UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI VERONA
Corso di Laurea in Biotecnologie Agro-Industriali
Dispense di
TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Prof. Massimo Delledonne
Tel. 045-8027962; Email: [email protected]
http://www.sci.univr.it/~delledon
16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
PLASMIDI, COSMIDI, BACTERIOFAGI, YAC E BAC
Vectors derived from plasmids ....................................................................................................................................... 5 Cosmidi......................................................................................................................................................................... 12 Fosmidi ......................................................................................................................................................................... 14 Vettori fagici ................................................................................................................................................................. 16 Fagi filamentosi ........................................................................................................................................................ 17 Fagi di tipo λ............................................................................................................................................................. 18 YAC.............................................................................................................................................................................. 31 BAC e PAC .................................................................................................................................................................. 35 ENZIMI
DNA Polimerasi DNA dipendenti ................................................................................................................................ 39 DNA polimerasi I di Escherichia coli ...................................................................................................................... 41 Frammento di Klenow della DNA polimerasi I ........................................................................................................ 41 Taq DNA polimerasi................................................................................................................................................. 42 DNA polimerasi templato indipendenti ........................................................................................................................ 42 Deossinucleotidiltransferasi terminale ...................................................................................................................... 42 DNA polimerasi RNA dipendenti................................................................................................................................. 43 Trascrittasi inversa .................................................................................................................................................... 43 RNA polimerasi DNA dipendenti................................................................................................................................. 44 RNA polimerasi di Escherichia coli ......................................................................................................................... 44 RNA polimerasi dei fagi SP6, T7, T3 ....................................................................................................................... 44 DNA LIGASI ............................................................................................................................................................... 45 DNA ligasi T4 .......................................................................................................................................................... 46 DNA ligasi di Escherichia coli ................................................................................................................................. 46 RNA ligasi .................................................................................................................................................................... 47 RNA ligasi T4 ........................................................................................................................................................... 47 RNA Polimerasi DNA indipendenti ............................................................................................................................. 48 Polimerasi poly(A).................................................................................................................................................... 48 Fosfatasi e chinasi ......................................................................................................................................................... 48 Fosfatasi alcalina ...................................................................................................................................................... 48 T4 polinucleotide chinasi .......................................................................................................................................... 49 Esonucleasi ................................................................................................................................................................... 51 Esonucleasi VII (exo VII) ......................................................................................................................................... 51 Esonucleasi III (exo III) ........................................................................................................................................... 51 Endonucleasi ................................................................................................................................................................. 52 Nucleasi BAL 31 ...................................................................................................................................................... 52 Nucleasi S1 ............................................................................................................................................................... 53 Nucleasi Mung Bean................................................................................................................................................. 53 Deossiribonucleasi I (DNasi I).................................................................................................................................. 54 Ribonucleasi ................................................................................................................................................................. 54 Ribonucleasi A.......................................................................................................................................................... 54 Ribonucleasi H.......................................................................................................................................................... 55 Enzimi di restrizione ..................................................................................................................................................... 55 RESTRIZIONE DEL DNA
Reazione di taglio ......................................................................................................................................................... 56 QUANTIFICAZIONE DEL DNA
Quantificazione spettrofotometrica del DNA ............................................................................................................... 60 ELETTROFORESI
Elettroforesi su gel di agarosio ..................................................................................................................................... 62 Preparazione del gel di agarosio (0.8%) ................................................................................................................... 63 Caricamento e corsa .................................................................................................................................................. 64 Visualizzazione delle bande...................................................................................................................................... 64 Elettroforesi pulsata ...................................................................................................................................................... 65 Escherichia coli
Inoculo e crescita dei batteri ......................................................................................................................................... 67 Semina batterica in piastra ............................................................................................................................................ 68 Preparazione delle piastre ......................................................................................................................................... 68 Piastratura (plating) .................................................................................................................................................. 69 Antibiotici ................................................................................................................................................................. 70 MINIPREPARAZIONE DI DNA PLASMIDICO
Preparazione di DNA plasmidico tramite lisi alcalina .................................................................................................. 72 2
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QIAprep Spin Miniprep Kit .......................................................................................................................................... 75 Magic miniprep............................................................................................................................................................. 77 ISOLAMENTO DI DNA GENOMICO DA TESSUTI VEGETALI
DNeasy Plant Mini Kit ................................................................................................................................................. 80 Metodo microprep Dellaporta ....................................................................................................................................... 82 Arabidopsis Genomic DNA Microprep Extraction Protocol ........................................................................................ 83 Minipreparazione di DNA da pianta ............................................................................................................................. 84 Estrazione del DNA con CTAB 2X .............................................................................................................................. 85 CTAB Invertito ............................................................................................................................................................. 88 PURIFICAZIONE DEL DNA DA GEL
QIAEXII Agarose Gel Extraction................................................................................................................................. 91 Geneclean ..................................................................................................................................................................... 93 PURIFICAZIONE DEL DNA IN SOLUZIONE
QIAEXII Protocol for Desalting and Concentrating DNA Solutions ........................................................................... 95 Geneclean for DNA solutions ....................................................................................................................................... 97 Trattamento con CTAB di DNA in soluzione .............................................................................................................. 98 Trattamento con fenolo:cloroformio ............................................................................................................................. 99 Precipitazione del DNA .............................................................................................................................................. 100 Trattamento con RNAsi .............................................................................................................................................. 100 ESTRAZIONE DI RNA DA TESSUTI VEGETALI
RNeasy Plant Mini Protocol (Qiagen) ........................................................................................................................ 101 TRIzol Reagent ........................................................................................................................................................... 104 Solubilizzazione dell’RNA ......................................................................................................................................... 106 Preparazione di poli(A)+ RNA mediante cromatografia su oligo(dT)-cellulosa. ........................................................ 107 Preparazione della colonna ..................................................................................................................................... 107 Separazione dell’mRNA ......................................................................................................................................... 108 CLONAGGIO
Descrizione ................................................................................................................................................................. 110 Fasi del clonaggio ....................................................................................................................................................... 111 Preparazione del frammento ................................................................................................................................... 113 Preparazione del plasmide ricevente ....................................................................................................................... 113 Ligatura................................................................................................................................................................... 116 Esempi di clonaggio ............................................................................................................................................... 119 Preparazione e trasformazione delle cellule competenti ......................................................................................... 124 Screening colorimetrico e controllo cellule ricombinanti ....................................................................................... 127 Protocolli clonaggio .................................................................................................................................................... 128 Purificazione dei plasmidi e quantificazione del DNA ........................................................................................... 128 Taglio con enzimi di restrizione ............................................................................................................................. 128 Preparazione del frammento ................................................................................................................................... 129 Preparazione del plasmide ricevente ....................................................................................................................... 129 Quantificazione del DNA su gel ............................................................................................................................. 130 Ligatura................................................................................................................................................................... 130 Preparazione delle cellule competenti con CaCl2 ................................................................................................... 131 Preparazione di cellule elettrocompetenti ............................................................................................................... 133 Trasformazione mediante shock termico di cellule rese competenti con CaCl2 ..................................................... 134 Trasformazione mediante elettroporazione di cellule elettrocompetenti ................................................................ 136 POLYMERASE CHAIN REACTION
PCR su DNA .............................................................................................................................................................. 141 Descrizione di un ciclo universale: ......................................................................................................................... 143 RT-PCR ...................................................................................................................................................................... 144 Protocollo di retrotrascrizione one-step .................................................................................................................. 144 Protocollo di retrotrascrizione two-step: sintesi del first-strand cDNA .................................................................. 146 IBRIDAZIONE MOLECOLARE
Southern Blot .............................................................................................................................................................. 147 DOT AND SLOT BLOT ............................................................................................................................................ 150 Northern Blot .............................................................................................................................................................. 151 Marcatura sonde radioattive........................................................................................................................................ 153 Random Priming ..................................................................................................................................................... 154 Ibridazione .................................................................................................................................................................. 154 Ibridazione classica ................................................................................................................................................. 156 Ibridazione con il metodo di Church ...................................................................................................................... 157 Stripping (rimozione della sonda dalla membrana) ................................................................................................ 158 3
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Nucleic Acid Labelling and detection......................................................................................................................... 159 Non-radioactive labelling methods ......................................................................................................................... 159 Choosing a radioactive labelling system................................................................................................................. 171 COMMONLY USED REAGENTS AND EQUIPMENT
DISCLAIMER
Nonostante la continua attività di revisione, questo documento contiene ancora numerosi errori.
Esso è stato concepito solamente come supporto all’attività formativa del Modulo I del corso di
Tecnologie biomolecolari, e non intende sostituire i testi di riferimento del corso che sono:
• Molecular Cloning – a laboratory manual, 3° edizione Sambrook and Russel, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, New York (ISBN 0-87969-577-3)
• Ingegneria Genetica – principi e tecniche. Primrose, Twyman e Old, Zanichelli (ISBN 88-0807581-8
• Current Protocols in Molecular Biology (http://meneghetti.univr.it/banche.php)
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Vectors derived from plasmids
Plasmids are self-replicating, extrachromosomal DNA molecules found in virtually all bacterial species. In nature,
plasmids occur in exuberant profusion, varying in structure, size, mode of replication, number of copies per bacterial
cell, ability to propagate in different bacteria, transferability between bacterial species, and perhaps most important, in
the traits they carry. Most prokaryotic plasmids are double-stranded circular DNA molecules; however, linear
plasmids have been identified in both gram-positive and gram-negative bacteria. The size of plasmids varies
widely, from several kilobases to hundreds of kilobases. Replication of plasmids depends on host-cell proteins but also
may require plasmid-encoded functions. Plasmid replication may be synchronized with the bacterial cell cycle,
resulting in a low number of plasmid molecules per bacterial cell, or independent of the host cell cycle, allowing
for the proliferation of hundreds of plasmid copies per cell. Some plasmids freely transfer their DNA across
bacterial species, some only transfer their DNA into bacteria of the same species, and some do not transfer their DNA at
all. Plasmids carry genes that specify a wide variety of functions including: resistance to antibiotics, resistance to heavy
metals, sensitivity to mutagens, sensitivity or resistance to bacteriophages, production of restriction enzymes,
production of rare amino acids, production of toxins, determination of virulence, catabolism of complicated organic
molecules, ability to form symbiotic relationships, and ability to transfer DNA across kingdoms.
Starting in the 1970s, vectors for propagation, manipulation, and delivery of specific DNA sequences were constructed
with fragments from naturally occurring plasmids, primarily Escherichia coli plasmids. All plasmid vectors contain
three common features: a replicator, a selectable marker, and a cloning site. The replicator is a stretch of DNA that
contains the site at which DNA replication begins (the origin of replication or ori), and that also includes genes
encoding whatever plasmid-encoded RNAs and proteins are necessary for replication. The selectable marker, necessary
for following and maintaining the presence of the plasmid in cells, is usually dominant and is usually a gene encoding
resistance to some antibiotic. The cloning site is a restriction endonuclease cleavage site into which foreign DNA can be
inserted without interfering with the plasmid's ability to replicate or to confer the selectable phenotype on its host. Over
the years, plasmid vectors have increased in sophistication; in addition to these three basic elements many vectors now
include features that make them particularly suitable for specific types of experiments.
REPLICATORS
One of the ways that replicators are classified is based on the number of plasmid molecules maintained per bacterial cell
under some set of standard growth conditions, the so-called copy number of the plasmid. This book defines high-copynumber plasmids as those which exist in ≥20 copies per bacterial cell grown in liquid LB medium, and low-copynumber plasmids as those which exist in <20 copies per cell. High-copy-number-plasmids tend to be smaller than lowcopy-number plasmids. They are more commonly used in molecular biological techniques since it is easier to prepare
large quantities of pure plasmid DNA from cells that bear them. Low-copy-number plasmids are utilized when it is
important to control the gene dosage of a cloned sequence, for example when the DNA sequence or the protein it
encodes makes the host organism sick (see Table 1.1).
High-copy-number plasmids tend to be under relaxed control of replication. These relaxed plasmids initiate DNA
replication in a process controlled by plasmid-encoded functions (see Mechanism of Replication and Copy-Number
Control), and replication does not depend on the unstable host replication initiation proteins synthesized at the start of
the bacterial cell cycle. Because their replication depends only on the stable host enzymatic replication machinery, the
copy number of these plasmids can be greatly increased, or amplified, by treatment of the plasmid-containing cells with
protein synthesis inhibitors such as chloramphenicol or spectinomycin. These protein synthesis inhibitors prevent
synthesis of the replication-initiation proteins required for chromosomal replication, allowing the replication enzymes to
be commandeered for plasmid replication. High-copy-number plasmids usually do not have any mechanism to ensure
correct segregation of the plasmids to the daughter cells; they rely on random assortment to partition at least one copy
of the plasmid to each daughter.
Plasmids carrying the ColE1 and pMB1 replicons are incompatible with one another, but they are fully compatible with
those carrying pSC101 and p15A replicons
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Table 1.1 Characteristics of Commonly Used Plasmid Replicators
Prototype
Markers on
Replicator
plasmid
Size (bp)
prototype
pBR322
4,362
pMB1
pUC vectors
ColE1
pMK16
~4,500
p15A
pSC101
F
R6K
R1 (R1drd-17)
RK2
pACYC184
pLG338
pDF41
pRK353
pBEU50
pRK2501
~4,000
~7,300
~12,800
~11,100
~10,000
~11,100
⎯c
Apr, Tetr
Apr
Kanr, Tetr,
ColE1imm
Emlr, Tetr
Kanr, Tetr
TrpE
TrpE
Apr, Tetr
Kanr, Tetr
Gal
Massimo Delledonne
Copya
number
Low; 15-20
References
Bolivar et al., 1977
High ; 500-700
High; >15
Kahn et al., 1979
High; ~15
Low; ~6
Low; 1 to 2
Low; <15
Low at 30°C; high above 35°Cb
Low; 2 to 4
Chang et al., 1978
Stoker et al., 1982
Kahn et al., 1979
Kahn et al., 1979
Uhlin et al., 1983
Kahn et al., 1979
Jackson et al., 1972
λ dv
λ dvgal
⎯
a Copy numbers are for the prototype plasmid. Plasmid vectors that contain replicators derived from these plasmids may have
different copy numbers due to introduction of mutations into the replicator. For example, pUC series (pmB1-derived) has copy
numbers of 1000-3000.
b Temperature sensitive.
c Not known.
Low-copy-number plasmids are usually under stringent control. Initiation of replication of these plasmids depends on
unstable proteins synthesized at the start of the bacterial cell cycle and thus is synchronized with the replication of the
bacterial chromosome. As copy number decreases, random segregation of plasmid copies is not sufficient to ensure that
each daughter cell acquires a copy of the plasmid. However, most low-copy-number plasmids carry genes that
guarantee their maintenance in the bacterial population. Stabilizing loci that encode a mechanism for postsegregational
killing of plasmid-free daughter cells and a system for efficiently resolving plasmid multimers so that they can be
appropriately partitioned have been identified. In addition, cis- and trans-acting partitioning loci (par) that are thought
to constitute an active mechanism for distribution of plasmid copies to daughter cells have also been identified.
MECHANISM OF REPLICATION AND COPY-NUMBER CONTROL
While there are many different replicators, the majority of plasmid vectors used in routine recombinant DNA work
contain one of the functionally similar replicators derived from plasmids ColE1 or pMB1 (for example, the popular
pBluescript series contain a ColE1 origin, and the pUC plasmids are derived from pMB1). The ColE1 replicator is a
600-nucleotide DNA fragment that contains the origin of replication (ori), encodes an RNA primer, and encodes
two negative regulators of replication initiation. All enzymatic functions for replication of the plasmid are
provided by the bacterial host.
Plasmid replication begins with transcription of an RNA primer upstream of the ori (RNAII; see Fig. 1.1) by the
host RNA polymerase. RNAII is elongated through and terminated downstream of the ori. Interaction of a
specific secondary structure in the nascent RNAII transcript with the DNA template results in formation of a
persistent hybrid between RNAII and the DNA template such that RNAII remains paired with the DNA
template at the ori. The RNAII transcript is cleaved by RNAseH at the ori sequence. This processed RNAII
primer is extended by DNA polymerase I to initiate plasmid replication. Regulation of the proper RNAII
secondary structure controls initiation of DNA replication and is responsible for determining the number of
plasmid molecules per cell.
Both ColE1 and pMB1 plasmids are high-copy-number plasmids, maintained at between 15 and 25 copies per bacterial
cell, respectively. The copy number of these plasmids is regulated by an antisense RNA transcript, RNAI, and the
protein ROP, the product of the rop gene. RNAI and the ROP protein act in concert to intercept formation of the
proper RNAII secondary structure. RNAI is exactly complementary to the 5′ end of the RNAII transcript. RNAI
base pairs with the 5′ end of RNAII, preventing the formation of the specific secondary structure necessary for
establishment of a persistent hybrid between RNAII and the DNA template that is a prerequisite for maturation
of the RNAII primer. ROP protein stabilizes the interaction between the antisense RNAI and the primer RNAII.
Mutations that disrupt or destabilize the RNAI/RNAII interaction result in a higher plasmid copy number. For
example, the pUC plasmid series have pMB1 replicators that do not contain an intact rop gene, which accounts for a 26
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fold increase in copy number over plasmids with intact pMB1 replicons. Interestingly, additional mutation(s) in the
origin are the main factor in the ultra-high-copy number (1000 to 3000) of this plasmid series (K. Struhl, unpub.
observ.)
Fig. 1.1
PLASMID INCOMPATIBILITY
For experiments that require that more than one plasmid vector be maintained in a bacterial cell at the same time,
another critical feature of plasmid replicators is whether or not two plasmid replicators are compatible. Two plasmids
are said to be incompatible with one another, and hence belong to the same incompatibility group, if they cannot
stably co-exist. Plasmids are generally incompatible if they share any function required for the regulation of plasmid
replication. For example, ColE1- and pMB1-derived plasmids are incompatible with one another but are compatible
with p15A plasmids. The incompatibility of ColE1 and pMB1 plasmids is a consequence of two facts: first, that plasmid
DNA replication of these plasmids is negatively controlled by RNAI which acts in trans on other plasmids with the
same primer RNA, and second, that these plasmids lack a mechanism to ensure that each plasmid in a cell replicates
once per cell cycle. Therefore, if a cell that contains a pMBI-derived plasmid is subsequently transformed with a ColE1derived plasmid, cells selected to contain the ColE1 plasmid will usually have lost the pMBI plasmid.
SELECTABLE MARKERS
In order to guarantee that a plasmid vector is taken up by and maintained in bacterial cells, there must be a way to select
for plasmid-containing cells. Genes encoding resistance to antibiotics such as ampicillin, tetracycline, kanamycin and
chloramphenicol are the most common bacterial selectable markers for plasmid vectors. Typically, cells are transformed
with plasmid DNA and then plated out on LB plates that contain the proper antibiotic. Only the bacterial cells
containing the plasmid will grow on the selective medium; the antibiotic-resistance phenotype conferred is dominant to
the antibiotic-sensitive phenotype of cells that do not possess the plasmid vector. Another dominant selectable marker
that is occasionally used is the immunity to infection by phage lambda (lambda repressor).
For experiments that involve introduction of plasmid vectors into systems other than bacteria, such as yeast or
mammalian cells, it is usually necessary to select for the presence of plasmid DNA in these hosts. Selectable markers
for yeast and mammalian systems are generally distinct from those used in E. coli (see Plasmid Vectors for Yeast and
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Plasmid Vectors for Expression in Cultured Mammalian Cells). In cases where a vector is needed that will be used in
both E. coli and another host, it is necessary for the plasmid vector to carry selectable markers for both hosts.
ANTIBIOTICO
Tetraciclina
Ampicillina
Cloramfenicolo
Kanamicina
neomicina
MODALITA’ D’AZIONE
RESISTENZA
Si lega ad una proteina della subunità 30S Il gene per la resistenza codifica per una proteina
del ribosoma inibendone la traslocazione.
di 399 aminoacidi associata alla membrana che
impedisce l'entrata dell'antibiotico nella cellula. Il
blocco all'ingresso richiede tempi brevi e non è
influenzato dalla quantità di antibiotico presente.
Si lega e inibisce enzimi della membrana Il gene per la resistenza codifica per un enzima
batterica coinvolti nella sintesi della parete che è secreto nello spazio periplasmico del
cellulare.
batterio, dove detossifica la droga idrolizzando
l'anello β lattame. È molto usato e sta creando
problemi per la comparsa di antibiotico
resistenze.
Si lega alla subunità ribosomale 50S e Il gene codifica per una proteina citosolica
inibisce la sintesi proteica.
tetramerica che, in presenza di acetil coenzima A,
catalizza la formazione di derivati idrossil
acetossi del cloramfenicolo che sono incapaci di
legarsi
ai
ribosomi.
L'espressione
dell'acetiltrasferasi è sensibile ai cataboliti ed
aumenta quando i batteri crescono su una fonte di
carbonio diversa dal glucosio.
e Sono aminoglicosidi deossistreptamine che Entrambi gli antibiotici sono inattivati da una
si legano ai componenti ribosomali e aminoglicoside fosfotrasferasi localizzata nello
inibiscono la sintesi proteica.
spazio periplasmico. Si ritiene che la
fosforilazione interferisca con il trasporto attivo
degli antibiotici nella cellula.
Le resistenze che si basano sulla degradazione dell’antibiotico (ampicillina, cloramfenicolo, kanamicina, neomicina)
richiedono l'accumulo di una quantità sufficiente di proteina e il range di concentrazione di antibiotico consigliato si
basa su considerazioni relative al numero di plasmidi presenti e al tempo di incubazione.
CLONING SITE
Today's plasmid vectors contain a multiple cloning site (MCS) or polylinker cloning region that can include >20
tandemly arranged restriction endonuclease sites. The sites in the polylinker are almost always designed to be unique
within the vector sequence so that cutting the vector with a restriction endonuclease in the polylinker and cloning
foreign DNA into this site does not disrupt other critical features of the vector. The plethora of sites in the polylinker
ensures that the appropriate enzyme sites will be available for cloning most DNA fragments, provides unique reference
restriction sites for rapid restriction mapping of the insert, and generally allows for a great deal of flexibility when
manipulating the cloned DNA.
The sequences that directly flank the polylinker site are often useful for manipulation or analysis of insert DNA. Many
polylinker sites are flanked by sequences for which there are commercially available complementary oligonucleotides,
for example the M13 reverse, −20, and −40 primers, that can be used for priming polymerase chain reactions (PCR) or
DNA sequencing reactions. Such primers are useful tools for amplification or sequencing of any DNA fragment
inserted into the polylinker. Some polylinkers are bordered by 8-bp-cutter restriction sites, like Not1. These sites occur
infrequently in DNA and thus allow for the easy excision of an intact insert fragment from the plasmid vector.
Many plasmid vectors have been developed with bacteriophage⎯SP6, T7, or T3⎯promoters flanking the polylinker
cloning sites. These promoters can be used in vitro or in vivo, if the bacteriophage RNA polymerase is also present, to
produce large quantities of RNA transcripts from DNA inserted into the polylinker.
In order to make it easier to identify plasmids that contain insert DNA, the polylinkers of some vectors have been
engineered so that introduction of DNA into the polylinker results in a scorable phenotype. The most common example
of this is insertion of the polylinker of many basic cloning vectors, the pUC series for example, into the lacZ gene α
fragment. In the appropriate genetic background, production of the lacZ α fragment allows for formation of an active βgalactosidase enzyme which results in the formation of blue colonies on Xgal/IPTG indicator plates. Cloning into these
polylinkers prevents production of a functional lacZ α fragment, allowing for rapid identification of plasmids
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containing inserts as white colonies on Xgal/IPTG indicator plates. Vectors have also been developed that allow for
direct selection of plasmids containing inserts by location of the polylinker in the ccdB (control of cell death) gene
which causes cell death in E. coli. Disruption of the ccdB gene by introduction of an insert into the polylinker allows the
cells to survive, and thus only recombinants will grow under conditions where the ccdB gene is expressed.
SCELTA DEL PLASMIDE VETTORE
Quando si seleziona un vettore plasmidico si considerano le dimensioni, il numero di copie, il polylinker e l'abililità a
selezionare i cloni ricombinanti.
I differenti tipi di vettori vengono utilizzati in relazione alla funzione desiderata: produrre grandi quantità di DNA,
esprimere una proteina di fusione in un batterio, ottenere un ibrido in lievito.
pBR322 è un vettore di prima generazione; contiene un replicatore pMB1 e geni codificanti la resistenza all'ampicillina
e alla tetracicilina.
Il DNA esogeno viene inserito in un sito di restrizione all’interno della sequenza del gene codificante per la resistenza
all’ ampicillina, inattivandola. Questa procedura consente alle colonie che portano i plasmidi trasformati di essere
identificate: non sono in grado di crescere su un mezzo con l'antibiotico.
•
•
Selezione iniziale con tetraciclina (vengono eliminate tutte le cellule senza plasmide)
Si riportano le colonie su una seconda piastra contenente ampicillina (sopravvivono le colonie non
ricombinanti: è necessario risalire alla colonia prelevata dalla prima piastra)
Risulta tuttavia più pratico e efficace eseguire un doppio passaggio riportando le stesse colonie su un primo terreno
contenente ampicillina e su un secondo con tetraciclina. L’ordine con cui disporre i terreni con gli antibiotici va
rispettato: si evitano così errori di interpretazione eventualmente dovuti al prelevamento di batteri insufficienti alla
crescita dei microrganismi in entrambe le piastre.
• in tetraciclina crescono tutte le cellule con plasmide
• le colonie che non crescono in ampicillina contengono un plasmide ricombinante
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pUC19 -pUC18 appartengono alla famiglia di plasmidi vettori che esprimono il frammento N-terminale del prodotto
genico del gene lacZ e mostrano una α-complementazione in particolari ospiti: le subunità della β galattosidasi, una
codificata dal plasmide,una dall’ospite (E. coli), complementano e diventano funzionali. L'enzima agisce su Xgal,
molecola incolore che se rotta dalla β galattosidasi rende blu la colonia. L'operone lac è attivato se viene fornito
galattosio ma, una volta esaurito il substrato attivante, il gene si spegne non consentendo la colorazione delle colonie
dove la β galattosidasi è comunque funzionale: ciò potrebbe portare ad interpretazioni erronee.
Si preferisce quindi utilizzare IPTG che attiva l'operone come il galattosio, ma non è degradato dall'attività enzimatica.
PUC19-PUC18 contengono un polylinker nella regione α del gene lacZ (si tratta della stessa sequenza ma con
orientamento opposto). Se un frammento viene inserito nel polylinker la β galattosidasi risulta non essere più
funzionale: le colonie trasformate formano colonie bianche anziché blu.
I plasmidi pUC mancano del gene rop che normalmente si trova nell’origine di replicazione e che è implicato nel
controllo del numero di copie: pertanto pUC19 e pUC18 sono a alto numero di copie.
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pBluescript M13+,M13- contiene, in aggiunta ad ori, un origine di replicazione f1 di un fago filamentoso inserita in
un vettore derivato da un plasmide pUC. Esso contiene inoltre i promotori T7 e T3 (o SP6) del batteriofago ai due lati
del polylinker.
Questi vettori ibridi, chiamati anche FAGEMIDI, possono essere usati per generare DNA a singolo filamento in vivo, o
RNA in vitro, complementare a uno dei due filamenti del DNA estraneo inserito nel polylinker ( + o - a seconda dell'
orientamento)
I fagemidi si moltiplicano in E. coli come normali plasmidi a doppio filamento finché non viene fornito un fago helper.
Dopo l'aggiunta di quest'ultimo, essi ne utilizzano il meccanismo di replicazione ed impacchettano i singoli filamenti di
DNA in particelle fagiche. Il fago helper è un mutante che replica in modo poco efficiente il proprio DNA ma fornisce
enzimi di replicazione virali e proteine strutturali per la produzione di molecole di DNa da impacchettare negli involucri
di rivestimento fagico.
Il DNA a singolo filamento purificato da queste particelle può essere utilizzato come stampo per determinare la
sequenza nucleotidica di un segmento di DNA per mutagenesi dirette verso nucleotidi, per la sintesi di sonde.
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Cosmidi
I cosmidi sono plasmidi che portano il sito cos dei batteriofagi λ. Sono stati concepiti per superare il limite
dimensionale durante la trasformazione di E. coli mediante shock termico. Si è pensato infatti che plasmidi di
grandi dimensioni potevano essere ‘inseriti’ in cellule di E. coli sfruttando il fago λ come vettore. I concatenameri
delle molecole cosmidiche funzionano infatti da substrati per l’impaccamento in vitro: hanno la stessa infettività dei
fagi λ. Tuttavia, una volta all’interno della cellula, il cosmide non può dirigere la sintesi di nuove particelle fagiche
(manca dell’intero corredo genico del fago) e pertanto si replica come un plasmide.
I cosmidi sono costituiti da:
• un marcatore molecolare (di solito la resistenza all’ampicillina amp)
• un’origine di replicazione plasmidica (di solito ColE1)
• uno o più siti di restizione unici per il clonaggio
• una regione cos (cohesive site): si tratta di estremità complementari a singolo filamento di 12 bp presenti nel
cromosoma del batteriofago λ maturo, che sono indispensabili affinchè il DNA venga impaccato all’interno
della testa del fago.
All’interno della testa dei fagi λ non possono essere impaccate molecole con dimensioni minori del 78% o maggiori del
105% della lunghezza del DNA del fago wild-type, che è di 48 kb. Pertanto la dimensione finale del cosmide deve
essere compresa fra 36-51 kb.
Il fago contenente il cosmide è in grado di infettare una cellula di E. coli, iniettando il filamento di DNA all’interno del
batterio. Una volta inserito, le due estremità coesive e complementari cos vengono legate covalentemente da una ligasi
batterica che circolarizza. La molecola circolare risultante contiene una copia completa del vettore cosmide, è in grado
di replicare come un plasmide e conferisce resistenza al batterio, consentendo la selezione delle cellule trasformate.Il
DNA ricombinante si estrae quindi dalle colonie e non dalle placche.
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VANTAGGI
• Capacità di accogliere frammenti di DNA estraneo di dimensioni (31-45 kb) maggiori rispetto a un plasmide.
Se si inseriscono cloni minori di 30 kb, non può essere sfruttata la caratteristica cos e il cosmide viene
utilizzato come un plasmide.
• Capacità del cosmide di replicare in modo autonomo in cellule di E.coli.
• Capacità del cromosoma del fago λ di impaccare in vitro.
SVANTAGGI
Spesso i cosmidi riarrangiano il DNA inserito al loro interno, forse perché il tempo di replicazione (di pBR322) è lungo
quasi quanto il tempo di generazione di E. coli. Per ovviare a questo problema si preferisce propagare i cosmidi in
cellule meno inclini a riarrangiare il DNA e si usano ori λ e le proteine O e P in modo che la replicazione impieghi solo
pochi minuti rendendo le inserzioni di DNA più stabili. Un altro problema molto grave è rappresentato da eventi di
ricombinazione omologa fra copie di cosmide presenti nella setssa cellula. Per questo (come nei BAC e negli YAC) si
prediligono sistemi di mantenimento di una singola copia per cellula. Cosmidi a singola copia sono i FOSMIDI (vedi
sotto). Mentre i fosmidi sono ancora largamente utilizzati, i cosmidi non si usano particamente più.
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Fosmidi
I geni Par servono a controllare in modo stringente la replicazione (vedi descrizione in BAC). Sia per BAC sia per
fosmidi, la singola copia crea problemi in fase di estrazione del DNA a causa della scarsa resa. Per questo oggi sono
stati messi a punto sistemi di amplificazione del numero di copie, basati sull’attivazione di una seconda origine di
replicazione, impiegata solo per l’estrazione di grandi quantità di DNA.
This system uses a cosmid vector that contains two different replication origins. The E. coli F factor partitioning and
single copy replication origin (ori), ori2, is responsible for maintaining the cosmid clones as single copy plasmids under
noninduced conditions, thereby providing replicational stability of the constructs and avoiding toxicity because of high
levels of protein expression. The ori2 of the vector readily replicates the large DNA inserts required for packaging into
phage particles. The second origin is the high copy oriV, the function of which depends on the TrfA protein. A trfA gene
under the control of a pBAD promoter is integrated on the chromosome of a special host strain (34) and encodes a
mutant TrfA that gives higher copy numbers than does wild type TrfA. Therefore, upon addition of arabinose, the
mutant TrfA is expressed allowing utilization of oriV and a 40-80-fold increase in cosmid clone copy number thereby
facilitating detection of cloned gene products and subsequent DNA manipulations. The phage cos site of the vector
allows plasmids with inserts of sufficient size ( 40 kb) to be readily packaged into phage particles either in vitro or in
vivo, and thus the cosmids can be very efficiently moved among host strains
The CopyControl™ Fosmid Library Production Kit provides an efficient and improved method for constructing a library of
cosmid-sized (approximately 40 kb) clones. The CopyControl™ pCC1FOS™ Vector (Figure 1) provided in the kit contains both
the E. coli F-factor single-copy origin of replication and the inducible high-copy oriV. CopyControl Fosmid clones are grown at
single copy to ensure insert stability and successful cloning of encoded and expressed toxic protein. The CopyControl Fosmid
clones can then be induced up to 50 copies per cell.
TransforMax™ EPI300™ E. coli, required for induction of the CopyControl Fosmid clones up to 50 copies per cell, are included
with the CopyControl Fosmid Library Production Kit.
Learn more about the CopyControl cloning process.
Figure 1. CopyControl™ Vector map. The CopyControl™ pCC1FOS™ cloning
vector for CopyControl Fosmid library production is supplied linearized at its Eco72 I
(blunt) site and then dephosphorylated and is ready for cloning end-repaired (blunt
end) genomic DNA of approximately 40 kb.
The kit utilizes a strategy of cloning blunt-ended DNA fragments generated by random shearing of the DNA, to produce more
complete and unbiased genomic libraries than can be obtained by partial restriction endonuclease digests. Genomic DNA is
first sheared into approximately 40-kb fragments. The sheared DNA is end-repaired to generate blunt, 5'-phosphorylated ends
and then size-selected by and recovered from a low melting-point agarose (LMP agarose) gel. Finally, the size-selected DNA is
ligated into the cloning-ready CopyControl pCC1FOS Vector, packaged using ultra-high efficiency MaxPlax™ Lambda Packaging
Extracts (>109 pfu/µg DNA), included in the kit, and plated on the supplied TransforMax™ EPI300™ E. coli.
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Figure 2. Overview of the process for preparing a fosmid library using the CopyControl™ Fosmid Library
Production Kit. Once the library has been prepared, individual clones can be cultured in small volume and induced to
multiple-copy number for high yields of high purity DNA for fingerprinting, sequencing, etc.
Benefits
•
Make complete and unbiased CopyControl Fosmid libraries.
•
CopyControl pCC1FOS Vector is supplied Cloning-Ready—linearized, dephosphorylated, purified, and ready for
ligation.
•
CopyControl Fosmid clones can be induced from single copy up to 50 copies per cell.
•
Fosmid cloning utilizes high efficiency lambda packaging that eliminates background and false positives.
•
Construction of a complete fosmid library is much faster and easier than BAC cloning.
•
No need for partial restriction endonuclease digests or pulse-field gel electrophoresis (PFGE) to prepare the genomic
DNA for cloning.
Figure 3. CopyControl™ Fosmid clones can be induced up to 50 copies per cell to greatly increase DNA yield. Five
randomly chosen CopyControl Fosmid clones were grown in culture in duplicate. One sample of each was induced (+) to
multiple-copy number by addition of CopyControl™ Induction Solution. The other sample was an uninduced control (-). DNA
was isolated from an equal number of cells of each and analyzed by agarose gel electrophoresis.
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Vettori fagici
I vettori fagici assumono diverse caratteristiche in relazione al tipo di batteriofago cui appartengono.
Si possono distinguere due tipi di fagi
• Fagi filamentosi: DNA a singolo filamento impaccato in proteine di rivestimento
• Fagi tipo λ: fago del tipo testa-coda
Se le cellule infette sono piastrate su un mezzo di agar solido immediatamente dopo l’infezione col fago, la lisi delle
cellule può essere visualizzata come placche sullo strato batterico. L’utilizzo del substrato agarizzato (in questo caso
chiamato “soft agar” perché la concentrazione di agar è ridotta e la consistenza dell’agar è limitata) serve a limitare la
diffusione delle particelle fagiche che altrimenti si sposterebbero su tutta la superficie della piastra mescolandosi fra di
loro.
Nel caso di un fago litico tipo λ, le placche sono traslucide perché contengono cellule morte (lisate) e particelle fagiche;
le placche di un fago filamentoso, tipo M13, sono opache e formate da cellule batteriche che crescono più lentamente
perché la replicazione del fago richiede energia e quindi rallenta il meccanismo di divisione cellulare.
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Fagi filamentosi
CICLO VITALE
L’informazione genica del virus è contenuta nel DNA a singolo filamento impaccato in un lungo e sottile virone. Il
virus infetta la cellula ospite penetrando attraverso il pilo F; perciò questi fagi infettano solo cellule F+ o Hfr, non
cellule F-. Dopo che le proteine del rivestimento sono state rimosse, il ssDNA di infezione, denominato filamento +, è
convertito in un doppio filamento circolare detto forma replicativa (RF) o intermedio di replicazione del DNA. Il
filamento + viene replicato con il meccanismo del circolo rotante (rolling circle). La progenie a singolo filamento di
DNA è impaccata in nuovi rivestimenti e i vironi sono estrusi attraverso l’involucro cellulare , senza uccidere la cellula
ospite.
Un esempio di fago filamentoso è M13.
FAGEMIDI
Il DNA a singolo filamento forniva fino a pochi anni fa il substrato ottimale per il sequenziamento del DNA (oggi
eseguito mediante impiego della PCR che rende pertanto inutile l’impiego di templato a singolo filamento) ed è
necessario per alcuni protocolli di mutagenesi in vitro. Dato che l’impaccamento dei singoli filamenti del DNA nella
particella fagica garantisce una accurata purificazione del ssDNA, sono stati costruiti vari vettori di cui i più utili sono i
vettori ibridi, chiamati anche fagemidi, che integrano nel DNA plasmidico alcune componenti del genoma fagico (vedi
origine di replicazione del fago filamentoso F1 nel plasmide pBluescript). Questi vettori si moltiplicano in E. coli come
normali plasmidi a doppio filamento finchè non è fornito un fago helper, un mutante che replica in maniera poco
efficiente il proprio DNA, ma fornisce enzimi di replicazione: i fagemidi ne utilizzano il meccanismo di replicazione ed
impaccano i singoli filamenti di DNA in nuove particelle fagiche. Le cellule infettate continuano a crescere ed
espellono, nel mezzo di coltura, migliaia di particelle di origine virale, ognuna contenente un genoma a ssDNA. Poichè
le particelle dei virus sono molto più piccole delle cellule ospiti, i batteri possono essere rimossi per centrifugazione a
bassa velocità e le particelle virali possono poi essere raccolte dalla sospensione supernatante con centrifugazione ad
alta velocità e, alla fine, le loro molecole di ssDNA possono essere isolate con estrazioni in fenolo-cloroformio.
Vantaggi:
•
La cellula infettata non è portata alla morte dalla liberazione dei fagi: rallenta il metabolismo per soddisfare il
bisogno di replicazione del virus ed è comunque in grado di moltiplicarsi consentendo l’amplificazione
dell’infezione.
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•
•
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Il ssDNA purificato da queste particelle può essere utilizzato come templato per determinare la sequenza
nucleotidica di un filamento di DNA estraneo, per nucleotide-mutagenesi diretta o per la sintesi di sonde
specifiche di DNA.
Dato che il genoma virale non è inserito in una struttura preformata, non esistono vincoli per le dimensioni
del singolo filamento di DNA che può essere impaccato.
Fagi di tipo λ
Lambda è un fago temperato. Quando infetta un batterio può seguire due vie alternative di sviluppo:
•
•
Ciclo litico, durante il quale si riproduce e provoca la lisi della cellula ospite, proprio come un fago virulento.
Ciclo lisogenico, durante la quale il suo DNA si inserisce nel cromosoma dell’ospite e quindi viene replicato
come ogni altro segmento di quel cromosoma. Una volta integrato nella cellula ospite, il cromosoma del fago
temperato viene chiamato profago.
