attivita` antibatterica e caratterizzazione chimica di estratti di piante

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PAVIA
DIPARTIMENTO DI SCIENZE DEL FARMACO
MASTER DI II LIVELLO IN “PRODOTTI NUTRACEUTICI:
PROGETTAZIONE, SVILUPPO FORMULATIVO, CONTROLLO
E COMMERCIALIZZAZIONE”
Coordinatore: Prof.ssa Maria Daglia
ATTIVITA’ ANTIBATTERICA E
CARATTERIZZAZIONE CHIMICA DI ESTRATTI
DI PIANTE MEDICINALI TRADIZIONALI DELL’
ECUADOR
Candidata: Dott.ssa Patricia Alexandra Chávez Carvajal
Relatore: Chiar.ma Prof.ssa Maria Daglia
ANNO ACCADEMICO 2012-2013
INDICE
1.
INTRODUZIONE .................................................................................................................... 1
1.1.
Medicina tradizionale ....................................................................................................... 1
1.2.
Medicina complementare e alternativa ............................................................................. 1
1.3.
L'uso tradizionale delle piante medicinali ........................................................................ 2
1.4.
Medicina tradizionale nel mondo ..................................................................................... 4
1.5.
Medicina tradizionale nei paesi latino-americani ............................................................. 4
1.6.
Medicina tradizionale nell’Ecuador .................................................................................. 5
2.
LO SCOPO DELLA RICERCA .............................................................................................. 8
3.
DESCRIZIONE ETNOBOTANICA DELLE PIANTE ........................................................ 10
3.1.
Famiglia Asteraceae ........................................................................................................ 10
3.1.1.
Descrizione botanica................................................................................................ 10
3.1.2.
Classificazione e distribuzione ................................................................................ 10
3.1.3.
Piante e prodotti d’interesse economico .................................................................. 11
3.1.4.
Ambrosia arborescens Mill ..................................................................................... 11
3.1.5.
Chuquiraga jussieui J.F. Gmel ................................................................................ 12
3.2.
Famiglia Myrtaceae ........................................................................................................ 12
3.2.1.
Descrizione botanica................................................................................................ 12
3.2.2.
Classificazione e distribuzione ................................................................................ 13
3.2.3.
Piante e prodotti d’interesse economico .................................................................. 13
3.2.4.
Myrcianthes hallii (Berg) McVaugh ....................................................................... 14
3.3.
Famiglia Solanaceae ....................................................................................................... 14
3.3.1.
Descrizione botanica................................................................................................ 14
3.3.2.
Classificazione e distribuzione ................................................................................ 15
3.3.3.
Piante e prodotti d’interesse economico .................................................................. 15
3.3.4.
Solanum americanum Mill ...................................................................................... 15
3.4.
Famiglia Tropaeolaceae .................................................................................................. 16
3.4.1.
Descrizione botanica................................................................................................ 16
3.4.2.
Classificazione e distribuzione ................................................................................ 16
4.
3.4.3.
Piante e prodotti d’interesse economico .................................................................. 16
3.4.4.
Tropaeolum tuberosum Ruiz & Pav ........................................................................ 16
MATERIALI E METODI ...................................................................................................... 18
4.1.
Materiali .......................................................................................................................... 18
4.1.1.
Reattivi .................................................................................................................... 18
4.1.2.
Strumentazione ........................................................................................................ 18
4.2.
Metodi ............................................................................................................................. 18
4.2.1.
Preparazione degli estratti vegetali .......................................................................... 18
4.2.2.
Determinazione dell’attività antibatterica ............................................................... 20
4.2.3.
Analisi UPLC-PDA-hESI-MSn............................................................................... 20
5.
RISULTATI E DISCUSSIONE ............................................................................................. 22
6.
CONCLUSIONI ..................................................................................................................... 37
BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................... 38
RINGRAZIAMENTI .................................................................................................................... 43
1. INTRODUZIONE
1.1. Medicina tradizionale
Nelle General Guidelines for Methodologies on Research and Evaluation of Traditional
Medicine (Ginevra, 2000) l’OMS fornisce per la medicina tradizionale la seguente definizione:
“La medicina tradizionale ha una lunga storia. È la somma di conoscenze, competenze e
pratiche basate su teorie, credenze ed esperienze indigene di diverse culture, siano esse
spiegabili o meno, utilizzate per il mantenimento della salute, così come nella
prevenzione, diagnosi, cura o miglioramento di malattie fisiche e mentali”.
La medicina tradizionale è un insieme di pratiche empiriche incorporate nella conoscenza di un
gruppo sociale, spesso trasmesse oralmente di generazione in generazione con lo scopo di
risolvere i problemi di salute (Bussmann & Sharon, 2006). Le pratiche di medicina tradizionale
variano notevolmente da paese a paese e da regione a regione, in quanto sono influenzate da
fattori quali la cultura, la storia, le attitudini personali e la filosofia (OMS, 2000). Si tratta di
un’alternativa alla medicina occidentale ed è anche fortemente legata a credenze religiose
(Bussmann & Sharon, 2006).
Esistono numerose forme di medicina tradizionale, tra cui: la medicina tradizionale cinese,
l’ayurveda indiano, l’unani arabo, la medicina tradizionale occidentale a base di erbe, la medicina
tradizionale omeopatica, l’aromaterapia e altri medicine indigene (OMS, 2002).
Nella medicina tradizionale possono essere incluse le terapie che comportano l’uso di medicinali,
siano questi a base di erbe medicinali, parti di animali e/o minerali; e le terapie che non
comportano l’uso di medicinali come nel caso dell’agopuntura, delle tecniche manuali e delle
terapie spirituali (OMS, 2002).
1.2. Medicina complementare e alternativa
Nei paesi in cui il sistema sanitario dominante si basa sulla medicina allopatica o convenzionale,
o dove la medicina tradizionale non è stata incorporata nel sistema sanitario nazionale, la
1
medicina tradizionale è spesso classificata come “medicina complementare e alternativa” (OMS,
2002).
L’OMS (2004) fornisce per la medicina complementare e alternativa la seguente definizione:
“La medicina complementare e alternativa si riferisce a un vasto insieme di pratiche di
assistenza sanitaria che non fanno parte della tradizione propria di un paese e non sono
integrate nel sistema sanitario dominante. Tra gli altri termini usati per descrivere queste
pratiche di assistenza sanitaria: “medicina naturale”, “medicina non convenzionale'' e
''medicina olistica".
Il termine "medicina tradizionale" è generalmente utilizzato quando si fa riferimento all’Africa,
all’America Latina, al Sud-Est asiatico e/o al Pacifico occidentale; mentre il termine "medicina
complementare e alternativa" è più adatto quando si fa riferimento all’Europa, al Nord America e
all’Australia. L'uso della medicina tradizionale è ancora molto diffuso nei paesi in via di
sviluppo, mentre l'uso della medicina alternativa e complementare sta aumentando rapidamente
nei paesi sviluppati (OMS, 2002).
1.3. L'uso tradizionale delle piante medicinali
Sin dai tempi antichi, diverse società sono ricorse alla natura, soprattutto alle piante, come fonti
mediche e sanitarie (Tene et al., 2007). La conoscenza delle erbe medicinali è una componente
importante della medicina tradizionale (Bussmann & Sharon, 2006). L'uso delle piante nella
medicina tradizionale deriva dalla conoscenza, soprattutto locale, acquisita da esperienze basate
su un processo di “trial and error” e raramente è incorporato nelle teorie complete e sistematiche
della medicina (Srithi et al., 2009).
I prodotti erboristici comprendono: erbe, materiali e preparati erboristici e prodotti erboristici
finiti che contengono come ingredienti attivi parti di piante o altri materiali vegetali, o
combinazioni di questi. L’OMS precisa quanto segue:
2

Erbe: Comprendono i materiali vegetali grezzi, come foglie, fiori, frutti, semi, gambi,
legno, corteccia, radici, rizomi o altre parti di piante intere, frammentate o polverizzate.

Materiali erboristici: Comprendono, oltre alle erbe, succhi freschi, gomme, oli non
volatili, oli essenziali, resine e polveri secche di erbe. In alcuni paesi è possibile che
questi materiali siano trattati secondo diverse procedure locali, al vapore, alla piastra, o
miscelati con miele, bevande alcoliche o altri materiali.

Preparati erboristici: Sono alla base di prodotti erboristici finiti e possono comprendere
materiali sminuzzati o polverizzati, estratti, tinture, oli grassi ricavati da materiali
erboristici. Sono prodotti per estrazione, frazionamento, depurazione, concentrazione o
altri processi fisici e biologici. Comprendono anche quelli realizzati facendo macerare o
riscaldando i materiali erboristici in bevande alcoliche e/o miele e altre sostanze.

