENZA - (fase 1) Aggiunta del 1° reagente: 15 secondi ¾ 100 μl di extractant 2 3. REAZIONE di BIOLUMINESCENZA - (fase 2) Aggiunta del 2° reagente: 5 secondi ¾ 100 μl di reagente bioluminescente 3 4. LETTURA del CAMPIONE BIOLUMINESCENTE Rilevamento dell’ATP con lo strumento Pallchek 4 © Pall Corporation 2005 RISULTATO in 1 MINUTO Valutazione quantitativa su campione filtrato A. Preparazione dei campioni Concentrazione del campione su membrana. A B. LAVAGGIO MEMBRANA B © Pall Corporation 2005 Lettura dell’ATP con PallchekTM 1. Trasferimento della membrana sul supporto di lettura 1 2. REAZIONE di BIOLUMINESCENZA - (fase 1) Aggiunta del 1° reagente: 15 secondi ¾ 150 μl di extractant 2 3. REAZIONE di BIOLUMINESCENZA - (fase 2) Aggiunta del 2° reagente: 5 secondi ¾ 100 μl di reagente bioluminescente 3 4. LETTURA del CAMPIONE BIOLUMINESCENTE Rilevamento dell’ATP con lo strumento Pallchek 4 © Pall Corporation 2005 RISULTATO in 1 MINUTO Punto 2 - REAZIONE di BIOLUMINESCENZA - (fase 1) 3 Rilascio di ATP La soluzione “extractant” aggiunta al campione agisce rapidamente con la componente fosfolipidica delle membrane cellulari dei microrganismi presenti: ¾ l’ATP INTRACELLULARE è reso disponibile © Pall Corporation 2005 Punto 3 - REAZIONE di BIOLUMINESCENZA - (fase 2) 3 Reazione con ATP L’enzima LUCIFERASI e il suo substrato LUCIFERINA (LH2): ¾ REAGISCONO immediatamente con l’ATP presente LH2 + ATP + E © Pall Corporation 2005 Mg++ E-LH2-AMP + PPi Punto 4 - LETTURA del CAMPIONE BIOLUMINESCENTE QUANTIFICAZIONE dell’emissione luminosa: Il complesso luciferina (LH2) viene ossidato dall’enzima LUCIFERASI a ossiluciferina e si produce luce: E-LH2-AMP + O2 oxyluciferina + hv + AMP + CO2 >>>Counting<<< quantificazione accurata dei fotoni emessi (hv = bioluminescenza 562 nm) © Pall Corporation 2005 Punto 4 – Quantificazione dell’ ATP RISULTATO della lettura <Test number 004> <4.7E6 RLU> L’emissione luminosa viene espressa come: Relative Light Units (RLU) • Tempo complessivo di TEST: 20 secondi © Pall Corporation 2005 Proporzionalità: ATP vs RLU e “ufc” vs. RLU ¾Proporzionalità della rilevazione dell’ATP estremamente elevata. ¾Analisi quantitativa, quantitativa con valutazione immediata del campione A. niger (ATCC 16404) Diluizioni seriali RLU 1,0E+06 y = 0,9331x - 0,1101 R2 = 0,9779 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00 © Pall Corporation 2005 106 105 104 103 102 cfu RLU CFU vs RLU B. diminuta RLU cfu CORRELAZIONE RLU vs.cfu y = 0,9165x + 0,0734 2 R = 0,9867 107 106 105 RLU 104 linearità 103 102 101 0 © Pall Corporation 2005 101 102 103 104 105 106 107 108 cfu RLU CFU vs RLU cfu cfu log S. aureus ATCC 6538 (1 ml) Lineare (cfu log) 8 7 6 5 4 y = 0,9148x1,4492 3 R2 = 0,9985 2 1 0 0,0E+00 1,0E+00 © Pall Corporation 2005 2,0E+00 3,0E+00 4,0E+00 5,0E+00 6,0E+00 7,0E+00 RLU CFU vs RLU cfu P. aeruginosa ATCC 14207 1,0E+07 Log RLU 1,0E+06 1,0E+05 y = 0,477x0,9389 R2= 0,9896 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00 1,0E+00 1,0E+01 1,0E+02 1,0E+03 1,0E+04 1,0E+05 1,0E+06 1,0E+07 3x101 © Pall Corporation 2005 3x102 3x103 3x104 Log cfu (agar plate) 3x105 3x106 cfu RLU CFU vs RLU cfu E. coli (colture in PBS) 1.00E+07 1.00E+06 1.0233 y = 0.6221 x R2 = 0.9977 LOG RLU 1.00E+05 1.00E+04 1.00E+03 1.00E+02 1.00E+01 1.00E+01 © Pall Corporation 2005 1.00E+02 1.00E+03 1.00E+04 LOG cfu 1.00E+05 1.00E+06 1.00E+07 Analisi di “conta totale” su