Strategie biotec per l’incremento di
resistenza alle malattie
Come si difendono le piante dai patogeni?
Difese costitutive:
-barriere strutturali: es., cuticola, periderma, parete
cellulare
-metaboliti secondari tossici
Difese indotte:
- risposta locale: induzione di una serie di reazioni
metaboliche al sito di infezione mirate a bloccare
l’ingresso del patogeno
-risposta sistemica (Resistenza sistemica acquisita, SAR)
Strategie usate per produrre piante transgeniche
Strategia 1: interferenza diretta con la patogenicità o inibizione della
fisiologia del patogeno
Strategia 1a – difesa costitutiva (inserire geni codificanti proteine
antimicrobiche)
Strategia 1b –difesa indotta (è una variante della strategia 1a dove
le proteine antimicrobiche sono controllate da un promotore
inducibile)
Strategia 2: regolazione della naturale risposta di difesa indotta
Strategia 2a: Modifica del sistema di riconoscimento del patogeno
(es. geni R)
Strategia 2b: Modifica delle vie di regolazione a valle (es. SAR)
e fattori di trascrizione
Strategia 3: “Pathogen mimicry” o vaccinazione genetica o resistenza
indotta. Consiste nella manipolazione della pianta per indurre il
riconoscimento di uno specifico patogeno attraverso sequenze
derivate dal patogeno.
Collinge et al. Eur J Plant Pathol (2008) 121:217–231
I geni più comuni inseriti in piante coltivate e di cui si
stanno effettuando prove di campo negli USA
Collinge et al. Annu. Rev. Phytopathol. 2010. 48:269–91
Strategia 1: interferenza diretta con la patogenicità o
inibizione della fisiologia del patogeno
• Strategia 1a – difesa costitutiva (inserire geni
codificanti proteine antimicrobiche)
• Strategia 1b –difesa indotta (è una variante della
strategia 1a dove le proteine antimicrobiche sono
controllate da un promotore inducibile)
Si utilizzano geni di pianta o esogeni che possiedono
attività antimicrobica o contrastano fattori di virulenza
del patogeno
•
Esempio: sovraespressione del gene della chitinasi
•
Esempio: proteina antimicrobica KP4
• Esempio: sovraespressione del gene della chitinasi
Fusariosi della spiga: Fusarium head
Blight (FHB)
Malattia causata da Fusarium
graminearum e altre specie del genere
Fusarium spp.
Premature bleaching of wheat spikes. (Courtesy G.
Bergstrom)
Fusarium graminearum produce la micotossina
Deossinivalenolo (DON)
Concentrazioni massime di DON per il frumento e i suoi
derivati (Commissione europea , regolamento comunitario
n. 856/2005)
Unprocessed common wheat and barley
Unprocessed durum wheat and oats
Flour
Finished products
Infant food
DON (ppb)
1250
1750
750
500
200
EU Guidance Values for DON in Grain Intended for Animal
Feedstuffs
DON (ppb)
Feed Grains
8000
Complete feedstuffs for pigs
900
Complete feedstuffs for calves, lambs and kids
2000
Il gene di chitinasi utilizzato:
Families
PR-1
Type member
Tobacco PR-1a
Properties
antifungal
PR-2
Tobacco PR-2
b-1,3-glucanase
PR-3
Tobacco P, Q
chitinase type I,II, IV,V,VI,VII
PR-4
Tobacco 'R'
chitinase type I,II
PR-5
Tobacco S
thaumatin-like
PR-6
Tomato Inhibitor I
proteinase-inhibitor
PR-7
Tomato P69
endoproteinase
PR-8
Cucumber chitinase
chitinase type III
Tobacco 'lignin-forming
PR-9
peroxidase'
peroxidase
PR-10
Parsley 'PR1'
'ribonuclease-like'
PR-11
Tobacco 'class V' chitinase
chitinase, type I
PR-12
Radish Rs-AFP3
defensin
PR-13
Arabidopsis THI2.1
thionin
PR-14
Barley LTP4
lipid-transfer protein
PR-15
Barley OxOa (germin)
oxalate oxidase
PR-16
PR-17
Barley OxOLP
Tobacco PRp27
'oxalate oxidase-like'
unknown
Produzione di piante transgeniche con la chitinasi
Metodo biolistico – co-bombardamento
pAHCBarChit + pAHC25 in embrioni immaturi
costrutti
pAHCBarChit: plasmide contenente un gene di chitinasi classe II (PR-3) di orzo
T nos: terminatore della nopalina sintasi di A. tumefaciens
uidA: gene per la β-glucuronidasi (GUS) di Escherichia coli
Bar: gene per la phosphinothricin acetyltransferase (PAT) di Streptomyces hygroscopicus
Selezione, rigenerazione e trasferimento in terreno delle piante T 0
Esperimenti di infezione
Frumento-Fusarium
graminearum
Monitoraggio dell’infezione: Esperimenti di infezione
Frumento-Fusarium graminearum
% infected spikelets
NS
T
Days post-infection
Risultati delle infezioni effettuate in condizioni controllate (fitotrone)
Incidenza della malattia sulle
cariossidi
Cariossidi malate
Cariossidi sane
Caratterizzazione molecolare
Caratterizzazione molecolare
Conclusioni
• Due delle 7 linee transgeniche che hanno mostrato una
aumentata resistenza alla fusariosi in serra, hanno
confermato questa capacità in esperimenti di campo.
