Metodi sperim. senza animali

Imparare dagli errori:
metodi scientifici senza l'utilizzo di
animali nella ricerca medica e nelle
prove di tossicità
Dott.ssa Lidia Armati
• Imparare dai disastri: Talidomide (10000 focomelici), TGN1412, Vioxx...
• REACH (Registration, Evaluation, Authorisation of Chemicals): Regolamento
(CE) n. 1907/2006
• Principio delle 3 R: Replacement, Refinement, Reduction
• L'importanza di studiare cellule e tessuti umani
• La sperimentazione animale non è mai stata validata, i metodi scientifici
“alternativi” sì: centro europeo ECVAM (Ispra, Italia) testa le varie tecniche
per valutare se sono ripetibili, affidabili, scientifiche
• Molti metodi “alternativi” hanno già portato ad avere intuizioni
scientifiche poi confermate (es. biopsie, autopsie, epidemiologia),
altri sono innovativi e promettenti.
Colture cellulari
Le colture cellulari mantengono
in vitro molte delle loro
caratteristiche in vivo:
●
●
le cellule miocardiche si
contraggono e rispondono
aumentando o diminuendo la
frequenza delle contrazioni in
seguito all’aggiunta di
determinati farmaci (feedback)
le cellule endocrine secernono in vitro
gli ormoni e rispondono alle diverse
condizioni ambientali
aumentando o riducendo la
secrezione (per es. cellule di paratiroide
rispondono alla presenza di calcio)
Test di Ames
Per testare se un composto è
in grado di creare mutazioni
Ceppi mutati di salmonella
(un batterio) che non
possono più sintetizzare
l'amminoacido istidina,
necessario per la loro crescita
Viene aggiunta la sostanza
da testare: se è mutagena, il
batterio riesce nuovamente a
produrre istidina e cresce a
dismisura
Test del micronucleo
• Osservazione al microscopio di cellule in mitosi
(che si stanno dividendo per riprodursi)
precedentemente colorate con metodiche
particolari.
• A contatto con la sostanza da testare: se questa
è capace di provocare mutazioni si verificano
errori nella replicazione cellulare e oltre al
nucleo saranno visibili dei frammenti di DNA nel
citoplasma, i cosiddetti micronuclei.
Test della cometa (elettroforesi su singola cellula)
• Si valuta la presenza di mutazioni cromosomiche: le membrane
cellulari vengono lisate tramite un apposito detergente perchè sia
esposto il materiale genico, il vetrino con le cellule viene poi posto
nella vasca dell'elettroforesi e viene aggiunta una sostanza
fluorescente che si lega al DNA e rende visibile il nucleo al
microscopio a fluorescenza.
• L'elettroforesi è costituita da un gel immerso in un campo elettrico: la
sostanza in esame si divide nelle sue componenti secondo la massa e
la carica, dato che ogni componente migra sul gel verso la polarità
opposta alla propria, dalla quale è attratta.
• Se il DNA testato non ha mutazioni, al microscopio sarà visibile
un'unica formazione rotonda compatta, viceversa alcuni frammenti di
DNA “spezzati” dalla mutazione tenderanno a rimanere più distanti
dal resto del materiale genetico, formando una struttura che somiglia
alla coda di una cometa.
Elettroforesi su gel, per il test della cometa
Test della cometa
Test della cometa
Biomarkers
•
Addotti del DNA: composti generati dalla modifica del DNA a seguito di una sua
interazione con composti chimici = indicatori, biomarcatori, di
esposizione ad un agente cancerogeno, in grado di modificare il DNA. Questi
addotti possono essere visti con metodi immunoenzimatici.
•
Le monoossigenasi sono enzimi che hanno il compito di ossidare certi composti
grassi (pesticidi, idrocarburi...) per renderli più solubili e quindi eliminabili.
Questi enzimi sono inducibili, ovvero aumentano quando nell'ambiente sono
presenti le sostanze tossiche. Il loro aumento è quindi un segno indiretto di
tossicità del composto.
•
Le metallotioneine sono proteine citoplasmatiche che legano i metalli pesanti e
anche queste aumentano di numero se sono presenti metalli pesanti.
Biomarkers
•
Le proteine da shock termico sono altre proteine citoplasmatiche sintetizzate in
risposta a certe situazioni pericolose come la febbre, l'infiammazione, la
carenza di zucchero, il cancro e molte altre, quindi un loro aumento segnala
una situazione d'allarme per il sistema biologico.
•
Ci sono poi proteine, come le esterasi, che sono inibite da composti come gli
insetticidi, rivelando così la loro presenza
•
I lisosomi, organuli citoplasmatici, sono degli “spazzini” che digeriscono
molecole che la cellula deve eliminare: quando entrano in contatto con
sostanze esterne, queste destabilizzano la membrana dei lisosomi, i quali
accumulano per ossidazione le lipofuscine (grassi), che possono essere
misurate e messe in relazione alla quantità di elementi tossici presenti.
Toxcast:
robot che in 2 giorni testa la tossicità di 100000 composti su
cellule e proteine umane, mentre nell’animale servirebbero
anni
Corrositex :
al posto del Draize test, che testava la sostanza sull’occhio del coniglio
(che non ha ghiandole lacrimali e possiede 3 palpebre, diversamente dall'uomo):
→
Skimune :
Prevede la risposta immunitaria (es. allergia) della cute umana ad un
nuovo composto chimico:
misura la proliferazione di linfociti T e il rilascio di citochine (mediatori
dell'infiammazione) mettendo in contatto sangue umano, frammenti
di cute umana e il composto da testare.
Svela anche la tossicità di composti non rilevata da studi su animali.
MIMIC (Modular IMmune In vitro Construct)
Monociti di vari donatori (+ rappresentativi) in soluz. nutritiva passano lo strato di
endotelio fino al collagene sottostante, si differenziano in cellule presentanti
l'antigene, di cui i macrofagi restano nel collagene, le cellule dendritiche tornano
in alto, vengono cimentate con antigeni, poi con linfociti T e B per creare cellule
della memoria (vaccini).
Colture cellulari 3D
Biologia + nanotecnologie,
stampanti 3D
Organi artificiali
molto promettenti per la medicina dei trapianti e per riprodurre
l’effetto di una malattia su un organo, es. Virtual Liver
Body on a chip:
polmone e cuore
finanziato dal Dipartimento della difesa USA
con 24 milioni di dollari
Body on a chip: rene e arterie
Simulatore polmone umano
Simulatore metabolico respiratorio realizzato dalla NASA per testare le condizioni dei polmoni in situazioni avverse,
con la possibilità di introdurre farmaci nel sistema, cambiare parametri come la frequenza respiratoria e valutare le
conseguenze.