acqua potabile 1.0E+08 1.0393 y = 1E+07x 2 R = 0.9976 1.0E+07 1.0E+06 RLU 1.0E+05 1.0E+04 1.0E+03 1.0E+02 1.0E+01 1.0E+00 1.0E-06 © Pall Corporation 2005 1.0E-05 1.0E-04 1.0E-03 1.0E-02 Diluizioni seriali di campione reale (acqua) 1.0E-01 1.0E+00 Vantaggi della bioluminescenza Tradizionale conta in piastra Conta su AGAR: Risultato: in “ufc Risultati: 3-7 giorni ” TABC: TYMC: 30-35°C (2-3 g) 20-25°C (5-7 g) Risultato soggettivo: BIOLUMINESCENZA Reazione enzimatica Risultato: in RLU Risultato: 1 minuto Risultato obiettivo lettura dell’ OPERATORE STRUMENTALE: enumerazione dei micro organismi “coltivabili” come ufc: MTL superato: <limite in ufc MTL fallito: >limite in ufc © Pall Corporation 2005 RLU dopo filtrazione su membrana: Test superato: <soglia in RLU Test fallito: >soglia in RLU Metodo qualitativo: presenza/assenza Risultati in 1 minuto dopo incubazione del campione per 16-24 ore © Pall Corporation 2005 Campionamento A) Concentrazione del CAMPIONE su membrana e inoculo in TSB B) Inoculo diretto campione non filtrabile in TSB C) Incubazione diretta del TAMPONE in TSB D) Filtrazione polimero o gel membrana x campioni ARIA e inoculo in TSB Dopo 16-24 ore CONCENTRAZIONE del campione (filtrazione 8ml di TSB) massimo recupero su membrana 2ml di TSB per IDENTIFICAZIONE ESTRAZIONE dell'ATP (lisi cellulare) Reazione ENZIMATICA Luciferina/luciferasi Misurazione strumentale dell'emissione LUMINOSA (RLU) © Pall Corporation 2005 Valutazione dell’ATP alla massima sensibilità (ufc=0) Metodi analitici qualitativi ¾ Risultati dopo 16-24 ore ¾ campioni tipicamente con 0 ufc ¾ arricchimento in TSB, previsto per ottenere un risultato inequivocabile, con tipiche applicazioni quali ad esempio: ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ “acque estremamente pulite” WFI, prodotti preservati e prodotti sterili, efficacia sterilizzazione su Indicatori Biologici efficacia cicli di sanitizzazione monitoraggi ambientali aree sterili, CRITICHE e isolatori © Pall Corporation 2005 Metodi a confronto: campioni critici CAMPIONAMENTO METODO IN USO NUOVO Filtrazione o inclusione su AGAR CONTA delle colonie “ufc” MISURAZIONE della luce RLU RLU < valore soglia non contaminato colonie < 1 ufc non contaminato colonie > 1 ufc >>contaminato<< VALUTAZIONE VISIVA 3-7 GIORNI © Pall Corporation 2005 Inoculo in BRODO e CONCENTRAZIONE del terreno su membrana RLU > valore soglia >>contaminato<< VALUTAZIONE strumentale (RLU) da CORRELARE: 1 GIORNO Metodo di validazione vs routine Metodo di presenza/assenza: risultati < 24 ore Discriminazione evidente tra “assenza” e presenza. S. aureus 1,0E+08 ATCC 6538 P. aeruginosa ATCC 9027 C. albicans 1,0E+06 RLU A. niger 4.8 107 3.2 107 1.3 107 2.9 107 ATCC 10231 ATCC 16404 CAMPIONE TEST superato 1,0E+04 SOGLIA CONTAMINATO 1,0E+02 1.4 102 1.2 102 1.3 102 1.5 102 1.5 102 1.4 102 1,0E+00 © Pall Corporation 2005 Testing Time 0 Testing Time 24 h ATCC Validazione della specificità Gram Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Ralstonia picketti ATCC 49129 Salmonella abony NCTC 6017 Gram + Micrococcus luteus ATCC 9341 Staphylococcus aureus ATCC 6538 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 Bacillus subtilis ATCC 6633 Sporigeni + Bacillus subtilis ATCC 6633 Miceti: LIEVITI: Candida albicans FILAMENTOSI - MUFFE: Aspergillus niger Penicillium notatum © Pall Corporation 2005 ATCC 10231 ATCC 16404 ATCC 9179
