1 Ruolo della risposta al danno al DNA nella carcinogenesi e nello

Ruolo della risposta al danno al DNA nella carcinogenesi
e nello sviluppo di terapie tumorali
Dr.ssa Daniela Barilà
Risposta al danno del DNA: diversi tipi di danno
Difetti nella risposta al danno del DNA
ed instabilità genomica
Patologie genomiche associate ad instabilità genomica:
alcuni esempi
Ruolo della disposta al danno del DNA nello sviluppo di
di terapie tumorali
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Risposta al danno del DNA: diversi tipi di danno
Danno al DNA di origine endogena:
processi metabolici
replicazione del DNA
riarrangiamenti DNA nel sistema immunitario (VDJ
recombination, class switch)
Danno al DNA di origine esogena:
radiazioni ionizzanti (IR)
radiazioni ultravioletto (UV)
diversi agenti chimici
Scopo principale della risposta di danno al DNA:
prevenire la replicazione del DNA in presenza di un
danno del DNA e la conseguente instabilità genomica
Danno
al DNA
Arresto del ciclo cellulare
Apoptosi
Riparo del DNA
Sopravvivenza
1) Attivazione dei checkpoint cellulari per arrestare il ciclo cellulare
2) Attivazione dei meccanismi di riparo del DNA
3) Riparo del danno e ripresa del ciclo cellulare… oppure…il danno
non è riparabile e si attiva la risposta apoptotica
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From Y. Shiloh, 2003, Nat Cancer Rev
Diversi tipi di danno al DNA e diversi meccanismi di riparo
From R. Hakem, 2008, EMBO J
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Direct reversal: a differenza delle altre risposte non richiede
L’attivazione di complessi multiproteici. Un esempio: O6-alkylguanina.
L’alchilazione impedisce l’appaiamento con la citosina. Viene rimossa
grazie all’azione di un singolo enzima, Ada in E. coli corrispondente a
O6-methyltransferase, MGMT in cellule di mammifero.
MMR pathway: Mismatch Rapair, presente in eucarioti e procarioti
viene utilizzata per il riparo di mismatches, ossia piccole inserzioni
o delezioni.
NER pathway: Nucleotide Excision Repair,presente in eucarioti e
procarioti viene utilizzata per il riparo di diverse lesioni tra cui
lesioni causate da UV, mutageni chimici e chemioterapici che inducano
la formazione di dimeri di pirimidina e addotti sproporzionati.
3 proteine (UvrA, UvrB, UvrC) in procarioti, piu’ di 30 in mammifero.
BER pathway: Base Excision Repair, viene utilizzata in procarioti
ed eucarioti per rimuovere basi danneggiate.
Danno al DNA su entrambi i filamenti:
Double Strand Breaks (DSBs)
HR pathway: Homologous Recombination, viene utilizzata in procarioti
ed eucarioti per risolvere rotture a doppio filamento (DSB).
Viene utilizzata in circa il 90% dei casi di DSBs nei batteri ed
in lievito, e solo nel 10% dei casi di DSBs in cellule di mammifero,
in cui si preferisce l’attivazione della NHEJ. Richiede l’attivazione
di una serie di complessi proteici e di una cascata di eventi di
trasduzione del segnale. E’ molto accurata.
NHEJ: Non Homologous End Joining, viene utilizzata in procarioti
ed eucarioti per risolvere rotture a doppio filamento (DSB).
Viene utilizzata solo in circa il 10% dei casi di DSBs nei batteri ed
in lievito, e nel 90% dei casi di DSBs in cellule di mammifero.
Richeiede l’attivazione di una serie di complessi proteici e di una
cascata di eventi di trasduzione del segnale. Non e’ molto accurata
bensi error prone.
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From Y. Shiloh, 2003, Nat Cancer Rev
Double Strand Breaks (DSBs): NHEJ or HR and cell cycle
From S. Takeda et al., 2007, Mol Cell
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La risposta cellulare attivata da DSBs è molto ben
caratterizzata a livello molecolare
Una cascata di eventi coordinata da:
1) Sensori del danno
2) Trasduttori
3) Effettori
Tale risposta deve essere rapida e
reversibile: modifiche post-traduzionali
quali fosforilazioni ed ubiquitinazioni
svolgono un ruolo centrale
nella trasduzione del segnale di risposta.