Prodotti erboristici finiti: Sono preparati erboristici realizzati con una o più erbe. Se si
utilizza più di un’erba, si può usare anche il termine di prodotto erboristico miscelato. I
prodotti erboristici finiti o miscelati possono contenere eccipienti in aggiunta agli
ingredienti attivi, ma quelli ai quali sono aggiunte sostanze chimiche definite attive,
compresi composti sintetici e/o costituenti isolati di materiali erboristici, non sono
considerati in sé prodotti erboristici (OMS, 2000; 2004).
I prodotti naturali svolgono un ruolo importante nei programmi di sviluppo farmaceutico (Gachet
et al., 2010). Farmaci e prodotti naturali sono stati strettamente collegati attraverso l'uso di
medicine tradizionali e veleni naturali. Gli studi clinici, farmacologici e chimici dei medicinali
tradizionali, derivati principalmente da piante, hanno fornito la base per la scoperta e
progettazione della maggior parte dei primi farmaci come: aspirina, digitossina, morfina, chinino
e pilocarpina (Butler, 2004).
Attualmente numerosi studi pubblicati su prestigiose riviste scientifiche hanno confermato
l'efficacia clinica dei trattamenti tradizionali. In studi “in vitro” e “in vivo”, gli estratti vegetali
hanno dimostrato di avere una varietà di effetti farmacologici, tra i quali si includono:
vasodilatatori, antimicrobici, anticonvulsivanti, sedativi, antipiretici, antinfiammatori, etc.
(OMS, 2002).
3
Tuttavia, per garantire l’uso sostenibile e razionale di tali piante e per fornire ulteriori prove della
loro sicurezza ed efficacia si rende necessario un approfondimento della ricerca scientifica. Nella
conduzione degli studi e della valutazione scientifica della medicina tradizionale dovrebbero
essere rispettate la conoscenza e l'esperienza acquisite attraverso nel corso del tempo (Srithi et al.,
2009; OMS, 2000).
1.4. Medicina tradizionale nel mondo
Durante l'ultimo decennio, l'uso della medicina tradizionale si è ampliato in tutto il mondo e ha
guadagnato popolarità. Non solo essa è ancora usata per l'assistenza sanitaria primaria nei paesi
in via di sviluppo, ma è utilizzata anche nei paesi in cui la medicina convenzionale è
predominante nel sistema sanitario nazionale (OMS, 2000).
Le medicine tradizionali sono utilizzate da circa il 60% della popolazione mondiale e in alcuni
paesi sono ampiamente integrate nel sistema sanitario pubblico (OMS, 2000). In Africa, fino
all’80% della popolazione utilizza la medicina tradizionale per soddisfare i bisogni sanitari. In
Asia e in America Latina, le popolazioni continuano a utilizzare la medicina tradizionale come
conseguenza di circostanze storiche e credenze culturali. In Cina, la medicina tradizionale
rappresenta circa il 40% dell'assistenza sanitaria. Contemporaneamente in molti paesi sviluppati,
la medicina complementare e alternativa sta diventando sempre più popolare (OMS, 2002).
1.5. Medicina tradizionale nei paesi latino-americani
Nei paesi latino-americani, la medicina tradizionale è profondamente radicata ed è utilizzata
ampiamente da gruppi indigeni, e frequentemente anche da un’ampia porzione della società in
generale. Spesso è un’alternativa economicamente inevitabile alla medicina occidentale costosa.
La conoscenza si trasmette da una generazione alla successiva, dai guaritori tradizionali, sciamani
o “curanderos”, ed è sopravvissuta ai rigori della conquista spagnola e un vasto “mestizaje” o
meticciato razziale. La medicina erboristica è tuttavia in continua evoluzione e ulteriori
conoscenze sono state acquisite nel corso dei secoli (Bussmann & Sharon, 2006).
4
1.6. Medicina tradizionale nell’Ecuador
La Repubblica dell'Ecuador si trova nel nord-ovest del Sud America, il suo nome deriva dalla sua
posizione a cavallo dell'equatore. Confina a nord con la Colombia, a sud e ad est con il Perù, e ad
ovest con l’Oceano Pacifico. Le Isole Galapagos appartengono all’Ecuador e sono localizzate a
circa 1000 km dalla terraferma. Nel complesso, l'Ecuador si estende su una superficie di 255234
km2.
Ci sono tre principali regioni geografiche in terraferma: la costa, gli altipiani (formati dalla
Cordigliera delle Ande) e la foresta amazzonica. Il clima in tutto l'Ecuador è fortemente
influenzato dall'altitudine. Negli altipiani andini è temperato, mentre nella zona costiera del
Pacifico e nella regione della foresta amazzonica il clima è tropicale.
Circa il 50% della superficie del paese è coperto da foreste, principalmente le foreste sempreverdi
dell’Amazzonia, le falde delle Ande e le Ande. Più di 6,8 milioni di ettari di foresta appartengono
ai popoli ancestrali, alle comunità indigene e alle comunità afro-ecuadoriane (Bertzky et al.,
2010).
Si tratta di uno dei paesi più ricchi di biodiversità grazie alle sue varietà di clima e di territori. In
Ecuador si trovano innumerevoli specie animali e vegetali. Secondo il Programma delle Nazioni
Unite per l'ambiente (UNEP, 2005) l’Ecuador fa parte dei 17 paesi cosiddetti megadiversi.
Figura 1. Mappa geografica dell'Ecuador
5
Per quanto riguarda la flora, in Ecuador sono presenti più di 17000 specie di piante vascolari, tra
le quali 5172 vengono utilizzate in modo differente: 3 specie su 10 che crescono in Ecuador sono
utili alle persone. Di questi ultimi il 60% sono medicinali, il 55% sono fonti di materiali grezzi
come quelli utilizzati per la costruzione, il 30% sono commestibili e il 20% sono utilizzate nelle
cosiddette pratiche sociali, che includono riti religiosi e simili. La somma di queste percentuali
supera il 100%, ciò significa che molte delle specie hanno molteplici usi. Le piante utilizzate per
scopi medicinali (60%) appartengono a 206 famiglie. Il 75% sono native e il 5% sono endemiche,
mentre l'11% sono introdotte. Alcune specie introdotte sono ampiamente utilizzate nel paese. Le
famiglie con il maggior numero di specie medicinali sono: Asteraceae, Fabaceae, Rubiaceae,
Solanaceae e Araceae (De la Torre, 2008).
L’Ecuador, oltre alla sua elevata diversità biologica, è caratterizzato per essere un paese
multietnico e pluriculturale, composto da popolazione meticcia, indigena, discendenti africani,
mulatti e popolazione bianca (OPS, 2000). Sono stati riconosciuti 14 gruppi etnici e 18 popoli
indigeni (CODENPE, 2014).
Figura 2. Mappa dei gruppi etnici e popoli indigeni dell’Ecuador (CODENPE, 2014)
In Ecuador la popolazione locale conserva le sue tradizioni ancestrali nell'uso di rimedi naturali e
tra i diversi gruppi indigeni la conoscenza etnobotanica è ancora trasmessa di generazione in
generazione (Tene et al., 2007).
6
Nella medicina tradizionale in Ecuador il mondo reale e il magico, quest’ultimo popolato da
spiriti, dei e demoni, sono due facce di una medaglia che si completano e si giustificano a
vicenda. In questo contesto, le malattie non sono conseguenze di disfunzioni fisiologiche o
dell'invasione di microrganismi patogeni; ma il risultato delle influenze di esseri e forze
soprannaturali (De la Torre, 2008).
L'uso delle piante medicinali è quotidiano per i suoi abitanti. La medicina tradizionale è praticata
prevalentemente dai residenti rurali, ma anche dai cittadini di tutte le classi sociali. È possibile
trovare una grande varietà di piante con usi medicinali che sono vendute nei mercati di tutto il
paese (De la Torre, 2008).
Sebbene la flora dell'Ecuador sia stata studiata da qualche tempo, la ricerca fitochimica è
piuttosto scarsa.
7
2. LO SCOPO DELLA RICERCA
Questa ricerca è stata condotta presso il Laboratorio di Chimica degli Alimenti e Nutraceutica del
Dipartimento di Scienze del Farmaco dell’Università di Pavia ed è stata svolta in collaborazione
con il Professore Francesco Bracco del Dipartimento di Scienze della Terra e dell’Ambiente
dell’Università di Pavia e la Professoressa Anna Marchese dell’Università di Genova.
Lo scopo di questo lavoro è stato quello di determinare l’attività antibatterica e condurre la
caratterizzazione chimica di estratti vegetali ottenuti da piante medicinali tradizionali impiegate
in Ecuador.
Allo scopo sono state selezionate cinque piante liberamente vendute nei mercati locali e che
secondo il loro uso tradizionale, potrebbero avere un’attività antibatterica contro batteri Grampositivi e Gram-negativi.
Le piante selezionate per questa ricerca appartengono a quattro diverse famiglie botaniche e sono
di seguito dettagliate:
Tabella 1. Specie botaniche in studio
Famiglia
Asteraceae
Asteraceae
Myrtaceae
Solanaceae
Tropaeolaceae
Genere
Ambrosia
Chuquiraga
Myrcianthes
Solanum
Tropaeolum
Specie
arborescens
jussieui
hallii
americanum
tuberosum
Autore
Mill
J.F. Gmel
(Berg) McVaugh
Mill
Ruiz & Pav
Nome comune
Marco
Chuquiragua
Arrayán
Hierba Mora
Mashua
Sulla base dei risultati ottenuti dallo svolgimento di un’accurata ricerca bibliografica, si può
affermare che a oggi non sono presenti sufficienti studi relativi a queste piante che possano
convalidarne scientificamente gli usi correnti riportati nella medicina tradizionale. Tuttavia si
possono trovare sul sito internet “PubMed” (US National Library of Medicine’s medline and premedline database, la banca dati che comprende oltre 23 milioni di citazioni di letteratura
biomedica da MEDLINE, riviste di scienze della vita e libri online) le seguenti informazioni che
sono riassunte su Tabella 2:
8
Tabella 2. Pubblicazioni scientifiche riportate per specie
Famiglia
Asteraceae
Asteraceae
Myrtaceae
Solanaceae
Tropaeolaceae
Nome scientifico
Nome comune
Ambrosia arborescens Mill
Chuquiraga jussieui J.F. Gmel
Myrcianthes hallii (Berg) McVaugh
Solanum americanum Mill
Tropaeolum tuberosum Ruiz & Pav
Marco
Chuquiragua
Arrayán
Hierba Mora
Mashua
Pubblicazioni su
PubMed
3
0*1
0*2
31
5
*1 Anche se non ci sono pubblicazioni che corrispondono alla specie, ci sono 14 pubblicazioni dello stesso genere.
*2 Anche se non ci sono pubblicazioni che corrispondono alla specie, ci sono 10 pubblicazioni dello stesso genere.
Per questa ricerca sono state selezionate piante che, secondo le loro applicazioni etnobotaniche,
sono utilizzate nel trattamento di infezioni, ferite e altre affezioni della pelle o tessuti
sottocutanei, disturbi del sistema respiratorio, digerente e urogenitale e che mostrano proprietà
antisettica, cicatrizzante, astringente, balsamica, diuretica, antidiarroica, etc.
9
3. DESCRIZIONE ETNOBOTANICA DELLE PIANTE
Di seguito vengono riportate le informazioni ottenute sulle piante studiate, che si riferiscono
principalmente alla famiglia di appartenenza, a causa delle limitate conoscenze rinvenute sulle
specie descritte in Tabella 1.
3.1. Famiglia Asteraceae
3.1.1. Descrizione botanica
A questa famiglia appartengono alberi sempreverdi, erbe annuali o perenni, arbusti e liane. Gli
alberi di grandi dimensioni sono scarsamente rappresentati e le piante acquatiche sono molto rare
(Castrillón et al., 2003).
Le foglie sono alterne e spitalate, opposte o verticillate, semplici, ma a volte profondamente
lobate o sette, con margine intero o variamente dentato, di solito penninervie o palminervie; le
stipole sono assenti. I fiori sono densamente raggruppati in capolini indefiniti circondanti da un
involucro di brattee; i capolini sono disposti in infiorescenze secondarie definite, terminali o
ascellari. I fiori sono ermafroditi o unisessuali, a volte sterili, attinomorfi o zigomorfi. Il frutto è
un achenio sormontato da un pappo persistente, a volte appiattito, alato o spinoso; l’endosperma è
scarso o assente (Judd et al., 2007).
3.1.2. Classificazione e distribuzione
Le Asteraceae sono una delle famiglie di angiosperme più variegate, altamente rappresentate e
mostrano tuttora un’intensa e attiva speciazione (Strasburger, 2004).
La famiglia comprende 1535 generi e 23000 specie con distribuzione cosmopolita e comune
soprattutto nelle regioni temperate e tropicali, montane e in luoghi aperti e/o aridi. I generi
principali sono Senecio, Vernonia, Cousinia, Eupatorium, Centaurea, Hieracium, Helichrysum,
Artemisia, Baccharis, Mikania, Saussurea, Cirsium, Aster, Jurinea, Bidens, Gnaphalium e
Solidago (Judd et al., 2007).
10
3.1.3. Piante e prodotti d’interesse economico
Piante d’interesse alimentare sono Cichorium (cicoria), Cynara (carciofo), Helianthus (girasole),
Taraxacum (tarassaco) e Lactuca (lattuga). Il genere Artemisia contiene piante utilizzate come
spezie (assenzio, dragoncello). Tanacetum (piretro) e Pulicaria (incensaria) contengono specie
con proprietà insetticide. Ambrosia è nota in quanto provoca allergie respiratorie. Alcuni generi
contengono importanti piante infestanti, infine sono piante ornamentali alcune specie dei generi
Calendula (calendula), Dendranthema, Argyranthemum, Leucanthemum (crisantemo), Dahlia,
Tagetes (tagete), Senecio, Helianthus (girasole) e molti altri.
Le piante di questa famiglia presentano oligosaccaridi, poliacetileni e olii aromatici terpenoidi, e
lattoni sesquiterpenici ma senza composti iridoidi (Judd et al., 2007).
3.1.4. Ambrosia arborescens Mill
Ambrosia arborescens Mill. è una pianta aromatica che cresce nella parte occidentale del Sud
