08_Prospettive - Filetici - Recenti Progressi in Medicina

32
Recenti Prog Med 2015; 106: 32-34
Epigenetica: un nuovo strumento
per la diagnosi e il trattamento
dei tumori
Patrizia Filetici1
Epigenetics: a novel tool for early diagnosis and tumor therapy.
Summary. Epigenetics, first described by Conrad Waddington, defines how pathways setting a specific phenotype and heritable cellular functions are activated in a
DNA independent way. Epigenetics concerns the study
of genome structure and accessibility that regulates patterns of gene expression through the dynamic compaction and opening the chromatin structure. Vincent Allfrey
profetically declared in 1964 that histone modifications
could influence gene expression. In cancer very often
cells show a profound modification of DNA methylation
and mutations in chromatin regulators. These evidences provided therefore a clear link between epigenetics
and neoplasia. Advanced molecular technology such as
Deep-sequencing and ChIP-Seq revealed the frequent relocalization in cancer of many PTM readers such the AcLys binding bromodomain. These results were important
for the development of novel classes of epigenetic drugs
some of which are inhibitors of histone modifyers or
molecule interacting with reader domains. Since cancer
imply profound changes in the epigenetic profile and in
gene transcription a future challenge of molecular and
chemical biology will be to develop novel epigenetic
compounds able to correct the epigenetic disfunction
and, possibly, coadiuvate canonical therapy in the cure
of cancer.
La cromatina è una struttura macromolecolare;
il DNA si avvolge intorno a un ottametro istonico,
il nucleo soma, costituito da due copie istoniche,
H3, H4, H2A e H2B, la cui struttura-3D è stata
risolta mediante studi di cristallografia2. Gli istoni
sono proteine basiche, altamente conservate nell’evoluzione dal lievito all’uomo. Gli istoni presentano un core proteico ad alfa-elica che costituisce il
nucleo globulare del nucleosoma, e da estremità
N-terminali che protrudono all’esterno, non hanno
una struttura tridimensionale definita e presentano residui aminoacidici estremamente conservati.
Le code istoniche rappresentano delle vere e proprie piattaforme di segnalazione per la regolazione
cromatinica e sono il substrato per modificazioni
post-traduzionali (PTM) deposte selettivamente dai modulatori e modificatori della cromatina.
Acetilazione, fosforilazione, metilazione ubiquitilazione, ATP-ribosilazione sono quindi dei marchi
epigenetici, e rappresentano un livello EPI-genetico che, modificando gli istoni3, agisce alterando
legami non-covalenti all’interno di un nucleosoma
o tra nucleosomi adiacenti rendendo la cromatina
più o meno condensata e determinando la spaziatura dei nucleosomi sul DNA (figura 1). Maggiore
apertura e rilassamento della cromatina, mediata
dalla acetilazione, consente un’accessibilità maggiore dei nucleosomi che diventano interspersi e
appaiono, al microscopio, come una collana di perle del diametro di circa 4 nm che consente l’accesso
al DNA del macchinario trascrizionale e l’espressione genica. La metilazione istonica è, in generale, un marchio di repressione, rende la cromatina
estremamente compatta, i nucleosomi molto ravvicinati, recluta proteine aggiuntive che, legando
i siti metilati, contribuiscono ulteriormente alla chiusura e all’impaccamento della cromatina,
che si definisce eterocromatina, producendo una
Introduzione
Il termine “epigenetica” è stato originariamente
coniato da Conrad Waddington e definisce le modalità con le quali la cellula esprime un fenotipo
specifico e funzioni cellulari ereditabili in modo indipendente dalla sequenza del DNA. L’epigenetica
è la scienza che studia come è regolata l’accessibilità del genoma e la capacità di espressione genica
mediante un processo dinamico di condensazione e
decondensazione del genoma, mediato dalla struttura della cromatina.
L’epigenetica definisce i cambiamenti cellulari
indipendenti dalla sequenza primaria del DNA,
dipendenti dal grado di accessibilità del genoma
mediato dalla cromatina e dai suoi modificatori.