From Y. Shiloh, 2003, Nat Cancer Rev
From Su, T.T, 2006, Annu Rev Genet
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La risposta cellulare attivata da DSBs è molto ben
caratterizzata a livello molecolare
In seguito al DSBs il complesso MRN (MRE11/RAD50/NBS1) viene
reclutato ai siti di rottura del DNA dove media a sua volta il reclutamento
e l’attivazione della Ser/Thr chinasi ATM. Inoltre altre due Ser/Thr chinasi,
ATR e DNA-PK sono attivate e partecipano attivamente alla risposta DSBs.
Il complesso MRN promuove anche grazie all’attività esonucleasica di MRE11
la resezione che porta alla formazione di DNA a singolo filamento,
il quale a sua volta promuove l’attivazione di ATR.
In pochi minuti dalla formazione di DSBs ATM, ATR e DNA-PK si attivano
e fosforilano a loro volta altri trasduttori ed effettori necessari sia
ad attivare il riparo del DNA che ad attivare i checkpoints cellulari
Il complesso MRN (MRE11/RAD50/NBS1)
MRE11: è una proteina che lega il DNA e possiede attività esonucleasica
3’-5’ oltre ad attività endonucleasica.
Promuove quindi la resezione e la formazione di ssDNA necessaria
per la ricombinazione omologa. Promuove inoltre l’attivazione di ATR.
RAD50: è un membro della famiglia SMC (Structural Maintenance
of Chromosomes) e forma omodimeri che si associano con due molecole
di MRE11 per formare complessi tetramerici MRE11-RAD50 che possono
inserirsi tra le estremità libere del DNA oppure tra i cromatidi fratelli
promuoveno la ricombinazione omologa.
NBS1 : presenta un dominio di legame con ATM ed è quindi necessaria per
Il reclutamento di ATM ai siti di rottura del DNA e per la sua attivazione.
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Il complesso MRN
Le PI3-like Ser/Thr chinasi svolgono un ruolo centrale
come trasduttori della risposta di danno al DNA
3056
1
ATM
2644
1
ATR
3031
1
ATX/SMG1
1
4128
DNA-PK
1
2549
mTOR/FRAP
TRRAP
3830
1
FAT
PI3-K FATC
Tali proteine sono altamente conservate nell’evoluzione.
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3056
1
ATM
2644
1
ATR
DNA-PK
3031
1
ATX/SMG1
1
4128
1
2549
mTOR/FRAP
TRRAP
3830
1
FAT
PI3-K FATC
Ruolo centrale nella risposta DSBs.
L’attività chinasica è finemente regolata da un complesso
di interazioni intra ed intermolecolare.
Induzione dell’ attività chinasica in risposta a DSBs ed attivazione
di una cascata di fosforilazioni con conseguente amplificazione del segnale.
ATM è presente nella cellula come dimero inattivo.
In seguito a danno del DNA ATM subisce un cambio conformazionale
che ne induce l’attività chinasica e l’autofosforilazione in Ser1981
che determina il rilascio dal dimero di due molecole di monomero
autofosforilate ed attive in grado di mediare la fosforilazione di substrati
sia in prossimità dei DSBs che piu’ genericamente nel nucleo.
From Bakkenist and Kastan, 2003, Nature
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Ruolo di ATM nel riparo del DNA
ATM colocalizza ed induce la fosforilazione dell’istone H2AX
in Ser139 ai siti di rottura del DNA.
Tale evento promuove la formazione degli IRIF (Ionizing Radiation
Induced Foci).
Agli IRIF vengono reclutati e fosforilati diversi fattori tra cui: MDC1,
53BP1, RNF8, BRCA1, CHK2 e p53. Inoltre RAD51 e RAD52 direttamente
coivolte nel riparo vengono fosforilate.
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Formazione dei foci in seguito ad IR
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Ruolo di ATM nel controllo del ciclo cellulare
From Shiloh, 2003, Nat Cancer Rev
From Rotman and Shiloh, 1999, Oncogene
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Patologie genomiche associate ad instabilità genomica:
alcuni esempi
Sono patologie genetiche autosomiche recessive associate a mutazioni a
carico di geni codificanti per proteine importanti nella risposta al danno
del DNA.
Tali patologie sono generalmente associate ad instabilità cromosomica,
aberrazioni del sistema nervoso ed immunitario ed ipersensibilità delle
cellule agli agenti che inducono il tipo di danno la cui risposta è non
funzionante.