America (Ecuador, Bolivia, Perù), dove è comunemente conosciuta come "marco" e
tradizionalmente utilizzata per scacciare gli insetti e dagli sciamani per “togliere i fantasmi” (De
Leo et al ., 2010).
Numerose sono le applicazioni terapeutiche nella medicina tradizionale in Perù, Bolivia ed
Ecuador riportate in letteratura: Foglie e fusti sono usati come antisettici, antinfiammatori e
repellenti per gli insetti (Rojas et al., 2003); per curare reumatismi e dolori muscolari le foglie
devono essere arrostite e messe sulla zona dolente prima di coricarsi (De la Cruz et al., 2007);
come abortiva, un decotto delle parti aeree della pianta viene ingerito (Macía et al., 2005); la
pianta fresca è utilizzata per curare l’ "Espanto", come decotto per i reumatismi ed è utilizzato
anche nei bagni post-partum (Tene et al., 2007).
"Espanto", è una patologia tipica andina, mal definita, in cui i problemi psicosomatici
provenienti da fattori fobici, producono una profonda debolezza biologica e psicologica
(Tene et al., 2007).
11
Tutte le specie Ambrosia sono caratterizzate da un elevato contenuto di lattoni sesquiterpenici
con proprietà antibatterica, antimicotica, citotossica, etc.. Due studi precedenti su Ambrosia
arborescens hanno riferito l'isolamento, dalle parti aeree della pianta, di quattro lattoni
sesquiterpenici: damsina, coronopilina, psilostachina e psilostachina C (De Leo et al., 2010).
3.1.5. Chuquiraga jussieui J.F. Gmel
Chuquiraga è un genere del Nuovo Mondo con 25 specie distribuite nelle montagne delle Ande e
la Patagonia del Cile e dell'Argentina (Flagg et al., 1999)
Numerose sono le applicazioni terapeutiche nella medicina tradizionale riportate in letteratura: Le
foglie, fusti e fiori di Chuquiraga spinosa, ingeriti come infuso riducono le infiammazioni renali
e della prostata, sono depurativi, diuretici (De la Cruz et al., 2007), antinfiammatori e sono
utilizzati anche per trattare la gonorrea (Rojas et. al, 2003). Le foglie e fusti di Chuquiraga
atacamensis conservati in etanolo vengono usati come preparazione topica per curare i
reumatismi, febbre e infiammazione. La resina della pianta si applica come cataplasma per
trattare contusioni e ferite e per consolidare lussazioni e fratture (Alberto et al., 2009).
Chuquiraga ulicina è usata come rimedio per l’iperglicemia (Flagg et al., 1999). Nel caso di
Chuquiraga jussieui J. F. Gmel l’ intera pianta è utilizzata sotto forma di decotto per il
trattamento di allergie, infezioni interne e malaria (Tene et al., 2007).
In Chuquiraga erinacea e Chuquiraga ulicina sono stati trovati, diversi triterpeni pentaciclici che
possiedono un gran numero di attività biologiche, tra cui l’azione antinfiammatoria e
chemopreventiva (Vela et al, 2011;. Flagg et al, 1999.).
3.2. Famiglia Myrtaceae
3.2.1. Descrizione botanica
Alla famiglia delle Mirtacee appartengono alberi o arbusti, spesso con corteccia desquamante. Le
foglie sono opposte o alterne e spiralate, raramente verticilate, intere, di solito penninervie, con
punti pellucidi sparsi (cioè cavità secretrici sferiche contenenti terpenoidi e altri composti
aromatico-resinosi); le stipole sono piccole o assenti. Le infiorescenze sono definite, ma talvolta
12
apparentemente indefinite, terminali o ascellari, talvolta sono ridotte a un unico fiore. I fiori sono
di solito ermafroditi, attinomorfi. Il frutto è generalmente a bacca o a capsula loculicida, di rado a
noce (Judd et al., 2007).
3.2.2. Classificazione e distribuzione
La famiglia Myrtaceae comprende 144 generi e 3100 specie con una distribuzione pantropicale,
diffuse in un’ampia varietà d’ambienti; molto differenziata nella regione temperato-calda
dell’Australia. I generi principali sono Eucalyptus, Eugenia, Myrcia, Syzygium, Melaleuca,
Psidium e Calyptranthes, altri generi d’interesse sono Rhodomyrtus e Myrcianthes (Judd et al.,
2007).
3.2.3. Piante e prodotti d’interesse economico
Le Myrtaceae sono piante legnose, sempreverdi, contraddistinte dalla presenza regolare di
ghiandole lisigene contenenti olii eterei, da cui deriva la loro grande importanza come piante
medicinali e aromatiche. Alcune specie possono raggiungere i 100 m di altezza ed essere quindi
considerate tra gli alberi giganti della terra. Alcune specie sono coltivate per la loro crescita
rapida, in particolare Eucalyptus globulus, nelle regione più calde come quella mediterranea,
dove vive l’unica specie europea, il mirto (Myrthus communis) che viene spesso coltivato
(Strasburger, 2004).
Molti generi includono specie ornamentali apprezzate per i loro sepali, petali e/o stami
appariscenti; tra questi Myrtus (mirto), Eucalyptus (eucalipto) Callistemon, Melaleuca,
Leptospermum e Rhodomyrtus. Il genere Eucalyptus è importante per la produzione di legname. I
bocci di Syzygium aromaticum sono i chiodi di garofano e i frutti di Pimenta dioica sono
denominati pepe di Giamaica. Molte specie forniscono frutti commestibili, come Psidium
guajava (guava), Syzygium jambos, Syzygium malaccense, Myrciaria cauliflora, Eugenia uniflora
e Feijoa sellowiana. Da parecchie specie di Eucalyptus viene estratto un olio, usato come aroma
e antisettico. Al genere Malaleuca appartengono alberi infestanti, molto dannosi dal punto di
vista economico ed ecologico.
13
Le piante di questa famiglia contengono terpeni (Judd et al., 2007).
3.2.4. Myrcianthes hallii (Berg) McVaugh
Esistono circa 50 specie di Myrcianthes, presenti nella regione Neotropicale (Cole et al., 2008).
Ci sono anche le specie ampiamente distribuite nei paesi sudamericani, come Myrcianthes
pungens, un albero che si trova principalmente in Brasile, Argentina, Uruguay e Paraguay
(Andrade et al., 2011).
Numerose sono le applicazioni terapeutiche nella medicina tradizionale riportate in letteratura:
L'infuso delle foglie e il decotto del legno di Mycianthes cisplatensis sono noti per le proprietà
astringenti, toniche, stimolanti, febbrifughe e diuretiche (Kott et al., 1998). E’ particolarmente
utile per lavare e curare le ulcere ed è considerato anche come un buon rimedio per le affezioni
polmonari e bronchiali (Penna, et al., 2001). Il frutto di Myrcianthes pungens è commestibile e le
foglie sono utilizzate nella medicina popolare, principalmente come antidiarroico e tonico
(Andrade et al., 2011). L'infuso delle foglie e della corteccia di Myrcianthes rhopaloides viene
assunto come tonico e in casi di gastrite (Tene et al., 2007). Le foglie di Myrcianthes discolor
sono utilizzate come anti-infiammatorio (Bussmann et al., 2010), in caso di reumatismi,
raffreddori, mal di stomaco, per regolarizzare il ciclo mestruale e per la pulizia orale (Bussmann
et al., 2009).
3.3. Famiglia Solanaceae
3.3.1. Descrizione botanica
Secondo Judd et al. (2007) a questa famiglia appartengono erbe, arbusti, alberi o rampicanti,
generalmente con floema interno. Le foglie sono alterne o spiralate, spesso a coppie con ambedue
le foglie sullo stesso lato del fusto, semplici, talvolta profondamente lobate o anche pennatocomposte, intere o serrate, penninervie; le stipole sono assenti. Le infiorescenze sono definite,
talvolta ridotte a un singolo fiore, terminali, ma di solito in apparenza laterali. I fiori sono in
genere ermafroditi e attinomorfi. Il frutto è in genere a bacca, capsula settifraga o schizocarpo di
nucule; i semi sono spesso appiattiti.
14
3.3.2. Classificazione e distribuzione
La famiglia Solanaceae comprende 147 generi e 2930 specie diffuse un po’ ovunque, ma
rappresentate soprattutto nelle regioni neotropicali. Molte specie crescono in climi avversi. I
generi principali sono Solanun, Lycianthes, Cestrum, Nicotiana, Physalis e Lycium. (Judd et al.,
2007).
3.3.3. Piante e prodotti d’interesse economico
Le Solanaceae sono molto importanti per l’economia (Strasburger, 2004). I membri della
famiglia sono, per lo più, velenosi per la presenza di tropano o alcaloidi steroidei. Le Solanaceae
forniscono diverse droghe per farmaci, alcune delle quali sono potenti narcotici; fra queste
Nicotiana (tabacco), Atropa (belladonna) e Datura (stramonio). Sorprendentemente, comunque,
la famiglia fornisce anche frutti commestibili come caienna, peperoncini, pomodori, melanzane,
etc. I tuberi di Solanun tuberosum (patata) sono un’importante fonte di amido. Molti generi
forniscono piante ornamentali, fra cui Brunfelsia, Cestrum, Datura, Petunia e Solanum.
Le piante di questa famiglia presentano vari tipi di alcaloidi (Judd et al., 2007).
3.3.4. Solanum americanum Mill
Numerose sono le applicazioni terapeutiche nella medicina tradizionale riportate in letteratura: Le
foglie di Solanum americanum sono usate per curare la tosse (Braga, 2007). L'estratto acquoso
preparato con le foglie fresche è usato per pulire le ferite e ridurre l'infiammazione (De la Cruz et
al., 2007). Il fusto, le foglie e i fiori sono usati, come infusi, in casi di: infiammazione, mal di
testa, mal di stomaco, dolore epatico, ematoma, dermatite, febbre, influenza, infezioni interne,
polmonite e problemi renali (Tene et al., 2007). Tutta la pianta fresca è usata per trattare la
sinusite, l’influenza, la febbre, vesciche e l’herpes labiale (Bussmann, 2010).
Le foglie di Solanum nigrum contengono quantità apprezzabili di minerali come calcio, ferro e
fosforo, vitamine A e C, così come proteine e aminoacidi come la metionina, scarsi in altre piante
comunemente commercializzati (Padulosi & Hoeschle-Zeledon, 2004).
15
3.4. Famiglia Tropaeolaceae
3.4.1. Descrizione botanica
Questa piccola famiglia di erbe rampicanti e succulente (Strasburger, 2004) presenta un olio acre
nella linfa e a volte produce tuberi. Si tratta di piante a portamento scadente il cui fusto cresce
normalmente in posizione strisciante, intorno ad esso; le foglie sono disposte in maniera alterna,
sono peltate, a volte profondamente lobate e senza stipole. I vistosi fiori sono bisessuali e
irregolari. Il frutto è uno schizocarpo (Heywood, 1993).
3.4.2. Classificazione e distribuzione
La famiglia è suddivisa in pochissimi generi, di cui i più rappresentati sono Tropaeolum con circa
90 specie e Magallana che ha soltanto una specie. Magallana differisce da Tropaeolum per il
fatto che i frutti sono alati. La famiglia era un tempo collocata nella Geraniaceae, ma ora e tenuta
separata, in quanto si differenzia per avere stami distinte e nessun becco sul frutto. Altre relazioni
sono state suggerite con le famiglie Limnanthaceae e Sapindaceae. La famiglia è originaria
principalmente delle montagne dal Messico al Cile centrale e dell'Argentina (Heywood, 1993).
3.4.3. Piante e prodotti d’interesse economico
Circa otto specie sono piante ornamentali, come Tropaeolum majus e Tropaeolum peregrinum. I
semi immaturi di Tropaeolum majus sono messi sotto aceto e utilizzati come capperi. Le foglie e
tuberi di alcune specie come Tropaeolum tuberosum sono commestibili (Heywood, 1993).
3.4.4. Tropaeolum tuberosum Ruiz & Pav
Tropaeolum tuberosum è un tubero indigeno andino coltivato per secoli in Argentina, Bolivia,
Colombia, Ecuador, Perù e Venezuela e recentemente è stato introdotto in Nuova Zelanda. E’ una
pianta erbacea, perenne, che cresce fra i 2400 e i 4300 metri sopra il livello del mare. Il
portamento della pianta è prostrato o rampicante e cresce oltre 1 m di diametro e 0,5 m di altezza
e produce foglie sottili. Questi tuberi presentano una diversità marcata nella morfologia e nel
colore, che varia dal crema al viola scuro (Chirinos et al., 2008; Flores et al., 2003).
16
I montanari andini la usano sia come alimento sia come medicinale. Tutte le parti della pianta
possono essere consumate, compresi i tuberi, le foglie e i fiori, ma il tubero è il più comunemente
consumato a causa del suo sapore e valore nutritivo (Flores et al., 2003).
Nella medicina popolare della regione andina se ne riscontrano numerosi usi medicinali. Le diete
a base di Tropaeolum tuberosum hanno fama di avere effetti benefici sul fegato e sui reni e di
alleviare i disturbi della prostata e delle vie urinarie. Ai tuberi sono associati effetti antibiotici,
vermifughi e diuretici. Sono utilizzati per il trattamento di malattie della pelle, come l'eczema e le
macchie cutanee e anche per il trattamento della tonsillite, della febbre dengue, della febbre
malaria e le condizioni dopo il parto. Nelle pratiche medicinali moderne è usata come
emmenagogo in quanto si ritiene che favorisca le mestruazioni.
Tra i suoi numerosi e reputati effetti medicinali, questa pianta è meglio conosciuta nelle Ande per
la sua presunta capacità negli uomini di sopprimere l'appetito sessuale e diminuire il potenziale
riproduttivo e la funzione erettile. Invece nelle donne, si ritiene che aumenti la fertilità (Flores et
al., 2003; Grau et al., 2003).
Le proprietà medicinali di Tropaeolum tuberosum potrebbero essere correlate al contenuto in
glucosinolati nonché al contenuto in composti fenolici antiossidanti in essi presenti (Chirinos et
al., 2007).
17
4. MATERIALI E METODI
4.1.Materiali
4.1.1. Reattivi