Nello stadio di lisogenia i geni del profago che codificano i prodotti coinvolti nella via litica, quali gli enzimi coinvolti
nella replicazione del DNA del fago, le proteine strutturali richieste per la morfogenesi ed il lisozima che catalizza la
lisi cellulare, devono rimanere spenti: il genoma di λ integrato è geneticamente inattivo, tranne per un singolo gene cI
che codifica un repressore in grado di mantenere tutti gli altri suoi geni in uno stato silente. Tuttavia, se la repressione
viene interrotta, il DNA di λ si può excidere dal cromosoma batterico e dare inizio ad una infezione litica.
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SELECTIONS FOR INSERTED DNA
Some phage vectors exploit the fact that λ has a minimum genome size requirement for packaging, so that vector
phages that do not contain inserts above a minimum size are never detected. Other phage vectors utilize some genetic
means to distinguish between phages that still retain the block of nonessential genes and recombinant phages in which
the block of genes has been replaced with foreign DNA. Since the selection for the insert does not depend on the size of
the inserted fragment, many of these vectors allow small fragments to be cloned.
Size selection. Lambda cannot be packaged into phage heads if its genome is less than 78% or more than 105% of the
length of wild-type λ DNA. When a vector is chosen on the basis of size selection, the region dispensable for growth is
cut out; the left and right arms of the phage are then purified and ligated to cut foreign DNA under conditions that favor
concatemer formation. Those phages whose left and right arms have not been joined to an insert will have cos sites too
close together to be packaged into viable phage. The existence of the size requirement for efficient phage packaging
makes it impossible to use a single phage vector to clone fragments of all sizes: phages that can accommodate large
inserts cannot be packaged if they contain small inserts, and vice versa.
spi− selection. red+ gam+ phages do not form plaques on a host lysogenic for the unrelated bacteriophage P2. These
phages are said to be spi+ (sensitive to P2 interference). red− gam− phages do form plaques on P2 lysogens, and so are
said to be spi− (Zissler et al., 1971). P2 inhibition of red+ gam+ phage growth only occurs if the P2 is wild-type for a
gene called old. Commonly used vectors like λ2001 (Karn et al., 1984) and λEMBL3 (Frischauf et al., 1983) contain
a fragment with the red+ and gam+ genes. These vectors will not form plaques on a P2 lysogen unless the red+
gam+ fragment is deleted and replaced with a piece of foreign DNA.
hfl− selection. The product of the λ cII gene is necessary for infecting phages to synthesize repressor efficiently. The E.
coli hflA and hflB genes encode products whose effect is to decrease the stability of the cII gene product (Banuett et al.,
1986; Hoyt et al., 1982). When wild-type λ infects an hfl− strain, so much repressor is made that the phage almost
always lysogenizes the infected cell, causing it to form either no plaque or an extremely turbid plaque. Vectors like
λgt10 contain a restriction site in the cI gene. Insertion of foreign DNA into this site inactivates the cI gene. The vector
phage does not form plaques on the hfl− strain, but phages containing inserts instead of the cI gene form clear, normalsized plaques.
VETTORI FAGICI
La maggior parte dei vettori fagici di clonaggio è stata costruita a partire dal cromosoma del fago λ, di cui è nota la
sequenza completa delle 48.502 coppie di nucleotidi del genoma selvatico e la funzione di tutti i suoi geni. Circa due
terzi del genoma di λ sono indispensabili per il ciclo litico e il terzo centrale contiene geni che sono richiesti per la
lisogenia: la parte centrale può così essere excisa con enzimi di restrizione (DNA facoltativo) e sostituita con DNA
estraneo senza alterare la capacità del fago di infettare i batteri e dirigere la sintesi di nuove particelle λ tramite ciclo
litico.
Le molecole di DNA derivanti possono essere impaccate in vitro nelle teste del fago e le particelle virali possono quindi
introdurre le molecole ricombinanti in cellule di E. coli, dove si replicheranno e produrranno cloni delle molecole di
DNA ricombinante. Perché avvenga l’infezione è necessaria la presenza di maltosio nel mezzo di coltura: il recettore
attraverso cui viene adsorbito il DNA fagico è normalmente usato per il trasporto di maltosio ed è indotto dalla presenza
di tale zucchero, mentre viene inibito dal glucosio.
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Sono stati sviluppati due tipi di vettori:
•
•
I VETTORI DI SOSTITUZIONE, in cui il DNA facoltativo è contenuto in un frammento di riempimento
(stuffer region), fiancheggiato da una coppia di siti di restrizione, che viene rimpiazzato quando il DNA da
clonare è legato al vettore. All’interno della testa dei fagi λ non possono essere impaccate molecole con
dimensioni minori del 78 % o maggiori del 105% della lunghezza del DNA del fago wild-type. Solitamente la
lunghezza media della sequenza è di 48 kb ed è quindi possibile inserire frammenti di DNA fino a raggiungere
una dimensione finale compresa fra 36-51 Kb. Sono simpiegati per la preparazione di librerie genomice
(DNA)
I VETTORI DI INSERZIONE, in cui una parte o tutto il DNA facoltativo è stato rimosso ed è stato introdotto
in un sito di restrizione unico per l’inserimento di massimo 9-10 Kb (non esiste limite minimo). Sono
impiegato per la preparazione di librerie cDNA.
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FAGI DI SOSTITUZIONE
FAGO EMBL 3A
E’ un fago di sostituzione: il frammento di DNA estraneo, con estremità compatibili con il braccio destro e sinistro, viene
inserito al posto della stuffer region, sequenza non indispensabile per il ciclo litico del virus e che può essere rimossa. In
tale regione sono presenti gli stessi tipi di siti di restrizione.
La lunghezza del braccio sinistro è di 19.9 Kb mentre il destro è di 8.8 Kb. Affinchè il filamento possa essere impaccato
nella testa fagica è necessario inserire una sequenza le cui dimensioni possono variare da 9 Kb a 23 Kb.
Se il braccio sinistro e quello destro fossero fusi insieme, senza un frammento centrale, il genoma virale risulterebbe
troppo corto per essere impaccato (circa 29 kb): l’utilizzo di tale vettore permette una selezione dei ricombinanti.
FAGI DI INSERZIONE
FAGO λgt10
È un vettore di inserzione che contiene un singolo sito di restrizione all’interno del gene cI .
Il braccio sinistro è lungo 32.7 Kb mentre il braccio destro 10.6 Kb.
Il frammento di DNA che è possibile inserire ha una lunghezza massima teorica di 7 Kb ma non presenta un limite
minimo in quanto la circolarizzazione di un vettore privo di inserzione produrrebbe comunque un filamento (di circa 43
Kb) con dimensioni sufficienti per essere impaccato.
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La selezione dei vettori ricombinati si basa sulla funzionalità del repressore cI.
È opportuno considerare alcune caratteristiche del meccanismo di repressione.
L’evoluzione ha portato a favorire l’infezione lisogenica: il fago ha la possibilità di replicarsi all’interno dell’ospite e
quindi di propagarsi, la cellula riesce a sopravvivere e moltiplicarsi evitando la lisi.
Affinchè la cellula segua la via lisogenica, il prodotto del gene fagico cI, una proteina ben caratterizzata con un peso
molecolare di 27 kD, si lega come dimero alle due regioni operatore che controllano la trascrizione dei geni λ coinvolti
nel ciclo litico, reprimendone la trascrizione. La cellula ospite favorisce solitamente l’accumulo del repressore. In ceppi
di E.coli hfl (high frequency of lysogenization) il prodotto del gene cII del batteriofago λ si accumula in quantità
elevata; cII è un regolatore positivo del gene cI: il risultato netto è un incremento nella cellula infetta del repressore
codificato da cI.
I vettori λgt10 portano il gene cI e pertanto determinano lisogenia con alta efficienza in ceppi di E.coli hfl. Se il gene cI
viene inattivato dall’inserzione di DNA estraneo, il batteriofago attiva il ciclo litico. Questo perché nel mutante hfl il
prodotto del gene cII del fago λ si accumula a livelli più alti del normale. CII è un regolatore positivo del gene cI, così
che l’effetto netto della mutazioen hfl è l’aumento del repressore cI nella cellula infetta. In questo modo, se è presente cI
il ciclo litico è bloccato e viene potenziata la crescita lisogenica.
A ogni fago vengono sempre associati due ceppi di batteri:
•
•
un ceppo permissivo cioe’ wild type: il fago può attivare il ciclo litico, pertanto questo ceppo viene impiegato
per moltiplicare il fago wild type
un ceppo non permissivo hfl: il fago wild type non può crescere perché il repressore si
accumula. Questo ceppo viene pertanto impiegato nella selezione dei fagi ricombinanti in cui cI e’ interrotto
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FAGO λgt11
Vettori come λgt11 sono stati costruiti non solo per permettere la propagazioni delle sequenze estranee ma anche per
consentire la loro espressione in cellule batteriche. λgt11 porta una porzione del gene della β-galattosidasi di E. coli,
inclusi gli elementi a monte necessari per la sua espressione. All’interno della porzione codificante carbossi-terminale
del gene è presente un sito di restrizione EcoRI, in cui è possibile inserire il DNA estraneo.
In appropriati ospiti, il gene chimerico può essere indotto: ne risulta la sintesi di una proteina di fusione, consistente
nella porzione ammino-terminale della β-galattosidasi fusa con la sequenza codificata dall’open reading frame a valle.
E’ importante quindi che la sequenza codificante per la proteina di interesse sia in frame con la porzione dell’enzima a
cui viene unita.
Il sistema di identificazione delle cellule trasformate si basa sullo screening bianco-blu dei batteri cresciuti in presenza
di X-gal e IPTG. Se il vettore porta il DNA estraneo inserito nella regione che complementa per la β galattosidasi
l’enzima risulta non essere più funzionale: le colonie trasformate sono bianche anziché blu.
La lunghezza del braccio sinistro è di 19.5 Kb mentre il destro è di 24.2 Kb; la sequenza di DNA che è possibile inserire
ha una dimensione massima di 7.2 Kb.
Questo vettore viene impiegato per la costruzione di librerie di cDNA poi analizzate mediante screening con anticorpi.
In questo modo è possibile identificare geni di cui non si possiedono informazioni ma di cui si ha la proteina
corrispondente. Tale metodo è risultato efficace per l’isolamento di molti geni codificanti per proteine di cui non era
disponibile alcuna sonda ma di cui si possedeva un anticorpo. È possibile ibridare con un solo anticorpo la libreria a
cDNA protando alla localizzazione della proteina antigenica espressa.
FAGO λZAP
λZAP è un vettore di inserzione fornito di siti multipli di clonaggio all’interno di una sequenza plasmidica, che può
essere excisa in vivo e convertita in un vettore plasmidico, pBluescript SK(M13-) mantenuto nelle cellule batteriche e
più comodo da maneggiare. Il polycloning site è collocato nella porzione amino-terminale di lacZ. Se il frammento
inserito è in-frame con la sequenza di lacZ la proteina di fusione espressa può essere localizzata con l’utilizzo di
anticorpi.
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Il plasmide vettore è costruito in modo da facilitare il sequenziamento di DNA e RNA e la sintesi di sonde di RNA,
utilizzando i promotori fagici T7 e T3 accanto alla regione da clonare. La regione estranea di DNA inserita nel plasmide
pBluescript SK(M13-) è excisa in presenza dei fagi helper f1 o M13.
La lunghezza del braccio sinistro è di 21.8 Kb mentre il destro è di 18.1 Kb; la sequenza di DNA che è possibile inserire
ha una dimensione massima di 10 Kb. Questo fago viene impiegato nella costruzione di librerie di cDNA.
LIBRERIE DI DNA GENOMICO E DI cDNA
Il primo passo per clonare un gene da un organismo di solito implica la costruzione di una genoteca di DNA, un gruppo
di cloni di DNA contenente, nell’insieme, l’intero genoma. Talvolta, singoli cromosomi di un organismo sono isolati
con una procedura che li seleziona in base alla dimensione ed al contenuto di DNA. Il DNA dei cromosomi isolati è poi
usato per costruire genoteche di DNA di un cromosoma specifico. La diponibilità di tali genoteche rende molto più
facile la ricerca di un gene che è noto trovarsi su un particolare cromosoma, in special modo per organismi con genomi
grandi, come quello dell’uomo.
Oltre al genoma, è possibile rappresentare in librerie il trascrittoma di un organismo, ossia l’insieme delle sequenze di
DNA che vengono trascritte in mRNA. Mediante una trascrittasi inversa (enzima codificato da retrovirus a RNA), si
sintetizzano molecole di cDNA, cioè di DNA complementare all’RNA. I cDNA possono essere inseriti in vettori
plasmidici o del fago λ. Partendo dall’RNA messaggero, i genetisti sono capaci di costruire una libreria di cDNA che
contiene solo le regioni codificanti dei geni espressi in un organismo. La disponibilità della sequenza genica priva di
introni costituisce un codice di lettura universale, indipendente dai meccanismi specie-specifici di splicing e cioè di
maturazione dell’RNA.
Fagi di inserzione come EMBL 3A che permettono l’introduzione di frammenti di DNA anche di 10-15 Kb possono
essere impiegati nella costruzione di librerie genomiche. Nei vettori di inserzione la dimensione massima della
sequenza che è possibile introdurre è circa 7 Kb, ciò rende ancora oggi fagi di inserzione (tipo λgt 10) i sistemi ideali
per la costruzione di librerie di cDNA che rappresentano il trascrittoma di un organismo, dato che l’mRNA maturo non
supera mediamente le 5-6 Kb.
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What is a We know what a "library" is in real life - a room or building filled with a collection of books. In molecular
library? biology we use the term in a slightly different way, to mean a collection of recombinant vectors containing
different inserted sequences. You might, for example, clone random genomic DNA or cDNA fragments
into a vector, with the hope of identifying a gene you are trying to clone through screening of the library.
When random fragments are cloned, the library is sometimes called a "shotgun" approach, because one
doesn't really need to aim too carefully to hit the target with a pellet. When a library is designed to contain
many possible versions of a sequence, often by synthesis using degenerate oligonucleotides, it is often
called a "combinatorial" library.
First let us Before we get too involved in discussing the DNA insertions in a library, let us discuss the vectors that hold
discuss the the foreign DNA. You could think of this as being the "bindings" and "covers" for the books in a real library
vectors that - they carry the information by holding together the pages.
can be used - Almost any recombinant vector can be used to make a library, but some are easier to work with than others.
for example Phage lambda derivatives are easy to use for genomic and cDNA libraries, because the plaques are a stable
lambda reference stock for your clones. When you lift a membrane from the collection of plaques, you always leave
some plaques behind that can be picked out and propagated.
We have discussed this already for lambda gt11 - the idea that you can grow a "lawn" of bacteria with
plaques in it, induce expression of the fusion protein with IPTG, and collect an imprint of the plaques on a
circle of nitrocellulose. You could detect your specific phage using an antibody probe (if an expression
system) or a DNA probe (by hybridization). For gt11 we'll assume that we've got an antibody probe.
Here's how it works. First, you mix the E. coli host and the lambda gt11
library in a tube, wait about 30 minutes for the phage to adsorb to the
bacteria, then mix in some molten agar-containing medium (cooled to 45
C), and "plate" the mixture onto a bacterial plate that already has a layer
of solidified agar-containing medium. This first layer of agar may contain
X-gal and IPTG (although it is usually the case that the IPTG is soaked
into the nitrocellulose filter - we'll forget about that so it is easier to show
you what happens)
After overnight growth the plate might look like this when you hold it up
to the light. Plaques are visible, and some of the plaques are blue. As you
recall, the blue plaques represent bacteriophage that do not have
insertions, so the lacZ gene is uninterrupted. The colorless plaques have
insertions into the lacZ gene. If this is a cDNA library, then we expect
that each colorless plaque might represent a different inserted cDNA.
If we apply a nitrocellulose membrane to this plate, allowing it to soak up
the proteins that have been expressed and released from the dying cells,
then probe the nitrocellulose with an antibody and detect the antibody
binding with a secondary antibody and enzyme-linked detection system,
we might see results as shown on the right. Note that it is important to
align the nitrocellulose membrane with the plate so you know which end
is up!
If you have marked the nitrocellulose so that you know its orientation,
you can go back to the plate and cut out (punch out) the plaque that
generated the positive signal by antibody binding. There will still be
some phage in the plaque that can be regrown, although some of the
phage are stuck to the nitrocellulose (and lost) and others will have
diffused out of the plaque.
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Tecnologie biomolecolari
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Now you have a phage stock that is partially purified. Since the phage diffuse in the plate, you can only
expect that your specific phage will be enriched in the population that you cut out. You need to repeat the
plating experiment and detection system several times to enrich for the phage that is the right one. Your first
attempt at replating might go something like this:
Note that a fraction of the plaques on the plate are
positive with the antibody, but most are still other
things. You then need to pick an isolated "positive"
plaque from this second generation plate and try
again with a third (and probably fourth) generation
plate to increase the level of purity.
This is what you eventually hope to see. In this case,
every plaque in the sample is detected as a "positive"
with the antibody probe. That means that the phage
you have picked is now "plaque purified", and all of
the phage in the stock are of one kind. It is now a
clone.
A lambda clone can be grown in large quantities and stored as a purified bacteriophage stock, at a
concentration of 109 to 1011 phage per ml. You may add chloroform to the stock to preserve it. You may also
preserve the lambda clone as purified lambda DNA, but to infect cells you would need to "package" the
DNA into capsids again.
What next?
You now have a gt11 clone that expresses a fusion protein that reacts or cross-reacts with your antibody
probe. It could be a good result, but then again it might not be the protein you are really looking for. You
will need to sequence the inserted DNA to see what you've got, and it is often the case that you want to
move the inserted DNA to a plasmid vector.
If the EcoRI sites are still intact in the gt11 vector, you could isolate the insertion by digesting the purified
lambda DNA with EcoRI and isolating the foreign DNA insert on a gel. You could also use the polymerase
chain reaction to isolate the insertion, but this might be difficult if the insertion is large (remember that gt11
can clone up to 9 kbp).
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Massimo Delledonne
lambda ZAP Lambda gt11 has been around for quite a while now, and there are more elaborate versions called lambda
ZAP vectors:
Lambda ZAP II vector
http://www.stratagene.com/figures/Lambda_ZAPII.gif
Note that a polylinker has now been inserted into the lacZ gene - you now have a choice of 10 cloning
enzymes! There are also T7 and T3 RNA polymerase promoters surrounding the polylinker, an ampicillin
resistance gene, a ColE1 origin, an f1 phage origin of DNA replication and terminator of replication (not
shown in map).
You can "subclone" the middle of the phage automatically!
From what we've discussed so far, you might consider using enzymes that cut the polylinker to release your
insert, then use a compatible pair of enzymes to prepare a plasmid vector to receive the fragment. Now
there's a way to do it automatically! If you infect male bacteria with both your lambda ZAP II clone and also
a filamentous helper phage, the trans-acting proteins in the filamentous phage will cause replication of the
central portion of the lambda clone, yielding a single-stranded DNA product that is packaged and secreted in
a filamentous phage coat. The plaques therefore have TWO count 'em TWO types of phage:
1. The original lambda ZAP II clone
2. A single-stranded copy of the central region, in a filamentous phage capsid
How does this work? Having an f1 origin of replication in a vector makes it sensitive to the replication
machinery of bacteriophage f1. You can cause packaging of single-stranded DNAs amplified from the f1
origin, even though there are no other elements of the phage present on the DNA strand.
What next?
You take the plaque containing these two types of phage and plate them on a bacterial strain that is resistant
to phage lambda but sensitive to filamentous phage (i.e. use male bacteria), and don't forget to add
ampicillin to the medium. The bacteria will take up the filamentous phage carrying your favorite DNA (the
single-stranded central portion of the lambda ZAP II clone), convert it from a single-stranded to a doublestranded molecule, and treat it just like any other plasmid. Since this new plasmid contains the ampicillin
resistance gene, the cells maintaining it will survive on the selective medium. This is a case of phage
transduction, but it does not lead to further generation of infectious particles. The introduced plasmid
contains the f1 origin of replication but no other part of the filamentous phage. There are no longer helper
phage around, so the sequence is not packaged and secreted as it was before. It is now simply a stable
plasmid, that looks something like this:
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pBluescript II KS plasmid vector
http://www.stratagene.com/vectors/cloning/pbluescript2.htm
Is there a term that describes this interchange between double-stranded plasmid and packaged singlestranded filamentous phage particles? How about "complete and utter confusion"? Actually there's a better
word than that. We call a plasmid that can be turned into a transducing phage (and vice versa) a "phagemid"
to indicate that it is a sort of hybrid.
Plasmid Plasmids are a bit more problematic, because lifting a membrane from a collection of colonies may strip
vectors away the entire colony, leaving you nothing to grow later. One solution is to make an imprint of the live
colonies on a piece of autoclaved velvet, then print the colony pattern onto a reference plate, a process called
"replica plating," but this is an unpleasant task. Plasmids vectors are generally not used for "expression
systems" like gt11, and are typically used for DNA detection only (i.e. using DNA probes to detect a
specific clone rather than antibodies). In the diagram below, the plate at left contains a collection of bacterial
colonies that are first replicated to velvet and printed on a clean reference plate (starting with step 1, going
horizontally to the right). After the plate is replicated, the remaining cells in the colony are adsorbed to a
piece of nitrocellulose (step 2), and the colonies are lysed directly onto the nitrocellulose (or nylon). This
imprint can then be probed with a DNA probe, just as you might handle a Southern blot, and you may find
that one of the colonies corresponds to a positive hybridization result.
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Lucky thing that you remembered to replicate the plate before adsorbing the colonies to nitrocellulose - now
you have a reference colony you can pick and grow!
A second problem with standard laboratory plasmids is that it is difficult to clone large insertions into them,
and this is particularly a problem if the library consists of genomic DNA fragments rather than cDNAs.
Most plasmids do not grow well if they have large (10 kbp) insertions. While that is similar to the limit for
gt10 and gt11, we'll be discussing later, lambda phage that can handle up to 23 kbp of DNA. The problem of
"insertion size" and representation in the library may become more clear from the next example.
How many
different Since a library contains random fragments, you can never be 100% certain that it contains a clone you
recombinants desire.
must a
library have? Here's an example of the problem. Suppose you have a genome of 100 kbp, and you break it into random
fragments of about 10 kbp for cloning (of course a real genome would be much larger). If you obtain a
library with ten phage in it, would the entire genome be represented?
The answer is no! Some of the clones would overlap.
Let's try the same problem, substituting umbrellas for DNA clones:
Suppose we want to protect a group of movie stars from the rain, while they're walking from their limos to
the doors of the Dorothy Chandler Pavillion ( a journey of 100 killibradpitts (kbp) - a new measure of
distance). We have 10 umbrellas on hand, each able to cover 1/10th of the distance from the street to the
door. If we distribute them randomly, will they cover the entire path and keep the stars dry?
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Of course, if we are thinking that umbrellas = clones and sidewalk = genome, then some sequences in the
genome will not have been cloned, and will not be represented in your library. That's fine, so long as the
sequences that you want to clone are not left out, but we are not always so fortunate. What would happen if
we made the library twice as big? Let's go back to the Academy Awards, and see how we fare with twice the
coverage:
As you can see, we got closer to complete coverage, but still have some unprotected areas. To be precise,
only 86 killibradpitts of sidewalk are covered and 14 are uncovered.
With our analogy of clones, the uncovered regions represent uncloned sequences in the genome. The way
we can calculate what's missing is pretty easy -- it's based on the Poisson distribution. If we have one
"covering" of the genome (as in the ten clone example) the chance of a sequence being cloned is (11/exp(1)) or about 0.63 (or 63%), where exp(x) = the base of the natural logarithm e to the x power, . If we
have two "coverings" of the genome (as in the twenty clone example) the chance of a sequence being cloned
is (1- 1/exp(2)) or about 0.86 (or 86%), where exp(2) means the square of e. The pattern continues as your
library contains more independent clones. With ten "coverings", the chances reach 0.99995 (or 99.995%),
but you can see that you never reach absolute certainty of cloning any particular sequence.
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YAC
La dimensione degli inserti genomici che sono portati in vettori tradizionali è limitata a 20-25 Kb per il fago λ e 40-45
Kb per i cosmidi. Questi vettori sono quindi di scarsa utilità per la preparazione di llibrerie genomiche.
Il cromosoma artificiale di lievito, yeast artificial chromosome (YAC), è portato come cromosoma sovrannumerario in
Saccharomyces cerevisiae, può contenere fino a 2 megabasi.
I primi YAC sono stati costruiti dopo che lo studio dei cromosomi naturali aveva mostrato che, oltre a contenere geni,
ognuno di essi presenta tre componenti importanti:
• centromero: consente una corretta distribuzione dei cromosomi tra le cellule figlie durante la divisione
cellulare
• telomeri: strutture alla fine del cromosoma necessarie per una corretta replicazione e per impedire la perdita di
basi alle estremità.
• ARS (sequenze replicantesi autonomamente): origini di replicazione da dove inizia la sintesi di nuovo DNA
quando il cromosoma si divide.
In uno YAC, le sequenze di DNA che rappresentano queste componenti del cromosoma sono associate ad uno o più
marcatori di selezione ed almeno un sito di restrizione nel quale è inserito il nuovo DNA.
I vettori usati contengono tutte le informazioni necessarie in un plasmide che può replicarsi in Escherichia coli:
• ARS
• CEN4: sequenza di DNA della regione del centromero del cromosoma 4
• TEL: sequenze responsabili della formazione in vivo dei telomeri.
• URA3, TRP1: marcatori di selezione
• SUP4: marcatore di selezione in cui il DNA esogeno è inserito durante l'esperimento di clonaggio.
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Il vettore è tagliato da enzimi di restrizione (BamHI e SnaBI) in 3 frammenti: il braccio sinistro che include il
centromero e un marcatore di selezione (TRP1), il braccio destro con l'altro marcatore (URA3) e la regione tra le due
sequenze TEL, che viene rimossa in un plasmide circolare. Le due braccia sono trattate con fosfatasi alcalina, per
impedire il riassemblaggio, e fra di loro è inserito il DNA esogeno.
La trasformazione con i protoplasti permette l'inserimento del vettore in S. cerevisiae. Il ceppo di lievito che viene usato
è un doppio mutante auxotrofo, trp-ura- (richiede triptofano e uracile come nutrienti), che sarà convertito a trp+ura+ dai
due marker sul cromosoma artificiale. I trasformanti sono quindi selezionati piastrandoli su un terreno minimo, su cui
solo le cellule contenenti cromosomi artificiali correttamente costruiti sono in grado di crescere. Ogni cellula
trasformata con un cromosoma anomalo, contenente 2 braccia destre o 2 braccia sinistre, non è vitale perché uno dei
marcatori è assente.
La presenza del DNA inserito nel vettore può essere controllata dall'inattivazione di SUP4 ,dovuta ad inserzione,
tramite un semplice test: nei ceppi ade2-ochre, le cellule che esprimono il soppressore SUP4 formano colonie bianche.
Pertanto, le colonie rosse sono ricombinanti, le colonie bianche no.La presenza di URA3 e TRP1 fa si che il lievito
selezionato porti un cromosoma artificiale dotato di entrambe le braccia, evitando cosi’ l’analisi di lieviti dotati di
strutture instabili che potrebbero formarsi per esempio in presenza di uno YAC costituito da 2 o nessun centromero (2
braccia destre oppure sinistre)
APPLICAZIONI
I vettori YAC vengono utilizzati per il clonaggio posizionale (isolamento di un clone di un gene o di un'altra sequenza
di DNA sulla base della sua posizione di mappa nel genoma) tramite chromosome walking.
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Il chromosome walking consiste nell’individuazione del gene di interesse mediante il percorso della distanza che
separa il gene da uno o piu’ marcatori molecolari associati:
-scelta di un marcatore molecolare prossimo al gene di interesse (è necessario conoscere la distanza in basi tra i due siti)
-digestione parziale con endonucleasi di restrizione per ottenere frammenti di DNA parzialmente sovrapposti
- costituzione della libreria (i cloni sono legati a vettori YAC e trasferiti a cellule riceventi per creare una libreria di
DNA genomico)
-ibridazione (un'estremità del clone prossimo al marcatore viene usata per preparare una sonda di DNA, che è poi
utilizzata in esperimenti d'ibridazione per trovare un clone sovrapposto Il DNA di questo secondo clone viene purificato
e la sua estremità più lontana è usata per preparare una seconda sonda di DNA, a sua volta impiegata per trovare un
clone sovrapposto e così via)
-ripetizione della procedura
Ripetendo queste fasi diverse volte ed isolando una serie di cloni genomici sovrapposti, si percorre la distanza
necessaria fino al gene d'interesse.
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SVANTAGGI DEGLI YAC
•
•
non contiguità: un frammento con un sito di restrizione non tagliato può derivare da una digestione incompleta
o dall’unione casuale di due frammenti di DNA lontani fra di loro o addirittura appartenenti a cromosomi
diversi. Questo fenomeno potrebbe portare ad oltrepassare il punto d'arrivo, a camminare nella direzione
opposta o addirittura a camminare su un altro cromosoma. Il metodo più affidabile per verificare la mancanza
di contiguità consiste nell'isolare un piccolo frammento da ognuna delle estremità dell'inserto, determinare il
cromosoma d'origine e se condivide sequenze con YAC sovrapposti derivati dalla stessa regione cromosomica.
Difficoltà di manipolazione dei cromosomi
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BAC e PAC
I sistemi BAC (cromosomi batterici artificiali) e PAC (cromosomi batterici derivati da P1) sono basati su Escherichia
coli e sul fattore F plasmidico che mantiene pari a 1 il numero di copie del BAC nella cellula, in modo da massimizzare
la stabilità della molecola (no ricombinazioni che sarebbero possibili se ci fossero più copie dello stesso BAC). Questi
vettori sono capaci di mantenere frammenti di DNA maggiori di 300 kb con un elevato grado di stabilità anche dopo
cento generazioni di crescita. Grazie all'efficienza di clonaggio, alla facilità di manipolazione e al mantenimento stabile
del DNA clonato, il sistema BAC rappresenta oggi il sistema più utilizzato per la costruzione di librerie di genomi
complessi.
Il vettore BAC è costituito da:
• geni oriS e repE (Mediano le replicazione unidirezionale del fattore F)
• geni parA e parB (Mantengono il numero di copie del fattore ad un basso livello (1 copia) .Un alto numero di
copie potrebbe causare problemi di instabilità degli inserti per delezioni e riarrangiamenti del DNA clonato a
causa di eventi di ricombinazione omologa)
• gene per la resistenza ad un antibiotico
• sito di clonaggio: È fiancheggiato dai promotori T7 e SP6 che generano sonde di DNA per il chromosome
walking e per il sequenziamento d'inserti di DNA. cosN e loxP sono siti di taglio specifici per terminasi del
batteriofago λ e consentono la formazione di estremità che possono essere usate, nelle mappe di restrizione,
per riarrangiare i cloni. I cloni ricombinanti sono selezionati mediante colorazione bianco/blu.
pBACe3,6 e i vettori PAC (cromosomi artificiali derivati dal fago P1) possiedono un altro sistema di selezione. Essi
portano il replicone del fattore F, il gene per la resistenza ad antibiotici (cloramfenicolo per pBACe3,6, kanamicina per
PAC) e un pUC link, fiancheggiato da siti di clonaggio, all'interno del gene sacB. Il pUC link, rimosso da enzimi di
restrizione per inserire il DNA esogeno, è utilizzato per selezionare le cellule trasformate. Il prodotto genico di sacB,
una levansaccarasi, produce metaboliti tossici da saccarosio. I cloni ricombinanti, in cui il DNA inserito sostituisce le
sequenze pUC link, possono crescere in piastre di agar con antibiotico e saccarosio perché il gene sacB non può essere
espresso. I BAC vengono trasferiti a E. coli mediante elettroporazione
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Vettori BAC disponibili
Name
Cloning sites
Recombinant
selection
pBAC108L
(6.7 kb)
HindIII, BamHI
no
pBeloBAC11
(7.4 kb)
HindIII,
BamHI, SphI
lacZ
pECSBAC4
(9.3 kb)
EcoRI, HindIII,
BamHI
lacZ
BIBAC2
(23.5 kb)
BamHI
sacBII
Plant Transformation
via Agrobacterium
pBACwich
(11 kb)
HindIII,
BamHI, SphI
lacZ
Plant Transformation
via Site-Specific
Recombination
pBACe3.6
(11.5 kb)
BamHI, SacI,
SacII, MluI,
EcoRI, AvaIII
sacBII
High copy number is
available
pClasper
(9.7 kb)
homologous
recombination
in yeast
LEU2
Yeast and bacteria
shuttle vector
Features
The Number of Clones Required for a 99% Probability of Having any DNA Sequence Represented in a Genomic
Library.
Common name
Scientific name
Genome size
Mb/1C
Insert size
100 kb
Insert size
150 kb
Apple
Malus x domestica
769
3.5 X 10^4
2.4 X 10^4
Arabidopsis
Arabidopsis thaliana
100
4.6 X 10^3
3.1 X 10^3
Banana
Musa sp.
873
4.0 X 10^4
2.7 X 10^4
Barley
Hordeum vulgare
4873
2.2 X 10^5
1.5 X 10^5
Canola
Brassica napus
1182
5.4 X 10^4
3.2 X 10^4
Cassava
Manihot esculenta
760
3.5 X 10^4
2.3 X 10^4
Common bean
Phaseolus vulgaris
637
2.9 X 10^4
2.0 X 10^4
Cotton
Gossypium hirsutum
2246
1.0 X 10^5
6.9 X 10^4
Lettuce
Lactuca sativa
2639
1.2 X 10^5
8.1 X 10^4
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Maize
Zea mays
2504
1.2 X 10^5
7.7 X 10^4
Oat
Avena sativa
11,315
5.2 X 10^5
3.5 X 10^5
Onion
Allium cepa
15,290
7.0 X 10^5
4.7 X 10^5
Orange
Citrus sinensis
382
1.8 X 10^4
1.2 X 10^4
Pepper
Capsicum annuum
2702
1.2 X 10^5
9.4 X 10^4
Rice
Oriyza sativa ssp.
indica & japonica
431
2.0 X 10^4
1.3 X 10^4
Sorghum
Sorghum bicolor
760
3.5 X 10^4
2.3 X 10^4
Soybean
Glycine max
1115
5.1 X 10^4
3.4 X 10^4
Sugarbeet
Beta vulgaris ssp.
esculenta
758
3.5 X 10^4
2.3 X 10^4
Sugarcane
Saccharum sp.
3000
1.4 X 10^5
9.2 X 10^4
Tobacco
Nicotiana tabacum
4434
2.0 X 10^5
1.4 X 10^5
Tomato
Lycopersicon
esculentum
953
4.4 X 10^4
2.9 X 10^4
Wheat
Triticum aestivum
15,966
7.4 X 10^5
4.9 X 10^5
Comparazione fra YAC and BAC Cloning System
Features
YAC
BAC
Configuration
Linear
Circular
Host
Yeast
Bacteria
Copy Number / Cell
1
1-2
Cloning Capacity
Unlimited
up-to 350 kb
Transformation
Spheroplast (10^7 T/ug)
Electroporation (10^10 T/ug)
Chimerism
up to 40%
None to low
DNA Isolation
Pulsed-field-gel-electrophoresis Gel Isolation
Standard Plasmid Miniprep
Insert Stability
Unstable
Stable
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CONFRONTO TRA VETTORI
Per illustrare le potenzialità di un chromosome walking con BAC, YAC e cosmidi , è mostrato il numero di cloni
richiesti per percorrere 1000 Kb, assumendo il 50 % di sovrapposizione per ogni frammento:
Se si usasse una libreria cosmidica con inserti di 50 Kb, sarebbero richiesti 39 step e la probabilità di completare il
clonaggio sarebbe nulla. Le librerie BAC, con inserti di 150 Kb, richiederebbero 13 step con una probabilità del 90%.
La libreria YAC avrebbe bisogno di soli 3 step con il 99 % di possibilità di successo.
Tuttavia il sistema BAC presenta alcuni vantaggi rispetto a YAC:
• l'elettroporazione, con cui i cromosomi artificiali vengono trasferiti in E. coli, è 10-100 volte più efficiente
della trasformazione con sferoplasti di lievito e riduce le quantità di DNA necessarie per la costruzione di una
libreria.
• mentre gli inserti YAC sono lineari, quelli BAC sono plasmidi circolari superavvolti che possono essere
facilmente manipolati e isolati con rotture minime.
• sono più stabili.
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ENZIMI
DNA Polimerasi DNA dipendenti
Tutte le DNA polimerasi aggiungono deossiribonucleotidi al terminale 3’ di una molecola primer di DNA a doppia
elica.
La sintesi avanza esclusivamente in direzione 5’Æ 3’ rispetto al filamento sintetizzato. Ogni nucleotide che viene
incorporato durante la polimerizzazione è complementare al suo opposto sul templato (dA con dT, dC con dG). La
reazione di sintesi richiede i quattro deossiribonucleosidi trifosfato (dNTPs) e ioni magnesio. Molte DNA polimerasi
hanno una esonucleasi 3’Æ5’ inerentemente associata con l’attività polimerasica.
L’attività esonucleasica 3’ Æ 5’ rimuove un singolo nucleotide alla volta rilasciando un nucleoside 5’ monofosfato. In
assenza di dNTPs, questa attività di degradazione sarà catalizzata a partire da un idrossile terminale 3’ libero sia di un
singolo che di un doppio filamento di DNA. In presenza di dNTPs, l’attività esonucleasica su un filamento a doppia
elica di DNA è inibita dall’attività polimerasica. Durante la sintesi del DNA, l’attività esonucleasica realizza la
correzione rimuovendo i nucleotidi incorporati errati. Oltre all’azione esonucleasica 3’ Æ 5’, molte DNA polimerasi
(per esempio E. coli DNA polimerasi I) hanno anche un’attività esonucleasica 5’ Æ 3’. Questa attività esonucleasica
degrada la doppia elica di DNA a partire da un terminale idrossile 5’ libero.
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L’attività esonucleasica 5’Æ3’ rimuove da uno a svariati nucleotidi alla volta, liberando prevalentemente nucleosidi
fosfato 5’, ma anche oligonucleotidi composti anche da più di 10 nucleotidi. L’attività esonucleasica 5’Æ 3’ della DNA
polimerasi I di E. coli permette di iniziare la sintesi da nick nella doppia elica del DNA. L’attività esonucleasica 5’Æ 3’
degrada il DNA davanti alla sintesi della polimerasi, ed ha come risultato lo spostamento del nick sul DNA. Questa
reazione, conosciuta come nick translation, è importante per uniformare la marcatura della doppia elica del DNA.
L’attività esonucleasica 5’ Æ 3’ della DNA polimerasi I di E. coli, che è localizzata all’N-terminale della molecola, può
essere rimossa sia da un trattamento con proteasi o per delezione della parte del gene interessato. La risultante DNA
polimerasi, che mantiene l’attività esonucleasica 3’ Æ 5’, è conosciuta come il frammento grande della DNA
polimerasi I di E. coli, o come il frammento di Klenow.
Un’importante proprietà delle DNA polimerasi è la loro processività, cioè l’abilità di una polimerasi di incorporare
nucleotidi continuamente su un primer donatore senza dissociarsi dal primer templato . La maggior parte delle DNA
polimerasi (es. DNA polimerasi I di E. coli, il frammento Klenow, la DNA polimerasi T4) hanno bassa processività; si
dissociano dal primer templato dopo aver incorporato meno di 10 nucleotidi. In contrapposizione, la DNA polimerasi
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T7 è altamente processiva; può incorporare centinaia di nucleotidi da un primer donatore senza dissociarsi dal primer
templato. Questa è una proprietà utile se si stanno sintetizzando lunghi tratti di DNA.