Nel 1964 Vincent Allfrey anticipò i tempi profetizzando che le modificazioni istoniche avrebbero potuto avere una influenza sulla regolazione dell’espressione genica1.
1Istituto
Figura 1. Differenziazione cellulare.
di Biologia, Medicina Molecolare e Nanobiotecnologie, CNR, Istituto di Fisiologia Generale, Roma.
Pervenuto su invito il 21 novembre 2014.
P. Filetici: Epigenetica: un nuovo strumento per la diagnosi e il trattamento dei tumori
struttura super-condensata e trascrizionalmente
inattiva nota come solenoide (30 nm). I cromosomi così chiusi e inaccessibili raggiungono il grado
massimo di compattamento nel cromosoma metafasico a tutti noto e visibile in microscopia ottica
in mitosi. Le modificazioni post-traduzionali PTM
costituiscono quindi importanti marchi epigenetici in grado di modificare la struttura del genoma
(epigenoma) e di influenzare l’espressione genica
globale e gene specifica. In un organismo le cellule
che costituiscono i diversi tessuti e organi derivano da una singola cellula e attraverso divisioni cellulari e programmi di differenziamento si originano cellule nervose, muscolari, ossee o del sangue.
Il risultato del programma di differenziamento è
quindi determinato da una regolazione epigenetica differenziale. Nello stesso modo due gemelli
omozigoti tenderanno a differenziarsi durante la
loro vita anche in relazione al loro stile di vita, dalla dieta e dall’ambiente in cui vivono. Tutti questi
sono esempi che sottolineano quanto il livello di
regolazione epigenetica sia determinante per una
cellula e contribuisce a collegare il programma di
espressione genica con l’ambiente, il metabolismo
esterno e lo stile di vita.
Esistono i modificatori della cromatina come
acetitasi/deacetilasi, metiltransferasi/demetilasi,
chinasi, ubiquitina-ligasi/proteasi. Sono generalmente proteine chimeriche che presentano un dominio catalitico di modificazione spesso affiancato
da un dominio che legge e interagisce selettivamente con un marchio PTM, come il bromodominio, lettore di Ac-Lys, il chromodominio Met-Lys,
tudor Met-Arg e altri. Quindi le code N-terminali
degli istoni presentano un vero e proprio codice di
PTM attivanti o repressive la cui combinazione
rappresenta un vero e proprio codice istonico letto dai reader che riconoscono singoli marchi epigenetici. Spesso alle modifiche PTM istoniche si
associa la metilazione del DNA in particolare su
regioni CpG il cui stato di metilazione contribuisce
a creare siti di regolazione genica attivi o inattivi e
quindi ad attivare specifici programmi genici.
Il recente sviluppo di metodiche di analisi genomica globale, come la spettrometria di massa, e
la marcatura con isotopi stabili (SILAC) costituiscono tecnologie in continua espansione e hanno
aperto la strada a un’analisi globale dell’epigenoma; inoltre, consentono lo studio della localizzazione dei lettori del codice genetico (readers) sui
genomi di cellule normali o patologiche. La lettura
dei pattern di metilazione genomica mediante sequenziatori di nuova generazione consente, inoltre, di ottenere il profilo delle regioni metilate e la
comparazione di cellule normali con quelle malate.