Inoltre spesso tali patologie sono anche associate ad una maggiore
frequenza di sviluppo tumorale, spesso ma non solo di tumori del sistema
immunitario.
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3 sindromi associate a difetti nella risposta NER
Xeroderma Pigmentosum (XP): e’ una sindrome generata da mutazioni
In uno o più geni XPA, XPB, XPC, XPD, XPE, XPF, XPG.
E’ caratterizza da ipersensibilita’ agi UV e da altissima incidenza di
tumori della pelle.
Cockayne syndrome: e’ una sindrome associata a mutazioni
in CSA o CSB, proteine richieste per NER.E’ una patologia
Caratterizzata da malformazioni e ritardo mentale grave.
Si osserva in alcuni casiun’alta incidenza di tumori della pelle come
per XP.
Tricothiodystrophy: TTD. e’ una sindrome associata a mutazioni
nelle proteine XPB e/o XPD. Ritardo mentale e fotosensibilita’.
Non si osservano correlazioni con lo sviluppo di tumori della pelle.
Bloom’s syndrome (BS): e’ una sindrome rara causata da mutazioni
della proteina BML una DNA elicasi importante nella risposta HR
a DSBs. Maggiore possibilita’ di sviluppare vari tumori.
Werner’s syndrome (WS):WS e’ un’ altra RECQ elicasi. Le mutazioni
di WS sono associate ad una patologia in cui si riscontra
maggiore propensione allo sviluppo di tumori
Rothmund-Thompson syndrome (RTS): RTS e’ generata da
mutazioni di un’altra RECQ elicasi. Anche questa patologia si associa
ad un aumentato rischio di sviluppare tumori della pelle ed
osteosarcomi.
Fanconi’s anemia (FA): E’ una patologia molto eterogenea
Caratterizzata da anemia aplastica.
Ci sono almeno 8 diversi “FA genes”.
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Ataxia Telangiectasia (A-T): rara patologia genetica, causata da
mutazioni del gene atm. E’ caratterizzata da neurodegenerazione,
Telangiectasia, immunodeficienza e da un’alta incidenza
di linfomi e leucemie.
Nijmegen Breakage Syndrome (NBS):mutazioni a carico della
proteina NBS1 che impediscono il corretto funzionamento.Patologia
Caratterizzata da neurodegenerazione e da alta incidenza di
B/T linfomi.
Ataxia Telangiectasia Like Disease (ATLD): Mutazioni a carico di
MRE11. Alta incidenza di tumori.
Diverse sindromi da instabilità genomica sono correlate tra loro
In quanto le proteine codificate dai geni mutati sono funzionalmente
correlate e partecipano alle stesse vie di trasduzione del segnale
A-T and NBS: ATM viene attivato e a sua volta fosforila NBS1
A-T and Fanconi Anemia: ATM fosforila FANCD2
A-T and Bloom’s Syndrome: ATM fosforila BLM
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From Helleday et al., 2008, Nat Cancer Rev
From Helleday et al., 2008, Nat Cancer Rev
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Inoltre molte mutazioni di geni della risposta a DSBs sono associate
Ad alta incidenza di tumori anche in eterozigosi, quando cioe’ non
si sviluppa la patologia genetica.
Attivazione della risposta DSBs nelle lesioni pretumorali:
Possibile ruolo di barriera anti-tumorale.
Ruolo della disposta al danno del DNA nello sviluppo di
di terapie tumorali
La terapia tumorale ha come scopo fondamentale cercare di colpire
Selettivamente le cellule tumorali e non quelle sane.
Pertanto tutti gli approcci di sviluppo di nuove terapie si basano
sulla comprensione delle differenze tra cellule tumorali e non
Una differenza fondamentale è che le cellule tumorali proliferano
maggiormente. Pertanto molti approcci sono mirati a colpire
il ciclo cellulare.
Un approccio molto utilizzato si basa sull’uso di sostanza che
inducono danno del DNA. Infatti le cellule tumorali in presenza di
danno al DNA non arrestano il ciclo. Ciò rende tali sostanze
particolarmente tossiche per le cellule che continuando a replicarsi
hanno maggiori probabilità di andare incontro a morte.
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From Helleday et al., 2008, European J of Cancer
From Helleday et al., 2008, Nat Cancer Rev
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From Helleday et al., 2008, Nat Cancer Rev
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