Proprietà delle DNA Polimerasi:
Enzimi
Esonucleasi
3’Æ 5’
DNA Polimerasi di
Bassa
E. coli
Frammento
Klenow
di
Esonucleasi
5’ Æ 3’
Velocità
di Processività
polimerizzazione
Presente
Intermedia
Bassa
Intermedia
Bassa
Bassa
Intermedia
Assente
Bassa
Trascrittasi inversa
Assente
Assente
DNA
T4
polimerasi
Alta
Assente
Intermedia
Bassa
DNA
polimerasi
T7 nativa
Alta
Assente
Veloce
Alta
Assente
Veloce
Alta
Assente
Veloce
Alta
Presente
Veloce
Alta
DNA Polimerasi
T7 geneticamente Bassa
modificata
DNA
polimerasi
T7 geneticamente Assente
modificata
Taq
DNA
polimerasi
Assente
DNA polimerasi I di Escherichia coli
L’enzima è il prodotto del gene polA di E. coli. Il gene polA è stato clonato nel batteriofago lambda, e l’enzima è
sovraprodotto dopo trattamento termico che attiva il ciclo litico del fago, mantenuto fino a quel momento nello stadio
lisogenico. La DNA polimerasi I è un singolo polipeptide con peso molecolare di 109,000. Oltre a questa attività
polimerasica DNA dipendente, essa ha anche un’attività esonucleasica 3’Æ 5’ e un’attività esonucleasica 5’Æ 3’.
L’attività esonucleasica è molto meno attiva rispetto a quella della DNA polimerasi T4 o T7.
Altre applicazioni della DNA polimerasi I di E. coli.
1. Marcare i terminali 3’ delle molecole di DNA. Questa procedura è generalmente realizzata con il frammento di
Klenow della DNA polimerasi I di E. coli.
2. Riparare i terminali 3’ o 5’ sporgenti (protuberanze) per creare terminali piatti. Questa procedura è
generalmente realizzata con il frammento Klenow della DNA polimerasi I di E. coli. Per riparare i terminali
3’ sporgenti è usata preferibilmente la DNA polimerasi T4 perché la sua attività esonucleasica 3’Æ 5’ è più
attiva.
Frammento di Klenow della DNA polimerasi I
Il frammento di Klenow, con peso molecolare di 76,000 , è rappresentato dal 70% del C-terminale della DNA
polimerasi I di I. Esso conserva l’attività esonucleasica 3’Æ 5’ e l’attività polimerasica della DNA polimerasi I, ma
manca dell’attività esonucleasica 5’Æ 3’.
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Originariamente il frammento di Klenow fu generato da digestione proteolitica della DNA polimerasi I di E. coli. Oggi
esso è prodotto, tramite cloni, direttamente dal gene per la DNA polimerasi I modificato per cancellare i 323 residui
amminoacidici che compongono l’N-terminale della polimerasi.
Altre applicazioni del frammento di Klenow
1. Sequenziamento del DNA con il metodo dei dideossi.
2. Sintesi del secondo filamento per il clonaggio del cDNA
3. Estensione dei primer oligonucleotidici sul templato a singolo filamento. Alcune specifiche applicazioni
includono il sequenziamento del DNA con il metodo dei dideossi, sintesi di sonde per l’ibridazione, e
mutagenesi in vitro.
4. Convertire oligonucleotidi a singolo filamento in DNA a doppio filamento
Taq DNA polimerasi
La Taq DNA polimerasi nativa fu isolata da un microrganismo termofilo, il Thermus aquaticus. L’enzima ha una massa
molecolare di 94 kDa. Ha una temperatura ottimale di polimerizzazione di 75-80°C e non sembra che abbia nessuna
attività esonucleasica 3’Æ 5’. L’enzima è costitutito da una singola catena polipeptidica con elevato numero di turnover
ed elevata processività.
Applicazioni
1. La Taq polimerasi è attiva in un largo range di temperature e ha una elevata temperatura ottimale di
polimerizzazione che la rende ideale per essere utilizzata nelle reazioni a catena della polimerasi o PCR. Le
elevate temperature permettono più specifici appaiamenti dei primer oligonucleotidici, questo incrementa
l’efficienza e la specificità e quindi la sensibilità della PCR. Il fatto che i primer oligonucleotidici resistano a
ripetuti cicli, dalla temperatura di annealing usata per la PCR fino alla temperatura richiesta per separare i
filamenti, presenta il vantaggio di aggiungere l’enzima una sola volta al campione precedentemente all’avvio
dei cicli di amplificazione.
La Taq polimerasi ha un elevato numero di turn over, alta processività, e la capacità di usare analoghi dei dNTP (
deossinucleosidi trifosfato) quali inosina, la rendono un enzima eccellente per il sequenziamento del DNA. Queste
qualità associate con la sua elevata temperatura d’esercizio permettono il sequenziamento di modelli che presentano
strutture forti strutture secondarie a basse temperature ovviando all’uso dei convenzionali enzimi per il sequenziamento.
DNA polimerasi templato indipendenti
Deossinucleotidiltransferasi terminale
La terminal transferasi, purificata la prima volta dal timo di vitello, catalizza l’incorporazione di deossinucleotidi al
terminale idrossilico 3’ del DNA accompagnato dal rilascio di fosfato inorganico.
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Il templato non è richiesto e non verrà perciò copiato. Sono necessari cationi bivalenti, il tipo di nucleotide che verrà
incorporato dipenderà dal tipo di ione bivalente utilizzato.Come primer si è soliti usare un DNA a singolo filamento,
rispetto ad uno a doppio filamento, questo perché l’estensione è più efficiente quando il terminale 3’ è sporgente.
Tuttavia, in presenza di Co2+, la transferasi terminale processerà qualsiasi terminale 3’(sporgente, piatto o accorciato) e
quindi si avrà un’efficienza non uniforme. La presenza di Co2+ può anche permettere alla transferasi terminale di
catalizzare la limitata polimerizzazione di RNA
DNA polimerasi RNA dipendenti
Trascrittasi inversa
Le “trascrittasi inverse” sono enzimi che derivano dai retrovirus come l’AMV (avian myeloblastosis virus) o il MMLV
(Moloney murine leukemia virus) che le utilizzano per sintetizzare copie di DNA a partire dai loro genomi a Rna.
L’enzima AMV viene purificato a partire dai virus AMV isolati, mentre l’enzima MMLV viene purificato grazie alla
produzione in E.coli che contiene il gene clonato.
Le trascrittasi inverse di AMV e MMLV sono enzimi multifunzionali, ma esse sono principalmente utilizzate come
“DNA polimerasi dipendenti da RNA”. In particolare dei deossioligonucleotidi (una sequenza specifica oppure una
collezione di sequenze random di DNA) vengono impegati come primer sui templati di RNA (di solito mRNA) per l’
allungamento.
Il DNA sintetizzato a partire dal templato-RNA viene chiamato cDNA.
La trascrittasi inversa possiede anche un’attività di “DNA polimerasi DNA dipendente”. L’incorporazione dei dNTPs è
molto lenta (all’ incirca vengono incorporati 5 nucleotidi al secondo) quasi 100 volte più lenta della DNA polimerasi
del batteriofago T7.
La DNA polimerasi della trascrittasi inversa manca dell’attività esonucleasica in direzione 3’ → 5’.
Una terza attività della trascrittasi inversa degrada RNA in un ibrido RNA:DNA Questa cosiddetta “attività RNasi H” è
un’ esonucleasi che agisce processualmente da entrambe le estremità 5’ e 3’. Questa attività è utile per distruggere in
modo selettivo parti di una molecola di RNA alla quale molecole di DNA (normalmente sequenze specifiche di
oligonucleotidi) sono state ibridizzate.
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RNA polimerasi DNA dipendenti
Ci sono due tipi di “RNA polimerasi dipendenti da DNA” comunemente usate per lo studio degli acidi nucleici. Una
classe è rappresentata dall’ RNA polimerasi di E. coli. Questo è un enzima grande e con molte subunità che riconosce
due sequenze di DNA, gli elementi –10 e –35, all’ interno di una grande regione-promotore (circa 40 bp).
L’ RNA polimerasi di E .coli è stata l’RNA polimerasi DNA dipendente utilizzata in origine per la sintesi dei trascritti
in vitro. Tuttavia il suo impiego comporta diversi problemi. In vitro essa termina prematuramente e di conseguenza
sono difficili da ottenere trascritti sopra le 500 basi. Inoltre essa possiede una specificità per la sequenza promotore
relativamente bassa; i trascritti di frequente iniziano da sequenze diverse, come le estremità 5’ dei templati.
Più recentemente è divenuta disponibile un’altra classe di RNA polimerasi DNA dipendenti: quella composta dalle
RNA polimerasi dei Batteriofagi T7, T3 e SP6, che sono codificate dai membri delle relative famiglie di batteriofagi.
Ciascun enzima è formato da una singola subunità che riconosce specifiche sequenze-promotore (20 bp). Ciascuno
comincia la trascrizione specificamente ed in modo esclusivo dalla propria sequenza-promotore.
L’ RNA polimerasi fagica possiede un maggior numero di vantaggi rispetto alla RNA polimerasi di E. coli per la sintesi
di specifici trascritti ad alto livello. Innanzitutto essi sono enzimi estremamente processivi; trascritti di migliaia di basi
in lunghezza sono prontamente ottenuti senza che l’ enzima si dissoci dal templato. In secondo luogo la trascrizione è
sia rapida che estesa; da 2 μg di DNA templato possono essere generati in trenta minuti 60 μg di trascritti specifici.
Inoltre l’inizio è estremamente specifico nei confronti della sola sequenza promotore. Questo permette la produzione di
sonde radioattive a RNA che sono filamento specifiche. Infine le RNA polimerasi dei fagi T7 e T3 sono state purificate
da cellule che hanno sovraespresso i relativi geni. Ciò ha come risultato preparazioni che contengono l’ enzima
omogeneo le quali sono poco costose ed hanno attività estremamente specifiche
RNA polimerasi di Escherichia coli
L’oloenzima di E. coli possiede 5 subunità (struttura α2ββ’o) ed un totale peso molecolare di circa 450,000. Esso
trascrive un DNA templato (in forma denaturata o nativa) in un RNA copia utilizzando ribonucleosidi trifosfati come
precursori. La trascrizione viene avviata preferenzialmente su promotori che contengono sequenze conservate
localizzate 10 e 35 bp a monte dell’inizio della trascrizione e, in vivo, di solito cessa all’altezza di sequenze chiamate
terminatori.
La specificità e l’estensione della trascrizione dipende fortemente dalla qualità della preparazione del DNA, dalla forza
della sequenza promotore e terminatore e dal tipo e dalla concentrazione dei cationi mono e bivalenti nella miscela di
reazione. Il core dell’enzima, che manca della subunità “o”, non riconosce le sequenze-promotore e di conseguenza
comincia la trascrizione in modo casuale sul templato
RNA polimerasi dei fagi SP6, T7, T3
Le Rna polimerasi dei fagi T7 e T3, prodotte dai rispettivi fagi (dal gene 1), furono in origine purificate individui infetti
di E. coli. Al giorno d’ oggi entrambe le polimerasi vengono purificate da ceppi di E. coli che sovraesprimono i geni
clonati.
L’ RNA polimerasi del fago SP6 viene ottenuta da Salmonella typhimurium infettata dal batteriofago SP6.
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Queste tre omologhe RNA polimerasi fagiche sono tutte costituite da singoli polipeptidi con un peso molecolare
compreso tra 90,000 e 100,000. Ciascuna ha un’ elevata specificià per il suo promotore, il quale consiste in una
sequenza specifica di 20 bp. La trascrizione è sia molto rapida (10 volte la velocità della RNA polimerasi di E. coli in
vitro) e sia estremamente processuale.
DNA LIGASI
Le DNA ligasi catalizzano la formazione dei legami fosfodiesterici tra i termini 5’-fosfato e 3’-idrossile giustapposti
lungo i filamenti del DNA a doppia elica. Questa attività permette:
• di riparare eventuali incisioni in un singolo filamento del DNA.
•
di legare dei frammenti di restrizione che hanno entrambe le estremità piatte
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•
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di legare sequenze terminali omologhe e coesive
Per la ricerca sugli acidi nucleici vengono utilizzate due ligasi: la E. coli ligasi e la T4 DNA ligasi. Questi due enzimi
differiscono sopprattutto in due proprietà. La prima è la fonte di energia: infatti T4 ligasi utilizza ATP, mentre E. coli
ligasi utilizza il NAD. Un’ altra importante differenza è la loro capacità di legare le estremità piatte; in condizioni
normali, solo la T4 ligasi è in grado di legare le estremità piatte.
DNA ligasi T4
La T4 DNA ligasi, il prodotto del gene 30 del fago T4, fu originalmente purificata da cellule fago-infettate di E. coli. Il
gene 30 del fago T4 è stato clonato, e l’enzima è ora preparato da ceppi sovraespressori. Utilizzando ATP come
cofattore, la T4 DNAligasi catalizza il riparo delle incisioni nel singolo filamento del dna e lega i frammenti di
restrizione che hanno sia estremità piatte che sequenze terminali coesive. E’ l’unica ligasi che lega efficientemente le
estremità piatte in condizioni di reazione normali: infatti sembra che la attività della T4 DNAligasi sia stimolata dalla
T4 RNA ligasi.
Applicazioni
La T4 DNA ligasi è di gran lunga la DNA ligasi più utilizzata. Essa può essere utilizzata virtualmente per ogni
applicazione che richieda una DNA ligasi. Molto importante è la sua efficienza nel legare le estremità piatte, una
reazione che altre ligasi non riescono ad eseguire.
DNA ligasi di Escherichia coli
La DNA ligasi di E. coli è il prodotto del gene lig. Il gene lig è stato clonato e l’enzima ottenuto da ceppi che lo
sovraesprimonoi. La DNA ligasi di E. coli catalizza la riparazione di nick a singolo filamento sul DNA a doppia elica e
unisce i filamenti che hanno estremità omologhe e coesive. La DNA ligasi di E. coli non può unire estremità piatte nelle
normali condizioni di reazione. A differenza delle altre ligasi essa utilizza il NAD come cofattore.
Applicazioni
La DNA ligasi di E. coli può essere usata in alternativa alla DNA ligasi T4 quando non sono richieste le estremità
piatte. La trasformazione effettuata usando DNA ligato con la DNA ligasi di E. coli ha un basso background da ligature
errate se comparato alla DNA ligasi T4; quest’ ultima ha ancora minorespecificità per la struttura dell’estremità (blunt,
sticky etc).
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RNA ligasi
RNA ligasi T4
L’RNA ligasi, prodotta da un gene virale (gene 63), è purificato dalle cellule infettate dal virus. Essa catalizza l’unione
covalente ATP dipendente dei singoli filamenti con terminale 5’-fosfato del DNA o dell’RNA a singoli filamenti con
terminale 3’ idrossile di molecole di DNA o RNA.
Applicazioni
1. Marcatore radioattivo delle estremità 3’ dell’RNA. La miscela di reazione contiene le molecole di RNA e
l’accettore, un nucleotide [5’ 32P] 3’, 5’bifosfato. (es: 5’32P-Cp) come donatore, e ATP come fonte di energia.
Il prodotto di questa reazione è una molecola di RNA contenente un nucleotide aggiuntivo al terminale 3’ e un
32
P nell’ultimo collegamento tra i nucleotidi.
2. Circolarizza deossi- e ribo-oligonucleotidi.
3. Lega gli oligomeri per la sintesi degli oligonucleotidi. È utilizzato per produrre oligomeri che contengono al
loro interno oligomeri marcati su specifici residui.
4. Stimola l’attività di ligatura piatta sulle estremità dei filamenti della T4 DNA ligasi.
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RNA Polimerasi DNA indipendenti
Polimerasi poly(A)
L'enzima purificato da E. coli catalizza l'incorporazione di residui di AMP all'estremita' libera 3'-OH dell'RNA,
utilizzando ATP come precursore.
Condizioni di reazione
Incubazione a 37°C per 30 minuti. La reazione viene bloccata aggiungendo EDTA o riscaldando a 75°C per 10 minuti.
Il volume delle reazioni e le concentrazioni di ATP variano a seconda delle applicazioni individuali.
Applicazioni
1. Marcatura dell'estremita' 3' dell'RNA utilizzando ATP con l'isotopo 32P. L'RNA cosi' marcato è usato per le sonde di
ibridazione. Per i geni clonati ,tuttavia, la sintesi di sonde di RNA usando l'RNA polimerasi di fagi è molto più
efficiente e produce RNA con un'attività a più' alta specificità. Per la marcatura dell'RNA cellulare si preferisce il
metodo della sintesi di cDNA usando la reverse trascrittasi.
2. Clonaggio di RNA che manca della coda di poli(A). La coda di poli(A) viene sintetizzata grazie alla poli(A)
polimerasi e successivamente viene fatta una copia di cDNA utilizzando come primer oligo(dT).
Fosfatasi e chinasi
Fosfatasi alcalina
Fosfatasi alcalina batterica (BAP) da E. coli e fosfatasi dell'intestino di vitello (CIP) sono state usate comunemente nella
ricerca di acidi nucleici. Entrambi gli enzimi catalizzano l'idrolisi di residui di 5'-P da DNA, RNA e ribo- e deossiribonucleoside trifosfati. I prodotti defosforilati hanno un'estremita' 5'-OH che può essere successivamente marcata
radioattivamente usando [γ-32P]ATP e chinasi polinucleotide T4.
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Entrambe le fosfatasi richiedono Zn2+ per la loro attività. La differenza pricipale tra i due enzimi è la stabilità: CIP è
facilmente inattivato dal riscaldamento a 70°C per 10 minuti e/o dall'estrazione con il fenolo, la BAP invece è molto più
resistente a questi trattamenti. Così, per più' ragioni, CIP è l'enzima scelto. Inoltre CIP ha un'attività specifica più alta
che BAP.
Condizioni di reazione per la BAP
Inoculare a 60°C per 30 minuti. La reazione viene bloccata con SDS e proteinasi K incubando a 37°C per 30 minuti. Poi
si estrae due volte con fenolo e si precipita il DNA con etanolo.
Condizioni di reazione per la CIP
Incubare a 37°C per 30 minuti. La reazione si blocca riscaldando a 75°C per 10 minuti (la CIP è labile al calore), oppure
estraendo con fenolo e precipitando con etanolo.
Applicazioni
1. Defosforilazione all'estremità 5' degli acidi nucleici per marcare con [γ-32P]ATP e T4 polinucleotide chinasi. La
marcatura del DNA al 5' con 32P era usata per il sequenziamento con la procedura di Maxam-Gilbert
2. Defosforilazioni all'estremita' 5' di un vettore di DNA per evitare che che si leghi con se stesso.
T4 polinucleotide chinasi
La T4 polinucleotide chinasi, prodotto del gene pseT del fago T4, fu originariamente purificata da cellule di E.coli
infettato dal fago T4. Recentemente, il gene pseT e' stato clonato in E. coli e l'enzima è stato sovraespresso da questo
ceppo. La reazione in avanti della T4 polinucleotide chinasi catalizza il trasferimento del fosfato terminale dell'ATP al
terminale 5'-OH di DNA e RNA. Questa reazione è molto efficiente e quindi rappersenta il metodo solitamente usato
per marcare l'estremita' 5' o per fosforilare gli oligonucleotidi.
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La reazione di scambio della stessa chinasi catalizza lo scambio dei fosfati all'estremità 5'. In questa reazione, che
richiede un eccesso di ADP, il fosfato all'estremità 5' è trasferito all'ADP e successivamente rifosforilato grazie al 32P di
una molecola di ATP. La reazione di scambio è meno efficente della reazione in avanti, quindi è usata raramente.
Infine la polinucleotide chinasi è una 3' fosfatasi. Alcune preparazioni commerciali di polinucleotide chinasi sono
preparate a partire dal filamento del fago T4 con il gene pseT mutato.
Applicazioni
1. Sequenziamento di DNA tramite la tecnica Maxam-Gilbert.
2. Mappatura dei siti di restrizione con una parziale digestione di frammenti di DNA marcati all'estremità 5'.
3. Mappatura dell'estremità dei trascritti di RNA.
4. Mappatura delle posizioni degli introni sul DNA.
5. Sintesi di substrati per le ligasi di DNA e RNA.
6. Marcatura di oligonucleotidi per la purificazione tramite elettroforesi su gel.
7. Ligatura di oligonucleotidi su vettori di RNA; quando gli oligonucleotidi sono sintetizzati chimicamente hanno
un'estremità 5'-OH; nel caso in cui vengano utilizzati per il clonaggio è preferibile molte volte fosforilarli.
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Esonucleasi
Esonucleasi VII (exo VII)
L'esonucleasi VII proveniente da E. coli consiste in due subunità, i prodotti dei geni xseA e xseB. E' un'esonucleasi che
lavora su singolo filamento e che agisce su entrambe le estremità del DNA. I prodotti dell'exo VII sono piccoli
oligonucleotidi. Exo VII è l'unica tra le nucleasi qui discusse che non ha bisogno di Mg2+. Ha attività massima in
presenza di EDTA 10 mM.
Applicazioni
1. Mappatura delle posizioni degli introni nel DNA genomico.
2. Escissione di segmenti di DNA che sono stati inseriti nei vettori plasmide tramite il metodo di tailing di poli(dAdT).
Esonucleasi III (exo III)
E' il prodotto del gene xthA di E.coli. E' sintetizzata dalle cellule di E. coli che sovraproducono la proteina. E' un enzima
polifunzionale che catalizza l'idrolisi di diversi tipi di legami fosfodiesterici nel DNA a doppio filamento. La principale
applicazione della exoIII è come specifica esonucleasi 3'-5' su doppio filamento che catalizza il rilascio di nucleotidi 5'
dall'estremità 3'-OH del DNA a doppio filamento.
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L'attività di esonucleasi è non-processiva, quindi è ideale per generare regioni uniformi a singolo filamento in DNA a
doppio filamento. La sua velocità di degradazione dipende dalle basi che compongono il DNA: C>>A~T>>G. Come
risultato estremità differenti saranno degradate a velocità differenti.
Oltre all'attività esonucleasica 3'-5', exo III ha altre tre attività:
• fosfatasica 3'
• RNAsi H
• endonucleasica specifica per siti apurinici o apirimidinici
Applicazioni
1. Preparazione di sonde radioattive filamento specifiche.
2. Preparazione di templati a singolo filamento di DNA per sequenziamento.
3. Costruzione di delezioni unidirezionali, poichè exo III è specifica per il DNA a doppio filamento essa degraderà
preferibilmente DNA duplex aventi 3'-recessed end as opposed to one with a 5'-recessed end. Questa proprietà è
utile per la costruzione di un set di delezioni unidirezionali da una data posizione nel DNA clonato, che sono usate
per il sequenziamento di DNA senza siti di restrizione precedentemente mappati.
Endonucleasi
Nucleasi BAL 31
La nucleasi BAL31 da Alteromonas espejiana è una endodeossiribonucleasi specifica per il singolo filamento. Sul DNA
circolare a doppia elica degrada a livello di nick o nelle regioni prominenti a singolo filamento create tramite
superavvolgimento. Sul DNA lineare a doppia elica degrada da entrambe le estremità ed ha come risultato un
accorciamento controllato del DNA.
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BAL 31 agisce anche come una ribonucleasi catalizzando l'idrolisi di RNA ribosomale e transfer. Richiede sia Ca2+ che
Mg2+. Le digestioni possono essere terminate con EGTA, uno specifico chelante del calcio, senza influire sulla
concentrazione di Mg2+. E' attiva in SDS e urea.
Applicazioni
1. Nel clonaggio per creare delezioni di diverse dimensioni in modo controllato. Il DNA clonato è tagliato in siti
specifici con un enzima di restrizione e il DNA lineare risultante è digerito con la nucleasi BAL31 per vari intervalli
di tempo.
2. Indagini sulla struttura secondaria di DNA superavvolto o alterazioni nella struttura a doppia elica di DNA causate
da trattamenti con agenti mutageni.
Nucleasi S1
La nucleasi S1 da Aspergillus oryzae è una endonucleasi a singolo filamento altamente specifica. La velocità di
digestione di DNA a singolo filamento è 75000 volte più veloce di quella di DNA a doppio filamento.
Il pH ottimale va da 4.0 a 4.3 e la velocità diminuisce del 50% a pH 4.9. Le reazioni vengono fatte correre normalmente
a pH 4.6 per evitare la depurinazione del DNA.
L'enzima richiede bassi livelli di Zn2+ e non è influenzato da NaCl presente in concentrazioni tra 10 e 300 mM.
L'enzima è stabile in urea.SDS e formamide.
Applicazioni
La maggior pate delle applicazioni della nucleasi S1 fa uso della sua abilità di orientare le estremità sporgenti di DNA e
RNA senza significativa erosione delle estremità piatte.
1. Mappatura delle estremità 5' e 3' di trascritti di RNA con l'analisi di ibridi RNA-DNA S1 resistenti.
2. Mappatura della locazione degli introni grazie alla digestione di un ibrido di un mRNA maturo con DNA genomico
marcato con 32P.
3. Digestione delle strutture a forcina formate durante la sintesi di cDNA da parte delle trascrittasi inverse.
4. Rimozione delle estremità a singolo filamento da filamenti di DNA per produrre estremita' piatte per la ligatura.
5. Creazione di piccole delezioni ai siti di restrizione
6. Rendere le estremità piatte dopo successive delezioni con exo III
Nucleasi Mung Bean
E' un'endonucleasi a singolo filamento altamente specifica, con proprietà simili a quelle della nucleasi S1. Le reazioni
sono normalmente portate avanti a pH 5 che è ottimale per la degradazione del DNA a singolo filamento. L'attività
contro il DNA a doppio filamento è essenzialmente trascurabile a pH 5 ma aumenta a pH inferiori. La sua attivazione
diminuisce significativamente a concentrazioni di NaCl maggiori di 200 mM.
Una unità è definita come la quantita' di enzima che produce 1 ng di materiale solubile in acido in 1 minuto a 37°C
usando come substrato DNA a singolo filamento estratto da sperma di salmone.
Applicazioni
E' usata per quasi tutti gli stessi scopi descritti per la nucleasi S1. Tuttavia non è più precisa di questa nel tagliare subito
dopo l'ultima coppia di basi ibridate senza rimuovere alcun nucleotide appaiato. Per questa ragione genera normalmente
bande singole, mentre S1 spesso da bande multiple. Inoltre è preferita a S1 per la precisa eliminazione di basi che
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sporgono (protuberanza dell’estremità) come risultato del taglio di endonucleasi di restrizione. A differenza di S1, la
nucleasi Mung Bean non taglia il filamento opposto ad un nick nel doppio filamento di DNA.
Deossiribonucleasi I (DNasi I)
Deriva dal pancreas bovino, è un'endonucleasi che degrada il DNA a doppio filamento producendo oligonucleotidi 3'OH. L'enzima richiede cationi bivalenti. La specificità della reazione varia a seconda del tipo di catione presente. In
presenza di Mg2+ la DNasi I produce nick non corrispondenti nei due filamenti di DNA mentre in presenza di Mn2+
l'enzima produce rotture corrispondenti su entrambi i filamenti.
Applicazioni
1. Nick translation (vedi marcatura sonde). Introduce nick su entrambi i filamenti di DNA che possono fungere da
primer per iniziare la sintesi di DNA da parte della DNA polimerasi I di E. coli.
2. Clonaggio random di frammenti di DNA catalizzando il taglio su doppio filamento in presenza di Mn2+.
Ribonucleasi
Ribonucleasi (RNAsi) con differenti specificità di sequenza sono usate per una molteplicità di scopi analitici inclusi il
sequenziamento, la mappatura e la quantificazione dell'RNA. Un'applicazione comune dell'RNasi A è l'idrolisi
dell'RNA che contamina le preparazioni di DNA.
Un'altra RNAsi usata comunemente e' l'RNasi H. Molte RNasi disponibili sono endoribonucleasi sequenza specifiche.
Questa proprietà è stata sfruttata per il sequenziamento enzimatico dell'RNA. Ad esempio una combinazione di tre
diverse RNAsi e la nucleasi di Staphilococcus aureus può essere usata nella determinazione della sequenza di RNA.
Ribonucleasi A
Proviene dal pancreas bovino, è un'endoribonucleasi che idrolizza specificatamente l'RNA dopo residui C e U. Il taglio
avviene tra il gruppo 3-fosfato di una pirimidina del ribonucleotide e il 5'-OH dell'adiacente nucleotide. La reazione
genera un fosfato ciclico 2'-3' che viene poi idrolizzato ai corrispondenti 3'-nucleosidi fosfati.
L'attivita' dell'RNasi A può essere specificamente inibita da un inibitore di RNAsi, una proteina isolata dalla placenta
umana.
Applicazioni
1. Mappatura e quantificazione di vari RNA usando il saggio di protezione da ribonucleasi. E' usata in combinazione
con l'RNasi T1.
2. Idrolisi dell'RNA che contamina preparazioni di DNA.
3. Sequenziamento di RNA.
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Ribonucleasi H
Isolata da E. coli. E' una endoribonucleasi che idrolizza specificamente i legami fosfodiesterici dell'RNA negli ibridi
RNA-DNA generando prodotti con estremità 3'-OH e 5'-P. Non degrada DNA o RNA a singolo o doppio filamento. Il
taglio dell'RNasi H può essere diretto verso siti specifici tramite ibridazioni di corti deossi-oligonucleotidi con l'RNA.
Una unità è definita come la quantità di enzima che produce una nmole di ribonucleotidi solubili in acido da poly(A)poly(T) in 20 minuti a 37°C.
Applicazioni
1. Sintesi di cDNA a doppio filamento rimuovendo il filamento di mRNA dall'ibrido RNA-DNA prodotto durante la
sintesi del primo filamento di cDNA. E' anche usata nel protocollo per degradare RNA residui insieme all'RNasi A.
2. Creazione di tagli specifici in molecole di RNA usando deossioligonucleotidi sintetici per creare regioni a doppio
filamento RNA-DNA.
Enzimi di restrizione
Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi che tagliano le molecole di DNA a doppio filamento in siti specifici che si
trovano all’interno o adiacenti a particolari sequenze di nucleotidi chiamate siti di riconoscimento.
Gli enzimi di restrizione comunemente riconoscono sequenze di DNA palindromiche.
Gli enzimi di restrizione producono due diversi tipi di estremità:
i. gli enzimi che tagliano entrambi i filamenti esattamente all’asse di simmetria della sequenza palindromica
generano frammenti di DNA con estremità piatte (blunt ends)
ii. gli enzimi che tagliano ogni filamento in posizione similare ai lati opposti dell’asse di simmetria creano
frammenti di DNA con estremità protruding (overhangs) a singolo filamento (sticky ends)
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RESTRIZIONE DEL DNA
Reazione di taglio
Per il taglio con enzimi di restrizione è importante non usare concentrazioni di DNA superiori a 0.1μg/μl (es.: 1μg di
DNA in 10μl di volume finale di reazione). Se si deve caricare su gel grandi quantità di DNA, digerire in un volume
adeguato e poi precipitare con alcool e risospendere nel volume di caricamento.
Aggiungere 1/10 del volume finale di tampone 10x per l’enzima di restrizione da
utilizzare.
1.
Il tampone ricrea un ambiente adatto all’azione dell’enzima di restrizione: quest’ultimo è un’endonucleasi e quindi
necessita di ioni Mg++. Poiché generalmente il DNA è risospeso in TE (contenente EDTA, un chelante di ioni bivalenti)
i tamponi contengono un eccesso di ioni Mg++ in modo da usare l’EDTA e da lasciare in soluzione una quantità di ioni
sufficiente all’enzima. 1mM di EDTA è sufficiente a complessare il Mg++ in soluzione ma non tanto da complessare
anche il Mg++ che serve quando dobbiamo usare degli enzimi di restrizione.
Il tampone è composto di Tris, Mg++ e stabilizzatori dell’attività enzimatica che permettono di evitare tagli aspecifici.
Usare il tampone appropriato per l’enzima di restrizione (anche se magari il tampone è di una ditta e l’enzima di
un’altra: l’importante è che i due corrispondano): l’utilizzo di un tampone non specifico può comportare attività
enzimatica aspecifica (per questo è importante testare i tamponi universali prima di prove importanti).
In caso di taglio con due enzimi di restrizione diversi, utilizzare un tampone che assicuri almeno 50% di efficienza per
entrambi gli enzimi (cfr tabelle dei cataloghi delle ditte di produzione dei tamponi). Se l’efficienza è minore, è
preferibile utilizzare il primo enzima in un tampone appropriato, precipitare il DNA, lavarlo, risospenderlo e procedere
al taglio con il secondo enzima nel nuovo tampone.
Come la maggiorparte delle aziende che oggi operano sul mercato, New England Biolab (www.neb.com) fornisce 4
tamponi con caratteristiche leggermente diverse. Ogni enzima funziona bene con almeno uno di essi ed è generalmente
possibile trovare un tampone che permetta l’attività dei due enzimi che si impiegano nel gaso di digestioni moltiple.
2.
Aggiungere 1 μl di enzima di restrizione.
L’enzima viene aggiunto per ultimo nella soluzione perché funziona solo se sono già presenti DNA, TE (o H2O) e
tampone.
Gli enzimi si misurano come unità di attività. 1 o 2 unità sono la quantità necessaria per tagliare 1 μg di DNA di Fago λ
in 30 minuti (bastano poche unità perché è DNA lineare e corto, quindi è facile da tagliare e il numero di siti
riconosciuti dall’enzima sono pochi ). Nel DNA plasmidico (superavvolto) o genomico i siti di restrizione sono di più e
possono essere nascosti per cui di solito si usano 5-8 unità di enzima per ogni μg di DNA da tagliare e servono tempi
più lunghi, fino a 3 ore. E’ da notare che, nei plasmidi superavvolti, l’enzima fatica a tagliare i siti di restrizione
mascherati dai superavvolgimenti. Dopo i primi tagli la struttura si rilassa esponendo così tutti i siti di restrizione del
DNA.
Si considera che in 10 μl può essere tagliato al massimo 1 μg di DNA. Quando taglio DNA plasmidico (circolare) che
ha un solo sito di restrizione per l’enzima utilizzato, sul gel di agarosio trovo una sola banda. Se taglio invece DNA
genomico che ha molti siti di taglio per lo stesso enzima, sul gel risulta una strisciata con gradiente crescente dal basso
verso l’alto poiché dal taglio si formano in maggioranza lunghi frammenti di DNA. La visualizzazione su gel di
agarosio di un frammento di DNA richiede almeno 20 picogrammi. Per la visualizzazione di DNA genomico tagliato
con un enzima di restrizione sono invece necessari di almeno 2 μg, che posso ottenere precipitando con isopropanolo e
NaOAc 3M, seguito da un lavaggio in etanolo e alla fine risospendo in 10-15 μl di TE.
Gli enzimi di restrizione sono forniti di glicerolo (crioprotettore) e conservati a –20°C. Durante la procedura devono
essere tenuti in ghiaccio. Per diluirli - se necessario - si utilizza il tampone di reazione ad una concentrazione 1X; una
volta diluiti non è possibile conservarli per più di qualche ora. Di solito le case fornisco gli enzimi a circa 12-20 unità
per μl.
3.
Incubare per 1h a 37°C (3h per DNA genomico).
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16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
Se dopo questo tempo il DNA non risulta tagliato completamente, conviene ripetere l’estrazione, non la digestione,
perché il DNA contiene evidentemenet impurità.
Alcuni enzimi hanno bisogno di temperature più basse di 37°C (es. Sma1 taglia a temperature inferiori a 25°C) per cui
prima di usare ogni enzima, assicurarsi sempre di quali sono le sue condizioni ottimali di utilizzo.
Gli enzimi di restrizione posso avere la cosiddetta “star activity”, un fenomeno che si presenta se l’enzima è in attività
per un tempo prolungato (es. over-night). Quando l’enzima perde le sue capacità funzionali o è in condizioni non
idonee, comincia a tagliare in modo aspecifico. Per questo motivo gli enzimi vengono usati con il tampone appropriato
e mai oltre le 3 ore.
Esempio: Avendo a disposizione il Tampone4 a una concentrazione 10X, l’enzima Sac1, H2O, DNA plasmidico da tagliare e volendo arrivare ad un
volume finale di 15μl totali, quanti μl di ogni componente devo prendere?
Se volessimo caricare 200 ng di DNA contenuti in 3μl della nostra soluzione, preparo la soluzione di taglio enzimatico nel seguente
modo:
•
3μl di DNA;
•
1μl di enzima Sac1 corrispondente a 5-8 unità;
•
1..5μl di Tampone4 diluendo su un volume di 15μl lo stock 10X a 1X;
•
9..5μl di H2O per portare a volume.
Cleavage Close to the End of DNA Fragments (linearized vector)
Linearized vectors were incubated with the indicated enzymes (10 units/µg) for 60 minutes at the recommended incubation
temperature and NEBuffer for each enzyme. Following ligation and transformation, cleavage efficiencies were determined by dividing
the number of transformants from the digestion reaction by the number obtained from religation of the linearized DNA (typically 100500 colonies) and subtracting from 100%. "Base Pairs from End" refers to the number of double-stranded base pairs between the
recognition site and the terminus of the fragment; this number does not include the single-stranded overhang from the initial cut. Since
it has not been demonstrated whether these single-stranded nucleotides contribute to cleavage efficiency, 4 bases should be added to
the indicated numbers when designing PCR primers. Average efficiencies were rounded to the nearest whole number; experimental
variation was typically within 10%. The numbers in parentheses refer to the number of independent trials for each enzyme tested (from
Moreira, R. and Noren, C. (1995), Biotechniques, 19, 56-59).
Note: As a general rule, enzymes not listed below require 6 bases pairs on either side of their recognition site to cleave efficiently.
|A|B|E|H|K|M|N|P|S|X|
Base pairs
from End
%Cleavage
Efficiency
Vector
Initial Cut
Aat II
3
2
1
88 (2)
100 (2)
95 (2)
LITMUS 29
LITMUS 28
LITMUS 29
Nco I
Nco I
PinA I
Acc65 I
2
1
99 (2)
75 (3)
LITMUS 29
pNEB193
Spe I
Sac I
Afl II
1
13 (2)
LITMUS 29
Stu I
Age I
1
1
100 (1)
100 (2)
LITMUS 29
LITMUS 29
Xba I
Aat II
Apa I
2
100 (1)
LITMUS 38
Spe I
Asc I
1
97 (2)
pNEB193
BamH I
Avr II
1
100 (2)
LITMUS 29
Sac I
BamH I
1
97 (2)
LITMUS 29
Hind III
Bgl II
3
100 (2)
LITMUS 29
Nsi I
BsiW I
2
100 (2)
LITMUS 29
BssH II
BspE I
2
1
100 (1)
8 (2)
LITMUS 39
LITMUS 38
BsrG I
BsrG I
BsrG I
2
1
99 (2)
88 (2)
LITMUS 39
LITMUS 38
Sph I
BspE I
BssH II
2
100 (2)
LITMUS 29
BsiW I
Eag I
2
100 (2)
LITMUS 39
Nhe I
EcoR I
1
1
1
100 (1)
88 (1)
100 (1)
LITMUS 29
LITMUS 29
LITMUS 39
Xho I
Pst I
Nhe I
Enzyme
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Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
EcoR V
1
100 (2)
LITMUS 29
Pst I
Hind III
3
2
1
90 (2)
91 (2)
0 (2)
LITMUS 29
LITMUS 28
LITMUS 29
Nco I
Nco I
BamH I
Kas I
2
1
97 (1)
93 (1)
LITMUS 38
LITMUS 38
NgoM IV
Hind III
Kpn I
2
2
1
100 (2)
100 (2)
99 (2)
LITMUS 29
LITMUS 29
pNEB193
Spe I
Sac I
Sac I
Mlu I
2
99 (2)
LITMUS 39
Eag I
Mun I
2
100 (1)
LITMUS 39
NgoM IV
Nco I
2
100 (1)
LITMUS 28
Hind III
NgoM IV
2
100 (1)
LITMUS 39
Mun I
Nhe I
1
2
100 (1)
82 (1)
LITMUS 39
LITMUS 39
EcoR I
Eag I
Not I
7
4
1
100 (2)
100 (1)
98 (2)
Bluescript SKBluescript SKBluescript SK-
Spe I
Ksp I
Xba I
Nsi I
3
3
2
100 (2)
77 (4)
95 (2)
LITMUS 29
LITMUS 29
LITMUS 28
BssH II
Bgl II
BssH II
Pac I
1
76 (3)
pNEB193
BamH I
Pme I
1
94 (2)
pNEB193
Pst I
Pst I
3
2
1
98 (1)
50 (5)
37 (3)
LITMUS 29
LITMUS 39
LITMUS 29
EcoR V
Hind III
EcoR I
Sac I
1
99 (2)
LITMUS 29
Avr II
Sal I
3
2
1
89 (2)
23 (2)
61 (3)
LITMUS 39
LITMUS 39
LITMUS 38
Spe I
Sph I
Sph I
Sfi I
9
4
1
81 (2)
97 (2)
93 (2)
LITMUS 38
LITMUS 38
LITMUS 38
BamH I
Mlu I
EcoR I
Spe I
2
2
100 (2)
100 (2)
LITMUS 29
LITMUS 29
Acc65 I
Kpn I
Sph I
2
2
1
99 (1)
97 (1)
92 (2)
LITMUS 39
LITMUS 39
LITMUS 38
Sal I
BsrG I
Sal I
Xba I
1
1
99 (2)
94 (1)
LITMUS 29
LITMUS 29
Age I
PinA I
Xho I
1
97 (2)
LITMUS 29
EcoR I
Xma I
2
2
98 (1)
92 (1)
pNEB193
pNEB193
Asc I
BssH II
Activity of Thermophiles at 37°C
Listed below is the percentage activity exhibited at 37°C for enzymes that have an optimal incubation temperature higher
(thermophiles) or lower (25°C) than 37°C.