• Entrambe queste linee (C8 and C17) hanno mostrato
livelli di espressione della chitinasi più elevati rispetto alle
altre linee.
• Per ragioni non chiarite, la linea C15 che esprime alti
livelli di chitinasi non mostra maggiore resistenza alla
fusariosi in campo.
• Esempio: proteina antimicrobica KP4
LA CARIE DEL GRANO (Tilletia caries, tilletia foetida)
KP: ‘killer proteins’ (KP) isolata da un virus che infetta
il fungo patogeno Ustilago maydis
Le linee transgeniche mostrano una riduzione del
sintomo del 30%
L’attività antimicrobica è efficace su più specie fungine di patogeni
Plant Biotechnology Journal
Volume 4, Issue 1, pages 63-75, 8 SEP 2005 DOI: 10.1111/j.1467-7652.2005.00158.x
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1467-7652.2005.00158.x/full#f1
Biosafety studies
Geni di pianta o esogeni che possiedono attività
antimicrobica o contrastano fattori di virulenza
del patogeno
• Esempio: inibitore proteico della
poligalattoronasi (PGIP) (esempio di sviluppo di
resistenza ad ampio spettro)
• Esempio: ossalato ossidasi (esempio di sviluppo di
resistenza patogeno-specifica)
Host response following fungal pathogen attack
PAMPs
effectors
CWDEs
Other
components
Hypersensitive response
Phytoalexin synthesis
Pathogenesis-related proteins
(protease inhibitors, LTP, etc.)
Ion fluxes
Protein phosphorylation
ROS
Nucleus
Signal
cascade
Activation of
defencerelated genes
• Esempio: inibitore proteico della poligalattoronasi (PGIP)
(è anche un esempio di strategia di difesa ad ampio spettro)
The effectiveness of PGIP as broad-spectrum disease
resistance
approach
Plant species
Pathogen
Gene
Test
Reference
Tobacco
Rhizoctonia solani
(fungus), Phytophthora
parasitica var.
nicotianae (oomycetes),
Peronospora hyoscyami
f.sp. tabacina
(oomycetes)
Pvpgip2
Growth chamber, field
Borras-Hidalgo et
al., 2012
Arabidopsis, wheat
(Triticum aestivum)
Fusarium graminearum
(fungus)
Pvpgip2, Atpgip1,
Atpgip2
Growth chamber
Ferrari et al., 2012
wheat (Triticum aestivum)
Bipolaris sorokiniana
(fungus)
Pvpgip2
Growth chamber
Janni et al., 2008
Tobacco
Botrytis cinerea (fungus)
Vvpgip1
Growth chamber
Joubert et al., 2006
Tobacco
Botrytis cinerea
(fungus)
Pvpgip2
Growth chamber
Manfredini et al.,
2006
Vitis vinifera
Botrytis cinerea
(fungus)
pPGIP
Growth chamber
Agüero et al., 2005
Arabidopsis
Botrytis cinerea (fungus)
Atpgip1, Atpgip2
Growth chamber
Ferrari eta l., 2003
Grapevines
Xylella fastidiosa
Bacteria
pPGIP
Growth chamber
Perez-Donoso et
al., 2010
Tomato
Botrytis cinerea( fungus)
pPGIP
Growth chamber
Powell et al., 2000
Brassica rapa ssp.