Metanolo Sigma Aldrich (HPLC grade)

Acido formico 1 M Sigma Aldrich

Acetonitrile Sigma Aldrich (LC grade)

Acqua millipore grade

Brodo Mueller-Hinton Biolife

Agar Mueller-Hinton Biolife

Agar McConkey Biolife
4.1.2. Strumentazione

Piastra magnetica Hieidolph MR 3001

Evaporatori rotanti BÜCHI R-200 e BÜCHI R-II.

Liofilizzatore Edwards Modulyo

Membrane Spectra/Por Biotech Regenerated Cellulose MWCO: 3500

Termostato MEMMERT
4.2.Metodi
4.2.1. Preparazione degli estratti vegetali
I campioni sono stati preparati mediante estrazione con soluzione idrometanolica acidificata con
acido formico 0,1%, a partire dalla pianta essiccata e tritata. Le parti utilizzate di ogni pianta sono
specificate nella seguente tabella:
Tabella 3. Droga vegetale utilizzata di ogni specie
Nome scientifico
Ambrosia arborescens Mill
Chuquiraga jussieui J.F. Gmel
Myrcianthes hallii (Berg) McVaugh
Solanum americanum Mill
Tropaeolum tuberosum Ruiz & Pav
Nome comune
Marco
Chuquiragua
Arrayán
Hierba Mora
Mashua
18
Parte utilizzata
Foglie
Foglie, fiori
Foglie
Foglie, semi
Tuberi
Nel dettaglio, 10 g di pianta sono stati estratti con 100 mL di soluzione per 24 ore a temperatura
ambiente e con agitazione costante. Dopo 24 ore l'estratto è stato filtrato con carta da filtro e il
residuo è stato ri-estratto nelle stesse condizioni. Dopo 48 ore, l'estratto è stato filtrato e gli
estratti risultanti sono stati riuniti e concentrati sotto vuoto per la rimozione dei solventi.
L’estratto concentrato è stato liofilizzato per la determinazione del residuo secco.
L’attività antibatterica di questi cinque estratti è stata valutata contro Staphylococus aureus ed
Escherichia coli. Gli estratti di Chuquiraga jussieui, Myrcianthes hallii e Tropaeolum tuberosum,
che hanno dimostrato attività antibatterica contro Staphylococcus aureus, sono stati sottoposti a
ulteriore indagine.
In particolare tali estratti sono stati divisi in 2 aliquote: la prima è stata liofilizzata e la seconda è
stata dializzata contro acqua distillata (rapporto 1:100) utilizzando una membrana per dialisi
(Spectra/Por) con cut-off molecolare nominale pari a 3500 Da, per 24 ore a 4°C e con agitazione
costante. Le frazioni ottenute, cioè il dializzato (PM < 3500 Da) e il ritenuto (PM > 3500 Da)
sono state liofilizzate. In questo modo sono stati ottenuti tre campioni per ciascun estratto che
sono stati sottoposti a valutazione dell’attività antibatterica.
Pianta essiccata
e tritata
Estrazione
Filtrazione
Liofilizzazione
Concentrazione
Campione 1
Dializzato (PM <
3500 Da)
Liofilizazione
Campione 2
Ritenuto (PM >
3500 Da)
Concentrazione
Liofilizzazione
Dialisi
Figura 3. Schema di preparazione degli estratti vegetali
19
Campione 3
4.2.2. Determinazione dell’attività antibatterica
a. Preparazione della coltura cellulare batterica
Sono stati studiati dieci ceppi di Staphylococus aureus, di cui 5 meticillino-resistenti (MRSA) e 5
meticillino-sensibili (MSSA); tra i cinque ceppi meticillino-resistenti, tre ceppi erano
multiresistenti (resistenti ad almeno tre classi di antibiotici). Per quanto riguarda Escherichia coli,
sono stati studiati 5 ceppi, di cui 3 multiresistenti (resistenti ad almeno tre classi di antibiotici) e 2
sensibili. Tutti questi ceppi sono conservati presso l'Istituto di Microbiologia dell’Università di
Genova.
Gli isolati sono stati identificati a livello di specie utilizzando un sistema API STAPH nel caso di
Staphylococus aureus e API 20 E nel caso di Escherichia coli (bioMèrieux, Marcy l'Etoile,
France). L’antibiotipo è stato determinato utilizzando il “disk diffusion test” suggerito dalle linee
guida del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2006). I ceppi sono stati coltivati in
brodo Mueller-Hinton, agar Mueller-Hinton e agar MacConkey (Biolife, Milano, Italia) a 37°C.
b. Determinazione della minima concentrazione inibente (MIC)
La minima concentrazione inibente (MIC) degli estratti è stata determinata con il metodo broth
microdilution suggerito dalle linee guida del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI,
2006 ).
I batteri in crescita esponenziale (5 × 105 cellule per mL, inoculo finale) sono stati aggiunti, alle
varie concentrazioni di estratto, 2 volte diluiti in 96 pozzetti di una piastra microtiter con terreno
di cottura Mueller-Hinton. Dopo 18-24 ore d’incubazione a 37°C la concentrazione di estratto
che ha impedito una crescita batterica visibile è stata registrata come la MIC. Tutti i test sono
stati eseguiti in triplicato e sono stati ripetuti tre volte.
4.2.3. Analisi UPLC-PDA-hESI-MSn
La frazione corrispondente al dializzato (PM < di 3500 Da) ottenuta da Myrcianthes hallii è stata
sottoposta ad analisi UPLC-PDA-hESI-MSn.
L’analisi è stata condotta utilizzando un sistema Jasco X-LC dotato di una pompa quaternaria, un
detector UPLC-PDA e uno spettrometro di massa a trappola lineare LTQ-XL (Thermo Scientific)
20
attraverso una sorgente h-ESI. La separazione è stata effettuata utilizzando una colonna
Purospher® RP-18 (5 µm) LiChroCART® 250-4 (250 mm x 4 mm i.d., 5 µm) (Merck) con la
corrispondente precolonna (Merck).
La fase mobile è rappresentata da acqua acidificata con acido formico allo 0,1 % (eluente A) e
acetonitrile (eluente B), il flusso è stato impostato a 1 mL/min e il volume d’iniezione a 5 µL. Il
gradiente di eluizione è mostrato nella seguente tabella:
Tabella 4. Metodo di eluizione degli estratti vegetali.
Tempo
(min)
5
40
45
47
52
57
Acqua acida Acetonitrile
(H3O+)
(CH3CN)
98
2
60
40
0
100
0
100
98
2
98
2
La temperatura del sistema è stata mantenuta a 24 °C. I cromatogrammi sono stati registrati a λ
280 nm (oltre che a 220, 366, 520 nm); gli spettri sono stati registrati nel range 200-650 nm per
tutti i picchi.
La trappola ionica ha operato nelle condizioni di data dependent, full scan (80-1500 m/z), zoom
scan e in modalità MSn. Per ottenere gli ioni frammento è stata applicata un’energia di collisione
del 35%; il voltaggio è stato tenuto a 3 kV per la ionizzazione negativa e 5 kV per quella positiva,
la temperatura del capilare era 275 °C, il flusso di gas nella guaina era di 20 unità arbitrarie e il
flusso ausiliario di gas era di 17 unità arbitrarie.
Poiché per la specie Myrcianthes hallii non erano presenti dati di letteratura relativi alla sua
composizione chimica, sono state utilizzate per l‘ottimizzazione dello spettro di massa le
condizioni operative standard dello strumento.
21
5. RISULTATI E DISCUSSIONE
Gli estratti ottenuti da Ambrosia arborescens, Chuquiraga jussieui, Myrcianthes hallii, Solanum
americanum e Tropaeolum tuberosum sono stati sottoposti ad analisi microbiologica come
riportato in materiali e metodi. Prima di tali analisi per ogni estratto è stato determinato il residuo
secco dopo la liofilizzazione (Tabella 5).
Tabella 5. Quantità di residuo secco per campione
Campione
Ambrosia arborescens Mill
Chuquiraga jussieui J.F. Gmel
Myrcianthes hallii (Berg) McVaugh
Solanum americanum Mill
Tropaeolum tuberosum Ruiz & Pav
Residuo secco (g)
0,9472
0,6426
1,2358
1,1529
0,9294
Corrispondenti a:
(g pianta essicata)
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
I risultati riportati in Tabella 6, 7, 8 e 9 indicano che Myrcianthes hallii, Chuquiraga jussieui e
Tropaeolum tuberosum sono attivi nei confronti di Staphylococus aureus; mentre Solanum
americanum e Ambrosia arborescens non mostrano attività nei confronti di Staphylococus
aureus, in quanto il valore di MIC range calcolato è maggiore della massima concentrazione
testata (0,5 g\mL di droga vegetale).
Tabella 6. MIC corrispondente a mg/mL di droga vegetale contro Staphylococus aureus
MIC (mg/mL*)
Range
50%
> 500
> 500
250 – 500
500
3,91 – 7,81
3,91
> 500
> 500
500 - > 500
500
Campione
Ambrosia arborescens Mill
Chuquiraga jussieui J.F. Gmel
Myrcianthes hallii (Berg) McVaugh
Solanum americanum Mill
Tropaeolum tuberosum Ruiz & Pav
22
90%
> 500
500
7,81
> 500
> 500
Tabella 7. MIC corrispondente a mg/mL di residuo secco contro Staphylococus aureus
MIC (mg/mL)
Range
50%
> 105,24
> 105,24
35,70 – 71,40
71,40
1,07 – 2,15
1,07
> 128,10
> 128,10
103,27 - > 103,27
103,27
Campione
Ambrosia arborescens Mill
Chuquiraga jussieui J.F. Gmel
Myrcianthes hallii (Berg) McVaugh
Solanum americanum Mill
Tropaeolum tuberosum Ruiz & Pav
90%
> 105,24
71,40
2,15
> 128,10
> 103,27
Per quanto riguarda Escherichia coli nessun campione ha mostrato attività antibatterica; il valore
di MIC range calcolato risulta infatti maggiore della massima concentrazione testata (0,5 g\mL di
droga vegetale).
Tabella 8. MIC corrispondente a mg/mL di droga vegetale contro Escherichia coli
MIC (mg/mL)
Range
50%
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