Optimal
Temperature
% Activity
at 37°C
Apa I
25°C
100*
ApeK I
75°C
<10
Apo I
50°C
50
Bae I
25°C
20
Enzyme
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16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
Bcl I
50°C
50
BfuA I
50°C
50
BpuE I
25°C
20
Bsa I
50°C
10
BsaB I
60°C
20
BsaJ I
60°C
20
BsaW I
60°C
20
BsiE I
60°C
30
BsiHKA I
65°C
<10
BsiW I
55°C
50
Bsl I
55°C
30
Bsm I
65°C
20
BsmA I
55°C
30
BsmB I
55°C
20
BsmF I
65°C
50
BspCN I
25°C
30
Bsr I
65°C
20
BsrD I
65°C
30
BssH II
50°C
75
BssK I
60°C
10
BstAP I
60°C
50
BstB I
65°C
10
BstE II
60°C
50
BstF5 I
65°C
20
BstN I
60°C
30
BstU I
60°C
20
BstX I
55°C
50
BstY I
60°C
30
BtgZ I
60°C
75
CviA II
25°C
20
Fat I
55°C
20
Fau I
55°C
20
Mwo I
60°C
10
N.BstNB I
55°C
<10
Nb.Bsm I
65°C
-
Pho I
75°C
<10
PI-Psp I
65°C
<10
PspG I
75°C
10
Sfi I
50°C
10
Sma I
25°C
50
Sml I
55°C
<10
Swa I
25°C
50
Taq I
65°C
10
Tfi I
65°C
10
Tli I
75°C
<10
Tse I
65°C
20
Tsp45 I
65°C
10
Tsp509 I
65°C
<10
TspR I
65°C
10
Tth111 I
65°C
10
Massimo Delledonne
* Apa I has 100% avtivity at 37°C, however the half-life of this enzyme at 37°C is only 30 minutes.
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16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
QUANTIFICAZIONE DEL DNA
−
−
−
Misura dell’OD260 allo spettrofotometro.
Osservazione delle bande su gel: il limite minimo di rilevabilità è di 20-25ng (dipende dal sistema di
rivelazione e dalla quantità di EtBr).
Confronto della banda ottenuta con quella di una quantità nota di fago λ o di marker.
Quantificazione spettrofotometrica del DNA
Le letture vengono fatte a due lunghezze d’onda:
• 280nm
• 260nm
assorbimento delle proteine
assorbimento del DNA
In una cuvetta di quarzo (trasparente agli UV) aggiungere 995μl di H2O.
Azzerare lo strumento.
Aggiungere 5μl di DNA.
Leggere il valore (es. A260 = 0.124, A280 = 0.060).
Dal rapporto dell’assorbimento a 260nm e quello a 280nm è possibile ricavare la purezza del campione di DNA:
A260 0.124
=
= 2.06
A280 0.060
Se il DNA è abbastanza puro si ottiene un rapporto di 1.8-1.9; un valore minore (cioè circa 1.6) indica che il DNA è
contaminato da proteine; un rapporto invece di circa 2 o addirittura più alto significa che il DNA è contaminato da
RNA, zuccheri o lipidi.
A260 = 1 corrisponde approssimativamente a 50 μg nel caso di DNA a doppia elica; 40 μg nel
caso di RNA e 30 μg nel caso di oligonucleotidi
1OD sono μg di acido nucleico in 1ml di volume con cuvetta di 1cm. Per esempio:
- Per DNA OD260 = 1 = 50 µg/ml, cioè se metto 50mg di DNA in 1ml trovo OD260 = 1;
- Per RNA OD260 = 1 = 40 µg/ml perché essendo a singola elica assorbe di più per cui una minore quantità mi dà
sempre una OD260 pari a 1;
- Per oligonucleotidi single-strand OD260 = 1 ≅ 33 µg/ml.
Il metodo dello spettrofotometro è adatto nel caso in cui abbiamo DNA in quantità non troppo bassa per evitare di
incorrere in valutazioni grossolanamente errate. E’ pertanto consigliabile eseguire la quantificazione confrontando la
fluorescenza emessa dall’etidio bromuro (dopo corsa su gel di agarosio) con uno standard di concentrazione (DNA a
quantità nota) nota.
Quantificazione tramite confronto della fluorescenza emessa dall’etidio
bromuro (EtBr) con uno standard a concentrazione nota (es. Fago λ o
marker)
Se per esempio abbiamo a disposizione come marker il Fago λ (ma potrebbe essere qualsiasi altro marker a
concentrazione nota) con una concentrazione di 10ng/μl e sul gel carichiamo 5μl, la banda risultante dopo corsa su gel
di agarosio conterrà 50ng di DNA:
10ng : 1μl = X : 5μl
X=
10ng ⋅ 5μl
= 50ng , che è la quantità di DNA contenuto nella banda.
1μl
Sapendo quanto DNA è contenuto nella banda del marker, è possibile fare un confronto con l’intensità di altre bande a
concentrazione ignota e farci così una stima approssimativa del contenuto in DNA di queste ultime.
60
16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
Notare che la quantità minima di DNA da caricare nel gel di agarosio deve essere 20-25ng altrimenti le bande non
sono visualizzabili!
61
16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
ELETTROFORESI
L’elettroforesi su gel è costituita da un movimento di cariche in un campo elettrico. E’ il metodo più comune per
separare molecole di DNA, RNA e proteine e trova numerose applicazioni in biologia molecolare. Vengono utilizzati
due diversi tipi di gel: di agarosio e di poliacrilammide. L’agarosio è un polisaccaride che forma un gel con pori
variabili tra 100 e 300 nm di diametro a seconda della sua concentrazione. E’ quindi la percentuale di agarosio che
determina la gamma dei frammenti di DNA, RNA o proteine che vengono separati. Tuttavia il gel di agarosio non ha il
potere risolutivo per separare molecole di DNA che differiscono soltanto per uno o pochi nucleotidi. Per questo scopo
vengono utilizzati i gel di poliacrilammide i quali riescono a separare frammenti diversi anche di un solo nucleotide
(range 1-1000 bp) grazie a pori di dimensioni minori rispetto a quelli di agarosio. Il gel è ottenuto per polimerizzazione
di acrilammide monofunzionale tramite un cross-legante, l’N, N’-metilenebisacrilammide. A differenza di quelli
dell’agarosio, i legami formati nella poliacrilammide sono irreversibili. La matrice è neutra e meccanicamente stabile.
Inoltre i gel di poliacrilammide si possono fare a varie concentrazioni (minimo 3%).
Elettroforesi su gel di agarosio
Dopo la loro polimerizzazione, i gel vengono posti nelle apposite vaschette elettroforetiche riempite in seguito del
tampone di corsa. Tale tampone è lo stesso e alla stessa concentrazione di quello usato per polimerizzare l’agarosio. I
tamponi più usati sono:
• il TAE (Tris-acetato + EDTA). Questo nel tempo perde capacità tamponante perché si ha la separazione di
cariche agli elettrodi. Viene quasi sempre utilizzato a una concentrazione 1X;
• il TBE (Tris-borato + EDTA) ha capacità tamponante superiore al TAE. E’ stabile e quindi viene usato in
corse elettroforetiche molto lunghe. L’unico difetto è che col tempo tende a precipitare. Può essere utilizzato
a “mezza forza”, cioè 0.5X, perché già a questa concentrazione ha un potere tamponante sufficiente;
• il TPE (Tris-fosfato + EDTA).
Il Tris contenuto nel tampone è un sale molto usato nei laboratori. Tampona tra pH 7 e pH 8, un range in cui il
DNA si mantiene molto bene. L’EDTA, invece, è un chelante che sequestra ioni Mg2+ presenti in soluzione e che
vengono utilizzati da enzimi che degradano il DNA (DNAsi). Il suo potere tamponante è nullo rispetto a quello del Tris.
Prima di caricare il gel si aggiunge al campione un colorante con velocità di migrazione nota in modo da seguire
istante per istante l’andamento dell’elettroforesi. Tale colorante è chiamato Loading buffer (LB) ed è costituito da:
•
0.25% Blu bromofenolo, che migra come un frammento di 300 bp in TBE 0.5X;
•
0.25% Xilene di cianolo, che migra come un frammento di 4000 bp in TBE 0.5X;
•
40% (w/v) saccarosio in acqua.
Spesso sul gel, durante il caricamento dei campioni, si riserva un pozzetto in cui verrà messo il marker. Questo è
composto da una miscela di frammenti lineari di DNA i quali migrano nel gel in maniera nota. Ogni marker comprende
un range di separazione. Per esempio l’1Kb contiene venti frammenti che si separato tra 0.1 e 10.0kb. In questo modo,
confrontando il mio campione con il marker, posso dire più o meno che lunghezza ha il mio frammento.
Il principio di funzionamento dell’elettroforesi consiste nel movimento di
particelle cariche negativamente, DNA, RNA o proteine (saturate con
Sodio-dodecilsolfato, SDS), in un campo elettrico verso il polo positivo
(anodo). La separazione, come detto prima, avviene in base alle dimensioni
e quindi alla massa della molecola. La distanza di migrazione è maggiore
per molecole piccole le quali sono trattenute meno dalla maglia
polisaccaridica formata dal gel.
Nell’esecuzione della corsa elettroforetica, si deve applicare una differenza
di potenziale proporzionale alla distanza tra gli elettrodi. In particolare si
applica un voltaggio di 3-5V/cm (calcolato come distanza tra i due
elettrodi). Solitamente si utilizza voltaggio costante per i gel di agarosio e un amperaggio costante per quelli di
poliacrilammide. Il voltaggio applicato deve essere circa 5V/cm perché se fosse maggiore si rischierebbe di scaldare il
tampone di corsa e quindi di danneggiare il DNA, l’RNA o le proteine, a seconda delle molecole con cui si sta
lavorando. Per ovviare a questo vengono usate vaschette che contengono un’elevata quantità di tampone di corsa. Nel
caso di voltaggio costante, l’amperaggio non deve essere un fattore limitante e quindi si posiziona il cursore dei mA
(milli Ampére) al massimo. Nel caso invece di amperaggio costante avremo il cursore del voltaggio al massimo e quello
dell’amperaggio settato sul valore desiderato.
Importante è anche il tempo della corsa elettroforetica che è direttamente proporzionale alla risoluzione. Si può
velocizzare il processo aumentando il voltaggio (o l’amperaggio) ma bisogna fare attenzione a non incorrere nei rischi
detti precedentemente dovuti al calore prodotto per effetto Joule.
62
16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
Per visualizzare le bande elettroforetiche durante e dopo la corsa, viene aggiunta al gel una quantità di 2.5 μl
Bromuro di etidio/100 ml agarosio (lo stock di EtBr e’ di norma 10 mg/ml di H2O).
Ethidium bromide can be added to 0.2-0.5 ug/ml in the gel. L’EtBr è un intercalante del
DNA e dell’RNA e se esposto a luce UV emette fluorescenza. In questo modo sono rese
visibili le bande sul gel che hanno migrato. Per la visualizzazione delle proteine si
preferisce fare un Western blotting in cui esse sono trasferite dal gel a una membrana di
nylon o di nitrocellulosa e successivamente vengono fatte riconoscere da anticorpi
specifici che portano legati enzimi che danno reazioni chimiche e colorimetriche.
I tamponi per l’elettroforesi in genere sono preparati come soluzioni concentrate e conservati a temperatura ambiente.
Tamponi più comuni:
Tampone
Stock concentrato (al litro)
Soluzione finale
Tris-acetato
TAE
50x : 242 g Tris base
57.1 ml acido acetico
glaciale
100 ml 0.5 M EDTA (pH8.0)
5x : 54 g Tris base
27.5 g acido borico
20 ml 0.5 M EDTA (pH8.0)
1x: 0.04 M Tris acetato
0.001 M EDTA
Tris-borato
TBE
0.5x : 0.045 M Tris borato
0.001 EDTA
Note: Tris fornisce il potere tamponante. Acido acetico e acido borico sono gli ioni che permettono il passaggio della
corrente elettrica. EDTA chela il Mg++ bloccando l’azione delle DNasi.
TAE
Perde capacità elettroforetica dopo qualche ora (l’anodo diviene alcalino e il catodo diviene acido). Bisogna
quindi sostituire il tampone o ricircolare quello presente ai compartimenti elettrodici.
TBE
Non perde capacità elettroforetica, ma tende a precipitare nel tempo. In questo modo variano le concentrazioni
saline. TBE può essere utilizzato a mezza forza (0.5x) in quanto il suo potere tamponante è sufficiente. Il
vantaggio di questo tampone è che sopporta corse molto lunghe.
Il tampone per l’elettroforesi viene utilizzato sia per preparare il gel d’agarosio (vedi di seguito anche per le quantità e
le modalità di preparazione) sia per la corsa, riempendo la vaschetta d’elettroforesi stessa, dopo avervi sistemato la
slitta con il gel.
Il tampone di corsa elettroforetica deve essere lo stesso impiegato per la preparazione del gel di agarosio, altrimenti il
gel potrebbe subire delle deformazioni, a causa delle diverse concentrazioni saline (richiama acqua dal tampone di
corsa, espandendosi oppure si compatta espellendo acqua) ed si otterrebbero corse non affidabili (le bande migrano in
modo anomalo).
Preparazione del gel di agarosio (0.8%)
- Sciogliere 0.8 g di agarosio in 100 ml di tampone di corsa
• Pesare 0.8 g di agarosio direttamente in una beuta, aggiungere il tampone di corsa (100 ml).
• Affinché l’agarosio si sciolga, porre la beuta nel forno a microonde a media potenza, di tanto
in tanto estrarla e agitare fino ad ottenere una soluzione limpida
•
Raffreddare leggermente il gel continuando ad agitare la beuta, tenendola sotto un getto
d’acqua fredda e, raggiunta una temperatura, tale che permetta di tenere in mano la beuta
stessa senza scottarsi, aggiungere 2.5 μl di etidio bromuro (10 mg/ml) ogni 100 ml di gel.
In alternativa, sciogliere il gel in 50 ml di tampone e poi aggiungere i rimanenti 50 ml. In questo
modo il gel viene immediatamente portato alla giusta temperatura. La quantità da versare di gel
nella vaschetta di elettroforesi deve dare uno spessore proporzionale alla quantità di DNA da
caricare.
63
16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
Loading buffer (10x)
0.25% Blu di bromofenolo
(migrazione simile a quella di un frammento di 300 bp in TBE 0.5x)
0.25% Xilene di cianolo FF
(migrazione simile a quella di un frammento di 4000 bp in TBE 0.5x)
40% (w/v) saccarosio o glicerolo in acqua.
Il loading buffer aumenta la densità del campione che così resta nel pozzetto, lo colora facilitando il caricamento,
contiene coloranti che migrano a velocità note verso l’anodo. Il loading buffer è preparato ad una concentrazione 10x:
deve essere diluito 10 volte per la concentrazione d’uso.
Caricamento e corsa
−
Preparare il campione in modo tale da diluire il loading buffer 10 volte.
Ad esempio 1μl LB + 9 μl DNA e TE (o acqua). Il volume di caricamento dipende dal tipo di pozzetto e dallo
spessore del gel.
− Caricare evitando di avere bolle nel puntale: queste uscendo spingerebbero il campione fuori
dal pozzetto.
− Applicare una differenza di potenziale proporzionale alla distanza tra gli elettrodi, in
particolare si applica un voltaggio di 3-5 V/cm (calcolato come distanza fra i due elettrodi).
Solitamente si utilizza voltaggio costante per il gel di agarosio e un amperaggio costante per
i gel di poliacrilammide, in quanto le proteine non devono subire sbalzi di temperatura. Nel
caso di voltaggio costante l’amperaggio non deve essere un fattore limitante e quindi si
posiziona il cursore delle mA al massimo. Nel caso invece di amperaggio costante avremo il
cursore del voltaggio al massimo e quello dell’amperaggio settato al valore desiderato.
− La corsa termina quando il primo colorante (blu di bromofenolo) ha percorso i ¾ della
lunghezza del gel
Visualizzazione delle bande
L’etidio bromuro è una molecola fluorescente ai raggi UV che, intercalandosi agli acidi nucleici, ne permette
l’evidenziazione su gel. E’ una molecola potenzialmente cancerogena, come TUTTE le molecole che si intercalano fra
le eliche del DNA, ed è dunque necessario maneggiarla con prudenza Æ in caso entrasse in contatto con la pelle,
lavare abbondantemente con acqua, ma non insaponare, per evitare di solubilizzare la molecola e farla penetrare negli
strati inferiori dell’epitelio. Gli strati più superficiali sono infatto formati da cellule morte che non possono quindi
essere danneggiate da parte di questa molecola.
L’etidio bromuro potrebbe anche esser aggiunto dopo la corsa , ma è molto più pratico aggiungerlo direttamente al
gel. Il limite di rivelabilità: è in genere attorno ai 15-20 ng di DNA
Lo strumento utilizzato per visualizzare le bande è il transilluminatore a UV che permette anche di
fotografare il gel:
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NOTE
Gli acidi nucleici sono carichi negativamente, quindi se sono posti in un campo elettrico migrano verso il polo positivo.
Un’aliquota di campione di DNA viene caricato su un gel di agarosio immerso in un tampone di corsa (una soluzione
conduttiva) e viene applicato un campo elettrico longitudinale al gel. Il campo elettrico fa migrare le molecole di DNA
all’interno del gel, che essendo poroso, rallenta la corsa in base alle loro dimensioni.
Dopo l’estrazione il DNA plasmidico può presentarsi in tre forme (superavvolto, circolare aperto e lineare) a seconda
di come è avvenuta l’estrazione. In generale si osservano solo due bande: superavvolto e circolare aperto. Se è più
evidente la banda della forma superavvolta significa che il protocollo di estrazione del plasmide è delicato e non
danneggia il DNA. La forma circolare aperta prevale se l’estrazione si basa su metodi poco delicati (es. utilizzo di
resine).
La mobilità elettroforetica in un gel di agarosio dipende dal peso molecolare e dalla forma del DNA: nella corsa di un
plasmide si possono trovare perciò tre bande (anche se in realtà la forma lineare è meno probabile). La mobilità
relativa delle tre forme dipende dalla concentrazione di agarosio, dal voltaggio applicato, dal tampone e dalla
concentrazione di etidio bromuro. In generale, la forma superavvolta migra più velocemente delle altre.
Per verificare se le tre bande sono tre forme diverse dello stesso DNA:
- corsa elettroforetica del plasmide
- esposizione agli UV per 5 minuti o all’acido cloridrico 0.1 N (Il DNA viene così rotto e anche la forma
superavvolta diviene circolare aperta)
- corsa elettroforetica dello stesso gel in posizione ortogonale a quella in cui è stata effettuata la prima corsa
elettroforetica.
L’etidio bromuro è una molecola fluorescente ai raggi UV che, intercalandosi agli acidi nucleici, ne permette
l’evidenziazione su gel. E’ una molecola potenzialmente cancerogena, come TUTTE le molecole che si intercalano fra
le eliche del DNA, ed è dunque necessario maneggiarla con prudenza (Æ in caso entrasse in contatto con la pelle,
lavare abbondantemente con acqua, ma non insaponare, per evitare di solubilizzare la molecola e farla penetrare negli
strati inferiori dell’epitelio. Gli strati più superficiali sono infatto formati da cellule morte che non possono quindi
essere danneggiate da parte di questa molecola. L’etidio bromuro potrebbe anche esser aggiunto dopo la corsa , ma è
molto più pratico aggiungerlo direttamente al gel. Il limite di rivelabilità: è in genere attorno ai 15-20 ng di DNA.
La migrazione su gel di agarosio è inversamente proporzionale al Log10 bp. Per separare il DNA in un range di 0.5 –
10.0 Kbp si utilizza agarosio 0.8 % (= 0.8g/100ml). Se si è interessati ad un particolare range di pesi molecolari è
possibile variare la percentuale di agarosio, tenendo conto del fatto che percentuali ≤ 0.3 risultano non maneggiabili e ≥
3% non permettono neppure l’ingresso del DNA nel gel. Un altro modo per separare le bande più pesanti o quelle che
bandeggiano ad una altezza simile consiste nel far correre più a lungo il gel, anche se così facendo si perdono le bande a
minor peso molecolare.
Elettroforesi pulsata
Una normale elettroforesi in gel di agarosio non permette di separare molecole di DNA più lunghe di 25 Kb, quindi per
separare molecole fra 10 e 2000 Kb si può usare l’ elettroforesi pulsata.
I frammenti da separare, anche interi cromosomi, possono essere inseriti nel pozzetto inclusi in blocchetti di agarosio,
dato che una normale estrazione non permette l’isolamento di frammenti di DNA più lunghi di 20-40 Kb.
La strumentazione per questo tipo di tecnica comprende una vaschetta per l’ elettroforesi dotata normalmente di sei
elettrodi che, lavorando accoppiati, si alternano nel creare il campo elettrico. La periodica variazione di direzione del
campo elettrico fa si che le lunghe molecole di DNA cambino continuamente conformazione, allungandosi e
contraendosi, e riescano cosi’ ad entrare nel gel e a muoversi attraverso i pori. Equilibrando in modo corretto gli impulsi
è possibile far procedere diritte le bande sul gel, anche se le singole molecole si muovono a zig-zag.
Più grande è la molecola, maggiore è il tempo impiegato per cambiare conformazione. Questi diversi tempi sono
sfruttati per separare le bande.
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Non molto usato è il sistema dell’ elettroforesi a campi elettrici invertiti, in cui il campo elettrico non cambia
periodicamente solo la direzione, ma anche la polarità.
Parametri critici:
I parametri critici di cui tener conto nell’ elettroforesi pulsata sono il voltaggio, la temperatura, la lunghezza degli
impulsi e la concentrazione di agarosio (in genere 1%). Variando questi parametri è possibile migliorare la risoluzione
delle bande e scegliere il range di peso molecolare da separare. Sarebbe meglio non aggiungere bromuro di etidio, in
quanto può rallentare il processo di rorientamento delle molecole.
Il tampone migliore da usare è il TBE 0,5X, anche se il TAE permette una maggiore mobilità del DNA, perché gli alti
voltaggi usati porterebbero ad un eccessivo riscaldamento del gel.
Dosando opportunamente voltaggio e temperatura è possibile fare in modo che frammenti di una certa lunghezza non
entrino nel gel (trapping). Questo metodo può servire per isolare i frammenti desiderati recuperandoli direttamente dal
pozzetto.
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Escherichia coli
Inoculo e crescita dei batteri
Materiale
-
Terreno di coltura LB liquido:
bacto triptone
10 g
estratto di lievito 5 g
NaCl
10 g
Correggere il pH a 7.2 con NaOH. Portare a volume la soluzione fino a 1 litro con acqua deionizzata. Autoclavare
-
Antibiotico per il quale i batteri inoculati possiedono la resistenza (Æ per una trattazione sugli antibiotici vedere la
sezione “clonaggio”)
1. Versare 5 ml di LB contenente l’antibiotico adatto in un tubo da 12-15 ml.
2. Prelevare con un puntale (o stuzzicadenti) sterile una colonia batterica ed inocularla
nel tubo con il terreno di coltura.
Per inoculare la colonia batterica servono tubi e puntali sterili, accanto ad un ambiente privo di possibilità di
contaminazioni, come possono essere una cappa sterile o, spesso più efficace, un “microambiente” nelle
vicinanze (una decina di centimetri circa) della fiamma creata da un becco bunsen. La paradossale maggiore
sterilità di un lavoro su bancone con un becco bunsen rispetto all’uso di una cappa sterile, si giustifica col
fatto che troppo spesso queste non presentano filtri e ambienti in grado di creare un ambiente effettivamente
privo di residui microbici (ad esempio i filtri non vengono cambiati).
3. Chiudere il tubo e fermare il tappo con un pezzo di nastro adesivo.
Avvitare e poi svitare di circa mezzo giro se tappo a vite; far fare al tappo solo uno scatto se tappo con
chiusura a due posizioni. In questo modo il tubo non è sigillato e consente il passaggio dell’aria,
indispensabile per colture aerobie.
4. Incubare in camera di crescita o/n a 37°C in forte agitazione, per consentire
un’adeguata aerazione. (dove o/n = overnight)
RACCOLTA DEI BATTERI
1. Prelevare 1.5 ml di coltura e porli in un tubo tipo Eppendorf.
Trascorso il tempo di incubazione della coltura, prendere il tubo dalla camera di crescita e risospendere i
batteri che tendono a precipitare sul fondo.Per la risospensione si può semplicemente agitare il tubo (dopo
averlo ben chiuso)
2. Centrifugare a 12000 x g per 30 sec. RT (dove RT = Room Temperature)
Sulla centrifuga di solito sono indicate le rivoluzioni per minuto (rpm): per calcolare 12000 x g si dovrebbe
considerare il raggio del rotore. In realtà, lo scopo di questo passaggio di centrifugazione è solo quello di
separare le cellule batteriche dal mezzo di coltura, quindi è sufficiente centrifugare a massima velocità per
circa 30 sec. Si ottiene così un pellet sufficientemente compatto da poter esser separato dal surnatante, ma
senza del resto impaccare eccessivamente i batteri.
3. Versare il surnatante e capovolgere il tubo su carta.
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E’ importante rimuovere completamente il mezzo di coltura per evitare di diluire le concentrazioni delle
soluzioni successive (che quindi potrebbero diventare meno efficienti) e di lasciare sostanze che in seguito
inibiscano gli enzimi utilizzati. Il risultato è un pellet compatto e biancastro di cellule batteriche.
Semina batterica in piastra
Preparazione delle piastre
Nella preparazione delle piastre si deve considerare il vettore utilizzato: nel caso in esame la selezione delle colonie
trasformate è data dalla resistenza all’ampicillina, mentre le colonie ricombinanti sono riconosciute dalla inattivazione
del gene lacZ per saggio colorimetrico con IPTG e X-gal (substrato della β-galattosidasi). L’IPTG induce il promotore
del gene lacZ il cui prodotto, degradando l’X-gal, rende possibile distinguere le colonie ricombinanti (bianche: gene
lacZ inattivato) da quelle non ricombinanti (blu)
Se necessario, si procede alla preparazione delle piastre con terreno LB selettivo aggiungendo al terreno di coltura LBagar non ancora solidificato, le definite quantità di antibiotico (es. ampicillina), IPTG e X-GAL riportate di seguito:
TERRENO LB SELETTIVO
Componente aggiuntivo
Ampicillina
IPTG
X-GAL
Concentrazione
100 γ (100 μg /ml)
0.5 mM
40 μg/ml
L’antibiotico non può essere aggiunto al terreno prima della sterilizzazione in autoclave perché è termolabile, viene
perciò direttamente versato nella piastra petri tramite per filtrazione.
1. In goccie separate porre sulla piastra 25 μl di antibiotico e 25 μl di IPTG 0.5M.
È utile aggiungere in goccie separate per evitare interazioni tra i solventi ed errori dell’operatore.
2. Aggiungere terreno LB agarizzato.
Il terreno ancora liquido non deve essere né troppo freddo (non permette il miscelamento di antibiotico, IPTG
X-gal), né troppo caldo (rovina l’antibiotico). Come regola generale la temperatura corretta è quella a cui è
appena possibile tenere in mano la bottiglia.
Poiché per ricoprire la piastra servono circa 25 ml di terreno, l’antibiotico e l’IPTG aggiunti vengono diluiti
1000 volte (concentrazione finale: Amp = 100 γ; IPTG = 0.5 mM; X-gal = 80 γ).
L’ampicillina è attiva a concentrazioni pari a 50 –150 γ
Nota: 1 γ = 1 μg/ml.
3. Aggiungere 50 μl di X-gal (20mg/ml) al terreno ancora liquido.
X-GAL non deve mai essere aggiunto direttamente nelle piastre di interesse per non sciogliere la plastica della
piastra, dato che il substrato è sciolto in
dimetilformammide (per cui non è necessaria la
filtrazione sterile).
L’ordine di riempimento per le piastre e’:
- IPTG
- AP 100 γ
- LB 25 ml
- X-Gal
Note: si deve mantenere il suddetto ordine per rispettare le diverse caratteristiche delle varie sostanze in
modo che non vengano alterate interagendo tra loro, e soprattutto per poter così utilizzarle in differenti
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concentrazioni nelle varie occasioni d’uso. Si versano quindi IPTG e Amp in due distinte parti della piastra, si
aggiunge poi il terreno e solo da ultimo l’X-GAL.
Calcolo quantità da aggiungere per piastra per n volume finale di 25 ml:
IPTG : stock 0.5 M, conc. finale 0.5 mM
Æ 25 μl
Amp : stock 100 mg/ml, conc. finale 100 μg/ml Æ 25 μl
X-GAL : stock da 20 mg/ml , conc. finale 40μg/ml Æ 50 μl
4. Ruotare immediatamente la piastra in modo da distribuire uniformemente i tre
composti.
Impilare le piastre e ruotarle attentamente seguendo la rosa dei venti (due rotazioni in senso orario, due in
senso antiorario, su, giù, diagonalmente e infine due rotazioni di assestamento).
5. Lasciare solidificare la piastra aperta sotto cappa.
Le piastre devono perder umidità prima di esser utilizzate, per cui si devono tener sotto cappa sterile o sul
bancone vicino al bunsen (raggio d’azione 10 cm) parzialmente aperte per almeno mezzora; bisogna infatti
attendere che il terreno solidifichi e si raffreddi.
Piastratura (plating)
1. Piastrare su LB agarizzato contenente antibiotico, distribuendo omogeneamente le
cellule.
Il volume di sospensione da piastrare va calibrato in funzione del grado di disidratazione del terreno,per
evitare che l’agar assorba troppa acqua. Quando si esegue la selezione con ampicillina non si piastra tutta la
sospensione a disposizione poiché con alta densità di colonie c‘è inibizione della crescita, a causa delle
sostanze rilasciate dalle cellule uccise dall’antibiotico; inoltre si rischia un aumento del numero di colonie
satelliti.
NOTA: Se si piastra il contenuto di una trasformazione è buona norma usare tre piastre: 2 per diluizioni
differenti (concentrata e diluita) e una di controllo per valutare l’efficienza di trasformazione delle cellule.
Piastrare 100 μl di campione (piastra diluita), centrifugare per 30" la sospensione batterica rimanente (1,1 ml),
versare il surnatante, risospendere in circa l00 μl e piastrare tutto (piastra concentrata circa 10 volte rispetto alla
diluita).
2. Distribuire omogeneamente le cellule sulla superficie del terreno spatolando con
movimento ellittico oppure aggiungendo sfere di vetro e ruotando le piastre fino a
quando il liquido sul terreno risulta assorbito.
3. Incubare o/n a 37 °C (capovolgendo le piastre per evitare la condensa).
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Antibiotici
Filtrare antibiotici: gli antibiotici si sciolgono in acqua o in alcol etilico in genere (Amp Æ acqua) e vanno sterilizzati
tramite filtrazione :
¾ 0.28 μm Æ filtro per virus
¾ 0.45 μm Æ filtro per batteri
In condizioni normali non si lavora con virus quindi, sono sufficienti i filtri per batteri, meno costosi e lo stesso efficaci.
La sterilizzazione in autoclave non è adeguata perché provoca denaturazione del principio attivo dell’antibiotico.
L’ampicillina e’ un inibitore degli enzimi deputati alla sintesi della parete cellulare; e’ disattivata tramite degradazione
all’esterno della cellula (che catalizza idrolisi del β-lattame con concomitante detossificazione dell’antibiotico stesso). I
meccanismi che determinano l’antibiotico resistenza sono differenti in base all’antibiotico stesso, di conseguenza per
rendere delle colonie resistenti si devono attendere tempi diversi durante l’incubazione a 37 °C. Per l’ampicillina si
deve attendere un’ora affinché le cellule si dividano e aumentino la produzione e il livello di espressione della proteina
(β-lattamasi) atta a detossificare all’esterno della cellula l’antibiotico stesso.
L’ampicillina essendo continuamente degradata cala di concentrazione con il tempo, e ciò va a vantaggio delle colonie
non resistenti che si possono sviluppare intorno alla colonia resistente: le colonie satelliti. Il fenomeno diventa tanto più
evidente quanto più lungo è il tempo di incubazione a 37°C (attendere al massimo 12-18 ore dall’inoculazione). Tanto
minore è la concentrazione dell’antibiotico nella piastra e tanto più è probabile la sua degradazione, quindi, la
formazione di colonie satellite o comunque non realmente resistenti (e quindi non trasformate).
La concentrazione ottimale per l’ampicillina è 100-150 γ, ovvero partendo da uno stock di Amp 100 = 100 mg/ml, si usi
una concentrazione di lavoro pari a 100 γ = 100 μg/ml.
Il problema della degradazione dell’ampicillina può essere risolto con l’uso di un altro antibiotico meno sensibile alla βlattasi e quindi più difficilmente degradabile: la carbenicillina. La concentrazione ottimale d’utilizzo è compresa tra 50 e
100 μg/ml.
Antibioticb
Ampicillinc
Stock
conc.
(mg/ml)
Final
conc.
(µg/ml)
4
50
10
20
D-Cycloserine,d in 0.1 M sodium
phosphate buffer, pH 8
10
200
Gentamycin
10
15
Kanamycin
10
30
Kasugamycin
10
1000
5
15
Rifampicin,e in methanol
34
150
Spectinomycin
10
100
Chloramphenicol
sciogliere in metanolo
oppure in etanolo
Nalidixic acid, pH to 11 with
NaOH
Mode of action
Mode of resistance
Bacteriocidal; only kills growing
E. coli; inhibits cell wall synthesis
by inhibiting formation of the
peptidoglycan cross-link
Bacteriostatic; inhibits protein
synthesis by interacting with the
50S ribosomal subunit and
inhibiting the peptidyltransferase
reaction
Bacteriocidal; only kills growing
E. coli; inhibits cell wall synthesis
by preventing formation of Dalanine from L-alanine and
formation of peptide bonds
involving D-alanine
Bacteriocidal; inhibits protein
synthesis by binding to the L6
protein of the 50S ribosomal
subunit
Bacteriocidal; inhibits protein
synthesis; inhibits translocation
and elicits miscoding
β-lactamase hydrolyzes ampicillin before it enters the
cell
Bacteriocidal; inhibits protein
synthesis by altering the
methylation of the 16S RNA and
thus an altered 30S ribosomal
subunit
Bacteriostatic; inhibits DNA
synthesis by inhibiting DNA
gyrase
Bacteriostatic; inhibits RNA
synthesis by binding to and
inhibiting the β subunit of RNA
polymerase; rifampicin sensitivity
is dominant.
Bacteriostatic; inhibits
70
Chloramphenicol acetyltransferase inactivates
chloramphenicol
Mutations destroy the D-alanine transport system
Aminoglycoside acetyltransferase and
aminoglycosidenucleotidyltransferase inactivate
gentamycin; mutations in rplF (encodes the L6
protein) prevent the gentamycin from binding
Aminoglycoside phosphotransferase, also known as
neomycin phosphotransferase, aminoglycoside
acetyltransferase, and aminoglycoside
nucleotidyltransferase; inactivates kanamycin
Mutations prevent kasugamycin from binding to the
ribosome; mutations decrease uptake of
kasugamycin
Mutations in the host DNA gyrase prevent nalidixic
acid from binding
Mutation in the β subunit of RNA polymerase
prevents rifampicin from complexing; rifampicin
resistance is recessive
Mutations in rpsE (encodes the S5 protein) prevent
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Tecnologie biomolecolari
Streptomycin
50
30
Tetracycline,e in 70% ethanol
12
12
translocation of peptidyl tRNA
from the A site to the P site
Bacteriocidal; inhibits protein
synthesis by binding to the S12
protein of the 30S ribosomal
subunit and inhibiting proper
translation; streptomycin
sensitivity is dominant
Bacteriostatic; inhibits protein
synthesis by preventing binding
of aminoacyl tRNA to the
ribosome A site
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spectinomycin from binding; spectinomycin sensitivity
is dominant and resistance is recessive
Aminoglycoside phosphotransferase inactivates
streptomycin; mutations in rpsL (encodes the S12
protein) prevent streptomycin from binding;
streptomycin resistance is recessive
Active efflux of drug from cell
a Data assembled from Foster (1983), Gottlieb and Shaw (1967), and Moazed and Noller (1987).
b All antibiotics should be stored at 4°C, except tetracycline, which should be stored at –20°C. All antibiotics should be dissolved in sterile distilled H O unless
2
c Carbenicillin, at the same concentration, can be used in place of ampicillin. Carbenicillin can be stored in 50% ethanol/50% water at -20 C.
d D-cycloserine solutions are unstable. They should be made immediately before use.
e Light-sensitive; store stock solutions and plates in the dark.
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MINIPREPARAZIONE DI DNA PLASMIDICO
Preparazione di DNA plasmidico tramite lisi alcalina
(MINIPREP MANIATIS)
-
Prelevare 1.5 ml di coltura batterica cresciuta o/n
L’estrazione del DNA plasmidico deve esser effettuata a partire da colture fresche, in quanto l’utilizzo di colture
vecchie potrebbe influenzare negativamente la corretta purificazione del DNA a causa dell’accumulo di metaboliti
secondari. La quantità esatta di coltura batterica prelevata non è importante: si tende tuttavia a riempire
l’eppendorf per massimizzare la quantità di DNA estratto. Non è indispensabile l’utilizzo di una cappa sterile:
l’eventuale presenza di DNasi esogene viene contrastata con l’utilizzo, nelle fasi successive, di EDTA.
-
Centrifugare per 30’’ a 12000 rpm e eliminare il supernatante.
L’operazione può essere effettuata a 4°C o a temperatura ambiente indipendentemente: una volta si operava con
microcentrifughe refrigerate per rallentare il metabolismo cellulare e quindi ridurre l’azione delle nucleasi. Oggi
si ritiene superflua questa operazione e si preferisce operare a temperatura ambiente(23-25°C).Il tempo e la
velocità della centrifugazione devono essere tali da consentire la formazione di un pellet più o meno
compatto(quelli riportati sono valori di centrifugazione indicativi: se il pellet è instabile procedere con
un’ulteriore centrifugazione). Per eliminare il surnatante è sufficiente versare il contenuto del tubo
capovolgendolo e picchiettarlo leggermente, con tappo aperto, su carta cercando di allontanare le eventuali
goccioline di terreno residue: tale operazione consente di non modificare le concentrazioni delle tre soluzioni in
seguito utilizzate.
1.
Risospendere il pellet batterico in 100 µl di Soluzione I.
Per la risospensione si può utilizzare il vortex o il puntale di una pipetta, in quanto le cellule sono ancora integre
ed il DNA è protetto.
2.
Aggiungere 200 µl di Soluzione II.
Mescolare capovolgendo il tubo due o tre volte. In questa fase la soluzione alcalina provoca la lisi delle cellule e
la denaturazione e precipitazione delle molecole di DNA genomico e plasmidico. Quindi, le molecole di DNA
diventano estremamente fragili, per questo si deve mescolare adeguatamente ma evitando azioni troppo energiche
(vortex) per non rompere meccanicamente il DNA stesso. Si ottiene un lisato cellulare viscoso e biancastro.
