DISS. ETH Nr. 20210
a correlative array tomography
protocol to investigate projection
neuron circuits
ABHANDLUNG
zur Erlangung des Titels
DOKTOR DER WISSENSCHAFTEN
der
ETH ZÜRICH
vorgelegt von
DANIELE OBERTI
Dipl. Natw. ETH
geboren am 20.3.1982
von
Onsernone, Ticino
Angenommen auf Antrag von
Kevan A.C. Martin
Richard H.R. Hahnloser
Graham W. Knott
2012
Abstract
Information about synaptic connectivity and three-dimensional structure of neurons is fundamental to understand neural microcircuits. Unfortunately acquisition of this information remains challenging, because of the relatively large volumes which need to be imaged at high resolution. Among different microscopy
approaches based on light and electrons, a promising technique is array tomography, in which arrays of ultrathin brain sections are stained with fluorescent
antibodies against neurotransmitters and synaptic proteins and are imaged in
light and electron microscopes (Micheva and Smith, 2007).
Based on array tomography, we developed a correlative microscopy approach
to study projection neurons between different brain regions in the zebra finch.
We inject fluorescent neural tracers of different colors into areas afferent and
efferent to the region of interest. After preparation of the tissue for electron
microscopy, we prepare arrays of serial ultrathin sections which we image in
the light microscope, either directly after sectioning, or after performing immunolabeling with anti-dye antibodies. The same sections are then imaged in
the electron microscope. Fluorescence signal allows to classify synapses and
neural processes identified in electron microscopy imagery. Thanks to a tissue
preparation which includes fixation and staining with heavy metals, high membrane contrast and ultrastructure quality is achieved in the electron microscope.
Good ultrastructure and reliable fluorescence information allow us to characterize synapses made by thalamic neurons in the forebrain premotor area HVC,
and in the same tissue a different fluorescence channel allows us to investigate
neurons projecting to the motor pathway. The application of our preparation
method will be useful to investigate the morphology of neurons and synapses
belonging to different populations and will provide statistical information about
their connectivity, which is crucial to understand how signals in the brain are
routed among different areas and transformed into meaningful motor output.
In addition to this main part, we present additional experiments we conducted
to explore preparation methods, which avoid the use of heavy metals (the cause
of strong fluorescence reduction during embedding), and screening experiments
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to identify adeno-associated viral vectors suitable for neural labeling in the zebra
finch.
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Sommario
La conoscenza della connettività a livello sinaptico e della struttura tridimensionale dei neuroni è fondamentale ai fini della comprensione di circuiti neurali.
L’acquisizione di questo tipo di informazione è tuttavia difficoltosa, a causa della
risoluzione necessaria e dei volumi relativamente grandi che devono essere fotografati. Tra le differenti strategie basate su microscopia ottica ed elettronica,
una tecnica promettente è rappresentata dall’array tomography, in cui serie di
sezioni ultrasottili di cervello vengono colorate con anticorpi fluorescenti contro
neurotrasmettitori ed altre proteine sinaptiche e fotografate con microscopi ottici ed elettronici (Micheva and Smith, 2007).
Basandoci sull’array tomography, abbiamo sviluppato un approccio di microscopia correlativa per studiare neuroni di proiezione tra diverse regioni del
cervello del diamante mandarino. Iniettiamo nelle regioni afferenti ed efferenti alla zona studiata elementi traccianti fluorescenti di diversi colori. Dopo
aver preparato il tessuto per microscopia elettronica, prepariamo serie ininterrotte di sezioni ultrasottili che fotografiamo nel microscopio ottico, direttamente
dopo averle tagliate o dopo avere eseguito una colorazione con anticorpi fluorescenti nel caso di perdita della fluorescenza delle sostanze traccianti durante
la preparazione. Fotografiamo inseguito le medesime sezioni con il microscopio
elettronico. Il segnale fluorescente permette di classificare sinapsi ed altre strutture neurali identificate nelle immagini acquisite con il microscopio elettronico.
Grazie ad una preparazione del tessuto che include fissazione e colorazione con
metalli pesanti, un’alto contrasto delle membrane e qualità ultrastrutturale sono
visibili delle micrografie elettroniche. Mostriamo come la buona ultrastruttura
e l’affidabile informazione fluorescente permettono di caratterizzare sinapsi di
neuroni provenienti dal talamo nell’area premotoria HVC e come nello stesso
tessuto un diverso canale fluorescente permette di investigare neuroni che proiettano in zona motorie. Il nostro metodo di preparazione sarà utile per investigare la morfologia di neuroni e sinapsi appartenenti a diverse popolazioni e darà
informazioni statistiche sulla loro connettività, cruciale per comprendere come
segnali nel cervello vengono trasmessi tra varie aree e trasformati in un output
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motorio sensato. In aggiunta a questa parte principale, presentiamo esperimenti
che abbiamo condotto per esplorare metodi di preparazioni che evitano metalli
pesanti (la causa della grande riduzione di fluorescenza durante la preparazione
del tessuto) ed esprimenti di screening che per identificare vettori basati su virus
adeno-associati per marcare neuroni nel diamante mandarino.
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