Epigenetica e cancro
Le prime evidenze di una connessione diretta
tra epigenoma e cancro si sono basate sullo studio
comparativo tra il profilo di espressione genica e
lo stato di metilazione del DNA di cui una rasse-
gna dettagliata è rappresentata dal contributo di
Feinberg e Tycko4. International Cancer Genome
Consortium (ICGC) ha effettuato il sequenziamento di interi genomi in una vasta collezione di
tessuti tumorali umani producendo un catalogo di
mutazioni ricorrenti in numerosi regolatori epigenetici. Il linfoma follicolare, per esempio, presenta
mutazioni nella istone-metiltransferasi MLL2 nel
90% dei casi. Un quadro delle mutazioni ricorrenti in diversi tipi di tumore dimostra che le acetiltransferasi e le metiltransferasi istoniche sono tra
le più rappresentate. Anche il Deep-sequencing è
una tecnica OMICA di grande rilevanza. La tecnica si avvale di ChIP-Seq (Chromatin ImmunoPrecipitation and Sequencing), si immunoprecipita
con anticorpi specifici un modificatore cromatinico
o un dominio di lettura di PTM, per esempio, bromodominio, chromodominio. Il materiale immunoprecipitato viene quindi sequenziato. Le sequenze
risultanti rappresenteranno le porzioni del DNA
che interagiscono con il reader analizzato. Il risultato rappresenta la mappa genomica dei siti di legame del reader cromatinico sul genoma: in altre
parole, evidenzia le regioni che reclutano e legano
il fattore epigenetico. I dati raccolti sono significativi e dimostrano che un cambiamento di PTM
cromatinici e la variazione di legame dei r­ eader
sul genoma viene alterato nei tumori rispetto ai
tessuti normali. Da questa analisi si evidenzia
quindi come la redistribuzione di zone di legame
di lettori cromatinici coincide e determina un pattern epigenetico e una concomitante espressione
genica alterata frequentemente connessi con la lesione tumorale. Geni silenziati da metilazioni istoniche in tumori coincidono spesso con geni chiave
per il differenziamento. Lo stato di metilazione del
DNA, il reclutamento e l’interazione dei reader sul
genoma e mutazioni di modificatori cromatinici
contribuiscono a produrre quindi una banca dati
la cui analisi e intersezione dei risultati produrrà
sicuramente database epigenetici che aiuteranno
a capire le caratteristiche e l’interconnessione tra
lo stato dell’epigenoma in una cellula normale e le
modificazioni in diversi tipi di tumori umani.
Farmaci epigenetici
Mutazioni in modificatori cromatinici e alterazioni nella localizzazione su regioni genomiche dei lettori di PTM ricorrenti in tumori non
solo implicano un ruolo causale di questi fattori
nell’insorgenza dei tumori, ma possono anche rappresentare bersagli utili per nuove terapie5. Sono
descritti un numero crescente di nuovi inibitori di
modificatori cromatinici. Questi composti si trovano a uno stadio diverso di sviluppo, alcuni specifici per DNA metiltransferasi, istone deacetilasi e
chinasi sono stati approvati dalla Food and Drug
Administration statunitense. In particolare, in base a un gran numero di studi preclinici e clinici,
due paninibitori di istone deacetilasi HDAC, vorinostat e romidepsin sono stati approvati da FDA
33
34
Recenti Progressi in Medicina, 106 (1), gennaio 2015
per l’uso clinico in pazienti con linfoma cutaneo a
cellule T. Altri inibitori HDAC sono in studio per
il trattamento di altri tipi di tumore. Tuttavia,
l’effetto pleiotropico di queste sostanze continua
a porre dei limiti all’uso di queste molecole nei
trattamenti clinici. Un nuovo campo di indagine
indagato recentemente riguarda lo sviluppo di
molecole che interagiscono con i domini di lettura di PTM. Tra questi, il bromodominio, le istone
acetiltransferasi, Gcn5, p300, CBP sono proteine
chimeriche che quasi invariabilmente presentano all’estremità carbossi-terminale il bromodominio, un dominio proteico altamente conservato
nell’evoluzione. Il bromodominio può essere definito un “chromatin browser”6 che interagisce con
acetil-lisina contribuendo a reclutare le HAT e le
bromodomain-protein sulle regioni genomiche acetilate e quindi trascrizionalmente attive. Alcune
proteine che contengono il bromodominio, le BETprotein, rivestono un ruolo chiave nel controllo del
ciclo cellulare e nel processo di progressione della
trascrizione. Molecole che interagiscono con il bromodominio sono quindi capaci di bloccare e inibire le BET-protein rappresentando una strategia
innovativa per combattere alcuni tipi di tumore7.