3.
Aggiungere 150 µl di soluzione III entro 2-3 minuti dall’aggiunta della Soluzione II e
mescolare capovolgendo il tubo due o tre volte
Anche in questo caso non vortexare per non di rompere il DNA. Con l’aggiunta della soluzione III si riporta il
lisato cellulare a pH che consentono la rinaturazione del DNA plasmidico. Il tempo di attesa che precede
l’aggiunta della soluzione III è fondamentale per la separazione del DNA plasmidico dal genomico: il DNA
plasmidico, proprio perché superavvolto e di piccole dimensioni, se mantenuto in condizioni di lisi per un tempo
non superiore ai 3-4 minuti riesce a rinaturare, mentre il DNA genomico e le proteine rimangono intrappolate
irreversibilmente nel complesso formato da potassio e SDS. Nel caso la soluzione II venisse lasciata agire per
periodi più lunghi, il DNA plasmidico sarebbe comunque in grado di rinaturare ma assumerebbe una
conformazione tale da risultare inattaccabile dagli enzimi di restrizione.
4.
Centrifugare a massima velocità per 5 min. e recuperare il supernatante in un nuovo tubo
Questo tempo deve essere rispettato per permettere la sedimentazione dei residui cellulari. Si consiglia di
prelevare una quantità di surnatante non superiore a 500μl in vista dall’aggiunta di un volume doppio di etanolo
nelle fasi successive.
72
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5.
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OPZIONALE : Trattamento con fenolo-cloroformio per eliminare le proteine rimanenti.
Questo trattamento è spiegato in dettaglio più avanti
6.
Precipitare il DNA con due vol. di etanolo (100% v/v) oppure con 0.6 vol. di isopropanolo.
L'etanolo è aggiunto al 100% per ottenere una soluzione finale al 70%. Per esempio: a 100 µl di DNA si
aggiungono 200 µl di etanolo assoluto oppure 60 µl di isopropanolo. In questa fase è necessario capovolgere il
tubo delicatamente: il DNA deve venire a contatto con l’alcol per precipitare.
7.
Centrifugare a 12000 g per 5 min.
Se il DNA è sporco è possibile vedere il pellet bianco sul fondo del tubo. Se è presente una grande quantità di
polisaccaridi il pellet è mucillaginoso.
8.
Rimuovere il supernatante e lavare con etanolo 70% v/v.
Per eliminare l’etanolo capovolgere la provetta aperta e scuoterla leggermente su un pezzo di carta, oppure
effettuare un breve passaggio in centrifuga (30” a massima velocità) per far scendere eventuali goccioline sul
fondo del tubo e quindi aspirarle con una micropipetta.
Il lavaggio con EtOH 70% serve a eliminare i sali rimasti.
Versare nel tubo circa 500 μl di EtOH 70%.
9.
Rimuovere completamente l’etanolo e lasciare seccare all’aria per 10 minuti.
Per eliminare l’etanolo aspirarlo con una micropipetta senza rompere il pellet, eventualmente ripetere una breve
centrifugazione come spiegato al punto 8. E’ importante che il pellet sia completamente asciutto perché la
presenza di tracce di etanolo determina una scarsa risospensione del DNA e, soprattutto, ne provoca la
fuoriuscita dal pozzetto quando si effettua il caricamento su gel di agarosio per un’elettroforesi. Questo passaggio
può esser velocizzato ponendo la provetta in un luogo ben aerato, per esempio in una cappa a flusso laminare.
10. Risospendere il DNA plasmidico in 50 µl di TE pH 8.0.
Si risospende in TE per evitare il pericolo di degradazione del DNA da parte delle DNAsi, infatti, la presenza di
EDTA nel TE garantisce protezione dalle DNAsi
11. Conservare a 4°C.
Se si risospende in acqua si deve conservare a –20°C (la bassa temperatura blocca le DNAsi)
MATERIALI
-
Soluzione I:
50 mM glucosio
25 mM Tris-HCl (pH 8.0)
10 mM EDTA (pH 8.0)
Alla Sol. 1 è possibile aggiungere RNasi (10 mg/ml) per eliminare l’RNA, in quantità di 1 μl per ml di
soluzione.
-
Soluzione II
0.2 N NaOH
1% SDS
73
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-
Soluzione III
5M potassio acetato
acido acetico glaciale
acqua
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60 ml
11.5 ml
28.5 ml
Per ottenere tale soluzione è necessario partire da 29.44 g di potassio acetato in 60 ml di acqua (il che dà una
diluizione 5 M) quindi, aggiungere 11.5 ml di acido acetico glaciale e i rimanenti 28.5 ml di acqua, per
giungere ad un volume di 100 ml di soluzione III. La soluzione finale conterrà potassio 3M e acetato 5M.
NOTE
Secondo la procedura della lisi alcalina, il DNA plasmidico è preparato piccole quantità di diverse colture (1-24) di
batteri contenenti plasmidi. I batteri sono lisati da un trattamento con una soluzione contenente sodio dodecil solfato
SDS ( denatura le proteine batteriche) e NAOH (denatura il DNA plasmidico e cromosomale). La miscela è
neutralizzata con potassio acetato che permette la rinaturazione del DNA plasmidico a differenza di quello genomico.
La maggior parte del DNA cromosomale e le proteine batteriche precipitano-così come l'SDS che forma un complesso
con il potassio- e sono rimosse da una centrifugazione. Il DNA plasmidico rinaturato, che rimane nel supernatante,
viene concentrato per precipitazione in etanolo.
Si possono distinguere tre fasi operative cui riferirsi anche per la descrizione di altri protocolli di estrazione del DNA:
Lisi alcalina: lisi delle cellule batteriche mediante l’uso di una soluzione alcalina che provoca la denaturazione e
la precipitazione di tutte le componenti cellulari, ad eccezione del DNA plasmidico che rimane in soluzione.
2. Trattamento Fenolo:Cloroformio: purificazione del DNA plasmidico estratto mediante un passaggio che prevede
l’uso del fenolo:cloroformio.
3. Precipitazione e risospensione del DNA: operazione che prevede la precipitazione ed il lavaggio del DNA, seguito
da risospensione in TE
1.
L’estrazione del DNA plasmidico deve esser effettuata a partire da colture fresche, in quanto l’utilizzo di colture
vecchie potrebbe influenzare negativamente la corretta purificazione del DNA a causa dell’accumulo di metaboliti
secondari.
La Soluzione I è necessaria per risospendere le cellule e porle nelle condizioni adatte alla successiva lisi. Il glucosio:
rende la soluzione isoosmotica; la sua presenza impone la sterilizzazione in autoclave della soluzione per evitare lo
sviluppo di muffe. Il tampone Tris-Cl (pH 8.0) : fornisce potere tamponante, viene equilibrato con HCl a valori
prossimi ad 8.0 , che è il pH ideale per mantenere in soluzione il DNA nella sua forma a doppio filamento. L’ EDTA
(pH 8.0): è necessario per sequestrare (chelare) gli ioni bivalenti, in particolare impedisce agli ioni Mg2+ di agire da
coenzimi per DNasi, rendendole inattive. Questo garantisce l’estrazione e la conservazione di DNA integro in qualsiasi
condizione di lavoro, tranne nel caso in cui operino enzimi di restrizione. L’EDTA, inoltre, chela gli ioni Ca2+
indebolendo la parete cellulare, evitando l’utilizzo di lisozima (se non in presenza di microrganismi recalcitranti) che
ha lo svantaggio di ricoprire il DNA di impurezze se usato per più di 2 minuti.
FACOLTATIVO: alla Sol. 1 è possibile aggiungere RNasi (10 mg/ml) per eliminare l’RNA, in quantità di 1 μl per ml
di soluzione. Se non si aggiunge RNAsi alla soluzione I e non si tratta con fenolo-cloroformio restano residui di RNA e
proteine. Nella corsa elettroforetica l’RNA tende a trascinare il DNA che così non darà bande nette.
La Soluzione II provoca la lisi alcalina delle cellule. La soluzione fresca ha maggior capacità alcalinizzante, che viene
persa col passare del tempo. L’NaOH permette la lisi alcalina con la quale il DNA genomico e plasmidico denaturano
e precipitano. L’SDS è un detergente che in ghiaccio precipita perdendo di efficacia, quindi, la soluzione II non va
mantenuta in ghiaccio.
L’SDS è di difficile preparazione: a temperature elevate si impacca mentre a basse temperature non si scioglie
completamente. Risulta necessario utilizzare acqua calda a 70°C in cui versarlo mantenendo in agitazione l miscela.
Precipitazione con 0.6 vol di isopropanolo:
L’utilizzo di isopropanolo presenta alcuni vantaggi: vengono aggiunti solo 0.6 vol, permette di ottenere la
precipitazione di volumi maggiori di soluzione e può essere utilizzato a temperatura ambiente.
Di contro però non evapora rapidamente e rende comunque necessario un lavaggio con etanolo per la sua rimozione.
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Tecnologie biomolecolari
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QIAprep Spin Miniprep Kit
-
Prelevare 1.5 ml di coltura batterica cresciuta o/n
-
Centrifugare per 30’’ a 12000 rpm ed eliminare il supernatante.
E’ sufficiente versare il contenuto del tubo e picchiettarlo leggermente, con tappo aperto, su carta.
1. Risospendere il pellet batterico in 250 µl di Buffer P1.
Assicurarsi che sia stata aggiunta l’Rnasi al Buffer P1 (altrimenti l’RNA, trattenuto dalla silice, satura la resina).
2. Aggiungere 250 µl di Buffer P2.
Non lasciar agire per più di 2-3 minuti (la soluzione P2 è la soluzione di lisi alcalina: se fatta agire per tempo
prolungato, il DNA plasmidico rinaturerebbe male e sarebbe inattaccabile dagli enzimi di restrizione.
3. Aggiungere 350 µl di Buffer N3e.
E’ importante mescolare finché la soluzione non diviene torbida, per permettere un’omogenea distribuzione del
tampone di neutralizzazione.
4. Centrifugare per 10 min. a 12000 rpm. Nel frattempo porre la colonna in un tubo da 2 ml.
5. Effettuare il primo trattamento su colonna di silice, trasferendo il supernatante ottenuto
sulla colonna stessa, fornita dal kit.
Questo trattamento sostituisce il trattamento con fenolo:cloroformio e si effettua trasferendo con una
micropipetta, il surnatante ottenuto dalla centrifugazione del punto 4.
6. Centrifugare per 30-60’’. Staccare quindi la colonnina, eliminare il liquido ottenuto e
rimettere a posto la colonnina nel tubo da 2 ml.
Per alcuni ceppi batterici è necessario a questo punto effettuare un lavaggio con 0.5 ml di tampone PB e poi
centrifugare per 30-60 secondi. Questo step è necessario per rimuovere tracce di attività nucleasica quando si
lavora con ceppi come la serie JM, HB101 e derivati, o con qualsiasi filamento wild-tipe che hanno alti livelli di
attività nucleasica o un alto contenuto in carboidrati. Con ceppi come XL-1 Blue e DH5α non è necessario.
7. Lavare la colonna con 0.75 ml di Buffer PE e centrifugare per 30-60’’.
Il Buffer PE è una soluzione di lavaggio che contiene etanolo.
8. Eliminare il Buffer PE e ricentrifugare 1 min. per rimuovere eventuali tracce di etanolo.
È importante rimuovere completamente l’etanolo per diversi motivi:
- il DNA non si stacca dalla resina,
- potrebbe inibire successive reazioni enzimatiche,
- impedirebbe al campione di esser poi utilizzato per un’eventuale elettroforesi, perché nel caricamento
le tracce di etanolo lo farebbero uscire dai pozzetti.
9. Porre la colonnina in un nuovo tubo da 1.5 ml pulito aggiungere 50 µl di TE, direttamente
nella colonna e attendere 5-10 min; centrifugare 1 min.
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Il kit suggerisce di risospendere in tampone EB che contiene Tris HCl 10 mM, pH 8.5, ma non EDTA. Di
conseguenza non è in grado di proteggere il DNA dalle nucleasi, mentre la miscela Tris ed EDTA del TE
garantisce la conservazione del materiale estratto a 4°C per lungo periodo.
Il volume di risospensione può variare dai 30 ai 50 µl; l’importante è tenere conto delle dimensioni della colonna
e assicurarsi che la resina venga interamente bagnata.
NOTE
Il protocollo permette di purificare fino ad un massimo di 20 μg di DNA plasmidico , partendo da 1.5 ml di coltura
fresca in LB, di ceppi di E.coli caratterizzati dalla capacità di mantenere un elevato numero di copie.
La quantità di coltura non è assoluta: dipende dal numero di copie plasmidiche e dalla velocità di crescita batterica.
Per ottimizzare la quantità di batteri da trattare, si può fare l’estrazione con una quantità doppia di batteri ed
osservare qual è il limite massimo della colonna utilizzata (in questo modo è possibile stimare il numero di plasmidi per
batterio conoscendo la concentrazione batterica).
Questo protocollo si distingue dal Maniatis Miniprep perché il DNA viene purificato tramite il passaggio in una
colonnina contenente silice.
Si distinguono due fasi operative:
1. Lisi alcalina: il principio è analogo a quello utilizzato dalla Magnatis Miniprep, ovvero la lisi
cellulare avviene in condizioni alcaline, tutte le componenti cellulari sono denaturate e fatte
precipitare, ad eccezione del DNA plasmidico che rimane in soluzione.
2. Purificazione del DNA su colonnina di silice: il DNA plasmidico viene purificato facendo passare
la soluzione ottenuta nella prima parte attraverso una colonnina piena di silice, in grado di trattenere
gli acidi nucleici.
Come funziona questo kit: Le colonnine contengono silice impaccata. La soluzione contenente il DNA, un’alta
concentrazione di sali e 30-50% etanolo è fatta passare per centrifugazione attraverso la resina. In questo modo si ha il
binding del DNA (dato che a queste condizioni è semidenaturato, esponendo così le cariche negative responsabili del
legame). Il distacco dalla resina è dato dal passaggio di una soluzione a basse concentrazioni di sali e priva di etanolo.
Attivazione della resina con guanidina isotiocianato.
- Oggi i Kit sono ottimizzati per utilizzare volumi uguali delle varie soluzioni.
- Conoscendo la composizione delle soluzioni I, II e III è possibile confrontare il primo protocollo con il
secondo ed eventualmente rifare le soluzioni del kit o creare varianti.
Buffer P1 = Soluzione I miniprep
Buffer P2 = Soluzione II miniprep
Buffer N3 = Soluzione III miniprep (previa aggiunta di guanidina isotiocianato?)
Le soluzioni dei kit sono fornite infatti senza informazioni allegate, ma dall’esperienza di miniprep per
estrazione di DNA e dal protocollo stesso si può inferire senza troppe approssimazioni la loro composizione.
Soluzione P1
Soluzione isosmotica per stabilizzare il DNA conterrà:
* Tris-HCl a pH 8.0, ideale per il DNA
* EDTA: chelante del magnesio
* RNasi: eliminano l’eventuale RNA presente, così che non si saturi subito la resina e si recuperi di conseguenza meno
DNA.
Soluzione P2
Dato il tempo ridotto (max 5’) con cui il tampone può stare a contatto col DNA, si comprende che questa sia la
soluzione per lisi alcalina, contenente NaOH che aumenta il pH fino a 12, e SDS che denatura proteine e DNA.
Ricordiamo infatti che la denaturazione del DNA plasmidico è reversibile solo se non si fa agire troppo a lungo la
soluzione.
Soluzione N3
Già la diversa dicitura fornita dal Kit: “N” invece di “P”, fa intendere come questa sia una soluzione di
Neutralizzazione, ovvero necessaria per ripristinare il pH intorno alla neutralità, salificando il mezzo.
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Magic miniprep
1. Centrifugare 1-1.5 ml di coltura batterica per 30 sec a 12000 rpm e successivamente
scartare il surnatante.
E’ sufficiente versare il contenuto del tubo e picchiettarlo leggermente, con tappo aperto, su carta.
2. Risospendere in 200 μl di Sol. 1
Rnasi devono essere contenute nella soluzione 1 per evitare la saturazione della resina con RNA.
3. Aggiungere 200 µl di Sol. 2
Agitare capovolgendo l’eppendorf. Non lasciar agire per più di 2-3 minuti (la soluzione 2 è la soluzione di lisi
alcalina: se fatta agire per tempo prolungato, il DNA plasmidico rinaturerebbe male e sarebbe inattaccabile dagli
enzimi di restrizione.
4. Aggiungere 200 μl di Sol. 3
Con l’aggiunta della soluzione 3 si riporta il lisato cellulare a pH che consentono la rinaturazione del DNA
plasmidico.
5. Agitare e centrifugare per 5 min.
6. Recuperare il surnatante (circa 500 μl) e versarlo in una nuova eppendorf.
7. Aggiungere 1 ml di resina attivata
Agitare bene perché la resina tende a sedimentare. La quantità di resina influisce sulla quantità di DNA trattenuto
8. Attaccare alla colonnina una siringa da 3 ml senza stantuffo
9. Versare il campione nella siringa, inserire delicatamente lo stantuffo tenendo la colonnina
ben salda alla siringa.
9. Spingere delicatamente lo stantuffo versando il liquido nei rifiuti.
Attenzione ad evitare schizzi e usare i guanti poiché il liquido contiene guanidina tiocianato.
10. Staccare la colonnina dalla siringa e solo successivamente estrarre lo stantuffo.
L’estrazione dello stantuffo quando la colonnina è ancora attaccata alla siringa determina lo spostamento della
resina e del filtro che sta alla base della colonnina con conseguente forte rischio di perdita del campione.
11. Riattaccare la siringa alla colonnina
12. Versare nella siringa 2 ml di Wash Magic e reinserire appena lo stantuffo.
13. Spingere delicatamente lo stantuffo versando il liquido nei rifiuti.
14. Disporre la colonnina su un tubo eppendorf e centrifugare per 30 sec a massima velocità.
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Scopo: rimuovere ogni traccia della soluzione di lavaggio.
15. Disporre la colonnina su un nuovo tubo eppendorf. Aggiungere direttamente nella
colonna 50 μl di TE (sulla resina, ma senza toccarla) e attendere 3-4 min.
16. Centrifugare 30 sec a massima velocità.
Questo passaggio permette di staccare il DNA dalla resina e di recuperarlo nell’eppendorf sospeso in 50 μl di TE.
Se il plasmide fosse di dimensioni maggiori di 10 kb o se si usasse DNA genomico, per la solubilizzazione finale
usare TE preriscaldato a 65° C circa.
17. Conservare a 4°C.
Soluzione 1
50 mM Tris-HCl pH 7.5 (importante che sia 7.5 e NON 8.0)
10 mM EDTA pH 8.0
100 μg/ml RNasi A
Soluzione 2
0.2 N NaOH
1 % SDS
Soluzione 3
1.32 M Potassio acetato pH 4.8
Wash Magic
200 mM
NaCl
20 mM
Tris-HCl pH 7.5
5 mM
EDTA pH 8.0
Diluire 1:1 con EtOH 95%
RIGENERAZIONE DELLA COLONNA
Liberare le colonnine (Promega A7211) dalla resina ponendole in acqua calda in agitazione per 15 min.
(agitazione troppo lenta non fa uscire la resina dalel colonnine, agitazione troppo violenta o troppo
prolungata determina il distacco del filtro interno) Ripetere 3-4 volte rimettendo ogni volta acqua pulita.
L’ultimo lavaggio deve essere eseguito con acqua demineralizzata o deionizzata. Asciugare le colonne che
sono pronte ad un nuovo uso. Il recupero delle siringhe prevede un semplice lavaggio in acqua corrente.
PREPARAZIONE DELLA RESINA
Agitare 25 g di terra di diatomeee (Sigma D5384) in 500 ml di acqua e lasciare sedimentare per 3 ore.
Rimuovere il surnatante contenente le particelle più fini che rimangono in sospensione. Aggiungere acqua a
100 ml e agitare per risospendere la matrice. La concentrazione finale della resina è 250 mg/ml. Conservare
la soluzione con la resina a temperatura ambiente (stabile per diversi anni). Risospendere accuratamente la
soluzione con la resina ogni qualvolta debba essere utilizzata.
Aggiungere 1 ml della soluzione contenente la resina (250 mg/ml) a 25 ml di 4 M guanidina tiocianato, 50
mM Tris-HCl pH 7.0, 20 mM EDTA. La guanidina tiocianato ha la funzione di attivare la resina,
conferendole carica positiva. In tal modo la resina può legare il DNA carico negativamente per attrazione
elettrostatica. Conservare la resina attivata a temperatura ambiente per non più di 6 mesi, dopo i quali perde
le capacità di legame.
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ISOLAMENTO DI DNA GENOMICO DA TESSUTI VEGETALI
Per l’estrazione di DNA genomico da tessuti vegetali non esiste un protocollo universale a causa delle considerevoli
variazioni riscontrabili in specie diverse. Generalmente però le procedure di estrazione del DNA da tessuti vegetali
devono comprendere i seguenti punti:
1- Rottura della parete cellulare per permettere il rilascio dei costituenti cellulari. Questo viene di solito effettuato
meccanicamente congelando il tessuto con azoto liquido e macinandolo con pestello nel mortaio. Congelando
il tessuto infatti lo si rende duro e quindi più fragile. Esistono anche sistemi enzimatici per digerire la parete
ma non sono efficienti;
2- Distruzione delle membrane cellulari per permettere il rilascio del DNA nel tampone di estrazione, e
precipitazione selettiva delel componenti indesiderate (proteine, polisaccaridi etc). Per questo si utilizza SDS o
CTAB;
3- Protezione del DNA dalle nucleasi endogene, che nei tessuti vegetali sono abbondanti, utilizzando EDTA. La
miscela tessuto più tampone può anche essere emulsionata con cloroformio o fenolo per denaturare e separare
le proteine dal DNA;
4- Trasferimento del campione ancora congelato, ma senza azoto liquido, nella eppendorf e aggiunta immediata
del tampone di estrazione. Il DNA infatti, una volta rotta la cellula non deve venire a contatto con quei
componenti (es. polisaccaridi) che si legherebbero ad esso compromettendone così la purezza. Il campione
deve quindi scongelarsi in presenza del tampone che impedisce il legame con altre molecole.
Il tampone di estrazione in genere contiene:
- Tris-HCl pH 8.0
- NaCl
- EDTA
- SDS
- ß- mercaptoetanolo
- Rnasi
Il ß-mercaptoetanolo è un agente riducente utilizzato come antiossidante. Rompe i ponti disolfuro contribuendo alla
denaturazione delle proteine; deve essere aggiunto al momento dell’utilizzo della soluzione perché è volatile.
E’ consigliabile usare come campioni tessuti giovani. Nel caso della foglia prelevare nella parte centrale evitando le
nervature. L’apice fogliare deve essere eliminato perché costituito da cellule vecchie che sono grandi (quindi a parità di
peso in una foglia giovane c’è più DNA), con vacuoli estesi e ricche di sostanze quali polisaccaridi e polifenoli che
creerebbero problemi durante l’estrazione.
Per quanto riguarda i kit commerciali, per esempio i prodotti Qiagen, si ricorda che l’assenza della composizione delle
singole soluzioni rende non verificabile per queste metodiche quanto scritto sopra.
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DNeasy Plant Mini Kit
1. Pesare 100 mg circa di tessuto vegetale.
Il protocollo prevede l’utilizzo di 100 mg di tessuto. Si consiglia però di utilizzarne un eccesso (150-200 mg circa)
perchè con la macinazione si perde molto materiale. Prelevare tessuti giovani (la parte della foglia più giovane è
quella centrale) in cui le cellule devono ancora crescere per distensione e devono ancora formare la parete
cellulare, quindi sono prive di polisaccaridi, polifenoli… e altre sostanze che creerebbero problemi durante
l’estrazione; evitare di prendere la nervatura centrale.
2. Macinare il tessuto in un mortaio con l’aiuto dell’azoto liquido.
Preraffreddare mortaio e pestello in azoto liquido.Aggiungere il campione. Macinarlo fino a ridurlo ad una
polvere finissima mantenendo sempre un po’ di azoto nel mortaio. Questa fase serve per rompere la parete
cellulare. Durante questo passaggio si rischia di perdere fino al 50% del campione. Quest’ultimo e il mortaio
devono essere completamente asciutti, altrimenti l’acqua crea un velo che fa scivolare il pestello sulla superficie
del campione senza che questo si frantumi. E’ importante evitare l’evaporazione completa dell’azoto liquido: il
campione non deve scongelare durante questa fase (evento evidenziato dal cambiamento di colore), altrimenti il
DNA, non più protetto dal nucleo si lega a polisaccaridi in modo irreversibile.
Trasferire il campione prima che scongeli in una eppendorf preraffreddata.
Porre i campioni a –20°C per qualche min per lasciare evaporare l’azoto e fare in modo che il tampone seguente
non congeli.
3. Aggiungere 400 μl di Buffer AP1 e 40 μl di RNasi A 10 mg/ml al campione ancora
congelato.
Non si devono formare degli agglomerati di tessuto perché ostacolano l’azione dei tamponi; qualora si formassero
vanno rimossi o rotti con il puntale della pipetta o vortexando.
4. Incubare il campione per 10 min a 65 °C, invertendo il tubo 2-3 volte durante
l’incubazione.
In questa fase avviene la lisi cellulare. Le RNasi presenti degradano le molecole di RNA rilasciate.
5. Aggiungere 130 μl di Buffer AP2, mescolare e incubare per 5 min in ghiaccio.
Durante questo passaggio precipitano le proteine, i polisaccaridi e il detergente.Se il campione risulta
particolarmente viscoso, centrifugare 5 min alla massima velocità e recuperare il supernatante.
6. Applicare il lisato alla colonna setaccio QIAshredder posta su un tubo di raccolta da 2 ml
e centrifugare 2 min alla massima velocità
In questo modo si rompono i grumi.
7. Trasferire l’eluato in un nuovo tubo tipo eppendorf, evitando di trasferire anche il pellet.
Annotare il volume esatto che viene raccolto per determinare la quantità di tampone da utilizzare in seguito.
Normalmente vengono recuperati circa 450 μl di campione.
8. Aggiungere 1.5 volumi di Buffer AP3 (a cui è stato aggiunto l’ etanolo) e mescolare.
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Massimo Delledonne
La concentrazione finale di etanolo deve essere sempre inferiore al 50 %. Dopo l’aggiunta dell’etanolo potrebbe
formarsi un precipitato che in ogni modo non influenza le seguenti procedure. È possibile che alcune soluzioni
siano costituite solo da buffer AP3 e l’etanolo venga fornito separatamente. Questo per ragioni di convenienza
durante il trasporto dato che l’etanolo è considerato facilmente infiammabile. In questo caso aggiungere 0.5
volumi di Buffer AP3 e 1 volume di etanolo (96%-100%) rispetto al volume iniziale e mescolare.
9. Trasferire 650 μl di campione (compreso l’eventuale precipitato) su una colonna DNeasy
mini posta su di un tubo eppendorf di raccolta.
Non caricare più di 650 μl altrimenti in centrifuga il liquido può uscire.
10. Centrifugare per 1 min ad una velocità ≥ a 8000 rpm ed eliminare l’eluato.
Non si deve centrifugare a 4°C altrimenti aumenta la viscosità della soluzione e l'estrazione viene compromessa
11. Riposizionare il tubo di raccolta svuotato del liquido sotto la colonna e ricentrifugare se è
rimasto del liquido.
12. Porre la colonna DNeasy in un tubo di raccolta nuovo e aggiungere 500 μl di Buffer AW.
Centrifugare per 1 min a 12000 g.
Eliminare l’eluato. Riposizionare la colonna sul tubo.
Questo passaggio serve per lavare il DNA legato alla resina.
13. Aggiungere 500 μl di Buffer AW e centrifugare 2 min. alla massima velocità.
Posizionare la colonna su un tubo tipo eppendorf sterile.
Centrifugare per 20 sec.
Questa centrifugazione permette di asciugare la resina e di eliminare completamente l’etanolo.
14. Aggiungere 100 μl di TE, precedentemente riscaldato a 65 °C e incubare a temperatura
ambiente per 5 min.
Centrifugare per 1 min a 12000 g per eluire il DNA dalla colonna.
Se si desidera ottenere DNA più concentrato é necessario eluire la resina con 50 μl di TE; in questo modo però la
resa è minore. Non eluire con più di 200 μl altrimenti la colonna tocca la soluzione nella eppendorf. Si utilizza TE
a 65°C quando si lavora con DNA genomico o DNA plasmidico ad alto peso molecolare per favorire il distacco
dalla resina. Per bassi pesi molecolari invece si può utilizzare TE a temperatura ambiente.
15. Conservare il campione a 4°C.
NOTE
Gli stock di AP1 e AP3 potrebbero nel tempo precipitare; in questo caso basta ridissolverli ponendo le soluzioni in un
bagnetto a 65°C. AP1 potrebbe diventare giallo durante la conservazione; questo non cambia le sue proprietà. AW è
fornito concentrato: aggiungere etanolo al primo utilizzo.
L’estrazione da matrici vegetali di DNA genomico pulito è particolarmente difficoltosa per la presenza di numerosi
contaminanti (in particolare polisaccaridi) presenti in grandi quantità soprattutto in cellule adulte con vacuoli molto
estesi. DNeasy Plant Mini Kit consente un’agevole estrazione e purificazione di DNA genomico vegetale grazie
all’utilizzo di resine specifiche, che però consentono solo rese standardizzate (limite fisico delle resine). Inoltre, l’uso di
resine non fornisce mai cromosomi integri; perciò il prodotto dell’estrazione va bene per amplificazioni di DNA tramite
PCR, dove utilizzo frammenti non più grandi di 10-15 Kb. Questo protocollo però non va bene per la costruzione di
librerie genomiche dove si utilizzano come vettori fagi di sostituzione, BAC o YAC.
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Metodo microprep Dellaporta
1. Macinare 100 mg circa di campione in mortaio, con azoto liquido
Considerando una certa perdita di materiale nella fase di macinazione, si consiglia di impiegare una quantità di
tessuto superiore, circa 150-200 mg
2. Trasferire il campione in un tubo eppendorf
Conservare i campioni a –20°C che non devono mai scongelare prima dell’aggiunta del tampone EB. Attenzione a
lasciare i tappi dei tubi leggermente aperti in modo che evapori l’azoto liquido rimasto a contatto dei tessuti.
3. Aggiungere 750 µl di EB, 0.5 μl di β-mercaptoetanolo e mescolare bene.
È possibile aggiungere RNasi (2 µl di sol. 10 mg/ml per ogni campione) alla soluzione EB
Il β-mercaptoetanolo è un agente riducente, utilizzato come antiossidante; rompe i ponti disolfuro contribuendo alla
denaturazione delle proteine; deve essere aggiunto al momento dell’utilizzo della soluzione EB in quanto volatile.
Quando si estrae da specie “difficili” si può aggiungere alla soluzione EB anche cisteina 30 mM o PVP 2% (come
concentrazioni finali) per eliminare polifenoli e polisaccaridi.
4. Incubare 10 min. a 65°C.
5. Aggiungere 150 µl di K-acetato 5 M, agitare bene e porre in ghiaccio per 20 min.
Il sale permette la precipitazione delle proteine.
6. Centrifugare a 12000 g per 10 min (mai oltre i 30 min). Prelevare il supernatante (fino a un
massimo di 750 µl)
Se è necessario bilanciare i tubi, impiegare K-acetato.
7.
FACOLTATIVO: Aggiungere 1 volume di fenolo:cloroformio:isoamilico (25:24:1),
mescolare bene, centrifugare 5 min. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo
Eppendorf
8. Aggiungere 1 vol. di isopropanolo e mescolare capovolgendo
9. Centrifugare 1 min., versare il supernatante
10. Lavare il pellet con Etanolo 70% freddo, centrifugare 5 min.
11. Seccare il pellet e risospendere il DNA in 50 µl TE
La fase di risospensione può essere accelerata ricorrendo all’uso di puntali per smuovere il pellet. Per favorire la
risospensione si può porre l’eppendorf a 65°C.
NOTE
Questo protocollo è stato messo a punto per l’estrazione di DNA genomico da tessuti animali. Può essere utilizzato
anche per l’estrazione di DNA da numerose specie vegetali. Il DNA estratto con il metodo Dellaporta rimane integro
come dimensioni, ma trattiene parecchie impurità che ne diminuiscono la qualità.
MATERIALI
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EB
50 mM TRIS pH 8.0
10 mM EDTA pH 8.0
100 mM NaCl
1% SDS
Aggiungere β-mercaptoetanolo (10 mM finale) al tampone utilizzato in giornata (circa 700 μl/l)
Arabidopsis Genomic DNA Microprep Extraction Protocol
(adapted from Dellaporta et.al Plant Mol. Biol Rep 1, 19-21 (1983))
1. Turn H2O bath to 65ºC.
2. Use ~2 floral clusters for each extraction. Grind with a Kontes style pellet pestle (VWR
catalog # KT749521-1590) and high speed drill in 750-800 µL EB in a 1.5 mL eppendorf tube.
Grinding can also be done under liquid N2 but is not necessary.
3. Add 150 µL5M K-acetate, vortex, and incubate on ice for 20 min. Spin at 14K RPM in a
microfuge for 5-10 min.
3b. (optional) Phenol:Chloroform:IAA / Chloroform Extract.
4. Transfer 750-800 µL of supernatant to a new 1.5 mL eppendorf tube and add an equal
volume of isopropanol. Mix well by inverting and immediately spin down nucleic acids by
centrifugation at 14K RPM for 2 min.
4b. (optional) RNase treat for 4-5 min with 1:20 dilution RNAse (10 mg/ml).
4c. Phenol:Choloroform:IAA / Chloroform extract and IPA precipitate.
5. Wash pellet w/ 1mL 80% EtOH. Let pellet air dry for ~10 min. Resuspend pellet in 40-200
µL 1xTE The DNA is ready for PCR at this point.
Steps 6-10 are optional.
6. (optional) Add 3M Na-Acetate to 10%. Mix and add 2.5 volumes 100% EtOH. Incubate at 20C for >10 min. Recover nucleic acids by centrifuging at 14K RPM for 10 min (this step
removes residual chlorophyll and debris that can carry over from step 4.
7. Wash pellet w/ 1mL 80% EtOH. Let pellet air dry for 10 min. Resuspend in 500 µL 1xTE
pH 7.5.
8. Extract with Phenol:Chloroform:IAA (2x) and Chloroform (2x) and EtOH precipitate.
9. Wash w/ 1 mL 80% EtOH. Let pellet air dry for 10 min.
10. Resuspend pellet in 40-200 µL 1xTE.
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16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
Minipreparazione di DNA da pianta
E’ un protocollo non adatto ai tessuti vegetali ricchi in polisaccaridi. Fornisce un DNA di scarsa qualità ma permette il
processamento di numerosi campioni contemporaneamente perché è un sistema veloce. Impiegare se si deve solamente
estrarre DNA da amplificare mediante PCR
1. Prelevare 50-100 mg di tessuto vegetale e porlo in tubo eppendorf da 1.5 ml.
Si può prelevare forando la foglia, usando come stampo il tappo dell’eppendorf stessa.
2. Aggiungere 100 μl di tampone di estrazione e omogeneizzare con l’apposito pestello.
Aggiungere altri 300 μl di tampone.
Se il tampone di estrazione non contiene β-mercaptoetanolo aggiungerne 1 μl. Prima di procedere con il
successivo campione lavare il pestello con etanolo al 100% per evitare contaminazioni. Si porta a volume solo
in seguito alla rimozione del pestello per evitare la fuoriuscita del campione dal tubo.
3.
Centrifugare a 12000 rpm per 10 min.
3a. (FACOLTATIVO) Passaggio in fenolo-cloroformio.
E’ possibile a questo punto effettuare un trattamento fenolo-cloroformio per aumentare la purezza del DNA.
Valutare tuttavia attentamente la necessità di questo passaggio, che se effettuato prolunga sensibilmente il
tempo richiesto per l’esecuzione di questo protocollo di estrazione
4. Prelevare 300 μl del supernatante aggiungere volume uguale di isopropanolo
Prelevando 300 μl si ha una quantità sufficiente di materiale e si standardizza il procedimento: è possibile
lavorare con più campioni.
5. Incubare per non più di 15 min a temperatura ambiente invertendo periodicamente i tubi.
L’incubazione può avvenire anche in ghiaccio poiché, essendo presente isopropanolo, il raffreddamento
favorisce la precipitazione del DNA.
6. Centrifugare per 15 min alla massima velocità.
7. Eliminare il supernatante e lavare il pellet con 100 μl di etanolo 75% (o 70%) freddo.
8. Centrifugare per 30 sec, eliminare l’etanolo e asciugare il pellet.
9. Risospendere in 100 μl di RNasi-TE
L’RNasi si aggiunge solo se non era presente nel tampone di estrazione.
Tampone di estrazione
200 mM tris-HCl pH 8.0
250 mM NaCl
25 mM EDTA
pH 8.0
1% SDS
10 mM β-mercaptoetanolo
OPZIONALE: 2 μg di RNasi
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16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
Estrazione del DNA con CTAB 2X
1.
Prelevare 0.3 g di tessuto fresco e macinare in un mortaio con azoto liquido.
2.
Trasferire tutto in una provetta di tipo eppendorf e aggiungere 2 volumi di soluzione
CTAB 2X.
Ad ogni campione aggiungiamo CTAB 2X in modo tale da rispettare il rapporto:1g di tessuto:2ml di 2X
CTAB. Avendo in ogni eppendorf 300 mg di foglie, dobbiamo aggiungere 600 μl di tampone. Assicurarsi che
il β-mercaptoetanolo sia stato aggiunto alla soluzione CTAB! Se assente, aggiungerlo al volume di soluzione
richiesto.La quantità di mercaptoetanolo da usare è diversa nei vari protocolli ,ma tale che la sua
concentrazione finale sia sempre compresa tra lo 0.2% e il 2% (v/v).
Variante
Questa variante e` particolarmente indicata per ottenere lisati cellulari a partire da cellule animali in cui non
e` richiesta la rottura della parete cellulare, ma solo della membrana citoplasmatica.
•
Prelevare 300 mg di tessuto, aggiungere 2 vol. di soluzione CTAB 2x e
omogenizzare con l’aiuto di un pestello.
Per ottenere una migliore e più facile omogeneizzazione possiamo procedere nel modo seguente:
♦ Aggiungere un’aliquota di CTAB 2X (per es. 200 µl).
♦ Omogeneizzare velocemente utilizzando il pestellino direttamente nel tubo Eppendorf. Porre in
ghiaccio per qualche secondo e aggiungere il volume rimanente di CTAB 2X (400 µl).
Se il tessuto contiene elevate quantità di composti fenolici può essere aggiunto del polivinilpirrolidone all'1%
(MW = 40,000; Sigma) per il loro assorbimento.
3.
Incubare a 65°C per 30 min invertendo il tubo ogni 10 min per evitare la formazione di
aggregati.
Questo passaggio serve per la rottura completa delle cellule e per la denaturazione delle proteine. Il tempo di
incubazione può essere prolungato fino a 60 min in quanto risulta una maggiore produzione di DNA ma se la
produzione massima non è importante, 10 min possono essere sufficienti.
4.
Lasciare raffreddare il campione per circa 30 sec in ghiaccio.
Il raffreddamento serve per evitare che il cloroformio (tossico), che si aggiunge al passaggio successivo,
volatilizzi.
5.
Aggiungere un volume di cloroformio isoamilico (24:1) e agitare vigorosamente.
Il cloroformio isoamilico (24:1) viene usato per rimuovere il CTAB che ha legato i polisaccaridi.
Può essere sostituito dal cloroformio ottanolo,un alcool che solubilizza le membrane e facilita
l’allontanamento dei lipidi di membrana.
6.
Centrifugare 5 min alla massima velocità, prelevare la fase superiore.
I polisaccaridi e il CTAB rimangono nell’interfaccia.
7.
Precipitare il DNA con 0.6 volumi di isopropanolo. Mescolare ed attendere 10-15 min a
T° ambiente o in ghiaccio.