Campione
Ambrosia arborescens Mill
Chuquiraga jussieui J.F. Gmel
Myrcianthes hallii (Berg) McVaugh
Solanum americanum Mill
Tropaeolum tuberosum Ruiz & Pav
90%
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
Tabella 9. MIC corrispondente a mg/mL di residuo secco contro Escherichia coli
Campione
Ambrosia arborescens Mill
Chuquiraga jussieui J.F. Gmel
Myrcianthes hallii (Berg) McVaugh
Solanum americanum Mill
Tropaeolum tuberosum Ruiz & Pav
Range
> 105,24
> 71,40
> 137,31
> 128,10
> 103,27
23
MIC (mg/mL)
50%
> 105,24
> 71,40
> 137,31
> 128,10
> 103,27
90%
> 105,24
> 71,40
> 137,31
> 128,10
> 103,27
Le indagine sono quindi proseguite sugli estratti delle 3 piante risultate attive conto
Staphylococcus aureus. Gli estratti sono stati sottoposti a dialisi nelle condizioni operative
riportate in Materiali e Metodi.
Sia il dializzato (PM < 3500 Da) sia il ritenuto (PM > 3500 Da) sono stati sottoposti ad analisi
microbiologica (Tabella 11-16) dopo averne determinato il residuo secco. I risultati sono riportati
in Tabella 10.
Tabella 10. Quantità di residuo secco per campione
Campione
Chuquiraga jussieui J.F. Gmel
Myrcianthes hallii (Berg) McVaugh
Tropaeolum tuberosum Ruiz & Pav
Residuo secco (g)
C1
C2 < 3500
C3 > 3500
A1
A2 < 3500
A3 > 3500
M1
M2 < 3500
M3 > 3500
0,3732
0,4917
0,0666
1,2457
0,5432
0,5251
1,0977
1,0028
0,0545
Corrispondenti a:
(g pianta essicata)
3,25
2,5
2,5
4,5
2,5
2,5
4,5
2,5
2,5
I risultati delle analisi microbiologiche indicano che l’estratto di Myrcianthes hallii è risultato
essere il più attivo. Le sue frazioni di dialisi sono anche le più efficaci nell’inibire la crescita di
Staphylococcus aureus.
Tabella 11. MIC corrispondente a mg/mL di droga vegetale di Myrcianthes hallii contro
Staphylococus aureus
Campione
M1
M2 < 3500
M3 > 3500
Range
3,91 - 7,81
7,81 - 15,63
3,91 - 7,81
24
MIC (mg/mL)
50%
3,91
15,63
7,81
90%
7,81
15,63
7,81
Tabella 12. MIC corrispondente a mg/mL di residuo secco di Myrcianthes hallii contro
Staphylococus aureus
Campione
M1
M2 < 3500
M3 > 3500
Range
1,08 - 2,16
1,70 – 3,40
0,82 – 1,64
MIC (mg/mL)
50%
1,08
3,40
1,64
90%
2,16
3,40
1,64
Tabella 13. MIC corrispondente a mg/mL di droga vegetale di Chuquiraga jussieui contro
Staphylococus aureus
Campione
C1
C2 < 3500
C3 > 3500
Range
250 - > 500
> 500
500 - > 500
MIC (g/mL)
50%
500
> 500
500
90%
500
> 500
500
Tabella 14. MIC corrispondente a mg/mL di residuo secco di Chuquiraga jussieui contro
Staphylococus aureus
Campione
C1
C2 < 3500
C3 > 3500
MIC (mg/mL)
Range
50%
28,71 - > 57,42
57,42
> 98,34
> 98,34
13,32 - > 13,32
13,32
90%
57,42
> 98,34
13,32
Tabella 15. MIC corrispondente a mg/mL di droga vegetale di Tropaeolum tuberosum contro
Staphylococus aureus
Campione
T1
T2 < 3500
T3 > 3500
Range
500 - > 500
> 500
> 500
25
MIC (g/mL)
50%
500
> 500
> 500
90%
> 500
> 500
> 500
Tabella 16. MIC corrispondente a mg/mL di residuo secco di Tropaeolum tuberosum contro
Staphylococus aureus
Campione
T1
T2 < 3500
T3 > 3500
Range
121,97 - > 121,97
> 200,56
> 10,90
MIC (g/mL)
50%
121,97
> 200,56
> 10,90
90%
> 121,97
> 200,56
> 10,90
Per quanto riguarda Chuquiraga jussieui e Tropaeolum tuberosum, sebbene siano risultate attive
contro Staphylococcus aureus, il valore di MIC range calcolato è generalmente compreso tra 0,5 > 0,5; cioè è uguale o maggiore della massima concentrazione di droga vegetale studiata.
È interessante osservare che, anche se i ceppi meticillino-resistenti di solito mostrano resistenza a
diversi farmaci, in questo caso non sono state osservate differenze rilevanti tra i diversi ceppi
meticillino-sensibili e resistenti.
In base ai risultati ottenuti si è deciso di proseguire con la caratterizzazione chimica della frazione
a basso peso molecolare (PM < 3500 Da) dell’estratto idrometanolico acidificato di Myrcianthes
hallii. La scelta di tale frazione è dovuta al fatto che essendo tale frazione costituita da
componenti a PM < 3500 Da, si può ipotizzare che siano presenti in essa composti polifenolici ai
quali numerose pubblicazioni attribuiscono attività antibatterica (Daglia, 2012).
Dall’analisi UPLC-PDA-hESI-MSn della frazione a basso peso molecolare (PM < 3500 Da) è
stato ottenuto a λ 280 nm il seguente cromatogramma:
26
Figura 4. Cromatogramma ottenuto dall’analisi della frazione a basso peso molecolare (PM <
3500 Da) dell’estratto idrometanolico acidificato di Myrcianthes hallii.
Sono stati identificati 23 composti (Tabella 17 e 18) sulla base del comportamento
cromatografico e dello spettro di MS e MS2.
Tabella 17. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura
chimica proposta nell’estratto di Myrcianthes hallii mediante UPLC-PDA-hESI-MSn con
ionizzazione negativa
Picco
m/z
[M+H]-
m/z ioni frammento
(% del picco di base)
Struttura proposta
1
Tempo di
ritenzione
(min)
2,54
191
Acido chinico
2
3
3,14
5,95
133
481
4
5
11,03
11,62
169
633
173 (100), 127 (100), 111
(35), 93 (40), 85 (55)
115 (100), 89 (2)
301 (100), 257 (2), 229 (2),
275 (5)
81 (2), 125 (100)
301 (100), 275 (20), 249 (15),
615 (2), 463 (5), 421 (5)
27
Acido malico
Esaidrossi difenoil glucosio
Acido gallico
Esaidrossi difenoil
galloilglucosio
6
15,65
305
7
21,95
577
8
23,11
289
9
11
23,66
25,26
457
479
12
26,75
615
13
26,93
449
14
27,43
463
15
27,69
463
17
18
28,83
29,23
433
447
19
20
30,23
31,15
447
433
21
32,55
483
22
36,40
629
179 (100), 261 (45), 221 (90),
219 (80), 165 (25), 125 (20)
407 (40), 289 (15), 425 (100),
451 (20)
245 (100), 205 (35), 179 (10),
125 (5), 109 (2)
331 (65), 169 (100), 305 (40)
316 (100), 317 (90), 179 (5),
151 (2)
463 (100), 283 (2), 373 (2),
301 (10)
316 (100), 179 (2), 317 (30),
151 (2)
316 (100), 151 (2), 179 (2),
317 (60)
301 (100), 179 (2), 151 (2)
301 (100), 151 (2), 179 (2)
285 (95), 284 (100), 257 (5),
255 (10)
301 (100), 179 (2), 151 (2)
287 (40), 269 (100), 259 (10),
179 (5), 151 (2)
271 (60), 331 (2), 313 (100),
169 (100), 211 (20), 193 (2)
463 (85), 301 (100), 445 (10)
Gallocatechina o
Epigallocatechina
Procianidina B1
Catechina o Epicatechina
Epigallocatechina gallato
Miricetina 3-O-galattoside
Quercetina 3-O-β-galattoside6”-O-gallato
Miricetina 3-O-arabinoside
Miricetina 3-O-ramnoside
Quercetina 3-O-galattoside o
Quercetina 3-O-glucoside
Quercetina 3-O-arabinosio
Campferolo 3-O-glucoside
Quercetina 3-O-ramnoside
Aromadendrina-ramnoside
Digalloilglucosio
Cipellogina A o B
Tabella 18. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura
chimica proposta nell’estratto di Myrcianthes hallii mediante UPLC-PDA-hESI-MSn con
ionizzazione positiva
Picco
m/z
[M+H]+
10
Tempo di
ritenzione
(min)
25,25
m/z ioni frammento
(% del picco di base)
481
319 (100)
16
28,56
197
23
43,72
343
179 (100), 161 (15), 151 (2),
119 (2), 105 (2)
343 (2), 325 (10), 301 (2), 240
(100)
28
Struttura proposta
Quercetagetina 7-O-β-Dglucopiranoside
Acido gluconico
Pinobanksin 3-O-isobutirrato
Time (min)
Arrayan2 #483 RT: 2,33 AV: 1 NL: 1,05E4
F: ITMS - c ESI Full ms [80,00-1500,00]
191,06
10000
Acido chinico
8000
6000
134,95
4000
2000
303,06
110,98
223,11
179,06
100
150
245,18
200
250
383,17
349,17
289,20
300
350
411,17 439,18
400
505,29 533,24
450
m/z
500
695,21
550
600
650
766,88
700
800,10
750
800
Arrayan2 #492 RT: 2,37 AV: 1 NL: 2,48E3
F: ITMS - c ESI d Full ms2 190,86@cid35,00 [50,00-395,00]
126,87
100
172,93
80
84,90
60
92,99
40
20
58,83
50
60
86,83
70,90
80,99
70
80
110,86
108,99
98,90
90
114,85
100
110
191,11
170,92
128,90
120
130
144,94
140
154,92
150
160
m/z
170
180
190
200
210
220
230
240
250
260
Figura 5. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 2,33 min della frazione a
basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
Time (min)
Arrayan2 #651 RT: 3,14 AV: 1 NL: 1,68E4
F: ITMS - c ESI Full ms [80,00-1500,00]
133,01
Acido malico
15000
10000
5000
114,89
90,95
191,08
100
150
275,14
200
250
431,15
320,94
300
350
400
500
776,87
643,34
513,28
450
m/z
550
600
650
700
750
800
Arrayan2 #656 RT: 3,16 AV: 1 NL: 4,63E3
F: ITMS - c ESI d Full ms2 133,01@cid35,00 [50,00-280,00]
114,73
100
80
60
40
20
55
60
65
70
132,93
86,88 89,00
70,90 72,88
50
75
80
85
90
95
100
m/z
105
110
115
120
125
130
135
140
145
150
Figura 6. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 3,14 min della frazione a
basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
Time (min)
Arrayan2 #1226 RT: 5,95 AV: 1 NL: 1,13E4
F: ITMS - c ESI Full ms [80,00-1500,00]
481,07
Esaidrossi difenoil glucosio
10000
5000
482,16
631,27
603,34
483,21
420
440
460
480
500
520
540
560
580
600
632,31 655,77
620
640
660
680
700
720
740
760
780
800
m/z
Arrayan2 #1231 RT: 5,97 AV: 1 NL: 9,69E3
F: ITMS - c ESI d Full ms2 481,12@cid35,00 [120,00-975,00]
301,00
100
80
60
40
20
229,32
220
249,13 257,18