pekinensis (Chinese
cabbage)
Pectobacterium
carotovorum ssp.
carotovorum, Bacteria
Brpgip2
Growth chamber
Hwang et al., 2010
Transgenic grape plants expressing pear pgip infected with B. cinerea
AGÜERO et al MOLECULAR PLANT PATHOLOGY (2005) 6 ( 1 ) , 43–51
Costrutti utilizzati:
Livelli di inibitore PGIP nelle piante transgeniche (T) e di
Controllo (NS)
Progressione dei sintomi dopo 7
e 19 giorni post infezione con
F. graminearum
T
C
C
T
Esperimenti di infezione in condizioni controllate
g/spike
Kernel yield per spike
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
*
*
C
C-I
T
T-I
Average values of 5 combined resistance tests
DON contamination of F. graminearum infected
control (NS) and Transgenic (T) plants
14
DON mg/g
12
*
10
8
6
*
4
2
0
C-I
T-I
More than 50% reduction in DON accumulation in
the transgenic infected plants
Total Starch
Total starch content (%)
66,00
64,00
62,00
*
60,00
*
58,00
56,00
54,00
52,00
50,00
NS
NS- I
T
T -I
Average values of 5 combined resistance tests
Qual è il limite dell’approccio ad ampio spettro della PGIP?
Che il patogeno produca la PG e
che questa venga inibita dalla
PGIP
• Esempio: ossalato ossidasi (è anche un esempio di
strategia patogeno-specifica)
Planta (2008) 228:331–340
The general inability of economically important
crops to develop germplasm resistant to
Sclerotinia sclerotiorum has focused attention on
the need for a more detailed understanding of
the pathogenic factors involved in disease
development.
Oxalic acid is a virulence factor of S. sclerotiorum
Oxalate secretion might enhance Sclerotinia virulence :
• Oxalate might aid Sclerotinia virulence by shifting the
apoplastic pH to a value better suited for enzymatic
degradation of plant cell walls (Bateman and Beer, 1965).
• Oxalate may be directly toxic to host plants, presumably
because of its acidity (Noyes and Hancock, 1981).
• oxalate anion could chelate cell wall Ca2+ compromising
the function of Ca2+-dependent defense responses
and weakening the plant cell wall (Bateman and Beer,
1965).
• oxalate secretion by Sclerotinia suppresses generation
of active oxygen species (ROS) and thereby
compromises the defense responses of the host plant.
Oxalate oxidase can eliminate oxalic acid secreted by
S. sclerotiorum
Oxalate oxidase
C2O42− + O2 + 2 H+
------->
2 CO2 + H2O2
oxalate
Es: Brassica napus expressing Oxalate oxidase showed
improved resistance against S. sclerotiorum - see the paper
Strategia 1: interferenza diretta con la patogenicità o inibizione della
fisiologia del patogeno
Strategia 2: regolazione della naturale risposta di difesa
indotta
• Strategia 2a: Modifica del sistema di riconoscimento
del patogeno (es. geni R)
• Strategia 2b: Modifica delle vie di regolazione a
valle (es. SAR) e fattori di trascrizione
Si utilizzano geni di pianta o del patogeno che possono
indurre o potenziare la risposta di immunità della pianta
Esempio: utilizzo del gene di Resistenza Rpg1
Esempio: utilizzo del gene Npr1
• Esempio: utilizzo del gene di Resistenza Rpg1
364–369 PNAS January 7, 2003 vol. 100 no. 1
Barley cv Morex
Barley cv Golden Promise
• Esempio: utilizzo del gene Npr1
Jaemyung Choi , Sung Un Huh , Mikiko Kojima , Hitoshi Sakakibara , Kyung-Hee Paek , Ildoo Hwang
The Cytokinin-Activated Transcription Factor ARR2 Promotes Plant Immunity via TGA3/NPR1-Dependent Salicylic Acid
Signaling in <ce:italic>Arabidopsis</ce:italic>
Developmental Cell Volume 19, Issue 2 2010 284 - 295
http://dx.doi.org/10.1016/j.devcel.2010.07.011
Infezione su
spiga con F.