A questo punto si può osservare la presenza della medusa.
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16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
8.
Centrifugare 5 min alla massima velocità, versare il supernatante.
9.
Lavare il pellet con Etanolo 75%, centrifugare 5 min.
10.
Seccare il pellet e risospendere il DNA in 500 µl TE / g di tessuto di partenza.
Se il pellet non si risospende porre qualche minuto a 65°C.
Eventualmente aggiunge Rnasi (1 µl di soluzione 10 mg/ml)
Nel campione dovrebbero esserci circa 100-500 µg DNA / g tessuto. Porre qualche min a 60 °C nel caso in cui
il pellet non si risospendesse.
11.
Conservare a 4 °C.
VARIANTE AL PROTOCOLLO (dopo il punto 7 precendente)
Questa variante viene utilizzata soprattutto quando si hanno molti campioni da analizzare perché permette di
procedere in serie.
8. Prelevare il DNA (medusa) con un uncino di vetro e trasferirlo in un nuovo tubo eppendorf
contente 1 ml di CTAB wash #1: etanolo 76%
0.2M NaOAc pH 4.8-5.2
9. Lasciare l'uncino con attaccato il precipitato all'interno della soluzione per 20 min
Il tempo di permanenza all'interno della soluzione può essere anche più lungo (questo ci permette di trattare anche
molti campioni contemporaneamente) Durante questo lavaggio i residui che potrebbero essere complessati col
precipitato vengono dispersi all'interno della soluzione
10. Trasferire l'uncino con attaccato il precipitato in un nuovo tubo eppendorf contenente 1
etanolo 76%
ml di CTAB wash #2 :
10mM NH4OAc
L' NH4OAc viene considerato superiore al NaOAc nel purificare il DNA.
11. Lasciare l'uncino con attaccato il precipitato all'interno della soluzione per 10 min
12. Asciugare la medusa con un pezzo di carta in modo da far assorbire l'etanolo presente in
eccesso; trasferire poi il DNA in un nuovo tubo eppendorf contenente 500 µl TE / g di
tessuto di partenza
(il DNA dovrebbe staccarsi subito dall'uncino)
12. Conservare a 4°C
In questo periodo il DNA viene disciolto nella soluzione e le eventuali impurezze possono essere eliminate tramite una
centrifugazione. Le rese attese sono nell’ordine dei 100-500μg di DNA per grammo di tessuto vegetale fresco
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Tecnologie biomolecolari
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MATERIALI
-
Tampone CTAB 2X (100 ml)
•
•
•
•
•
•
Tris-HCl pH 8.0
EDTA pH 8.0
NaCl
CTAB
acqua
β-mercaptoetanolo
100 mM
20 mM
1.4 M
2%
a volume
0.2%
10 ml
4 ml
35 ml
2g
1M
0.5 M pH 8.0
4M
20 μl in 10 ml di tampone (leggi note).
La percentuale di CTAB da impiegare dipende dalla quantità di polisaccaridi presenti nel campione.
NOTE
Il detergente anionico CTAB (cetiltrimetilammonio bromuro) e` usato per liberare gli acidi nucleici totali dai
polisaccaridi. Questa procedura generale e` stata usata in una grande varieta` di generi vegetali e tipologia di tessuti. I
vantaggi di questo protocollo sono i seguenti: relativa semplicita` di esecuzione, velocita`, versatilita` di applicazione
per quantita` di campione che vanno da milligrammi a grammi di tessuto;inoltre tale procedura non richiede la
centrifugazione in gradiente di cloruro di cesio. Il protocollo che prevede l'uso del CTAB fu inizialmente usato per i
batteri,e solo successivamente venne modificato in modo tale da ottenere DNA da piante.
Il tampone CTAB è un detergente, irritante e corrosivo, in grado di legare i polisaccaridi e di sottrarli alla soluzione
evitando il legame con il DNA. Rimane in soluzione solo se la concentrazione di NaCl è maggiore di 0.7 M
Il protocollo può essere applicato a numerosi tessuti vegetali quali semi, foglie ed embrioni. Prevede la macinazione del
tessuto e l’aggiunta del tampone CTAB,che permette di raggiungere una concentrazione di NaCl > 0.7 M. Il CTAB si
lega così ai polisaccaridi, evitando il loro legame al DNA. E’ importante aggiungere il tampone prima che il DNA
scongeli e possa venire a contatto con i polisaccaridi.Il successivo trattamento con cloroformio rimuove il CTAB e i
polisaccaridi,ad esso legati. Si dovrebbe ottenere un DNA dell’ordine dei 50 Kb in lunghezza,che è accettabile per la
maggior parte delle applicazioni.
Il tampone è concentrato 2 volte perché operando con tessuti freschi le cellule del campione contengono acqua che
diluisce il tampone stesso. In caso di tessuti secchi (disidratati) si deve pertanto dimezzare la concentrazione della
soluzione CTAB (utilizzare CTAB 1X oppure reidratare il campione prima di aggiungere il tampone). La soluzione
CTAB è stabile per lungo tempo a temperatura ambiente. La concentrazione di lavoro di CTAB dipende dalla quantità
(presunta) di polisaccaridi presenti: in una matrice semplice può andar bene l’1%, mentre per matrici complesse si può
arrivare al 5%. Il β-mercaptoetanolo non deve mai essere aggiunto alla soluzione da conservare ma solo allo stock di
utilizzo in quanto volatile.
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Tecnologie biomolecolari
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CTAB Invertito
E’ impiegato per l’estrazione e purificazione di DNA da matrici complesse
Il tampone CTAB è stato già illustrato precedentemente nei metodi di estrazione del DNA genomico. Si differenzia dal
metodo prima utilizzato per due motivi:
1. la concentrazione del CTAB inferiore 1X anziché 2X. Questo protocollo è infatti preferibilmente impiegato
per campioni secchi, ma è necessario aggiungere un sufficiente volume d’acqua per diluire il tampone stesso;
2. diverso principio di purificazione del DNA. Qui il CTAB porta alla precipitazione del DNA. Infatti, la ridotta
concentrazione di NaCl (0.04 M) nella soluzione di precipitazione fa si che il CTAB leghi il DNA e precipiti
con esso, lasciando in soluzione un surnatante che contiene solamente residui da eliminare. Con il metodo
CTAB 2X, avveniva l’evento opposto: il detergente serviva per precipitare le impurezze da eliminare, e
lasciava in soluzione il DNA.
NOTE GENERALI:
• la concentrazione di lavoro di CTAB dipende dalla quantità (presunta) di polisaccaridi presenti: in una matrice
semplice può andar bene l’1%, mentre per matrici complesse si può arrivare al 5%;
• per i tessuti freschi e ricchi d’acqua è maggiormente adottato il protocollo per l’estrazione del DNA con CTAB
2X.
MATERIALI
- Tampone CTAB (non porre in ghiaccio perché precipita)
20 g/litro di CTAB
NaCl 1.4 M
Tris-HCl 0.1 M
EDTA 20 mM
+ aggiunta di ß-mercaptoetanolo 0.2%
- NaCl 1.2 M
- Cloroformio isoamilico 24:1
- Soluzione di precipitazione CTAB:
5 g/litro di CTAB
NaCl 0.04 M
- Isopropanolo a temperatura ambiente
- Etanolo al 70% v/v
- TE pH 8.0
10 mM Tris-Cl
1mM EDTA
- Microcentrifuga
- Bagnetto a 65°C
PROTOCOLLO
1.
Pesare 100 mg di materiale omogeneo, macinarlo e trasferirlo in un tubo di tipo eppendorf.
In caso di tessuti vegetali, si prediliga la scelta di materiale giovane che a parità di peso possiede un maggior
contenuto di acidi nucleici.
Se il materiale è particolarmente resistente, prima del trasferimento nel tubo e dell’aggiunta del tampone CTAB,
macinarlo con l’ausilio di N liquido in un mortaio preraffreddato.
2.
Aggiungere 500 μl di tampone CTAB (2X) e mescolare.
Assicurarsi che la soluzione di ß-mercaptoetanolo sia stata aggiunta alla soluzione di CTAB.
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Tecnologie biomolecolari
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Dato che la concentrazione finale di CTAB deve essere 1X, se si lavora con un campione secco è necessario
aggiungere un ugual volume di acqua. Se si lavora invece con un campione umido questa operazione non è
necessaria, è l’acqua stessa del campione che diluisce il CTAB.
Mescolare vigorosamente, invertendo ripetutamente il tubo, fino ad ottenere una soluzione viscosa.
3.
Incubare a 65 °C per 30 min.
4.
Centrifugare a 12000 rpm per 10 min.
5.
Prelevare il supernatante e porlo in un nuovo tubo contenente 200 μl di cloroformio
isoamilico.
Mescolare vigorosamente per 30 sec e poi centrifugare a massima velocità per 10 min.
L’aggiunta del cloroformio isoamilico è necessaria per rimuovere il CTAB. Dopo la centrifugazione, gli oli ed il
DNA si trovano nella fase superiore ed il CTAB precipita.
6.
Recuperare il supernatante in un nuovo tubo, annotando il volume.
Il volume dev’esser annotato per effettuare con maggior precisione il passaggio successivo (aggiunta della
soluzione di precipitazione), per cui al fine di misurare il volume, si recuperi il surnatante con una micropipetta.
7.
Aggiungere 2 volumi di soluzione di precipitazione CTAB, mescolare e incubare a
temperatura ambiente per 1h.
Per questo passaggio non sono necessarie particolari precauzioni.
8.
Centrifugare per 5 minuti a 12000 rpm ed eliminare poi il supernatante.
Durante questo passaggio il DNA, legandosi con il CTAB, forma un pellet. Nell’eliminare il surnatante, quindi,
fare attenzione a non staccarlo dal tubo.
9.
Disciogliere il pellet in un tubo con 350 μl di NaCl 1.2 M.
L’aggiunta di NaCl determina la rottura del legame tra DNA e CTAB.
10. Aggiungere 350 μl di cloroformio e mescolare bene.
11. Centrifugare a massima velocità per 10 min.
Si è ora verificata una separazione di fase: il DNA da recuperare è nella fase superiore acquosa.
12. Raccogliere la fase superiore, annotandone il volume, trasferirla in un nuovo tubo.
Nel recuperare la fase superiore, aiutarsi utilizzando una micropipetta p200 e inclinare leggermente il tubo, senza
comunque toccare l’interfaccia, che inquinerebbe i passaggi successivi.
13. Aggiungere 0.6 volumi di isopropanolo.
0.6 volumi di alcool da aggiungere sono da riferire al volume di DNA annotato. Questo passaggio serve per
precipitare il DNA. Non vengono aggiunti sali dato il precedente utilizzo di NaCl.
14. Centrifugare per 10 minuti a massima velocità.
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15. Eliminare il supernatante e aggiungere nel tubo 500 μl di etanolo 70 % v/v.
Mescolare delicatamente e centrifugare per 10 min a massima velocità.
Questo passaggio è un lavaggio del DNA, per cui in questa fase porre attenzione durante il mescolamento, per
non rovinarne la struttura.
16. Eliminare il supernatante e asciugare il pellet quanto più possibile.
Dopo aver eliminato la maggior parte di surnatante, eliminare eventuali gocce sulle pareti con l’ausilio di una
pipetta dopo aver centrifugato nuovamente il tubo (anche aperto) per 30 sec a massima velocità. Quindi,
attendere che il pellet assuma un colore biancastro, indice che si è seccato.
17. Risospendere il DNA in 50 μl di TE.
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16 aprile 2010
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PURIFICAZIONE DEL DNA DA GEL
QIAEXII Agarose Gel Extraction
1.
Pesare una eppendorf vuota.
2.
Pesare la stessa eppendorf con la porzione di gel tagliato e dalla differenza di peso
ottenuta calcolare il peso della banda tenendo presente la relazione per cui 1μl=1mg
Quindi aggiungere 3 volumi di Tampone QX1 per ogni volume di campione (per
frammenti di DNA compresi tra 100 e 4000 bp).
Considerare che per ogni mg di agarosio va aggiunto 1 μl di Tampone QX1.
Se il DNA < 100 basi
Se il DNA > 4000 basi
Æ aggiungere 6 volumi di Tampone QX1.
Æ aggiungere 3volumi di Tampone QX1
Se il gel risulta maggiore del 2%
Æ aggiungere 6 volumi di Tampone QX1.
e 2 volumi di H2O.
3. Risospendere la resina QIAEX II vortexando 30 sec.
La resina tende a precipitare perciò bisogna sospenderla bene in modo da riuscire a prelevarla con una
pipetta. Se non é ben mescolata si rischia di prelevarne troppa oppure troppo poca.
4. Aggiungere 10 μl di QIAEX II e agitare delicatamente per non rompere il DNA,
Se il DNA >10 Kb é meglio mescolare con colpetti sul tubo per limitare le rotture.
La quantità di resina da utilizzare dipende dalla quantità di DNA:
Æ 10 μl di QIAEX II
- ≤ 2 μg di DNA
Æ 30 μl di QIAEX II
- 2-10 μg di DNA
Æ 10 μl di QIAEX II
- per ogni ulteriore 10 μg di DNA
5. Incubare 10 min a 50° per solubilizzare l’agarosio e far legare il DNA alla resina.
Mescolare ogni 2 minuti per risospendere la resina.
Il tampone QXI ha lo scopo di facilitare la solubilizzazione del gel e del DNA (in acqua non avviene
altrettanto bene) e di portare il pH a valori ottimali per il binding della resina.
Controllare che il campione sia di colore giallo.
Il tampone QX1 è un indicatore di pH. Esso rende giallo il campione se questo è a pH ≤ 7.5 o arancio-porpora
se il pH risulta > 7.5. Poiché le particelle della resina QIAEX II sono efficienti solo se il pH del campione
risulta ≤ 7.5 il campione DEVE risultare di colore giallo, altrimenti é necessario aggiungere 10 μl di NaOAc 3
M pH tra 4.8 e 5.2 e mescolare: il colore dovrebbe tornare giallo. Incubare per altri 5 minuti.
6. Centrifugare 30 sec e rimuovere il surnatante delicatamente con una pipetta.
La resina si impacca sul fondo con legato il DNA. Anche se l’agarosio si raffredda, la sua concentrazione ora
è talmente bassa rispetto al totale da non permettere una risolidificazione.
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7. Risospendere il pellet con 500 μl di Buffer QX1, quindi centrifugare 30 sec e rimuovere
il surnatante.
Il buffer QX1 è un tampone di lavaggio.Infatti questo passaggio serve per rimuovere le tracce di agarosio
presenti. nel TBE che non permetterebbero la successiva azione della ligasi. Non è necessario in TAE, anche
se permette di eliminare i residui d’agarosio. Se i frammenti sono di grandi dimensioni una risospensione può
essere uno stress eccessivo che può degradare il DNA, sottoposto ad esempio a trazione da parte di particelle
di resina.Il bromuro di etidio presente nel gel dovrebbe essere rimosso con questi lavaggi.Comunque quello
rimasto che si intercala nel DNA non ha effetto.
8. Lavare il pellet 2 volte con 500 μl di Buffer PE seguendo la seguente procedura:
Aggiungere il tampone PE e risospendere il DNA con il puntale; centrifugare 30 secondi e togliere il Tampone
PE. Ripetere.
Questo step serve per rimuovere i residui di sali.
L’alcool é necessario per impedire il distacco del DNA dalla resina.
9. Lasciare asciugare il DNA all’aria per 10 – 15 min finché il pellet diventa bianco(la
resina da grigia diventa bianca), ovvero evapora tutto l’etanolo.
Si deve essere sicuri che nel DNA non sia più presente l’etanolo; infatti, è questo che tende a far fuoriuscire il
campione dai pozzetti del gel di agarosio mentre si tenta di caricarlo.
È sconsigliabile asciugare creando il vuoto perché si riduce l’efficienza di eluizione.
Se si lavora con 30 μl di QIAEX II é necessario lasciare asciugare all’aria per 30 minuti.
10. Risospendere il DNA con 10 μl di TE senza vortexare, utilizzando un puntale.
È importante che il volume sia ridotto perché il DNA necessita di esser altamente concentrato per ligare
frammento e vettore.
Si ottiene la miglior eluizione quando il pH è compreso tra 7.0 e 8.5.
11. Incubare il campione secondo la tabella sotto riportata:
frammenti di DNA ≤ 4Kb
frammenti di DNA 4-10 Kb
frammenti di DNA > 10 Kb
fortemente legato alla resina).
Æ incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
Æ incubare a 50° per 5 minuti.
Æ incubare a 50° per 10 minuti (per staccare DNA di grosse dimensioni
12. Centrifugare per 30 sec e trasferire con attenzione il surnatante, contenente il DNA, in
un nuovo tubo (almeno 8 μl).
È necessario non trasferire la resina.Conservare il campione a 4°C.
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16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
Geneclean
1.
Tagliare la banda di DNA dal gel di agarosio con un bisturi pulito e affilato
2.
Porre il blocchetto di gel in un tubo eppendorf e pesare la porzione di gel per poter
calcolare il volume di DNA presente sulla base della relazione per cui 1 μl = 1 mg .
pesare la eppendorf contenente il blocchetto di agarosio e sottrarre il peso di una eppendorf vuota
4. Per gel in TAE, aggiungere 3 volumi di NaI
Per gel in TBE, aggiungere 0.5 volumi di TBE modifier e 3 volumi di NaI
I volumi da aggiungere vanno calcolati sulla base dell’ ultimo volume presente nella eppendorf.
Il TBE modifier può essere sostituito da tampone fosfato (vedi composizione soluzione NAI).
5. Porre l’ eppendorf a 55°C per 5 min, invertendo il tubo ogni 2 min per facilitare lo
scioglimento dell’agarosio.
6.
Aggiungere 5 ul di Resina per campioni contenenti fino a 5 ug di DNA, altrimenti
addizionare ai 5 ul 1 ul di resina per ogni 0.5 ug di DNA in più.
Se il volume della soluzione è di 0.5 ml usare un volume minimo di resina di 10 ul, per 1 ml usare come
minimo 20 ul. Prima di prelevare il volume di resina, vortexare il suo contenitore per almeno 1 min.
La resina contiene 1μg di DNA per ogni μl.Utilizzare almeno 5 μl di soluzione
1.
Incubare a temperatura ambiente per 5 min, agitando ogni tanto il tubo per mantenere
sospesa la resina
2.
Centrifugare 5 sec alla massima velocità ed eliminare il surnatante decantando
La silice precipita subito
3.
Lavare per tre volte il pellet risospendendolo in 500 ul di Wash Solution
La quantità di Wash non è così rigorosa. Seccare il pellet con qualche secondo di centrifuga
4.
Eluire il DNA dalla resina risospendendo il pellet in 10 ul di TE, incubare a 55° C per 2-3
min e centrifugare alla massima velocità per 30 sec
5.
Trasferire il surnatante in una nuova eppendorf e conservare a +4°C
Se si vede il DNA insieme a contaminanti(ad esempio la resina)centrifugare di nuovo per pochi secondi e
trasferire il surnatante in una nuova eppendorf
NOTE: nel caso si applichi questa metodica a DNA già in soluzione (per esempio eliminazione CIP da vettore di
clonaggio) aggiungere 3 volumi di NaI al DNA e procedere dal punto 4 del protocollo
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16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
MATERIALE
Soluzione NaI
90.8 g NaI
0.5 g Na2SO3
acqua a 100 ml
(per gel con TBE aggiungere 100 mM NaH2PO4 pH 6.0 alla soluzione NaI, oppure impiegare il TBE modifier
come descritto sopra)
Glassmilk
12.5 g Silice (Sigma cod. 5631) in 25 ml di acqua
Soluzione Wash
50 ml etanolo assoluto
2 ml NaCl 5M
2 ml Tris 0.5 M pH 7.5
0.4 ml EDTA pH 8.0
acqua a 100 ml
Commenti su Geneclean e Qiaex II
Il tampone QX1 contiene Sali caotropici che distruggono i ponti idrogeno fra molecole di zucchero nel polimero di
agarosio, permettendo la solubilizzazione del cubetto. Inoltre, l’alta concentrazione salina dissocia le proteine legate al
DNA dal DNA stesso. Con il tampone QX1 il DNA può essere estratto da gel in TBE senza l’aggiunta di TBE
modifier (vedi Geneclean). Gel in TBE infatti non solubilizzano bene come i gel in TAE a causa della formazione
di complessi fra il borato e i gruppi cis-diol dei monomeri e polimeri di zucchero. I Sali caotropici non possono
solubilizzare questi gel senza l’aggiunta di monomeri di zucchero quali il sorbitolo e il mannitolo per chelare il
boro libero.
Queste resine funzionano come leganti del DNA quando questo eè in una soluzione altamente elettrolitica contenente
grandi anioni (per esempio derivanti dai Sali caotropici) che causano una modificazione nella struttura dell’H2O
forzando il DNA ad essere adsorbito dalle particelle di resina (silice). L’adsorbimento di frammenti di DNA piccoli (<
100 bp) è incrementata aumentando la concentrazione salina, mentre l’adsorbimento di frammenti grandi (> 4 kb) è
aumentata a concentrazioni saline più basse.
La resina di silice è efficiente solo se il pH del campione risulta ≤ 7.5. A valori superiori l’adsorbimento del DNA è
drasticamente ridotto.
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16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
PURIFICAZIONE DEL DNA IN SOLUZIONE
QIAEXII Protocol for Desalting and Concentrating DNA Solutions
1. Trasferire il DNA defosforilato (con un numero di basi compreso tra 100 e 4000) in un
tubo non colorato e aggiungere 3 volumi di Buffer QX1 per ogni volume di campione.
Se il DNA < 100 basi Æ aggiungere 6 volumi di Buffer QX1
Se il DNA > 4000 basi Æ aggiungere 3 volumi di Buffer QX1 e 2 volumi di H2O
2. Controllare che il campione sia di colore giallo dopo l’aggiunta del Buffer QX1.
Buffer QX1 è un indicatore di pH. Esso rende giallo il campione se questo è a pH ≤ 7.5 o arancio-porpora se il
pH risulta > 7.5. Poiché le particelle della resina QIAEX II sono efficienti solo se il pH del campione risulta ≤
7.5 il campione DEVE risultare di colore giallo, altrimenti risulta necessario aggiungere 10 μl do
sodioacetato 3M a pH 5.0 e mescolare: il colore dovrebbe tornare giallo.
3. Risospendere la resina QIAEX II vortexando per 30 sec.
La resina tende a precipitare per il suo alto PM perciò bisogna risospenderla bene in modo da riuscire a
prelevarla con una pipetta. Se non risulta ben mescolata si rischia di prelevarne troppa e di diminuirne la
concentrazione nel tubo.
4. Aggiungere 10 μl di QIAEX II per quantità di DNA < 5 μg, e mescolare dolcemente
per non danneggiare eccessivamente il DNA.
In questa fase è preferibile eccedere con la resina per essere sicuri di legare tutto il DNA.
Per frammenti di DNA > 10 Kb risulta necessario agitare il tubo con il dito.
5. Incubare a temperatura ambiente per 10 min mescolando ogni 2 min per far rimanere
in sospensione la resina.
6. Centrifugare per 30 sec e rimuovere il supernatante, capovolgendo l’eppendorf.
La resina si impacca sul fondo con legato il DNA a cui conferisce un colore grigio.
7. Lavare il pellet 2 volte con 500 μl di Tampone PE (dopo essersi assicurati di aver
aggiunto l’etanolo a 96 – 100%) seguendo la seguente procedura:
Aggiungere il tampone PE e risospendere il DNA con il puntale; centrifugare 30 secondi e togliere il tampone
PE. Ripetere.
8. Lasciare asciugare il Tampone PE rimasto all’aria per 10 – 15 min. finché il pellet
risulta bianco.
È necessario che non ci sia più traccia di etanolo, perché nell’atto di caricamento del DNA nei pozzetti di gel
di agarosio tende a far fuoriuscire il campione. Non asciugare troppo perché diventa difficile la risospensione;
ciò potrebbe causare una diminuzione dell’efficienza di eluizione.
9. Eluire il DNA con 10 μl di TE e mescolare senza vortexare, utilizzando un puntale.
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L’efficienza di eluizione dipende dal pH. La massima efficienza di eluizione si ha a pH compreso tra 7.0 e 8.5.
10. Incubare il campione secondo quanto segue
frammenti di DNA ≤ 4Kb
frammenti di DNA 4-10 Kb
frammenti di DNA > 10 Kb
Æ incubare a temperatura ambiente per 5 min
Æ incubare a 50° per 5 min
Æ incubare a 50° per 10 min (per staccare DNA di grosse dimensioni
fortemente legato alla resina).
11. Centrifugare per 30 sec e trasferire con attenzione il surnatante, contenente il DNA
puro, in un nuovo tubo.
12. Optional: ripetere punto 11 per aumentare la resa di DNA.
13. Conservare il vettore rimasto a 4 °C.
NOTE: Utilizzabile per la purificazione di frammenti di DNA compresi tra 100 bp e 12 Kb in soluzione acquosa senza
eseguire la procedura con fenolocloroformio o etanolo. Questo kit elimina enzimi come la fosfatasi, polimerasi,
endonucleasi, i sali e i singoli nucleotidi.
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Geneclean for DNA solutions
1. Aggiungere 3 volumi di NaI alla soluzione contenente il DNA.
I volumi da aggiungere vanno calcolati sulla base del volume presente nella eppendorf.
2. Aggiungere 5 ul di Resina per campioni contenenti fino a 5 ug di DNA, altrimenti
addizionare ai 5 ul 1 ul di resina per ogni 0.5 ug di DNA in più.
Se il volume della soluzione è di 0.5 ml usare un volume minimo di resina di 10 ul, per 1 ml usare come
minimo 20 ul. Prima di prelevare il volume di resina, vortexare il suo contenitore per almeno 1 min in modo
tale che sia ben risospesa; se la resina è secca aggiungere acqua.a resina contiene 1μg di DNA per ogni
μl.Lavorare almeno con 5 μl di soluzione( 5μg di DNA).
3. Incubare a temperatura ambiente per 5 min, agitando ogni tanto il tubo per mantenere
sospesa la resina
4. Centrifugare 5 sec alla massima velocità ed eliminare il surnatante versando il tubo
La silice precipita subito
5. Lavare per tre volte il pellet risospendendolo in 500 ul di Wash Solution
La quantità di Wash non è così rigorosa. Seccare il pellet con qualche secondo di centrifuga
6. Eluire il DNA dalla resina risospendendo il pellet in 10 ul di TE, incubare a 55° C per
2-3 min e centrifugare alla massima velocità per 30 sec
7. Trasferire il surnatante in una nuova eppendorf e conservare a +4°C
Se si vede il DNA insieme a contaminanti(ad esempio la resina)centrifugare di nuovo per pochi secondi e
trasferire il surnatante in una nuova eppendorf
MATERIALE
Soluzione NaI
90.8 g NaI
0.5 g Na2SO3
acqua a 100 ml
Glassmilk
12.5 g Silice (Sigma cod. 5631) in 25 ml di acqua
Soluzione Wash
50 ml etanolo assoluto
2 ml NaCl 5M
2 ml Tris 0.5 M pH 7.5
0.4 ml EDTA pH 8.0
acqua a 100 ml
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Trattamento con CTAB di DNA in soluzione
E’ possibile procedere alla rimozione dei polisaccaridi anche su DNA precedentemente estratto, mediante trattamento
con CTAB 2X
Portare la soluzione contenente il DNA (già estratto con altri metodi, per cui conservato in TE) ad un volume di lavoro
adeguato (almeno 200 μl), dato che con questo metodo (come già illustrato a proposito del trattamento con
fenolo:cloroformio) si rischia di perdere parte del materiale di partenza.
14. Aggiungere alla soluzione di DNA un egual volume di soluzione CTAB 2x.
15. Incubare per 10 min a 65°C.
16. Aggiungere 1 volume di cloroformio isoamilico (24:1) e miscelare le fasi.
Lo scopo è rimuovere il CTAB e indirettamente i polisaccaridi ad esso legati. Mescolare molto energicamente.
17. Centrifugare per 5 min alla massima velocità.
Così si ottengono due fasi: DNA pulito da una parte e polisaccaridi più proteine denaturate dall’altra.
18. Prelevare il supernatante e precipitare il DNA con 0.6 volumi di isopropanolo e lavaggio
con etanolo 70%.
Non aggiungere il sale (1/10 vol NaOAc 3M pH 4.8) per la precipitazione perché la soluzione di CTAB ha già
apportato sufficienti quantità di sale.
19. Risospendere in 50 μl di RNasi-TE.
Porre qualche min a 60 °C nel caso in cui il pellet non si risospenda bene.
7.
Conservare a 4°C.
Tampone CTAB 2X (100 ml)
− Tris-HCl pH 8.0 100mM
− EDTA pH 8.0
20 mM
− NaCl
1.4 M
− CTAB
2%
− acqua
(Non porre in ghiaccio perché precipita)
− β-mercaptoetanolo
0.2%
10 ml
1 M Tris-HCl pH 8.0
4 ml
0.5 M pH 8.0
35 ml
4M
2g
a volume
20 μl in 10 ml di tampone
Il β-mercaptoetanolo non deve mai essere aggiunto alla soluzione da conservare ma solo allo stock di utilizzo in quanto
volatile
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Trattamento con fenolo:cloroformio
1. Aggiungere alla soluzione contenente il DNA 1 vol. di fenolo:cloroformio:isoamilico
(25:24:1)
La presenza dell’isoamilico serve per semisaturare il cloroformio che altrimenti puro avrebbe la tendenza a
disidratare il campione.
2. Miscelare le due fasi (non vortexare)
Agitare vigorosamente fintanto che il campione non si presenta lattiginoso
3. Centrifugare almeno 3 minuti.
Si formano due fasi distinte: quella inferiore di fenolo-cloroformio e quella superiore con il DNA in soluzione.
L’interfaccia bianca è data dalle proteine denaturate.
4. Recuperare la fase superiore, contenente DNA.
È importante evitare di creare vortici che smuovano lo strato inferiore: tenere la punta della pipetta appena
sotto la superficie dello strato superiore (Fig.1). Ad un certo punto si forma una bolla di soluzione contenente
il DNA. Può essere utile tenere inclinato il tubo in modo da prevedere dove si formerà la bolla (Fig.2). Con il
puntale posizionarsi al centro della bolla e cercare di prelevare il più possibile.
È importante evitare di trasportare nel nuovo tubo tracce di fenolo-cloroformio (visibili in controluce come
“sferette” vetrose), perché queste degraderebbero gli enzimi utilizzati in seguito (polimerasi, enzimi di
restrizione…).
Fig.1
Fig.2
5. Precipitare il DNA con etanolo o isopropanolo
Se inizialmente il DNA era in TE, è necessario aggiungere 1/10 vol. NaOAc 3M pH 4.8 prima di aggiungere i
2 vol. di etanolo assoluto oppure gli 0.6 vol. isopropanolo. Qualora questo trattamento venga condotto
durante la Miniprep (punto 5), la presenza massiccia di sali forniti con la Sol. 3 rende inutile (se non dannosa)
l’aggiunta di 1/10 vol. NaOAc 3M pH 4.8 prima dell’alcool. In questo caso la precipitazione deve essere
condotta come da punto 6 del protocollo Miniprep
NOTE
Il fenolo cloroformio è una soluzione sinergica altamente deproteinizzante che serve per eliminare i possibili
contaminanti del DNA per evitare che interferiscano con i successivi trattamenti, specialmente nel caso in cui si lavori
con enzimi di restrizione. Questo trattamento può essere fatto anche su DNA genomico o comunque su DNA plasmidico
già risospeso in TE. Il passaggio in fenolo:cloroformio deve sempre esser seguito da precipitazione in etanolo assoluto
(o isopropanolo) e successiva risolubilizzazione in TE.
Precauzioni
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Il fenolo:cloroformio è altamente tossico per cui è necessario lavorare sotto cappa chimica.
Bisogna inoltre assicurarsi che i tubi utilizzati siano resistenti alla corrosione da parte del fenolo:cloroformio stesso.
Questa miscela è tossica e deve essere maneggiata con cura sotto cappa chimica.
Precipitazione del DNA
1. Aggiungere al campione di DNA 1/10 vol. di acetato di sodio 3 M pH 4.8-5.2
Se nella soluzione è già presente una simile concentrazione di sale, l’acetato di sodio non va aggiunto
2. Aggiungere 2 vol. di etanolo assoluto freddo oppure 0.6 volumi di isopropanolo (quando i
volumi sono elevati).
1. Centrifugare 10-15 min a 12000 g ed eliminare il surnatante.
2. Lavare il pellet con etanolo 70% v/v ( per eliminare i sali).
Per effettuare questo passaggio è sufficiente versare nel tubo 500 μl circa di etanolo 70 % (non isopropanolo
perché evapora meno facilmente) quindi eliminarli con una micropipetta, eventualmente centrifugare a massima
velocità per 30’’ per riuscire a togliere anche possibili gocce depositate sulle pareti (che, cadendo sul fondo del
tubo, si potranno recuperare tramite ulteriore aspirazione con la pipetta).
5.
Seccare il pellet all’aria e risospende il DNA nel volume desiderato di TE
NOTE:
Il volume di etanolo o isopropanolo necessario deve esser calcolato sul volume risultante dopo l’aggiunta della
soluzione salina, e non sul volume iniziale. L’etanolo assoluto viene conservato a –20°C. Se il DNA è presente ad alte
concentrazioni, può precipitare anche se non viene aggiunta la soluzione salina, tuttavia la presenza dell’acetato di
sodio è indispensabile per consentire la precipitazione nei casi di basse concentrazioni di DNA. E’ quindi buona norma
aggiungerlo sempre, con la sola eccezione del caso in cui sia già presente del sale proveniente da reagenti aggiunti
precedentemente (come per esempio nel caso dell’utilizzo delle soluzioni II e III del protocollo di lisi alcalina). In
quest’ultimo caso si aggiunge solo etanolo o isopropanolo. È importante aggiungere per primo il sale che interagisce
con le cariche del DNA permettendo la precipitazione in alcool. Se il volume di partenza è grande, utilizzare
l’isopropanolo che agisce in quantità minori rispetto all’etanolo.
Acetato di Sodio 3M pH 4.8
408.1 g di acetato di sodio · 3 H2O in 800 ml di H2O
equilibrare il pH a 4.8 con acido acetico glaciale
portare a 1 l con H2O
Trattamento con RNAsi
Il trattamento con RNAsi DNAsi freeè impiegato per la rimozione dell’RNA nelle preparazioni di DNA
Dissolvere RNAsi pancreatica (RNAsi A) ad una concentrazione di 10mg/ml in 10mM di Tris-HCl (pH 7.5) e
15mM di NaCl . Riscaldare a 100°C per 15 min e raffreddare a RT (Room Temperature). L’RNAsi si conserva a
-20°C
Aggiungere 1 µl di RNAsi al campione e incubare 30’ a 37° oppure a temp. ambiente. Nel caso l’RNAsi venga
impiegata durante l’estrazione del DNA, utilizzare le dosi indicate (vedi protocolli estrazione DNA)
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ESTRAZIONE DI RNA DA TESSUTI VEGETALI
RNeasy Plant Mini Protocol (Qiagen)
(for Isolation of Total RNA from Plant Cells and Tissues, and Filamentous Fungi)
1.
Prelevare 100 mg di tessuto. Macinare il campione in azoto liquido. Trasferire il macinato
in un tubo tipo eppendorf.
Quantità superiori non permettono di eliminare completamente il DNA. Non lasciare scongelare il campione.
Proseguire immediatamente con il passo 2 2 perché l’RNA è conservato solo alla temperatura di –80°C.
2. Aggiungere 450 μl di Buffer RLT. Mescolare vigorosamente.
Incubare a 65 °C per 1-3 min può favorire la lisi cellulare, ma tale passaggio è da evitare per campioni con alto
contenuto di amido che gelatinizza ad alte T°.
Il tampone RLT contiene guanidina isotiocianato che ha un elevato potere di distruzione cellulare e di
denaturazione delle proteine, ha proprietà denaturanti e protegge dall’RNasi. I suoi effetti denaturanti sono
incrementati dal β-Met che rompe i ponti disolfuro della conformazione nativa delle proteine. Esiste anche un
altro buffer denominato RLC, che contiene guanidina cloroidrato, meno efficiente nella rottura delle cellule
rispetto RLT . Questo è consigliato nei campioni vegetali quali l’endosperma di mais che contengono metaboliti
secondari in grado di causare la solidificazione del campione in presenza di guanidina isotiocianato.
3.
Applicare il lisato alla colonna setaccio QIAshredder posta su un tubo di raccolta da 2 ml
e centrifugare 2 min. Trasferire l’eluato in un nuovo tubo eppendorf, evitando di
prelevare il pellet formatosi nel tubo di raccolta.
Può essere necessario tagliare il puntale della pipetta per trasferire il lisato sulla colonna. Con questo passaggio
si eliminano i frammenti cellulari e si omogenizza il lisato.
4. Aggiungere 0.5 volumi di etanolo (96-100%) al lisato trasparente e mescolare bene.
L’etanolo, nel quale gli acidi nucleici sono insolubili, può determinare la formazione di una medusa o di un
precipitato oltre a denaturare l’RNA e quindi prepararlo per il legame alla resina nella fase successiva. La
comparsa di una medusa non è prova di buona estrazione, anzi la sua formazione riflette la presenza di proteine
e/o polisaccaridi inglobati nelle maglie del DNA. Questo non dovrebbe comunque influenzare la procedura
RNeasy.
5. Applicare il campione, compreso un eventuale precipitato, su una colonna RNeasy posta
su un tubo di raccolta da 2 ml. Centrifugare 15 sec.
Se il volume del campione supera 700 μl caricare aliquote successive sulla colonna e centrifugare. Riutilizzare lo
stesso tubo di raccolta svuotandolo dopo ogni passo.
Questo è il passaggio fondamentale del protocollo: Secondo le indicazioni del fornitore l’RNA si lega in modo
specifico alla resina della colonna, permettendo la sua purificazione dagli altri componenti della sospensione,
proteine, polisaccaridi, enzimi (es. RNasi che, se presenti, degradano RNA) i quali, non trattenuti da alcun
legame, precipitano con la centrifugazione.
6. Aggiungere 700 μl di Buffer RW1 alla colonna e centrifugare 15 sec. per lavarla. Svuotare
il tubo di raccolta.
7. Trasferire la colonna su un nuovo tubo di raccolta da 2 ml. Aggiungere 500 μl di tampone
RPE alla colonna e centrifugare 15 sec. Svuotare il tubo di raccolta.
In questo caso il tuo di raccolta viene riutilizzato
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Tecnologie biomolecolari
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8. Aggiungere 500 μl di tampone RPE alla colonna e centrifugare 2 min. per asciugare la
resina.
Eliminare poi eluato e tubo di raccolta. È importante asciugare la resina perché i residui di etanolo ostacolano la
risospensione dell’RNA e possono interferire con le successive reazioni. Rimuovere la colonna evitando il contatto
con l’eluato che contiene etanolo.
OPZIONALE. Porre la colonna in un nuovo tubo da 2 ml. Centrifugare 1 min.
In questo modo si elimina con sicurezza ogni traccia di Buffer RPE.
9. Trasferire la colonna in tubo Eppendorf sterile e aggiungere 35 μl di acqua RNasi free.
Centrifugare 1 min. per eluire l’RNA.
L’acqua priva di RNasi è ottenuta trattando l’acqua con DEPC che degrada l’RNasi e autoclavando il tutto per
eliminare DEPC in quanto tossico.
10. Trasferire immediatamente in ghiaccio e poi prontamente a –80°C.
MATERIALE
-
Acqua Rnasi free.
Si ottiene aggiungendo dietilpirocarbonato (DEPC) 0.1% (v/v), lasciando agire per tutta la notte e poi
autoclavando per disattivare DEPC (tossico).
¾
Al tampone RLT o al RLC deve essere aggiunto β-mercaptoetanolo (β-ME) prima dell’uso: aggiungere 10 μl
per 1 ml di RLT o RLC. La soluzione rimane stabile per un mese.
Il tampone RPE è fornito concentrato: prima di utilizzarlo va diluito con 4 volumi di etanolo (96-100%) come
indicato sulla bottiglia per ottenere una soluzione di lavoro.