240
260
275,14
280
302,03 318,24
289,06
300
320
335,05 346,88
340
361,21
360
m/z
421,01
422,10 437,12
377,13
380
400
420
440
460
480
500
Figura 7. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 5,95 min della frazione a
basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
29
Time (min)
Arrayan2 #2245 RT: 11,03 AV: 1 NL: 3,68E3
F: ITMS - c ESI Full ms [80,00-1500,00]
168,92
Acido gallico
3000
331,13
329,22
2000
277,19
90,85
1000
112,87
100
150
323,04
421,15 451,18
309,21
170,10
200
250
499,13
375,05
300
350
140
160
400
450
m/z
180
200
m/z
609,14
555,47
500
550
645,28
600
650
700
750
800
Arrayan2 #2250 RT: 11,05 AV: 1 NL: 1,91E3
F: ITMS - c ESI d Full ms2 168,92@cid35,00 [50,00-350,00]
124,90
100
80
60
40
20
80,81
0
60
168,85
80
100
120
220
240
260
280
300
320
340
Figura 8. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 11,03 min della frazione a
basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
Time (min)
Arrayan2 #2365 RT: 11,62 AV: 1 NL: 5,38E3
F: ITMS - c ESI Full ms [80,00-1500,00]
Esaidrossi difenoil galloilglucosio
633,15
5000
4000
3000
634,22
2000
1000
635,15
540
560
580
600
620
777,31
640
660
680
700
720
740
760
804,91
780
800
m/z
Arrayan2 #2370 RT: 11,64 AV: 1 NL: 1,49E3
F: ITMS - c ESI d Full ms2 633,05@cid35,00 [160,00-1280,00]
300,95
100
80
60
40
20
230,98
220
249,01
257,16
240
260
275,06
302,00
276,13
280
300
331,10
320
373,30
340
360
401,09
380
400
421,10
445,28
420
440
463,10
460
481,23
549,22 560,96
480
500
520
540
560
589,32 605,09 615,18
580
600
620
m/z
Figura 9. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 11,62 min della frazione a
basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
Time (min)
Arrayan2 #3145 RT: 15,65 AV: 1 NL: 1,00E4
F: ITMS - c ESI Full ms [80,00-1500,00]
305,20
10000
Gallocatechina o Epigallocatechina
8000
6000
4000
611,21
350,89
2000
347,30
299,07
250
300
419,10
350
400
483,26
451,29
450
607,29
500
550
612,19
600
679,34
650
783,65
710,97
700
750
800
m/z
Arrayan2 #3154 RT: 15,70 AV: 1 NL: 2,54E3
F: ITMS - c ESI d Full ms2 305,11@cid35,00 [70,00-625,00]
178,90
100
220,99
218,98
80
60
261,08
40
124,94 136,96
20
110,88
80
100
120
140
164,87
161,01
160
167,02
180
246,91
233,03
258,84 263,01
191,09 203,12
200
220
240
m/z
260
287,06
280
300
320
340
360
380
400
Figura 10. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 15,65 min della frazione
a basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
30
Time (min)
Arrayan2 #4369 RT: 21,95 AV: 1 NL: 4,45E4
F: ITMS - c ESI Full ms [80,00-1500,00]
Procianidina B1
577,19
40000
30000
20000
578,24
10000
525,32 535,19
520
579,31
567,28
540
560
614,04
592,36
580
600
676,98
640,04
620
640
660
m/z
691,11
680
728,53 736,23
700
720
759,21
740
777,58
760
796,26
780
800
Arrayan2 #4382 RT: 22,01 AV: 1 NL: 4,81E3
F: ITMS - c ESI d Full ms2 577,13@cid35,00 [145,00-1165,00]
425,07
100
80
60
407,12
40
289,07
20
161,10
187,09
160
180
203,08
245,13
227,06
200
220
240
273,00
260
280
451,25
299,20
300
331,07
320
357,15
340
381,29 393,24
360
380
449,27
409,13
400
420
467,23
440
491,16 500,60
460
480
500
m/z
Figura 11. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 21,95 min della frazione
a basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
Time (min)
Arrayan2 #4593 RT: 23,11 AV: 1 NL: 1,19E4
F: ITMS - c ESI Full ms [80,00-1500,00]
289,15
Catechina o Epicatechina
6000
4000
335,11
245,22
0
445,29 454,25
357,18 379,45 403,13
250
300
579,10
453,25
2000
350
400
450
577,36
515,32
500
728,60
597,40
550
638,18
600
650
785,22
745,27
671,07 690,63
700
750
815,21
800
m/z
Arrayan2 #4602 RT: 23,15 AV: 1 NL: 1,35E3
F: ITMS - c ESI d Full ms2 289,10@cid35,00 [65,00-590,00]
245,00
100
80
60
205,00
40
20
124,93 136,92
108,88
80
100
120
140
179,02
165,00
160
203,14 206,13
180
200
231,08
220
247,13
240
m/z
271,11
260
280
300
320
340
360
380
400
Figura 12. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 23,11 min della frazione
a basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
Time (min)
Arrayan2 #4701 RT: 23,66 AV: 1 NL: 9,02E3
F: ITMS - c ESI Full ms [80,00-1500,00]
Epigallocatechina gallato
457,21
8000
6000
4000
2000
377,24 393,28
307,29
300
350
453,27
431,32
400
502,86
458,21
571,09
461,21 493,19 503,98
450
500
584,10
550
m/z
631,33 652,45
607,22
736,33
671,60
600
650
700
780,59 795,10
750
800
Arrayan2 #4706 RT: 23,68 AV: 1 NL: 2,01E3
F: ITMS - c ESI d Full ms2 457,14@cid35,00 [115,00-925,00]
169,01
100
80
331,11
60
305,09
40
20
193,00
160,97
120
140
160
180
205,03
200
231,17
220
240
257,29
269,13
260
287,06
280
318,99
300
320
332,01 351,18
340
360
373,15
380
395,29
400
413,16
420
439,21
440
460
480
500
m/z
Figura 13. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 23,66 min della frazione
a basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
31
Time (min)
Arrayan2 #5007 RT: 25,25 AV: 1 NL: 2,95E4
F: ITMS + c ESI Full ms [80,00-1500,00]
Quercetagetina 7-O-β-D-glucopiranoside
481,10
15000
10000
5000
319,17
109,94
145,00
100
150
200
335,13
273,44 288,64
195,13 217,19
0
250
300
503,27
455,22
399,43 418,40
350
400
450
m/z
541,16
500
579,19
550
632,76
600
731,20
673,51
650
700
747,87
750
800
Arrayan2 #5012 RT: 25,27 AV: 1 NL: 3,21E4
F: ITMS + c ESI d Full ms2 481,01@cid35,00 [120,00-975,00]
318,97
100
80
60
40
20
271,10
200
220
240
260
289,38 301,32 315,09
280
300
329,03
320
361,13 373,23 385,19 397,05
343,11
340
360
m/z
380
415,20 427,08
400
463,05
445,11
420
440
481,41
460
480
500
Figura 14. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 25,25 min della frazione a
basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
Time (min)
Arrayan2 #5009 RT: 25,26 AV: 1 NL: 2,28E4
F: ITMS - c ESI Full ms [80,00-1500,00]
Miricetina 3-O-galattoside
479,15
20000
15000
10000
5000
307,09
250
333,22
334,13
300
481,24 513,30 539,43
453,34
399,37
350
400
450
500
584,44 599,59
550
652,12
600
729,25 751,61 775,10
679,25
650
700
750
813,06
800
m/z
Arrayan2 #5014 RT: 25,28 AV: 1 NL: 1,06E4
F: ITMS - c ESI d Full ms2 479,13@cid35,00 [120,00-970,00]
316,10
317,03
100
80
60
40
20
179,06
151,07
120
140
160
197,02 207,06
180
200
233,10 245,18
220
240
271,12
260
318,05 341,13
313,18
289,14
280
300
320
m/z
359,20
340
360
461,16
417,21 433,32
389,14
380
400
420
440
460
480
500
Figura 15. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 25,26 min della frazione
a basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
Time (min)
Arrayan2 #5305 RT: 26,75 AV: 1 NL: 2,20E4
F: ITMS - c ESI Full ms [80,00-1500,00]
615,19
Quercetina 3-O-β-galattoside-6”-O-gallato
20000
15000
10000
616,21
5000
547,31
540
565,47
560
584,33 592,32
580
611,15
600
617,28
637,06
620
652,54 668,25 675,24
640
660
702,09
680
700
713,21
728,97
744,40
720
760,32 770,15
740
760
787,18
780
804,44
800
m/z
Arrayan2 #5310 RT: 26,77 AV: 1 NL: 1,50E4
F: ITMS - c ESI d Full ms2 615,13@cid35,00 [155,00-1245,00]
463,22
100
80
60
40
20
241,16
240
255,07
260
271,21
283,15
280
301,09
300
464,20
313,16
331,19
320
343,09
340
372,99
360
435,33
380
400
420
440
453,16
460
480,23 489,23
480
507,19
500
m/z
2
Figura 16. Spettro MS e spettro MS del picco con tempo di ritenzione 26,75 min della frazione
a basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
32
Time (min)
Arrayan2 #5341 RT: 26,93 AV: 1 NL: 2,33E4
F: ITMS - c ESI Full ms [80,00-1500,00]
Miricetina 3-O-arabinoside
449,14
20000
15000
10000
450,27
399,33
5000
316,03
250
401,31
300
350
441,33
400
509,29
452,22
591,29 615,25
636,91
563,04
450
500
550
600
668,57 691,39
650
728,25
754,16
700
796,56
750
800
m/z
Arrayan2 #5346 RT: 26,96 AV: 1 NL: 1,35E4
F: ITMS - c ESI d Full ms2 449,10@cid35,00 [110,00-910,00]
316,10
100
80
60
40
317,04
20
150,91
120
140
160
179,02
197,03 207,08
180
200
233,07 245,14
220
240
271,10
260
289,12
280
318,12 341,12
313,11
300
320
340
359,19
431,10
389,25 405,14
360
380
400
420
440
460
480
500
m/z
Figura 17. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 26,93 min della frazione
a basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
Time (min)
Arrayan2 #5441 RT: 27,43 AV: 1 NL: 6,07E4
F: ITMS - c ESI Full ms [80,00-1500,00]
Miricetina 3-O-ramnoside
463,22
40000
30000
20000
449,25
10000
113,01
0
316,30
100
150
200
250
465,26
431,48
300
350
400
450
m/z
523,38
500
577,08
550
622,92
705,31
600
650
700
751,76
805,09
750
800
Arrayan2 #5446 RT: 27,46 AV: 1 NL: 2,87E4
F: ITMS - c ESI d Full ms2 463,13@cid35,00 [115,00-940,00]
316,07
100
80
317,06
60
40
20
151,01
120
140
160
179,01
180
233,18 245,14
207,14
200
220
240
271,18
260
318,12 337,04
301,24
280
300
320
m/z
340
359,11
360
389,17 401,24
380
400
427,16
420
445,23
440
460
480
500
Figura 18. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 27,43 min della frazione
a basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
Time (min)
Arrayan2 #5493 RT: 27,69 AV: 1 NL: 3,40E4
F: ITMS - c ESI Full ms [80,00-1500,00]
Quercetina 3-O-galattoside
463,18
Quercetina 3-O-glucoside
30000
20000
441,24
10000
301,15
377,33
300
350
395,41
435,28
400
442,32
464,25
465,24
450
509,09
565,18 577,12 597,46
526,11
500
550
m/z
660,40
600
706,85 728,90
650
700
755,26
799,77
750
800
Arrayan2 #5498 RT: 27,72 AV: 1 NL: 2,37E4
F: ITMS - c ESI d Full ms2 463,13@cid35,00 [115,00-940,00]
301,00
100
80
60
40
20
151,02
120
140
160
179,03 189,09
180
200
221,14 233,16
220
240
255,19
260
316,08
273,16 285,24
280
300
320
343,14
340
373,02 385,26
360
380
409,12
400
435,13 445,21
420
440
463,03
460
480
500
m/z
Figura 19. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 27,69 min della frazione
a basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
33
Time (min)
Arrayan2 #5667 RT: 28,56 AV: 1 NL: 1,33E4
F: ITMS + c ESI Full ms [80,00-1500,00]
197,07
Acido gluconico
6000
4000
238,02
2000
109,98 130,17
219,17
178,90
242,20
371,19
0
100
150
200
250
421,12 437,01
451,08
331,24
305,18
300
350
493,17
419,02
400
450
m/z
540,37
500
684,21 701,25
592,88 608,38
550
600
650
731,20
751,26
700
750
800
Arrayan2 #5676 RT: 28,61 AV: 1 NL: 4,16E3
F: ITMS + c ESI d Full ms2 196,93@cid35,00 [50,00-405,00]
178,99
100
80
134,90
60
40
20
161,05
104,84 106,99 109,05
92,85
90
95
100
105
133,06
118,93 121,02 123,25
110
115
120
125
130
137,05 140,81
135
m/z
140
151,06
145
155,98
150
155
160
165
170
175
180
Figura 20. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 28,56 min della frazione
a basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
Time (min)
Arrayan2 #5721 RT: 28,83 AV: 1 NL: 8,69E3
F: ITMS - c ESI Full ms [80,00-1500,00]
Quercetina 3-O-arabinosio
433,18
8000
6000
4000
435,12
2000
377,41 389,22
350
463,27
431,61
400
489,13
450
517,08
539,40
500
562,32
660,29
607,37 625,30
584,07
550
600
729,36 743,21 755,06
650
700
788,53
750
800
m/z
Arrayan2 #5926 RT: 29,86 AV: 1 NL: 4,23E4
F: ITMS - c ESI d Full ms2 433,10@cid35,00 [105,00-880,00]
301,08
100
80
60
40
20
125,07
120
150,99
140
179,09 191,07
160
180
217,17 229,06
200
220
255,05 271,28 285,14
240
260
280
331,02 343,14
301,99
300
320
340
373,11
360
415,19
380
400
420
440
460
480
500
m/z
Figura 21. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 28,83 min della frazione
a basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
Time (min)
Arrayan2 #5801 RT: 29,23 AV: 1 NL: 1,32E4
F: ITMS - c ESI Full ms [80,00-1500,00]
Campferolo 3-O-glucoside
447,24
10000
5000
433,28
275,14
250
300
448,23
463,31
401,19
321,10
350
400
489,32 515,09
450
549,21
500
567,11
550
599,32
625,20
600
653,42 675,33
650
740,28
700
804,84 818,30
750
800
m/z
Arrayan2 #5810 RT: 29,28 AV: 1 NL: 4,32E3
F: ITMS - c ESI d Full ms2 447,14@cid35,00 [110,00-905,00]
284,13
100
285,02
80
60
40
20
255,03
254
257,12
256
258
264,17 265,14
259,24
260
262
264
266
267,10
268
269,13
270
271,12
272
m/z
273,21
274
281,14
276
278
280
282
283,13
284
286,05
286
286,93
288
289,11
290
Figura 22. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 29,23 min della frazione
a basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
34
Time (min)
Arrayan2 #5985 RT: 30,15 AV: 1 NL: 3,99E4
F: ITMS - c ESI Full ms [80,00-1500,00]
Quercetina 3-O-ramnoside
447,23
30000
20000
10000
300,25
250
433,21
403,29
300
350
400
492,96 510,12
449,26
450
561,11
500
601,38
550
739,27
631,21
600
650
700
784,79
750
800
m/z
Arrayan2 #5990 RT: 30,17 AV: 1 NL: 3,09E4
F: ITMS - c ESI d Full ms2 447,14@cid35,00 [110,00-905,00]
301,04
100
80
60
40
20
151,09
120
140
179,08 191,19
160
180
217,22 231,27
200
220
255,16
240
302,11 321,15
285,14
260
280
300
320
343,10
429,19
373,17 385,23 403,11
340
360
380
400
420
440
460
480
500
m/z
Figura 23. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 30,15 min della frazione
a basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
Time (min)
Arrayan2 #6185 RT: 31,15 AV: 1 NL: 2,99E3
F: ITMS - c ESI Full ms [80,00-1500,00]
433,25
Aromadendrina-ramnoside
505,25
2000
417,13
449,24
420
440
460
569,47
509,32 524,19
463,37 478,45
400
547,23
506,29
1000
480
500
520
540
560
652,40
657,55
594,96
580
600
m/z
620
640
688,26
660
680
700
719,79
739,29
720
740
762,15
760
780,25 796,52
780
800
Arrayan2 #6186 RT: 31,16 AV: 1 NL: 6,79E2
F: ITMS - c ESI d Full ms2 433,10@cid35,00 [105,00-880,00]
268,95
100
80
301,06
60
287,05
40
271,09
20
178,93
150,96
140
160
259,08
241,17
180
200
220
240
300,08
286,31
260
280
m/z
302,04
355,27
300
320
340
373,30 383,09
360
403,25 415,21
380
400
420
Figura 24. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 31,15 min della frazione
a basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
Time (min)
Arrayan2 #6461 RT: 32,55 AV: 1 NL: 9,28E3
F: ITMS - c ESI Full ms [80,00-1500,00]
Digalloilglucosio
483,34
8000
6000
4000
371,31
2000
338,31
300
372,28
350
417,16 431,18
447,35
400
484,35
473,16
450
505,27 528,74
500
551,31
585,20 597,14
550
m/z
625,20
680,57
600
650
723,12
700
753,30
783,32
750
800
Arrayan2 #6466 RT: 32,57 AV: 1 NL: 6,08E2
F: ITMS - c ESI d Full ms2 483,11@cid35,00 [120,00-980,00]
313,16
168,93
100
80
271,08
60
40
20
140
150,96
149,01 153,13
150
168,11
160
169,99
170
181,08
180
210,95
209,19 212,03
193,07
190
200
210
223,09
220
233,13 241,07
230
240
253,10
250
272,13
265,03
260
270
314,22
287,13 295,19
280
290
300
310
320
331,33
330
m/z
Figura 25. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 32,55 min della frazione
a basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
35
Time (min)
Arrayan2 #7229 RT: 36,40 AV: 1 NL: 1,95E3
F: ITMS - c ESI Full ms [80,00-1500,00]
Cipellogina A or B
629,33
1500
599,36
1000
500
630,24
635,34
611,47
541,01
560
580
600
620
703,28
640
660
680
m/z
728,36
700
720
758,26
740
760
780
800
Arrayan2 #7234 RT: 36,42 AV: 1 NL: 5,54E2
F: ITMS - c ESI d Full ms2 629,29@cid35,00 [160,00-1270,00]
301,06
100
463,20
80
60
40
20
185,05
180
220
302,15
255,09 271,10 283,21
210,88
200
240
260
280
300
343,23
320
387,23
340
360
426,80
380
400
420
464,25
445,21
440
460
480
537,77
503,44
500
520
540
559,42
593,52 611,09
560
580
600
m/z
Figura 26. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 36,40 min della frazione
a basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
Time (min)
Arrayan2 #8701 RT: 43,72 AV: 1 NL: 1,26E4
F: ITMS + c ESI Full ms [80,00-1500,00]
Pinobanksin 3-O-isobutirrato
343,30
4000
2000
109,89
144,86
240,19
181,05
217,11
283,18
0
100
150
200
250
371,38
300,36
300
350
413,46
425,41
400
464,25
450
m/z
502,37 525,38
500
573,09 590,50
550
643,36 664,31
600
650
722,67
700
767,56
750
810,73
800
Arrayan2 #8709 RT: 43,76 AV: 1 NL: 1,46E3
F: ITMS + c ESI d Full ms2 343,26@cid35,00 [80,00-700,00]
240,25
100
80
60
40
325,30
20
145,13
80
100
120
140
243,20 270,83 289,11 301,10
171,31
160
180
200
220
240
260
280
300
m/z
343,20
320
340
360
380
400
420
440
460
480
500
Figura 27. Spettro MS e spettro MS2 del picco con tempo di ritenzione 43,72 min della frazione
a basso peso molecolare (MWCO < 3500 Da) dell’estratto di Myrcianthes hallii
36
6. CONCLUSIONI
Attraverso questa ricerca è stato dimostrato che gli estratti idrometanolici ottenuti da piante
medicinali tradizionali impiegate in Ecuador, quali Chuquiraga jussieui, Myrcianthes hallii e
Tropaeolum tuberosum mostrano attività antibatterica contro ceppi meticillino-resistenti (MRSA)
e meticillino-sensibili (MSSA) di Staphylococcus aureus. È importante sottolineare che
Myrcianthes hallii è attivo a basse concentrazioni, con valori di MIC 50 di 1,08 mg/mL (residuo
secco) e MIC 90 di 2,16 mg/mL (residuo secco).
Pertanto su tale estratto è stata proseguita la ricerca. L’estratto è stato frazionato sulla base del
peso molecolare mediante dialisi. Dell’analisi del dializzato (PM < 3500 Da) e ritenuto (PM >
3500 Da) è emerso che l’attività antibatterica si mantiene in entrambe le frazioni.
Si è quindi proceduto con la caratterizzazione chimica della frazione a basso peso molecolare per
verificare la presenza in essa di polifenoli, metaboliti secondari delle piante a cui è ascritta
attività antibatterica.
Le analisi condotte mediante la tecnica UPLC-PDA-hESI-MSn hanno portato a isolare e
individuare 23 composti di cui 20 polifenoli (acidi fenolici e flavonoidi) e 3 acidi organici (acido
chinico, malico e gluconico).
37
BIBLIOGRAFIA
Alberto, M. R., Zampini, I. C., & Isla, M. I. (2009). Inhibition of cyclooxygenase activity by
standardized hydroalcoholic extracts of four Asteraceae species from the Argentine
Puna. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 42(9), 787-790.
Andrade, J. M., Aboy, A. L., Apel, M. A., Raseira, M. C., Pereira, J. F., & Henriques, A. T.