graminearum
Trattmento
sulla foglia
Trattmento
sulla foglia
NH1 (NPR1 di riso) sotto il controllo del promotore Ubi1 di mais induce
una espressione costitutiva dei geni PR
Strategie usate per produrre piante transgeniche
Strategia 3: “Pathogen mimicry” o vaccinazione genetica o
resistenza indotta
Resistenza ai virus
Virus del
mosaico del
tabacco
Il controllo delle malattie virali è difficile:
in genere si controllano gli organismi che ne
consentono la diffusione (es. afidi, ma l’uso
degli insetticidi ha un impatto limitato nel
controllo della diffusione della malattia)
o più efficacemente si attuano controlli
colturali (rimozione delle piante malate o uso
di varietà resistenti/tolleranti)
Protezione crociata
-1972: prima osservazione:
l’inoculo di una pianta con un ceppo virale non molto
virulento causava la protezione contro una successiva
infezione con un ceppo virale molto virulento. Protezione
crociata
Quasi tutti i virus esprimono proteine dei seguenti tre tipi:
• Proteine di rivestimento (Coat proteins, CPs);
• Proteine di movimento (Movement proteins, MPs);
• Proteine per la replicazione
I meccanismi di difesa naturali delle piante sono
diretti verso questi target e verso il genoma virale.
Come funziona la resistenza indotta
nelle prime piante GM resistenti ai
virus?
Sovraesprimendo nella pianta una proteina del virus
(in genere la proteina del capside) si induce un
processo noto come cosoppressione genica
In caso di infezione la cellula vegetale transgenica
“percepisce” che un gene è sovraespresso e risponde
«bloccando» l’espressione del transgene e virale
Strategia nota anche come Resistenza virale mediata
dalla proteina del capside
Waterhouse et al.
trends in plant
science November
1999, Vol. 4, No. 11
First example: Expression of the coat protein gene of Tobacco
mosaic virus in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants
is the first example of transgene-mediated resistance to a plant
virus.
Silenziamento genico nelle piante
“Cosoppressione” originalmente descritta in una petunia transgenica in cui
desiderava sovraesprimere la calcone sintasi (CHS), un enzima per la
biosintesi delle antocianine (Jorgensen et al, Plant Cell 1990 2:279).
(RNAi di un gene endogeno indotta da una inserzione di un transgene)
35S CHS cDNA
promotore
Processo che determina la downregulation di un gene
•a livello della trascrizione (TGS)(es.
trasposoni, geni retrovirali,
eterocromatica)
•o post-trascrizionale (PTGS)(dopo la
trascrizione di un gene)
Esistono due meccanismi correlati basati sull’RNA
che determinano il silenziamento genico nelle
piante :
1) RNA interference (RNAi): degradazione
dell’mRNA
2) Metilazione del DNA controllata dall’RNA (RNAdirected DNA Methylation, RdDM): soppressione
della trascrizione
Meccanismo generale dell’ RNAi
RNA a doppia elica
dicer ribonucleasi
siRNAs
RISC
Degradazione del trascritto
Meccanismo generale dell’ RNAi
RNA a doppia elica
dicer ribonucleasi
siRNAs
RISC
Degradazione del trascritto
RNA a doppia elica o siRNAs scatenano la metilazione del DNA (RdDM)
RNA aberrante
priming
RdRP, etc.
ds RNA
dicer ribonuclease
siRNAs
RISC
Degradazione del trascritto
RNAi fornisce una difesa contro virus e sequenze trasponibili, ma si è
anche evoluto come meccanismo per produrre micro-RNAs (miRNAs) da
sequenze endogene che regolano l’espressione genica durante lo
sviluppo disturbando la stabilità o la traduzione dell’ mRNA target.
DICER
RISC
Virus-induced gene silencing (VIGS)
VIGS Principle
Recombinant virus carrying a pant gene fragment:
Viral replication
DICER
siRNA
RISC
RISC
RISC
Viral RNA
Plant RNA
VIGS di NbEDS1 compromette la resistenza al TMV
mediata dal gene di resistenza N (N is a TIR-NBS-LRR
protein)