Il tempo che intercorre tra la raccolta del tessuto e il congelamento dovrebbe esser minimizzato, e una volta
congelato, non si deve permettere al tessuto di riscaldarsi.
Dopo distruzione, tutti gli step del protocollo si eseguono a temperatura ambiente e durante la procedura si
lavora rapidamente.
Ogni centrifugazione dovrebbe essere effettuata in una microcentrifuga a 20-25 °C.
La capacità della colonnina è di 100 ug di RNA
La tabella seguente riporta le caratteristiche della colonna Rneasy e le quantità massime di materiale iniziale
consigliate per diversi organismi.
NOTE
¾
¾
¾
¾
¾
¾
¾
L'integrità e le dimensioni delle molecole di DNA ottenute con questo kit possono essere osservate mediante
elettroforesi su gel di agarosio denaturante. Le bande relative agli RNA ribosomali indicati nella seguente
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Tecnologie biomolecolari
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tabella dovrebbero apparire distinte e marcate come nella figura riportata. Inoltre la banda relativa all'rRNA
28S dovrebbe avere un'intensità circa doppia rispetto a quella del 18S. Se le bande relative agli rRNA non
appaiono nette ma si osserva uno smear dato da piccole molecole è probabile che il campione si sia degradato
durante la preparazione.
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TRIzol Reagent
1. Omogenizzazione del tessuto: può avvenire in due modi:
a) frantumare con il pestellino il tessuto in piccole particelle e lisare le cellule con un
volume di 1 ml di TRIzol Reagent ogni 50-100 mg di tessuto.
N.B: L’operazione deve avvenire sotto cappa.
b) macinare il campione in azoto liquido ed in seguito aggiungere 1 ml di Trizol
Reagent sotto cappa prima che il campione scongeli.
La soluzione TRIzol Reagent, pH 4, contiene fenolo e guanidina isotiocianato 4M e per tale motivo va
utilizzato con attenzione sotto cappa chimica, ha lo scopo di mantenere integro RNA mentre distrugge le
cellule e ne denatura i vari componenti.
Le condizioni acide alterano la solubilità del DNA, che infatti precipita e non si ritrova nel gel finale come
banda ad alto PM, ma non quella del RNA, che resta in soluzione acquosa. La frammentazione del DNA
durante l’omogenizzazione facilita la sua rimozione dalla fase acquosa durante il passaggio della separazione
di fasi.
2. Separazione di fasi: incubare i campioni omogenizzati per 5 min a 15/30°C al fine di
permettere la completa dissociazione dei complessi nucleoproteici. Aggiungere 0,2 ml
di cloroformio (100%) ogni ml di TRIzol Reagent dell’omogenizzazione. Vortexare i tubi
per 15 sec al fine di mescolare la sospensione, quindi incubarli a 15/30°C per 2/3 min.
Il fenolo, presente nella soluzione fornita dal kit, in sinergia con il cloroformio, aggiunto successivamente, ha
un notevole effetto denaturante e determina una separazione in tre fasi della sospensione: una organica
inferiore contenente la maggior parte delle proteine e piccoli frammenti di DNA (da 50 basi a 10 kb), una
intermedia costituita da alcune proteine e da frammenti di DNA di grandi dimensioni, e una fase superiore
acquosa in cui è presente tutto RNA. Il volume di tale fase è circa 60% del volume di TRIzol Reagent usato per
l’omogenizzazione. Dopo i 15 secondi di agitazione si dovrebbe ottenere un a soluzione lattiginosa.
3. Centrifugare a 12000 rpm per 15 min a RT.
4. Trasferire la fase acquosa in un tubo nuovo (conservare anche la fase organica se si desidera
isolare il DNA o le proteine) e aggiungere 0,5 ml di isopropanolo per 1 ml di TRIzol
Reagent usato durante il primo passaggio. Incubare i campioni a 15/30°C per 10 min,
quindi centrifugare a 12000 rpm per 15 min a RT.
RNA precipitato, spesso invisibile prima della centrifugazione, forma un pellet gelatinoso sul fondo
dell’eppendorf, mentre il surnatante viene rimosso.
5. Lavaggio del RNA: lavare il pellet di RNA con 1 ml di etanolo 75 % ogni ml di TRIzol
Reagent dell’iniziale omogenizzazione. Mescolare il campione vortexando e
centrifugare a 7500g per 5 min a RT.
Il lavaggio con etanolo (75%) è un passaggio cruciale. Se fatto bene sul gel non si formerà la banda relativa
all’RNA impuro. L’uso del vortex è consentito nell’estrazione dell’RNA perché questo è a singola elica e corto.
(Nel caso dell’estrazione del DNA non si deve mai vortexare quando si hanno cellule rotte.) Durante questa
operazione il pellet si deve staccare dal tubo e girare al suo interno per migliorare la pulizia del’RNA.
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6. Risospensione del RNA: dopo aver rimosso l’etanolo lasciar asciugare brevemente il
pellet (pochi minuti). Dissolvere RNA in acqua priva di RNasi (33 μl).
(In caso di Elettroforesi) Invece dell’acqua aggiungere una soluzione di SDS 0,5%, pipettando alcune volte e
incubando 10 min a 55/60°C. Asciugare il pellet, ma non lasciarlo seccare completamente perché altrimenti la
risospensione risulterebbe molto difficile (non utilizzare centrifughe sotto vuoto).
L’RNA estratto dai tessuti non è contaminato da un significativo eccesso di DNA, a parte il caso in cui l’RNA
sia estratto da linee cellulari che stiano andando incontro ad apoptosi spontanea o naturale. In questi casi
infatti è spesso contaminato da frammenti di DNA genomico degradato. Allo scopo di eliminare
completamente il DNA qualche ricercatore preferisce trattare l’RNA estratto con DNase RNase-free.
7. Incubare a –80°C per preservare l’RNA
MATERIALI
-
Etanolo 75% (in acqua trattata con DEPC)
Acqua Rnase free.
Si ottiene aggiungendo dietilpirocarbonato (DEPC) 0. 1% (v/v), lasciando agire per tutta la notte e poi
autoclavando per disattivare DEPC (tossico).
NOTE
Tutte le operazioni (eccetto dove indicato) devono essere effettuate a 15-30°C.
Il TRIzol è concepito per estrarre da uno stesso materiale RNA, DNA e proteine, ciascuno in un singolo passaggio. In
pratica il suo uso è divenuto specifico per l’estrazione di RNA, data la semplicità del metodo, il basso costo e gli ottimi
risultati anche su tessuti assai piccoli, come possono esser quelli derivanti da biopsie, etc.
Il metodo TRIzol permette di ottenere un RNA privo di contaminazioni derivanti da Rnasi, DNA e proteine, utile per poi
effettuare sia PCR, analisi Northern blot, etc. Il TRIZOL è tossico: deve essere manipolato sotto cappa, bisogna evitare
il contatto con la pelle e l’inalazione. E’ preferibile conservarlo a 2-8 °C. E’ importante evitare l’introduzione
accidentale di RNasi, in quanto la sua attività è difficile da inibire. Perciò è necessario utilizzare i guanti se non è
presente il TRIZOL.
Composizione e modalità d’azione
Questo protocollo si basa sulla precipitazione (e conseguente eliminazione) del DNA in presenza di fenolo acido,
mentre l’Rneasy plant mini protocol si basa sul LEGAME ALLA COLONNA del solo RNA. Nel TRIzol, le condizioni
acide alterano infatti la solubilità del DNA, che precipita e non si ritrova nel gel finale come banda ad alto PM, ma
non quella del RNA, che resta in soluzione acquosa. La frammentazione del DNA durante l’omogenizzazione facilita la
sua rimozione dalla fase acquosa durante il passaggio della separazione di fasi.
Metodo di isolamento dell’RNA sviluppato da Chomczynski e Sacchi, si basa sul suddetto reagente, pronto all’uso,
costituito da una soluzione monofasica di fenolo e guanidina isotiocianato, che mantiene l’integrità dell’RNA
nonostante la lisi cellulare e la dissoluzione dei componenti cellulari stessi. Anche se a singola elica l’RNA è riavvolto
in loop, per cui deve anche esser denaturato-linearizzato. Questa tecnica dà buoni risultati sia partendo da basse
quantità di tessuto (50-100 mg) e di cellule (5x106) sia, all’opposto, considerandone grandi quantità (> di 1 g di tessuto
e > 107 cellule).
Il metodo “homemade” si basa sull’utilizzo di una soluzione denaturante (Soluzione D) preparata nel seguente modo:
• Sciogliere 250 g di guanidina tiocianato in 293ml di H2O, 17.6 ml di 0.75 M sodio citrato (pH 7) e 26.4 ml di
10% (w/v) di N-lauroylsarcosine (Sarkosil). Porre il tutto a 60°-65° C per facilitare l’omogeneizzazione.
A temperatura ambiente poi aggiungere 0.35 ml di β-mercaptoetanolo a 50 ml della soluzione stock.
Le
concentrazioni finali saranno:
4M guanidina tiocianato
25mM sodio citrato
0.5% Sarkosyl
0.1M mercaptoetanolo
si aggiunge poi 1 ml di soluzione D al campione di tessuto omogeneizzato con N2 liqido o per pestellamento, e si
risospende. Per ogni ml di soluzione D si aggiungono:
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- 100 μl di sodio acetato 2M
- 1 ml di fenolo acido
- 200 μl di cloroformio
si mescola il tutto e si procede con una centrifugazione: la fase acquosa conterrà RNA; si recupera in un nuovo tubo e si
precipita l’RNA con due precipitazioni in isopropanolo. Si procede al lavaggio in etanolo 75% , si centrifuga e si
risospende il pellet (RNA) in H2O-DEPC.
Sodio acetato 2M
Per preparare il sodio acetato aggiungere 16.42 g di sodio acetato anidro in 40 ml di H2O e 35 ml di acido acetico
glaciale. Aggiustare la soluzione a pH 4 con acido acetico glaciale e portare ad un volume di 100 ml con H2O.
Preparazione del Fenolo acido pH 4 e del Fenolo pH 8
Fenolo acido: il fenolo viene acquistato come cristallizzato a T ambiente, quindi viene sciolto portandolo a 65°C e viene
aggiunta acqua. In queste condizioni il fenolo è saturo, non può cristallizzare e si trova a pH 4. L’acqua forma una fase
separata, superiore al fenolo.
Fenolo a pH 8:
a partire da fenolo cristallizzato: lo si scioglie a 65°C, si aggiunge Tris a pH 8, si mescola e si lascia che si formino le 2
fasi (Tris sopra e fenolo sotto); si misura il pH del solo Tris ( che ora sarà, per es., a pH 6 essendosi equilibrato col pH 4
del fenolo); quindi si preleva tale Tris e se ne aggiunge di nuovo finchè il Tris nella fase superiore non ha raggiunto pH
8.
a partire da fenolo acido saturato con acqua: si preleva l’acqua della fase superiore e la si elimina, quindi si aggiunge
Tris a pH 8 e si procede come nel caso precedente.
Solubilizzazione dell’RNA
(utilizzabile anche per DNA genomico).
Questo protocollo è utile per facilitare la preparazione di gel con quantità equilibrata di RNA. Quando si estrae l’RNA
utilizzando il protocollo del Trizol la risospensione dell’RNA in acqua
Rnasi free risulta difficile. Per aumentare la
solubilità dell’RNA è consigliabile fare un ciclo di
congelamento/scongelamento seguendo questo procedimento:
1.
Recuperare l’Eppendorf posta precedentemente a –80°C e porla a 65°C per 5 minuti.
2.
Agitare con il dito per 1 minuto.
3.
Centrifugare per 30 sec. a velocità massima.
Se c’è ancora dell’RNA parzialmente non solubile questo si depositerà sul fondo del tubo, formando un nuovo
pellet. Siamo così sicuri che il liquido contiene RNA completamente solubilizzato.
4.
Prelevare circa il 90% del liquido e trasferirlo in un nuovo tubo avendo cura di non
trasferire il pellet formatosi
E’ sufficiente lasciare nel tuobo una piccola quantità di liquido, 3-4 ul. In questo modo il campione recuperato in
un nuovo tubo ha una concentrazione di RNA omogenea.
NOTE:
Questa procedura è molto importante nel caso si debba utilizzare il campione per analisi Northen blot.
Per avere alta riproducibilità in questa tecnica bisogna caricare nel gel sempre la stessa quantità di RNA totale.
L’operazione diventa difficile se l’RNA è risospeso non uniformemente.
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16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
Preparazione di poli(A)+ RNA mediante cromatografia su oligo(dT)cellulosa.
A differenza del rRNA e del tRNA la maggior parte dell’mRNA eucariote porta un tratto di poli(A) al 3’.Questo
protocollo permette di separare il poli(A)+RNA dal restante RNA totale sfruttando la capacità del tratto di poli(A) di
formare ibridi RNA-DNA stabili con brevi catene di oligo(dT) (generalmente 18-30 nucleotidi) legate covalentemente
ad una matrice di cellulosa che funziona da supporto.
L’RNA totale viene denaturato affinchè le molecole di mRNA espongano le code di poli(A). L’RNA totale viene poi
caricato in un colonna di resina: le catene di oligo(dT) interagiscono con le code di poli(A) dell’mRNA trattenendolo in
colonna. Poiché si formano solo poche coppie dT-A viene aggiunta un’alta concentrazione di sali al tampone iniziale
per la cromatografia per stabilizzarne il legame. Il restante RNA totale eluisce. Infine il poli(A)+RNA viene raccolto per
eluizione utilizzando un tampone a bassa concentrazione salina per destabilizzare gli ibridi poli(T):poli(A).
Il poly(A)+RNA può essere selezionato con la cromatografia in una colonna di oligo(dT) oppure batch elution. La
cromatografia in colonna è il metodo preferito per la purificazione di grandi quantità (>25μg) di poly(A)+RNA non
radioattivo estratto da cellule di mammifero.
Il metodo batch elution viene usato in casi con piccole frazioni di campione per velocizzare il procedimento.
Generalmente il poly(A)+RNA recuperato costituisce solo tra l’1% ed il 10% dell’RNA totale utilizzato. Inltre risulta
molto difficile rimuovere tutto l’RNA non poliadenilato contaminante e per questo si preferiscono fare più passaggi in
colonna.
Esiste un terzo metodo per la purificazione di mRNA che consiste nell’uso di sferette magnetiche a cui sono legate delle
sequenze di oligo(dT). Queste sferette vengono aggiunte alla soluzione dell’RNA totale in modo che le molecole di
poly(A)+RNA vi si leghino. A questo punto appoggio un magnetino ad una porzione di tubo e verso via il liquido
mentre l’mRNA legato alle sferette resta nel tubo.
Il protocollo della cromatografia in colonna risulta un passaggio indispensabile per la preparazione di mRNA da usare
nella costruzione di libreria a cDNA. Consente inoltre di ottenere risultati migliori rispetto all’RNA totale in analisi di
ibridazione, PCR o saggi di protezione da Rnasi.
Preparazione della colonna
1. Lavare la colonna di silice con 10 ml di soluzione 5M di NaOH.
Si possono usare una pipetta Pasteur in vetro silanizzato tappata con lana di vetro silanizzato oppure una piccola
colonna usa e getta con una capacità di 2ml. E importante silanizzare la colonna per evitare che l’RNA si leghi al
vetro o alla plastica.
2. Sciacquare la colonna con acqua.
3. Aggiungere 0.5g di polvere di cellulosa oligo(dT) in 1ml di 0.1M NaOH e versare l’impasto
nella colonna. Sciacquare con circa 10 ml di acqua.
4. Equilibrare la colonna con 10-20 ml di tampone poly(A) loading buffer. Il pH all’uscita
della colonna deve essere intono a 7.5 a fine lavaggio.
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Tecnologie biomolecolari
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Separazione dell’mRNA
5. Scaldare 2 mg circa di RNA totale in acqua a 70°C per 10 minuti. Aggiungere LiCl in
modo da passare dalla concentrazione 10M dello stock a 0.5M della soluzione finale del
campione.
E’ necessario scaldare l’RNA per denaturare qualsiasi struttura secondaria che si potrebbe essere formata. E’
importante non utilizzare una colonna troppo grande in relazione alla quantità dell’RNA da selezionare per evitare
di ottenere l’mRNA finale troppo diluito.. Di conseguenza usare una colonna più piccola per campioni contenenti
fino a 500μg di RNA. Generalmente 1 ml di oligo(T) cellulosa è sufficiente per 5-10 mg di RNA totale.
6. Far passare la soluzione con l’RNA in colonna. Lavare con 1 ml di poli(A) loading buffer
raccogliendo l’eluito.
7. Fare un secondo ed un terzo passaggio in colonna con l’eluito.
L’RNA di partenza viene fatto scorrere tre volte all’interno della colonna per assicurarsi che tutte le molecole
contenenti il poli(A) si leghino alle code di poli(dT) della resina.
8. Lavare la colonna con 2 ml di Middle wash buffer.
9. Eluire l’RNA in un tubo freddo con 2 ml della soluzione 2mM EDTA/0.1% SDS.
10. Riequilibrare la colonna come nel punto 4. Ripetere l’eluizione selettiva del poli(A)+RNA
(vedi passaggi da 5 a 9).
Il secondo passaggio nella poli(dT) colonna permette l’eliminazione delle molecole poli(A)-RNA contaminanti.
Questo passaggio può essere omesso se i possibili contaminanti non creano problemi nelle analisi successive: per
esempio in analisi S1.
11. Precipitare l’RNA eluito raggiungendo una concentrazione salina di 0.3M di Na-acetato
usando uno stock 3M. Aggiungere 2.5 volumi di etanolo e trasferire la soluzione in due
tubi silanizzati SW55.
12. Incubare l’RNA overnight a –20°C o in ghiaccio secco/etanolo per 30 minuti.
13. Centrifugare il campione per 30 minuti a 50,000 rpm (304,000 x g) a 4°C in un rotore tipo
Beckman SW-55.
L’alta velocità di centrifugazione è necessaria affinchè si formi il pellet in quanto l’RNA è molto diluito.
14. Versare l’etanolo e lasciare il pellet a seccare all’aria. Risospendere l’RNA in 150 μl di
tampone TE RNase-free e riunire i campioni.
La qualità dell’RNA può essere verificata scaldando 5 μl del campione a 70°C per 5 minuti ed analizzandoli in un
gel di agarosio all’1%.
MATERIALI:
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Tecnologie biomolecolari
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Middle wash buffer
0.15 M LiCl
10 mM Tris-Cl, pH 7.5
1 mM EDTA
0.1% SDS.
Poly(A) loading buffer
0.5 M LiCl
10 mm Tris-Cl, pH 7.5
1 mM EDTA
0.1% SDS.
Le seguenti soluzioni devono essere trattate con DEPC (Diethylpyrocarbonate) per inibire l’attività Rnasica: acqua, 10
M LiCl, 3 M Na-acetato.
NOTE:
La tecnica presenta dei punti critici. Sono necessarie soluzioni Rnasi free durante la selezione delle molecole
dell’mRNA perché in molti casi le estremità al 5’ del messaggero servono integre. Inoltre non si devono creare rotture
tra il 5’ ed il 3’ in quanto si perderebbe la parte della molecola senza la coda di poli(A) durante l’eluizione dalla
colonna.
Un secondo punto critico riguarda la grandezza della colonna che deve essere scelta in relazione alla quantità di RNA
da selezionare. Infatti la grandezza della colonna determina il volume nel quale viene eluito il poli(A)+RNA. Se il
volume è molto grande l’RNA è molto diluito e ciò ne aumenta la difficoltà di precipitazione.
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Tecnologie biomolecolari
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CLONAGGIO
Il clonaggio implica l’inserzione di un frammento di DNA in una molecola autoreplicante di DNA e la duplicazione
della molecola di DNA ricombinante ottenuta in un’appropriata cellula ospite.
Il modo più semplice per costruire una molecola di DNA ricombinante consiste nell’inserire sequenze di DNA
all’interno di un plasmide o nel cromosoma di un batteriofago (vettori di clonaggio). La sequenza di DNA che viene
inserita nel vettore può provenire da qualsiasi organismo e può essere isolata direttamente dal genoma, da mRNA
oppure da frammenti di DNA precedentemente clonati. Inoltre può essere inserito nel vettore DNA di sintesi.
Descrizione
Parametri critici
Prima di iniziare la manipolazione del DNA bisogna prendere in considerazione numerosi fattori. Questi includono il
numero, il tipo, la concentrazione, la preparazione e la purificazione dei frammenti di DNA, la selezione e lo screening
dei sistemi che possono essere necessari per identificare le molecole di DNA di interesse. Un altro parametro da tenere
in considerazione è il numero di molecole ibride che si desidera ottenere per ogni particolare esperimento. Ad esempio,
quando si vuole generare librerie genomiche o di cDNA è importante ottenere il massimo numero di ricombinanti.
Invece, quando si desidera costruire una o relativamente poche specifiche molecole di DNA non è così importante
massimizzare l’efficienza del clonaggio. Anche se è ovvio che le condizioni sperimentali devono essere tali da favorire
gli eventi di ligatura desiderati, il fattore cruciale per ottimizzare la frequenza di molecole corrette è quello di ridurre il
“background” di eventi indesiderati che potranno poi diventare molecole trasformabili. Una delle maggiori cause di
background coinvolge errori nella preparazione dei componenti a DNA iniziali (es. digestione incompleta con enzimi di
restrizione). Alcuni errori possono essere ridotti, ma mai saranno eliminati. L’altra maggiore causa di background è la
ligatura indesiderata tra molecole nel mix di reazione. Questo problema è superato considerando tutte le possibili vie in
cui i componenti di partenza (e probabili contaminanti) possono unirsi per produrre molecole di DNA che possono
trasformare E.coli. Con appropriati “trucchi”, le principali reazioni secondarie possono spesso essere minimizzate.
Preparazione del DNA e purificazione dei frammenti specifici
L’efficienza nell’ottenere le molecole di DNA ricombinanti desiderate viene notevolmente aumentata con la
purificazione dei singoli componenti attraverso l’elttroforesi su gel di agarosio. I frammenti di DNA purificati sono
relativamente liberi da contaminanti minori che possono causare problemi maggiori di background. Per esempio, se un
vettore plasmidico circolare viene tagliato con un’efficienza del 99% con un solo enzima di restrizione, le molecole non
tagliate (1%) sono molte anche se non possono essere visualizzate con etidio bromuro. Questo background, che è
inaccetabilmente elevato per molti esperimenti, può essere notevolmente ridotto attraverso la purificazione su gel del
DNA linearizzato. La purificazione su gel è estremamente utile nelle situazioni in cui solo uno dei molti frammenti è
necessario o quando i frammenti sono generati da digestioni parziali. Ciò inoltre è utile per rimovere piccoli linker o
altri contaminanti a basso peso molecolare.
I frammenti di DNA separati elettroforeticamente devono essere isolati in un blocco di gel di volume il più possibile
ridotto per poter essere estratti dal gel di agarosio (o acrilammide) mediante le metodiche Geneclean o Qiaex. Queste
due metodiche presentano elevatissimi gradi di purificazione del DNA e fanno si che non sia più così importante usare
agarosio di alta qualità come SeaKem o SeaPlaque che, a differenza di altre preparazioni, contengono pochi inibitori
della DNA ligasi. Il DNA purificato da gel di acrilammide di solito non contiene questi inibitori.
Quantità di DNA
Generalmente non è necessario molto DNA. Per la costruzione di ibridi semplici, circa l’1-10% delle molecole vettore
vengono trasformate nei ricombinanti di interesse. Con un’efficienza normale di trasformazione (106 colonie per
microgrammo di vettore puro), i prodotti della ligatura contenenti circa 1 ng di DNA vettore possono generare da 10 a
100 trasformanti. Questo è più che sufficiente se il background non è un problema. In termini pratici, se i frammenti
iniziali di DNA sono visualizzabili con bromuro di etidio, c’è abbastanza DNA (~ 20 ng) per la maggior parte degli
esperimenti. Questo è vero anche quando si effettua la ligatura direttamente nel blocco di gel (protocollo alternativo)
dove viene usata solo una parte del DNA separato eletroforeticamente. Le costruzioni di molecole ibride difficoltose,
come quelle che coinvolgono estremità piatte (blunt) oppure a tre (1 vettore + 2 frammenti) solitamente richedono più
DNA. In generale, da 15 a100 ng di ogni componente (in una reazione standard di 20 μl) sono solitamente sufficienti
per ottenere i ricombinanti desiderati. L’efficienza del clonaggio può però essere incrementata attraverso l’uso di più
alte concentrazioni dei componenti. Se si prova che ciò è necessario, il DNA può essere concentrato facilmente dopo
averlo estratto dal gel di agarosio.
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Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
Fasi del clonaggio
1) Purificazione del plasmide donatore e del plasmide ricevente (nel caso in cui il frammento debba essere
subclonato in un altro plasmide) e quantificazione del DNA su gel di agarosio
2) Taglio con enzimi di restrizione dei plasmidi
3) Preparazione del frammento da clonare
4) Preparazione del plasmide ricevente (vettore)
5) Quantificazione del frammento purificato e del plasmide ricevente linearizzato
6) Ligatura
7) Trasformazione cellule E. coli: sono utilizzabili due tecniche di trasformazione per inserire il
costrutto all’interno di E.coli:
a. Shock termico:
i. Preparazione cellule competenti mediante trattamento con CaCl2
ii. Shock termico, crescita delle cellule e piastramento
b. Elettroporazione:
i. Preparazione delle cellule
ii. Elettroporazione, crescita delle cellule e piastramento
8) Screening colorimetrico e controllo cellule ricombinanti
Purificazione dei plasmidi e quantificazione del DNA
Il plasmide donatore e il plasmide ricevente sono estratti da E. coli attraverso una delle metodiche descritte
precedentemente. Per plasmide donatore intendiamo un plasmide che porta un frammento di DNAche ora deve essere
spostato (subclonato) in un altro plasmide. In molti casi il frammento da clonare viene ottenuto in modo diverso (per
esempio mediante PCR) e pertanto la sua purificazione per il clonaggio deve essere considerata a partire dalla sua
separazione mediante gel elettroforesi (da separazione elettroforetica e recupero banda da gel in poi)
I plasmidi vengono poi quantificati tramite una corsa su gel di agarosio in modo da determinare le quantità di plasmidi
da tagliare con gli enzimi di restrizione.
Su gel vengono caricati i plasmidi estratti e un marcatore di peso molecolare. Poiché a noi interessa determinare la
quantità di plasmide si confronta l’intensità delle bande ottenute con l’intensità della banda del marcatore
corrispondente per esempio 100 ng (noto questo la stima risulta facilitata).
L’utilità del marker in casi come questo, infatti, è differente: non ha senso confrontare la corsa di frammenti lineari e
plasmidi non tagliati che migrano come molecole superavvolte.
Per poter fare ciò i plasmidi devono essere presenti in quantità tale da permetterne la visualizzazione su gel (limite di
rivelabilità ~ 20 ng).
In ogni pozzetto si potrebbero caricare, ad esempio:
9 5 µl di DNA
9 1 µl di LB
9 4 µl di TE
NOTA: Il TE è stato aggiunto allo scopo di raggiungere il volume di caricamento desiderato, ovvero 10 µl. Poteva
altresì esser aggiunta acqua.
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Tecnologie biomolecolari
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Taglio con enzimi di restrizione
Il plasmide donatore che porta il frammento di DNA da trasferire nel plasmide ricevente viene tagliato con un enzima
di restrizione (es. EcoRI) in modo da liberare il frammento di DNA che, dopo corsa elettroforetica, verrà purificata dal
gel. Il plasmide che deve ricevere il costrutto viene linearizzato con un enzima di restrizione.
PLASMIDE RICEVENTE (es. pBluescript II SK):
enzima di restrizione
plasmide
plasmide ricevente linearizzato
PLASMIDE DONATORE (es. pGEM GAD65):
enzima di restrizione
frammento
plasmide
L’excisione di un frammento, con uno o due enzimi di restrizione, presenta in entrambi i casi vantaggi e svantaggi.
Nel caso di impiego di 1 enzima di restrizione :
•
•
•
Svantaggio: il frammento, una volta exciso, presentando ad entrambe le estremità la medesima sequenza, può
inserirsi nel vettore di clonaggio in un senso o nell’altro (clonaggio non direzionale);
Svantaggio: la linearizzazione del plasmide ricevente con un solo enzima di restrizione rende coesive le
estremità libere che tendono a risaldarsi fra di loro (plasmide si richiude su se stesso);
Vantaggio: nell’aver un solo enzima di restrizione attivo sta nella scelta del tampone specifico, che ovviamente
sarà unico e sicuramente efficace.
Nel caso di impiego di 2 enzimi di restrizione:
•
•
Svantaggio: E’ necessario trovare un unico tampone compatibile con entrambi gli enzimi di restrizione, tale
cioè per cui le attività di entrambi risultino adeguate e possano essere contemporanee. A questo scopo si
possono consultare le interessanti tabelle di compatibilità della NewEnglandBioLab. (www.neb.com).
Lavorare con tamponi non adatti può portare alla formazione di tagli casuali (star activity) è allora consigliato
utilizzare un tampone che dia almeno 50% di efficienza per entrambi gli enzimi; se si è costretti ad utilizzare
un tampone che riduce l’efficienza di un enzima aumentare le unità di quest’ultimo (cfr. tabelle dei cataloghi
delle ditte di produzione dei tamponi). In realtà però questo normalmente non lo si fa, sapendo che un’unità
d’enzima taglia 1 μg di DNA di fago λ in 30’ e che l’enzima è generalmente fornito concentrato 10-20 unità /
μl, poiché normalmente se ne usa almeno 1 μl e questa è già una quantità eccessiva d’enzima per la quantità di
DNA che dobbiamo tagliare. Se non c’è possibilità di utilizzare un tampone che permetta almeno il 50% di
attività per ognuno dei due enzimi (o per necessità operative si vuole utilizzare gli enzimi nei loro tamponi più
adatti) si può prima tagliare il DNA con un solo enzima in presenza del suo tampone idoneo, poi fare un
trattamento fenolo:cloroformio per togliere l’enzima, precipitare con etanolo per togliere il tampone e poi
risospendere in TE. In seguito effettuare il secondo taglio con il secondo enzima (digestioni separate)
Svantaggio: nelle tabelle sopra citate è riportato inoltre il numero di nucleotidi d’"appoggio" minimo affinché
l’enzima sia in grado di agire (nucleotidi fiancheggianti il sito di restrizione che favoriscono il taglio da parte
112
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•
•
Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
dell’enzima); sono dati utili soprattutto nel caso di polilinker in cui la troppa vicinanza tra i siti di restrizione a
volte può rendere inutilizzabile un sito di taglio: nonostante il tampone sia corretto per i due enzimi, uno dei
due non può agire, perché deficiente dell’opportuno “appoggio” perduto dopo il taglio del primo enzima.
Unico sistema per risolvere un simile caso è l’incubazione del plasmide alternativamente prima con l’enzima
che richiede il più basso numero di nucleotidi d’appoggio e poi con l’altro enzima. Queste tabelle risultano
molto utili da consultare, sebbene un valido consiglio è quello di provarne realmente la validità in base alle
proprie condizioni di lavoro e al proprio materiale (studiando la sequenza nucleotidica e le distanze dai vari siti
di taglio).
Vantaggio: le due zone di taglio non essendo compatibili, non manifestano la tendenza a richiudersi;
Vantaggio: è possibile controllare il mantenimento della giusta direzione di clonaggio; infatti in questo caso il
clonaggio può essere direzionale, per cui il frammento si inserisce solo in una certa maniera prevista e voluta
considerando le altre zone del plasmide (es promotore e altre regioni consenso) che possono determinarne
l’attività.
Nota: esistono enzimi che sono isoschizomeri, sono cioè enzimi diversi che riconoscono e tagliano sequenze uguali. Si
possono trovare in commercio enzimi isolati da organismi diversi che però hanno struttura e funzione simile.
Preparazione del frammento
Nonostante in molti casi il frammento da clonare sia ottenuto in modo diverso (per esempio mediante PCR) è frequente
il caso in cui il frammento da clonare si trova già inserito in un vettore plasmidico. In questo caso si parla di
sublconaggio, oppure di mobilizzazione del frammento. Nell’ambito delle esercitazioni del corso di Tecnologie
Biomolecolari è previsto un subclonaggio, per cui la procedura dettagliata in seguito è relativa alla purificazione di un
frammento precedentemente clonato. In questa esercitazione, a partire dalla digestione del plasmide donatore (che cioè
contiene il frammento da mobilizzare in un altro plasmide) viene effettuata una corsa elettroforetica, la quale separa i
due frammenti ottenuti (vettore + frammento da clonare) di diverso peso molecolare. Viene pertanto caricato su gel
tutto il plasmide donatore dato che bisogna recuperare la massima quantità di frammento da utilizzare in seguito.
E’ necessario valutare attentamente il rapporto di dimensione tra il frammento exciso e il vettore che lo conteneva. E’
importante infatti essere sicuri che ciò che si recupera da gel corrisponda al frammento di nostro interesse. Questo non è
problematico se il frammento ha delle dimensioni molto più piccole del corrispondente vettore, poiché correrà molto più
velocemente tra le maglie del gel e sarà evidenziabile verso il fine corsa. Difficile invece è tale valutazione se le
dimensioni dei 2 sono tali che si potrebbe confondere il frammento con il plasmide non digerito, che dà comunque due
bande corrispondenti alle forme superavvolta e circolare aperta. In questo secondo caso è allora consigliabile far correre
a fianco dei nostri digeriti anche il plasmide non digerito, in modo da avere un riferimento sull’avvenuta digestione.
La durata della corsa elettroforetica deve essere tale da separare il frammento da clonare dal vettore.
Dal gel viene poi estratta la banda corrispondente al frammento con uno dei protocolli descritti in seguito (Qiaex oppure
Geneclean). Se necessario, si può concentrare il plasmide donatore (tagliato con gli opportuni enzimi) per precipitazione
in un volume tale da poter essere tutto caricato su gel (vedi Precipitazione del DNA).
Preparazione del plasmide ricevente
La digestione del plasmide ricevente viene controllata caricando una minima aliquota di DNA digerito su gel
d’agarosio. E’ importante che su gel appaia un’unica banda netta. Se su gel appaiono due bande, una dovuta alla
digestione totale ed una a quella parziale, significa che il taglio del plasmide ricevente non è completo, conviene quindi
ripetere la digestione oppure procedere con una nuova estrazione (prolungare il tempo di digestione non serve per
ottenere una digestione totale). Questo perché un plasmide non linearizzato ha un’efficienza di trasformazione molto
superiore a quella dei vettori contenenti il frammento clonato, in quanto i plasmidi ricombinanti conterranno dei nick
nella zona di ligatura che porteranno il plasmide ad assumere una conformazione open-circular. Questo tipo di
conformazione ha infatti un’efficienza di trasformazione inferiore rispetto ai plasmidi superavvolti (non digeriti).
Il plasmide ricevente dovrà successivamente sopportare un ulteriore trattamento che consiste in una defosforilazione
delle estremità per evitare che il vettore si richiuda su se stesso.
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Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
Fosfatasi alcalina
La fosfatasi alcalina catalizza la rimozione del gruppo fosfato al 5’ di molecole di DNA, RNA, ribo e
deossiribonucleosidi trifosfati.
In commercio si trovano duetipi di fosfatasi alcalina:
- CIP fosfatasi alcalina di intestino di vitello
- BAP fosfatasi alcalina batterica estratta da E. coli
Entrambe le fosfatasi richiedono Zn2+ per la loro attività (a differenza della DNasi), oltre a Mg2+ e Tris come gli enzimi
di restrizione. Il tampone CIP perciò, a differenza di quelli degli enzimi di restrizione, ha la peculiarità di contenere
Zn2+. In base alle tabelle della New England BIO Lab, oltre al tampone proprio dell’enzima, i tamponi universali 2,3 e
4 (NEB) che possono essere impiegati per la linearizzazione del plasmide permettono anche l’azione di CIP. Questo è
probabilmente possibile poiché la soluzione di conservazione della fosfatasi contiene una già una alta concentrazione di
zinco.
In passato la procedura seguita era quella di trattare con fenolo-cloroformio il DNA tagliato con gli enzimi di restrizione
per eliminare gli enzimi stessi e precipitare il DNA per eliminare il tampone. Successivamente si proseguiva con il
trattamento con fosfatasi alcalina dopo aver risospeso il DNA. Questa precipitazione aumentava però il rischio di
perdere il DNA. Perciò oggi la fosfatasi viene aggiunta direttamente al campione trattato con gli enzimi di restrizione,
che durante l’attività della CIP continuano (se necessario) la digestione del DNA.
Con la defosforilazione si rimuovono le estremità 5’ fosforilate prodotte dagli enzimi di restrizione ed utilizzate dalle
ligasi per la richiusura dei nick. Questo passaggio è fondamentale in quanto il vettore digerito con gli enzimi di
restrizione presenta spesso delle estremità coesive, che successivamente potrebbero essere usate dalla ligasi per unire
due plasmidi o richiudere il plasmide su se stesso dando luogo ad un vettore privo del frammento di interesse. Con esso
in seguito si andrebbe a trasformare E. coli ottenendo colonie non ricombinanti. Defosforilando le estremità 5’ del
vettore, la ligasi può agire solo unendo un vettore con un frammento che fornisce le estremità fosforilate. Il fosfato
mancante su entrambi i filamenti al 5’ viene ripristinato da E. coli in seguito alla trasformazione, al momento della
divisione cellulare (duplicazione del plasmide).
Dopo la defosforilazione è necessaria la rimozione completa della fosfatasi per evitare la defosforilazione del
frammento una volta che questo viene aggiunto al plasmide ricevente per la ligatura. CIP è sensibile al calore, per cui
bastano 60 minuti a 65°C per degradarla, mentre per eliminare BAP si necessita di un trattamento deproteinizzante con
fenolo/cloroformio, seguito da una precipitazione in etanolo per recuperare il DNA, puro, come serve alla ligasi. Oggi si
preferisce ricorrere a purificazioni con resine che rendono questa procedura più semplice e soprattutto più riproducibile.
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16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
Esempio in figura
Quantificazione del DNA
Il plasmide e il frammento vengono quantificati su gel di agarosio. Il frammento nella fase di ligatura deve essere
presente in eccesso in modo tale da ridurre la formazione di vettori non ricombinanti (causati dall’unione di due vettori
o dalla richiusura di un vettore su se stesso), che ridurrebbe la quantità di vettore disponibile per il frammento. Infatti, i
due vettori appaiati non sarebbero soggetti all’azione della ligasi, in quanto defosforilati, e perciò non verrebbero
trasferiti in E. coli.
Quantificazione → Vettore : Frammento = 1 : 2
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16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
Il rapporto si riferisce al numero di molecole e non alla quantità di DNA; si avrebbe corrispondenza tra i due rapporti
solamente se il frammento ed il plasmide ricevente avessero le stesse dimensioni. Assumendo ad esempio di avere un
frammento di 1.2 kbp e un vettore di 1 kbp, usare per esempio 240 ng di frammento e 100 ng di vettore.
Ligatura
Viene assemblata una reazione di ligatura del frammento e del vettore, utilizzando i corretti rapporti
quantitativi precedentemente determinati. La ligatura viene effettuata mediante l’enzima DNA
ligasi.
DNA ligasi
La ligasi catalizza la formazione di legami fosfodiesterici tra il terminale 5’ fosfato e il 3’ idrossiterminale in molecole
di DNA a doppio filamento.
Vi sono due tipi di ligasi:
- ligasi di E.coli
- ligasi del fago T4 (PM 68000)
questi enzimi differiscono per due importanti proprietà:
fonte di energia:
- ligasi T4 usa ATP
- ligasi di E.coli usa NAD+
estremità unite:
- ligasi T4 unisce sia estremità piatte che estremità coesive
- ligasi di E.coli unisce solo estremità coesive
La ligasi agisce su tre tipi diversi di rotture:
- riparazione della rottura di un filamento del DNA ds (double strand)
- unione di frammenti di DNA a doppio filamento con estremità piatte
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16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
- unione di frammenti di DNA a doppio filamento con estremità coesive
LIGATURA INTERMOLECOLARE ED INTRAMOLECOLARE
Le concentrazioni assolute e relative dei frammenti di DNA di inserzione influenzano le frequenze degli eventi di
ligatura.