(2011). Phenolic composition in different genotypes of guabiju fruits (Myrcianthes pungens) and
their potential as antioxidant and antichemotactic agents. Journal of food science, 76(8), C1181C1187.
Bertzky, M., Ravilious, C., Araujo Navas, A. L., Kapos, V., Carrión, D., Chíu, M., & Dickson, B.
(2010). Carbon, biodiversity and ecosystem services: Exploring co-benefits. Ecuador. UNEPWCMC, Cambridge, UK. pp. 1, 2.
Braga, F. G., Bouzada, M. L. M., Fabri, R. L., de O Matos, M., Moreira, F. O., Scio, E., &
Coimbra, E. S. (2007). Antileishmanial and antifungal activity of plants used in traditional
medicine in Brazil. Journal of Ethnopharmacology,111(2), 396-402.
Bussmann, R. & Sharon, D., (2006). Traditional medicinal plant use in Loja province, Southern
Ecuador. Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine 2, 44, Available online at:
http://www.ethnobiomed.com/content/2/1/44.
Bussmann, R. W., Glenn, A., Meyer, K., Rothrock, A., Townesmith, A., Sharon, D. & Regalado,
S. (2009). Antibacterial Activity of Medicinal Plants of Northern Peru–Part II. Arnaldoa 16(1),
93-103.
Bussmann, R. W., Glenn, A., & Sharon, D. (2010). Antibacterial activity of medicinal plants of
Northern Peru–can traditional applications provide leads for modern science. Indian Journal of
Traditional Knowledge, 9(4), 742-753.
38
Butler, M. S. (2004). The role of natural product chemistry in drug discovery. Journal of Natural
Products, 67(12), 2141-2153.
Castrillón, B. V., Oliva, S. R., & Raimondo, F. M. (2003). Especies ornamentales de la familia
Asteraceae cultivadas en las áreas verdes de Sicilia Occidental. Lagascalia, 23(1), 75-84.
Chirinos, R., Campos, D., Costa, N., Arbizu, C., Pedreschi, R., & Larondelle, Y. (2008). Phenolic
profiles of andean mashua (Tropaeolum tuberosum Ruíz & Pavón) tubers: Identification by
HPLC-DAD and evaluation of their antioxidant activity. Food chemistry, 106(3), 1285-1298.
Chirinos, R., Rogez, H., Campos, D., Pedreschi, R., & Larondelle, Y. (2007). Optimization of
extraction conditions of antioxidant phenolic compounds from mashua (Tropaeolum tuberosum
Ruíz & Pavón) tubers. Separation and Purification Technology, 55(2), 217-225.
Clinical and Laboratory Standards Institute (2006). Performance standards for antimicrobial disk
susceptibility tests; approved standard Document M2-A9 (9th ed.). Wayne, PA: CLSI.
Cole, R. A., Haber, W. A., Lawton, R. O., & Setzer, W. N. (2008). Leaf essential oil composition
of three species of Myrcianthes from Monteverde, Costa Rica. Chemistry & Biodiversity, 5(7),
1327-1334.
CODENPE. (2014). Consejo de Desarrollo de las Nacionalidades y Pueblos del Ecuador.
Consultato 02 febbraio 2014. Disponibile all’indirizzo http://www.codenpe.gob.ec
Daglia, M. (2012). Polyphenols as antimicrobial agents. Current opinion in biotechnology, 23(2),
174-181.
De la Cruz, H., Vilcapoma, G., & Zevallos, P. A. (2007). Ethnobotanical study of medicinal
plants used by the Andean people of Canta, Lima, Peru. Journal of Ethnopharmacology, 111(2),
284-294.
39
De la Torre, L., Navarrete, H., Muriel, P., Macía, M. J., & Balslev, H. (2008). Enciclopedia de
las plantas útiles del Ecuador. Herbario QCA & Herbario AAU. pp 1, 2, 3, 8, 39, 105, 106.
De Leo, M., Saltos, M. B. V., Puente, B. F. N., De Tommasi, N., & Braca, A. (2010).
Sesquiterpenes and diterpenes from Ambrosia arborescens. Phytochemistry, 71(7), 804-809.
Flagg, M. L., Valcic, S., Montenegro, G., Gomez, M., & Timmermann, B. N. (1999). Pentacyclic
triterpenes from Chuquiraga ulicina. Phytochemistry, 52(7), 1345-1350.
Flores, H. E., Walker, T. S., Guimarães, R. L., Bais, H. P., & Vivanco, J. M. (2003). Andean root
and tuber crops: Underground rainbows. HortScience, 38(2), 161-168.
Gachet, M. S., Lecaro, J. S., Kaiser, M., Brun, R., Navarrete, H., Muñoz, R. A., & Schühly, W.
(2010). Assessment of anti-protozoal activity of plants traditionally used in Ecuador in the
treatment of leishmaniasis. Journal of Ethnopharmacology, 128(1), 184-197.
Grau, A., Ortega. R., Nieto, C., & Hermann, M. (2003). Mashua (Tropaeolum tuberosum Ruíz &
Pav.). In Jan, M., & Engels, M., (Vol. Eds.), Promoting the conservation and use of underutilized
and neglected crops, Vol. 25., International Potato Center, Lima, Peru/International Plant Genetic
Resources Institute, Rome, Italy.
Heywood, V. H. (1993). Flowering plants of the world (No. Ed. 2). BT Batsford Ltd., Oxford
University Press. pp 212, 213.
Judd, W. S., Campbell, C. S., Kellogg, E. A., Stevens, P. F., & Donoghue, M. J. (2007). Botanica
sistematica un approccio filogenetico (No. Ed. 2). Piccin Nuova Libraria SpA, Padova. pp. 430432, 473-475, 517-524.
Kott, V., Barbini, L., Cruañes, M., Muñoz, J. D. D., Vivot, E., Cruañes, J., & Campos, R. (1998).
Antiviral activity in Argentine medicinal plants. Journal of ethnopharmacology, 64(1), 79-84.
40
Macía, M. J., García, E., & Vidaurre, P. J. (2005). An ethnobotanical survey of medicinal plants
commercialized
in
the
markets
of
La
Paz
and
El
Alto,
Bolivia.Journal
of
ethnopharmacology, 97(2), 337-350.
OMS. (2000). General Guidelines for Methodologies on Research and Evaluation of Traditional
Medicine, Geneva.
OMS. (2002). Estrategia de la OMS sobre medicina tradicional 2002-2005, Ginebra.
OMS. (2004). Linee guida per lo sviluppo dell’informazione al consumatore sull’utilizzo
appropriato della medicina tradizionale, complementare e alternativa, Italia.
OPS. (2000). Programa Especial de Análisis de Salud. Iniciativa de Datos Básicos en Salud y
Perfiles de País 2000. Documento de trabajo. Washington, DC.
Padulosi,
S.,
&
Hoeschle-Zeledon,
I.
(2004).
¿A
qué
denominamos
especies
subutilizadas?. LEISA Rev.
Penna, C., Marino, S., Vivot, E., Cruañes, M. C., De D Munoz, J., Cruañes, J., & Martino, V.
(2001). Antimicrobial activity of Argentine plants used in the treatment of infectious diseases.
Isolation
of
active
compounds
from
Sebastiania
brasiliensi. Journal
of
ethnopharmacology, 77(1), 37-40.
Rojas, R., Bustamante, B., Bauer, J., Fernández, I., Albán, J., & Lock, O. (2003). Antimicrobial
activity of selected Peruvian medicinal plants. Journal of ethnopharmacology, 88(2), 199-204.
Srithi, K., Balslev, H., Wangpakapattanawong, P., Srisanga, P., & Trisonthi, C. (2009).
Medicinal plant knowledge and its erosion among the Mien (Yao) in northern Thailand. Journal
of Ethnopharmacology, 123(2), 335-342.
41
Strasburger, E. A. (2004). Trattato di botanica: per le università, (34° Ed.). P. Sitte, H. Ziegler,
F. Ehrendorfer, & A. Bresinsky (Eds.). Antonio Delfino Editore, Roma. pp 774, 777, 789, 798.
Tene, V., Malagon, O., Finzi, P. V., Vidari, G., Armijos, C., & Zaragoza, T. (2007). An
ethnobotanical survey of medicinal plants used in Loja and Zamora-Chinchipe, Ecuador. Journal
of Ethnopharmacology, 111(1), 63-81.
UNEP. (2005). Grupo de Países Megadiversos Afines. Consultato 20 Gennaio 2014. Disponibile
all’indirizzo http://www.pnuma.org
Vela Gurovic, M. S., Díaz Lanza, A. M., Boyano Adánez, M. D. C., Estañ Omaña, M. C., Gañán
Gómez, I., Murray, A. P., & Sancho López, P. (2011). Cytotoxic effects induced by combination
of heliantriol B2 and dequalinium against human leukemic cell lines. Phytotherapy
Research, 25(4), 603-610.
42
RINGRAZIAMENTI
AGRADECIMIENTOS
A Dios por darme la capacidad y fortaleza para seguir adelante cada día.
A mis Padres Vinicio y Rosario por su guía, su amor y su apoyo incondicional; a mi hermano
Vinicio y a mi hermana Ma. Angeles por cada “la amo enana” en el momento justo.
A mi abuelita Piedad por sus consejos y sus palabras de aliento.
A Luis por acompañarme cada día durante esta experiencia, por motivarme, escucharme y
apoyarme siempre.
A la Profesora Maria Daglia por permitirme formar parte de esta Maestría y por su guía durante
la elaboración de este trabajo. Al Profesor Francesco Bracco y Erika Copoo por su gran ayuda,
disponibilidad y gentileza.
A la familia Bombelli, en especial a la Profe Nadia, Giovanna, Sergio, Marco y la Nona Lucia
por todo el tiempo compartido, la ayuda brindada y por hacerme sentir parte de su familia.
A mis amigos: Dany, Mily, Daniel, Sebas y Jairo los cuales pese a la distancia me han
acompañado.
A mis lojanos queridos: Kary, Vladimir, Jorge, Luis, Paty y Santi por todos los momentos
vividos y la ayuda brindada.
A mis compañeras de laboratorio, en especial a: Lara, Giorgia, Arianna y Ornella por mostrarse
siempre gentiles y dispuestas a darme una mano.
Por último un especial agradecimiento a la Secretaría Nacional de Educación Superior, Ciencia,
Tecnología e Innovación “SENESCYT” por el financiamiento otorgado para la realización de
esta Maestría.
43