Inibitori di BET-protein hanno mostrato un’ottima
efficacia in NUT-midline carcinoma e in diversi tumori ematologici. In alcuni studi si è dimostrato
che questi inibitori e interattori, bloccando le proteine BET, inibiscono di conseguenza l’espressione dell’oncogene MYC che è un gene master per
la proliferazione e la sopravvivenza cellulare5. In
realtà, il bromodominio è presente in molti altri
fattori coinvolti nell’attivazione di pathway differenziativi; inoltre, il loro reclutamento su regioni
genomiche è frequentemente alterato in cellule tumorali. Gli inibitori BET sono anche stati testati
in altri tipi di tumore, in stati infiammatori e in
infezioni virali; in particolare, la selettività di questi inibitori verso le fusioni oncogene BRD3-NUT
e BRD4-NUT ha fornito un bersaglio specifico per
utilizzare queste nuove molecole di interazione con
il bromodominio e consentendone l’utilizzo in sperimentazioni cliniche nella terapia di forme di linfoma progressivo. Questi inibitori di acetilazione
possono fornire nuove strade per diminuire l’impatto dell’espressione di nuovi pathway in cellule
tumorali e consentono di essere affiancati ad altri
inibitori come, per esempio, inibitori di chinasi.
Il blocco del differenziamento, la divisione incontrollata, l’invasività tessutale e l’evasione dal
controllo della morte cellulare sono caratteristiche
Indirizzo per la corrispondenza:
Dott. Patrizia Filetici
Istituto di Biologia, Medicina Molecolare
e Nanobiotecnologie, CNR
Istituto Fisiologia Generale
Piazzale Aldo Moro 5
00185 Roma
E-mail: [email protected]
ricorrenti delle cellule neoplastiche determinate
da cambiamenti epigenetici. La sfida principale
per sviluppare degli inibitori efficaci è identificare la loro selettività. Nel caso delle BET-protein,
per esempio, le molecole che interagiscono con il
bromodominio possono selettivamente inibire una
sottoclasse genica attivata esclusivamente nei
tumori. Inoltre, in molti casi le cellule tumorali
attivano dei nuovi pathway di espressione genica connessi con determinate PTM così che inibire i modificatori cromatinici corrispondenti possa
essere una via per bloccare la crescita di cellule
neoplastiche.
È utile ricordare che questi nuovi approcci terapeutici di inibizione di regolatori epigenetici possono in molti casi essere associati a trattamenti
di chemioterapia classica. Basandoci sull’osservazione che la differenza tra una cellula normale
e una tumorale spesso è basata su una profonda
differenza del loro epigenoma, mirare attraverso
nuove molecole a inibire i regolatori epigenetici
può rappresentare una strategia intesa a distruggere le cellule trasformate in modo selettivo. Cellule neoplastiche ematopoietiche sono, infatti, più
vulnerabili di quelle sane, che presentano vie alternative di compensazione nella regolazione epigenetica. Sicuramente molte di queste nuove cure
epigenetiche sono ancora in fase di definizione, ma
siamo sicuri che in un prossimo futuro potranno
riservare nuove opportunità e prospettive per la
diagnosi precoce e la cura dei tumori umani.
Bibliografia
1. Allfrey VG, Faulkner R, Mirsky AE. Acetylation and
methylation of histones and their possible role in the
regulation of RNA synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A
1964; 51: 786-94.
2. Luger K, Dechassa ML, Tremethick DJ. New insights
into nucleosome and chromatin structure: an ordered
state or a disordered affair? Nat Rev Mol Cell Biol
2012; 13: 436-47.
3. Jenuwein T, Allis CD. Translating the histone code.
Science 2001; 293: 1074-80.
4. Feinberg AP, Tycko B. The history of cancer epigenetics. Nat Rev Cancer 2004; 4: 143-53.
5. Dawson MA, Kouzarides T. Cancer epigenetics: from
mechanism to therapy. Cell 2012; 150: 12-27.
6. Filetici P, Ornaghi P, Ballario P. The bromodomain:
a chromatin browser? Front Biosci 2001; 6: D866-76.
7. Filippakopoulos P, Knapp S. Targeting bromodomains: epigenetic readers of lys acetylation. Nat Rev
Drug Discov 2014; 5: 337-56.