Ligatura intramolecolare: l’estremità di una molecola di DNA si unisce all’altra estremità della stessa molecola.
Ligatura intermolecolare: l’estremità di una molecola di DNA si unisce ad un’altra molecola di DNA. La ligatura
intermolecolare può verificarsi tra molecole delle stesso tipo (vettore-vettore, frammento-frammento) o tra molecole di
diverso tipo (vettore-frammento).
La costruzione di molecole ibride coinvolge nella maggior parte dei casi eventi di ligatura intermolecolare seguiti da un
evento finale intramolecolare per generare una molecola di plasmide circolare.
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Eventi di ligatura intramolecolare
Gli eventi intramolecolari sono la fonte principale di background negli esperimenti di clonaggio poiché la richiusura del
vettore su se stesso genera molecole di DNA che producono cellule di E. coli trasformate ma senza frammento.
Comunque, poiché la ligatura intramolecolare può avvenire solo se le estremità della molecola sono coesive o piatte,
essa può essere completamente eliminata usando molecole con estremità eterologhe. Ciò è ottenuto tagliando il vettore
con due enzimi di restrizione che producono estremità incompatibili. In situazioni in cui il vettore deve essere tagliato
con una singola endonucleasi di restrizione l’unione intramolecolare può essere evitata rimovendo entrambi i 5’ fosfati
di ogni molecola con la fosfatasi alcalina. Queste molecole di DNA defosforilate possono essere legate a frammenti di
DNA fosforilati anche se a ciascuna estremità uno solo dei due filamenti sarà unito covalentemente in vitro. E. coli
riparerà i nick a singolo filamento in vivo per generare la molecole di DNA desiderate.
La ligatura intramolecolare dei frammenti di inserzione generalmente non influenza il background di colonie
indesiderate; tuttavia essa influenza fortemente la frequenza di ottenimento delle colonie correte poiché frammenti di
DNA richiusi su se stessi non possono essere uniti al vettore. Quindi in situazioni in cui i frammenti di DNA possono
circolarizzare devono essere usate elevate concentrazioni di DNA per favorire eventi di ligatura intermolecolare. Questo
è particolarmente vero per corti frammenti che sono più propensi a circolarizzare dei frammenti grandi.
Eventi di ligatura intermolecolari
Tutti gli esperimenti di clonaggio che usano plasmidi vettori richiedono l’unione di due o più molecole di DNA separate
seguite da circolarizzazione del prodotto. Ovviamente, eventi di ligatura intermolecolare divengono sempre più favoriti
rispetto agli eventi intramolecolari man mano che la concentrazione totale delle estremità aumenta. Perciò l’efficenza di
clonaggio risulta ottimale quando le concentrazioni di DNA sono sufficientemente alte da permettere l’unione
intermolecolare ma non così alte da ridurre la ligatura intramolecolare. Per avere un basso background si utilizzano
concentrazioni di DNA tra 1 e 50 μg/ml.
Se escludiamo gli eventi di richiusura della molecola su se stessa, la frequenza di unione di segmenti di DNA differenti
è direttamente correlata alla molarità di ogni componente in termini di specifiche estremità da unire. Per esempio, se
sono presenti quantità equimolari di vettore e frammento, il 50% dei prodotti bimolecolari sarà vettore-frammento, il
25% sarà vettore-vettore eil 25% sarà frammento-frammento. Comunque, poiché nella maggior parte dei casi solo le
molecole contenenti il vettore genereranno E.coli trasformati, è preferibile usare concentrazioni molari più alte di
frammento poiché questo favorirà i prodotti desiderati vettore-frammento rispetto al background vettore-vettore. Questa
considerazione è meno importante se l’unione vettore-vettore è esclusa da un trattamento con la fosfatasi o se l’unione
vettore-vettore non può generare molecole vitali.
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Esempi di clonaggio
Clonaggio di frammenti di DNA con estremità coesive ed omologhe
Questo tipo di clonaggio prevede l’inserzione di un frammento di DNA, ottenuto usando l’enzima tipo EcoRI, in un
vettore contenente un singolo sito EcoRI. La fonte principale di background (molecole indesiderate) è data dalla
presenza di vettori di DNA non tagliati o richiusi senza frammento. Nella maggior parte dei casi la richiusura del
plasmide su se stesso può essere ridotta trattando il vettore con la fosfatasi alcalina CIP. Anche se il trattamento con la
fosfatasi abbassa l’efficienza assoluta di ottenimento delle molecole di DNA desiderate, la grande riduzione del
background eleva significativamente la frequenza relativa di molecole ricombinanti.
La concentrazione del frammento da clonare deve essere relativamente elevata per facilitare la ligatura nel vettore.
Inoltre anche il frammento può contribuire al background legandosi a se stesso specialmente quando è difficile estrarlo
dal vettore originale.
Poiché tutte le estremità tagliate con EcoRI sono equivalenti, il frammento può inserirsi in entrambi gli orientamenti
rispetto alla sequenza del vettore. Questi due risultati possono essere distinti solamente tramite una mappa di restrizione
ottenuta usando un’enzima che taglia asimmetricamente all’interno del frammento, oppure mediante PCR utilizzando
un primer sul vettore e un primer sul frammento.
E’ possibile che più copie del frammento si inseriscano all’interno del vettore. Generalmente l’inserzione multipla non è
tuttavia frequente a meno che le concentrazioni di DNA non siano molto elevate. Quando si verificano inserzioni
multiple i frammenti sono solitamente orientati nella stessa direzione; le molecole contenenti coppie in tandem orientate
in direzioni opposte sono incapaci di replicazione in E. coli a meno che il frammento inserito non sia molto corto (meno
di 30 bp).
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Per tutte queste ragioni il clonaggio di frammenti con estremità coesive ed omologhe va possibilmente evitato. Il
clonaggio direzionale è preferibile.
Clonaggio direzionale di frammenti con estremità eterologhe
Questo è il metodo di clonaggio più efficiente e deve essere usato ogni qualvolta sia possibile.
Il frammento ed il vettore di clonaggio sono entrambi ottenuti mediante taglio con due diversi enzimi di restrizione. In
questo modo entrambi i segmenti di DNA teoricamente non possono richiudersi su se stessi poiché le estremità non
sono complementari. Quindi quasi tutte le cellule trasformate conterranno molecole ricombinanti nelle quali la copia del
frammento di inserzione è orientata in una direzione definita rispetto la vettore. Molecole contenenti due copie di
frammento non si possono formare e quelle con tre copie saranno molto rare.
Il maggior problema associato al clonaggio direzionale deriva da errori nella generazione dei segmenti di DNA, in
particolar modo dal taglio incompleto del vettore da parte di uno degli enzimi di restrizione. I vettori che sono tagliati in
un solo punto possono richiudersi su se stessi e generare molecole indesiderate.
Le molecole tagliate da entrambi gli enzimi possono essere separate da quelle tagliate in modo incompleto attraverso
una corsa elettroforetica. Tuttavia questo non è possibile quando i siti di taglio dei due enzimi sono molto vicini.
Inoltre se i due siti sono estremamente vicini può essere difficile il taglio delle molecole con entrambi gli enzimi di
restrizione.
La grande efficienza del clonaggio direzionale permette la creazione di molecole formate da tre o più segmenti: la tipica
unione di tre segmenti si ottiene tagliando con tre diversi enzimi di restrizione (A, B, C); i tre frammenti sono generati
rispettivamente dagli enzimi A e B, B e C, A e C. Il ricombinante composto dai tre frammenti si ottiene con minore
efficienza rispetto all’unione di due frammenti. Comunque il basso livello di background permette di ottenere le
molecola desiderate con una frequenza sufficiente da permettere l’analisi individuale delle colonie.
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Clonaggio di frammenti di DNA con estremità piatte
L’unione di frammenti con estremità piatte si ottiene utilizzando la T4 DNA ligasi. L’efficienza di ligatura è molto
ridotta confronto all’unione di segmento con estremità coesive.
Il clonaggio di frammenti di DNA con estremità piatte viene facilitato dall’uso di elevate concentrazioni di DNA e da
una quantità dieci volte superiore di ligasi.
A differenza dell’unione di estremità coesive che richiede la compatibilità, i frammenti piatti sono ligabili
indipendentemente dall’enzima usato per produrne le estremità. L’unione delle estremità piatte prodotte da diversi
enzimi quasi sempre dà come risultato una molecola che non può più essere tagliata da entrambi gli enzimi.
Le ligature più difficili sono quelle in cui tutte le estremità sono piatte (es. clonaggio di un frammento tagliato con SmaI
in un vettore tagliato con SmaI). I problemi che ne derivano sono simili a quelli descritti per il clonaggio di frammenti
con estremità coesive ed omologhe sommati al problema dell’inefficienza della ligatura.
Il clonaggio che coinvolge estremità piatte è estremamente più facile se uno degli eventi di ligatura riguarda estremità
coesive. Ad esempio due frammenti generati da SmaI e EcoRI sono uniti molto più facilmente che due segmenti
generati da SmaI. Inoltre queste estremità eterologhe permettono il clonaggio direzionale e le molecole indesiderate
sono poche.
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Clonaggio di frammenti di DNA con estremità incompatibili
Per unire estremità incompatibili (ad esempio una 5’ protruding AATT ottenuta con EcoRI e una 3’ protruding AGTC
ottenuta con SacI) è necessario convertirle in estremità piatte.
Per le 5’ protruding la conversione in estremità piatte è ottenuta attraverso l’attività del frammento Klenow dalla DNA
polimerasi I di E.coli in presenza dei quattro deossiribonucleotidi trifosfati (dNTP). Questa reazione deve avvenire in
presenza di tutti e quattro i nucleotidi per prevenire una più estesa azione dell’esonucleasi.
Per le 3’ protruding viene utilizzata la T4 DNA polimerasi con attività esonucleasica 3’→5’ o l’enzima S1.
La T4 DNA polimerasi è preferibile poiché possiede una maggiore attività esonucleasica ma è più costosa dell’enzima
di Klenow. Entrambe le polimerasi sono attive in tutti i tamponi degli enzimi di restrizione e quindi possono essere
aggiunte (assieme ai quattro deossiribonucleotidi trifosfati) direttamente nella soluzione di reazione dopo il taglio.
Diversi manuali suggeriscono l’impiego di esonucleasi che tagliano il DNA a singola elica (S1) in modo da rimuovere
la protuberanza. Nessun sistema è comunque efficiente per l’appiattimento di estremità 3’. Si sconsiglia vivamente
pertanto di appiattire questo tipo di estremità.
Una volta che le estremità sono state rese piatte la procedura di ligatura è la stessa dell’esempio precedente. Tuttavia il
passaggio addizionale per creare le estremità piatte solitamente causa una più bassa efficienza di ligatura; più estremità
devono essere rese piatte più problematica risulta la procedura.
Quando si devono unire estremità incompatibili è preferibile se alcune delle reazioni di ligatura coinvolgono estremità
coesive: ad esempio l’unione di un frammento tagliato con BamHI e EcoRI con un frammento generato da BamHI e
SacI.
In molti casi l’unione di estremità incompatibili crea una molecola che non può più essere tagliata da entrambi gli
enzimi di restrizione usati per produrre le estremità. In questi casi, la struttura della molecola nel punto di fusione può
essere determinata solo attraverso sequenziamento del DNA.
Alcune volte comunque uno dei siti di restrizione può essere rigenerato rendendo così possibile l’analisi della molecola
risultante attraverso una mappa di restrizione. Ad esempio al 5’ protruding generato da EcoRI la polimerasi produce una
sequenza terminale GAATT che unita al nucleotide C (es. sito SacI) dell’altro frammento rigenera un sito EcoRI. Se
tuttavia le estremità prodotte da EcoRI e SacI vengono unite in modo aberrante non vi sarà rigenerazione del sito
EcoRI.
Ligatura di frammenti generati da taglio parziale
A volte un dato frammento di DNA contiene siti interni di restrizione che sono gli stessi di quelli presenti ad una o ad
entrambe le estremità. In questo caso, il frammento può essere ottenuto solo attraverso digestione parziale con
endonucleasi di restrizione. Non è difficile ottenere molecole ibride di DNA quando uno o più dei componenti è
generato da taglio parziale con endonucleasi di restrizione. Dopo aver ottenuto attraverso purificazione da gel i prodotti
del taglio parziale desiderati, le reazioni di ligatura possono essere preparate nel modo normale, e saranno ugualmente
efficienti. La principale difficoltà del taglio parziale, ossia ottenere una quantità sufficiente del frammento specifico,
può solitamente essere superata impiegando più DNA (da 1 a 5 μg) prima dell’elettroforesi su gel. Per assicurare il
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grado appropriato di digestione parziale, può essere usato il metodo della diluizione seriale dell’enzima (serie di
digestioni effettuate con diluizioni crescenti dell’enzima).
In alcuni casi può essere difficile purificare il prodotto del taglio parziale desiderato dai prodotti indesiderati,
specialmente se la molecola di partenza contiene molti siti di taglio o se i siti di taglio sono ravvicinati. Comunque, se la
reazione di ligatura presenta un basso background questi frammenti indesiderati sono un problema minore. Per esempio,
se la banda che viene tagliata dal gel contiene quattro differenti frammenti clonabili, circa il 25 % dei trasformanti
dovrebbe essere quello di interesse. Inoltre, se il frammento viene generato da taglio parziale a una estremità e da taglio
completo da parte di un altro enzima all’altra estremità, molti dei frammenti contaminanti non possono venire clonati
nel vettore e quindi non contribuiscono al background.
Ligatura con linker oligonucleotidici
I linker sintetici sono oligonucleotidi complementari a se stessi , tipicamente lunghi da 8 a 10 basi, che si appaiano per
formare DNA a doppio filamento con estremità piatte, che contengono un sito di restrizione. Per esempio, GGAATTCC
è un linker EcoRI di 8 bp ( i nucleotidi sottolineati rappresentano il sito di riconoscimento). I linker oligonucleotidici
facilitano il clonaggio di frammenti di DNA con estremità piatte, e sono utilizzabili per introdurre nuovi siti di
restrizione in posizioni desiderate. In commercio è disponibile una grande varietà di linker, ognuno contenente una
specifica sequenza di riconoscimento. I linkers sono solitamente ottenuti in forma non fosforilata. Per la maggior parte
delle applicazioni essi sono fosforilati usando ATP e T4 polinucleotide chinasi. Dopo la reazione della chinasi, i linker
fosforilati possono essere aggiunti direttamente nella reazione di ligatura.
La ligatura che coinvolge linker avviene in tre stadi.
1.
2.
3.
Il DNA di interesse, che deve avere estremità piatte, è unito al linker come mostrato in figura. Questa reazione
è ottenuta con una quantità da 0.1 a 1 μg di linker, che rappresenta un eccesso molare (da 100 a 1000 volte) di
linker rispetto al frammento. L’elevata concentrazione di estremità rende questa ligatura con estremità piatte
più efficiente del normale. Generalmente, il linker è fosforilato prima della ligatura. In questo caso, i prodotti
della ligatura contengono tipicamente parecchi linker ad ogni estremità del frammento. Alcuni esperimenti
coinvolgono ligature di linker non fosforilati: i prodotti conterranno solo un linker ad ogni estremità.
Dopo trattamento termico per inattivare la ligasi, i prodotti di questa reazione sono tagliati con l’enzima di
restrizione che riconosce il linker (come mostrato in figura). A causa dell’alta concentrazione di siti di
restrizione dovuti al linker, questo stadio richiede una incubazione di parecchie ore con una grande quantità di
enzima di restrizione (da 20 a 50 U) . E’ importante che il frammento non contenga un sito interno
riconosciuto dall’enzima di restrizione (a meno che il frammento non sia stato preventivamente metilato dalla
metilasi corrispondente all’enzima di restrizione ). Se è possibile, i prodotti della ligatura, vanno tagliati con un
secondo enzima di restrizione per produrre un frammento con estremità eterologhe appropriate per il
clonaggio.
Il frammento viene purificato tramite elettroforesi su gel di agarosio e quindi legato con i metodi tradizionali.
Lo stadio della purificazione su gel rimuove anche i linker non legati, che interferirebbero con questo secondo
stadio di ligatura. I linker possono anche essere rimossi attraverso altri metodi (cromatografia su Sepharose
CL-4B o Sephacril S-300), ma l’elettroforesi su gel è più efficiente e permette la purificazione del frammento
desiderato da frammenti indesiderati.
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Clonaggio di oligonucleotidi sintetici
Gli oligonucleotidi a doppio filamento utilizzabili per il clonaggio possono essere ottenuti attraverso l’appaiamento di
due oligonucleotidi a singolo filamento sintetizzati chimicamente. Generalmente questi oligonucleotidi vengono
fosforilati con la T4 chinasi prima dell’appaiamento. Gli oligonucleotidi a doppio filamento fosforilati possono anche
essere generati tramite “mutually primed synthesis” di appropriati oligonucleotidi a singolo filmento.
Esempio di mutually primed synthesis, i due oligo (riga intera) sono complementari per circa 10 basi in modo da
formare una struttura che puo’ essere estesa con Klenow, oppure mediante PCR, per completare la doppia elica.
Gli oligonucleotidi ottenuti attraverso entrambi i metodi possono venire clonati utilizzando le procedure standard di
ligatura.
Il principale problema associato al clonaggio degli oligonucleotidi è quello dell’inserzione multipla. Questo perché
piccole quantità di oligonucleotidi rappresentano un grande eccesso molare. Questo problema è superato effettuando
una serie di diluizioni dell’oligonucleotide e allestendo reazioni di ligatura in parallelo usando queste diverse
concentrazioni. Se si desiderano inserzioni singole, i trasformanti devono essere recuperati da colonie che rappresentano
la più bassa quantità di oligonucleotidi necessari per incrementare il numero di colonie significativamente sopra il
background (es. assenza di oligonucleotidi). Generalmente la condizioni migliori per l’inserzione singola si hanno
quando l’oligonucleotide è presente in eccesso molare (da 5 a 20 volte) rispetto agli altri frammenti nel mix di ligatura.
Preparazione e trasformazione delle cellule competenti
Perché la trasformazione risulti veramente efficiente i batteri devono essere opportunamente preparati, ovvero le cellule
devono essere rese competenti, vale a dire suscettibili alla trasformazione. Questo è possibile trattando le cellule
batteriche con CaCl2 oppure sottoponendole ad elettroporazione.
Il trattamento con CaCl2 permette buone efficienze di trasformazione, è semplice e non necessita di specifiche
apparecchiature. Le cellule competenti dopo questo trattamento possono essere conservate.
L’elettroporazione è consigliata nel caso si necessiti di alte efficienze di trasformazione. Anche questa procedura è
semplice, veloce e facilmente realizzabile. Richiede un elettroporatore. Come nel precedente protocollo, le cellule rese
competenti possono essere conservate.
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Entrambe le tecniche si basano sul danneggiamento della membrana plasmatica dei batteri, rendendo così possibile
l’ingresso di DNA plasmidico extracellulare.
Preparazione cellule competenti con calcio cloruro
Il metodo del CaCl2 è il più usato poiché è semplice, ripetibile e offre un’efficienza di trasformazione elevata: 5*106 ÷
2*107 colonie trasformate per μg di DNA plasmidico superavvolto. Si specifica il fatto che deve essere superavvolto, in
quanto la capacità di trasferimento è molto diversa rispetto al DNA “ricucito” in laboratorio. In questo caso l’efficienza
varia molto in base alle capacità dell’operatore.
L’inoculo deve essere realizzato in condizioni di sterilità perché eventuali contaminazioni proliferano nelle successive
fasi di incubazione, dato che non sono presenti antibiotici (il batterio non porta ancora il plasmide con la resistenza). La
difficoltà iniziale consiste proprio nel far crescere il ceppo in purezza senza la pressione selettiva data dall’antibiotico.
Inoltre è necessario l’accorgimento di non utilizzare come ceppi per le cellule competenti quelli che portano già la
resistenza all’antibiotico che ci servirà per verificare l’avvenuta trasformazione: ad esempio XL1blue che è Tcr porta un
trasposone che conferisce resistenza alla tetraciclina.
L’inoculo iniziale va calibrato in funzione della densità cellulare della sospensione di partenza. Infatti, normalmente
l’inoculo corrisponde a 1 ml ma, con sospensioni cellulari concentrate, è necessario ridurne la quantità. Per avere uno
sviluppo ottimale di cellule nei 100 ml di terreno si deve evitare di partire con un’elevata concentrazione cellulare
perché altrimenti si raggiunge il limite di 108 cellule/ml troppo velocemente con poche cellule giovani allo stadio di
crescita esponenziale e conseguente bassa percentuale di competenza alla trasformazione. Infatti, per ottenere la
massima resa in cellule competenti è necessario trattare con CaCl2 una popolazione batterica in intensa attività di
crescita, ossia cellule ad uno stadio prossimo al punto di flesso della crescita esponenziale.
Normalmente l’incubazione dura circa tre ore, ma è necessario monitorare la concentrazione di cellule nella
sospensione per arrestare la crescita al punto di flesso della fase logaritmica, che si stima essere in corrispondenza di
una densità cellulare di circa 1 ÷ 4*108 cellule/ ml. L’analisi della crescita cellulare si esegue misurando la densità ottica
del mezzo a 600 nm. Secondo il ceppo la densità ottica ottimale si aggira tra 0.2 ÷ 0.4.
Si esegue la prima misura allo spettrofotometro dopo 1 ora di incubazione, e si realizzano le successive circa ogni 30
minuti. Naturalmente come bianco di riferimento si usa il terreno LB puro. È possibile calcolare il tempo che deve
trascorrere tra una misura e la successiva conoscendo la velocità di divisione del batterio. Si considera che E.coli si
divide ogni 20 minuti; perciò si stima che la densità ottica aumenti dell’80% ogni 30 minuti. Se già dopo 30 min di
incubazione è raggiunta un’OD600=0.3, significa che l’inoculo iniziale era eccessivo.
L’efficienza di trasformazione di cellule rese competenti con CaCl2 dipende da tre fattori importanti a cui è necessario
prestare particolare attenzione:
• Le cellule devono trovarsi nella fase logaritmica di crescita.
• Mantenimento delle cellule in ghiaccio, nei passaggi in cui è specificato dal protocollo, per rallentarne il
metabolismo.
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• Esposizione prolungata a CaCl2
Questi tre punti sono particolarmente importanti e se eseguiti in modo scrupoloso, si avrà una buona efficienza di
trasformazione.
Le cellule una volta rese competenti con CaCl2 devono essere trasformate. Un buon metodo per farlo è quello di
sottoporle ad uno shock termico, raffreddarle immediatamente dopo e farle crescere per un’ora a 37°C.
In seguito si seminano in piastra in un terreno selettivo un antibiotico a cui le cellule trasformate dovrebbero sviluppare
resistenza. Questo ci permette di isolare soltanto le cellule effettivamente trasformate.
Generalmente solo il 3-10% delle cellule trattate con CaCl2 sono rese competenti e la trasformazione è tanto più difficile
tanto più grosso è il plasmide da incorporare. Il numero di cellule trasformate aumenta linearmente con l’aumentare del
numero di plasmidi fino ad un limite massimo di 10 ng di plasmide per 100 μl di cellule competenti. Raggiunto questo
limite non si ha più un incremento lineare di trasformazione rispetto alla quantità di DNA fornito.
Preparazione di cellule elettrocompetenti
L’elettroporazione è molto più effieciente rispetto alla trasformazione con CaCl2. Dato che la preparazione dlle cellule
elettrocompetenti consiste semplicemente in una serie di lavaggi che hanno lo scopo di rimuovere i sali, si possono
accorciare i tempi di centrifugazione aumentando la velocità, non è necessario l’uso di glicerolo nei lavaggi se le cellule
sono usate immediatamente, ed è possibile lavorare RT.
L’ellettroporazione è una tecnica valida per trasferire DNA sia in cellule eucarioti che in quelle procarioti. Questo
metodo è applicabile a diversi ceppi di E. coli e anche ad altri batteri sia gram positivi che gram negativi. In pratica
viene applicato alle cellule un breve campo elettrico ad alto voltaggio, che produce dei buchi temporanei nella
membrana plasmatica della cellula batterica attraverso i quali il DNA plasmidico può entrare. Per una trasformazione
con buona efficienza, la forza del campo elettrico deve essere di circa 12.5 kV/cm. Il numero di cellule trasformate che
riescono a sopravvivere dipende dall’intensità del campo elettrico e dalla durata dell’impulso.
The field strength used for mammalian cell and plant protoplast electroporation is usually 0.5 to 1 kV/cm. The field
strength needed for high-efficiency transformation of E. coli is much greater, usually ~2.5 kV/cm. Under these
conditions up to 1010 transformants/ug plasmid DNA have been reported. Recently, field strength up to 8 kV/cm was
also used successfully to electroporate both mammalian cells and plant protoplasts.
L’elettroporatore crea nella celletta contenente il campione un impulso elettrico che ha un decadimento di tipo
esponenziale. Il voltaggio attraversa i due elettrodi e cresce raggiungendo rapidamente un picco, che poi decade
secondo l’equazione:
Vt = V0 [e-t/T]
dove Vt è il voltaggio ad un determinato tempo t
V0 è il voltaggio iniziale
t è il tempo in secondi
T = pulse time constant = RC (R = resistenza del circuito in ohms e C = capacità del circuito in Faraday)
Nel caso di cellule di E. coli, T deve essere di 5 – 10 msec.
T troppo basse indicano una presenza eccessiva di sali che comporta una elettroporazione poco efficiente, in quanto il
campo elettrico non attraversa la cellula.
Il numero di cellule trasformate aumenta linearmente con l’aumentare della quantità di DNA disponibile per la
trasformazione. Questa linearità è rispettata in un ampio range con contenuti di DNA che vanno dai 5 pg ai 500 ng.
Tuttavia l’efficienza di trasformazione non è correlata alla quantità di DNA, anche se con quantità di DNA inferiori ai 5
pg diminuisce sensibilmente.
Anche le dimensioni del DNA non hanno molta influenza sull’efficienza di trasformazione. Inoltre plasmidi
superavvolti e costrutti creati in laboratorio vengono introdotti nella cellula allo stesso modo.
Cellule fresche mostrano un’efficienza di trasformazione maggiore di cellule congelate.
In genere si hanno efficienze di trasformazione dell’ordine di 10 9 -10 10 cellule trasformate/μg di DNA
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Screening colorimetrico e controllo cellule ricombinanti
Le colonie trasformate con plasmidi ricombinanti sono spesso individuabili mediante screening bianco-blu, un
riconoscimento che consiste nell’osservare il colore con cui appaiono le colonie dopo esser state piastrate su terreno
LB selettivo in presenza degli appositi marcatori (IPTG e X-GAL). Lo screening si basa sulla colorazione determinata
dall’interazione della β-galattosidasi con il substrato X-GAL, composto incolore che se attaccato alla β-galattosidasi
diviene blu. Tutto ciò è possibile perchè nella regione del polilinker del plasmide è inserito l’operone del lattosio pLac:
se il plasmide è ricombinante viene tagliata proprio questa regione interrompendo il gene che codifica per la βgalattosidasi e dunque il composto rimane incolore o bianco.
LacZ danneggiato → colonie bianche (gene interrotto-inserito nel polilinker)
LacZ integro
→ colonie blu (gene funzionale-non inserito nel polilinker)
L’operone del lattosio comunque è un operone inducibile, quindi, necessita di lattosio per attivare la trascrizione della
β-galattosidasi. Esiste però un problema: la β-galattosidasi attivata scinde il lattosio che, venendo degradato,
interromperà la trascrizione dell’enzima stesso. Perciò si aggiunge alla piastra un suo analogo, l’IPTG, che pur
attivando la trascrizione dell’operone non viene degradato dall’enzima (è un induttore costante).
Nello screening colonie bianche-blu il colore non è sempre facilmente individuabile, si possono infatti ottenere anche
colonie a varia gradazione di blu. Diversi possono essere gli eventi accaduti in relazione a varie situazioni:
1. il frammento viene inserito non in ORF, si genera un peptide che non corrisponde alla β-galattosidasi → colonia
bianca.
2. il frammento viene inserito in ORF ma non è un multiplo di tre, questo fa sfalsare la fase di lettura → colonia
bianca.
3. il frammento viene inserito in ORF ed è un multiplo di tre, genererà un polipeptide con qualche aminoacido in più
rispetto alla β-galattosidasi, che può avere una parziale attività enzimatica → colonia azzurra.
4. il frammento viene inserito in ORF ed è un multiplo di tre, ma contiene un codone di stop, questo farà terminare la
trascrizione → colonia bianca.
5. il frammento non viene inserito e il plasmide vettore anche se tagliato nel polilinker riesce a richiudersi (più facile
con un solo enzima di restrizione) e dare una β-galattosidasi funzionante → colonia blu.
6. il frammento non viene inserito ma la fosfatasi degrada parzialmente il plasmide vettore alle sue estremità
compromettendo la sintesi di β-galattosidasi → colonie bianche.
7. il frammento non viene inserito e la fosfatasi degrada le estremità del plasmide ricevente ma per un numero di
nucleotidi multiplo di tre, si può ottenere allora una β-galattosidasi che anche se deficiente di alcuni aa riesce a
svolgere parzialmente la sua funzione → colonie azzurre.
8. in un clonaggio non direzionale in cui il frammento ha due estremità uguali date dal taglio con lo stesso enzima di
restrizione, il frammento viene inserito in ORF ma è un multiplo di tre e contiene al suo interno anche un sito di
fine della trascrizione, così:
• Il frammento è inserito nella direzione per cui il codone di stop è in ORF, questo determina il termine
della trascrizione → colonia bianca.
• Il frammento è inserito nella direzione opposta per cui non è più presente un segnale di fine della
trascrizione → colonia azzurra.
Lo screening colorimetrico fornisce delle informazioni indicative sull’avvenuta ricombinazione ma per avere la certezza
dell’esito positivo del clonaggio è bene andare ad isolare dalle colonie scelte il presunto frammento inserito.
Per fare questo si amplifica la colonia in terreno liquido, si estrae il plasmide e si digerisce con enzima/i di restrizione.
La successiva separazione elettroforetica conferma o meno la presenza dell’inserto atteso per confronto con opportuno
marker di peso molecolare.
Un metodo alternativo alla digestione ma più grossolano (usato quando si devono testare un numero notevole di
colonie) consiste nel confronto fra i patterns dati dai diversi plasmidi ricombinanti e non. E’ possibile usare questo
sistema solo quando inserto e vettore sono ben diversi come massa molecolare e tale differenza è facilmente
apprezzabile su gel di agarosio.
Comunque tale analisi è ancora indicativa, anche in questo caso è consigliabile procedere con digestione enzimatica.
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Protocolli clonaggio
Purificazione dei plasmidi e quantificazione del DNA
1.
Estrarre il plasmide donatore e quello ricevente da E. coli con il metodo ritenuto più idoneo (vedi
Minipreparazione di DNA plasmidico).
2.
Controllare 5 µl di campione estratto su gel di agarosio (vedi Elettroforesi su gel di agarosio).
3.
Quantificare il DNA estratto (vedi Metodi di quantificazione del DNA).
Questo passaggio serve per valutare le quantità di plasmidi da tagliare con gli enzimi di restrizione.
I plasmidi devono essere presenti in quantità tale da permetterne la visualizzazione su gel (limite di rivelabilità =
20-25 ng).
In ogni pozzetto si potrebbero caricare, ad esempio:
9 5 µl di DNA
9 1 µl di LB
9 4 µl di TE
NOTA: Il TE è stato aggiunto allo scopo di raggiungere il volume di caricamento desiderato, ovvero 10 µl.
Poteva altresì esser aggiunta acqua.
Taglio con enzimi di restrizione
1.
Taglio del plasmide donatore e del plasmide ricevente con gli enzimi di restrizione appropriati.
Si può ipotizzare un volume finale di 15 μl, meglio 20μl, (in base alle dimensioni del pozzetto che si ha a disposizione)
da cui si ricavano le aliquote dei vari componenti, nel nostro esempio:
X μl di DNA
2 μl di tampone 10X
1 μl di enzima
Acqua a volume
20 μl volume totale
dove posso sostituire ad X il volume della soluzione campione dove è presente il DNA quantificato in base alla
concentrazione stimata dal gel di prova.
Per quanto riguarda le componenti del volume entro cui avverrà la reazione di taglio, esse devono essere aggiunte
seguendo un ordine preciso, o meglio evitando alcune azioni scorrette: l’enzima deve assolutamente essere aggiunto per
ultimo, dopo l’acqua, il tampone e il campione col DNA (non necessariamente in quest’ordine!). Infatti è necessario
preparare un ambiente ideale (con il tampone già diluito) affinché l’enzima non subisca stress che potrebbero
diminuirne l’attività o comunque alterarne la funzionalità. Inoltre per semplicità lavorative spesso si aggiunge il DNA
come penultimo componente.
2. Incubare per 1h e 30’ a 37°C.
Gli enzimi di restrizione riescono a tagliare in meno di 30 min, ma di norma si lasciano procedere per più tempo per
assicurarsi un taglio completo.
Prima della ligatura è necessario purificare e concentrare sia il vettore che il frammento; quest’ultimo dovrà essere
estratto dal gel, mentre il vettore deve subire un protocollo di de-salting. Le procedure sono sostanzialmente equivalenti,
con la differenza di temperatura di incubazione: T ambiente per il vettore, 50°C per sciogliere il gel.
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Preparazione del frammento
1. Se necessario, concentrare il plasmide donatore (tagliato con gli opportuni enzimi) per precipitazione in un
volume tale da poter essere caricato su gel (vedi Precipitazione del DNA).
2. Corsa elettroforetica su gel (vedi Elettroforesi su gel di agarosio).
Caricare su gel tutto il campione tagliato insieme al marcatore, nostro scopo è infatti recuperare la massima
quantità di frammento per poi costruire il clonaggio.
Se è possibile caricare lasciando dei pozzetti vuoti tra i diversi caricamenti, in quanto la successiva operazione di
prelievo della banda da gel potrebbe disturbare i pozzetti adiacenti la banda excisa.
La durata della corsa elettroforetica deve essere tale da separare il frammento da clonare dal vettore.
3. Tagliare la banda corrispondente al gene d’interesse con un bisturi pulito, cercando di ottenere una fettina
sottile, individuandola al transilluminatore. Porla in un’eppendorf da 1.5 ml precedentemente tarata.
Conservare al buio.
Controllare che la banda sia stata completamente rimossa analizzando al transilluminatore il gel rimasto. È
necessario evitare un’esposizione prolungata del DNA al transilluminatore o alla luce solare perché i raggi UV
attivano l’etidio bromuro che rompe il DNA.
4. Recuperare il frammento dal gel e risospendere in 10 µl TE
Impiegare il metodo ritenuto più opportuno, QIAEXII Agarose Gel Extraction oppure Geneclean.
Preparazione del plasmide ricevente
1.
Controllare una aliquota (2 μl) di plasmide ricevente su gel. Il taglio con gli enzimi di restrizione deve essere
completo.
È importante controllare su gel una quantità minima di vettore per evidenziare la presenza di
un’unica banda netta. Se il taglio del plasmide ricevente non risulta completo (ovvero sul gel
si notano due bande, una dovuta alla digestione totale ed una a quella parziale) conviene
ripeterlo o procedere con una nuova estrazione.
2. Defosforilare il plasmide ricevente con 1 μl di fosfatasi alcalina (CIP) e 1/10 di tampone
CIP 10x.
Soluzione di defosforilazione a partire dalla soluzione di incubazione con gli enzimi di restrizione:
18 μl di campione dalla restrizione*
8.2 μl di tampone per CIP o universale
72.8 μ l di acqua
1 μl di CIP
----------------------------------------100 μl volume totale
* questa soluzione comprende DNA, enzimi di restrizione, tampone, acqua (vedi sopra) preparata a 20
prelevati per la corsa elettroforetica.
l di cui 2
Nota: è abitudine aumentare il volume fino a 100 μl.
Si sono utilizzati 8 μl di tampone in quanto il DNA (18 μl) contiene già il tampone utilizzato con gli enzimi di
restrizione che funziona anche per la CIP.
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3.
Tecnologie biomolecolari
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Incubare per 30 minuti a 37°C.
Non proseguire con la defosforilazione per più di 30 minuti!! (per tempi superiori si rischia di degradare le
estremità).
4. Eliminazione della fosfatasi alcalina con il protocollo di desalificazione
(QIAEXII Protocol for Desalting and Concentrating DNA Solutions oppure GeneClean).
Quantificazione del DNA su gel
1. Corsa elettroforetica su gel di una aliquota (1-2 µl) di plasmide ricevente e di frammento
(vedi Elettroforesi su gel di agarosio).
Con questa corsa elettroforetica si vuole quantificare il plasmide e il frammento.
Consigliabile utilizzare subito 2 µl di frammento se di piccole dimensioni, poiché potrebbe accadere che
caricandone 1 µl non sia poi visibile, obbligandoci ad utilizzarne altri 2 µl.
2. Quantificazione Vettore : Frammento = 1 : 2
Il rapporto si riferisce al numero di molecole e non alla quantità di DNA, si avrebbe corrispondenza tra i due
rapporti solamente se il frammento ed il plasmide ricevente avessero le stesse dimensioni. Assumendo ad esempio
di avere un frammento di 1.2 kbp e un vettore di 1 kbp, usare 2.4 µg di frammento e 1 µg di vettore.
Ligatura
1. Porre in un tubo di tipo eppendorf il vettore e il frammento secondo le quantità calcolate
precedentemente (circa 100 ng in totale)
Si utilizza normalmente un volume di 10 μl per far avvenire la ligatura in un volume ridotto. Sapendo che saranno
poi aggiunti 1 μl di ligasi e 1 μl di tampone, allora il volume massimo dellamiscela vettore-frammento è di 8 μl.
Enzima e corrispondente tampone (che contiene ATP) sono aggiunti successivamente perché il successivo
trattamento a 65°C causerebbe la denaturazione degli stessi.
2. Incubare per 5 min a 65°C.
In questo modo si rompono i legami H fra le estremità compatibili.
3. Raffreddare qualche secondo in ghiaccio. Centrifugare 10 sec per fare precipitare la
condensa.
Importante passare velocemente dai 65°C al ghiaccio per evitare la riformazione di interazioni tra estremità
compatibili.
La precipitazione della condensa viene fatta per evitare che la ligasi sia aggiunta in una soluzione troppo
concentrata.
4. Per un volume finale di 10 µl, aggiungere alla soluzione vettore+frammento 1 µl di
tampone ligasi 10x, portare (se necessario) a 9 µl con acqua e aggiungere 1 µl di enzima
ligasi.
Il tampone per la ligasi contiene ATP. Per evitarne la degradazione in seguito a ripetuti scongelamenti può essere
utile preparare delle aliquote monouso.
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5. Incubare 18 h a 16 °C oppure 3h a RT.
Se non è disponibile un refrigeratore porre in un bagnetto con un termometro e aggiungere ghiaccio quando
necessario. La bassa temperatura rallenta l’attività della ligasi permettendo l’appaiamento vettore-frammento.
Oggi in commercio esistono ligasi in grado di ligare in 5 minuti a temperatura ambiente, in presenza di opportuni
tamponi.
Preparazione delle cellule competenti con CaCl2
1.
Preinoculo: Isolare una colonia da inoculare in LB liquido (5 ml) e incubare a 37°C per
16-20 h (overnight).
Per procedere vedere il protocollo “inoculo e crescita dei batteri”. Quest’operazione va condotta in sterilità. Le
colonie non devono essere più vecchie di 3-4 settimane (fino ad una settimana sono considerate fresche).
Questo preinoculo serve per limitare lo sviluppo di eventuali contaminanti, che potrebbero prendere il
sopravvento, in un volume maggiore di coltura e per favorire un rapido raggiungimento del plateau della curva
di crescita.
2.
Trasferire 200 µl – 1 ml del preinoculo in 100 ml di LB in beuta (capacità 1l). Incubare a
37 °C per 3h e controllare che la OD600 sia tra lo 0.2 e lo 0.3.
Un’incubazione in continua agitazione permette una migliore ossigenazione e quindi una crescita più rapida del
batterio. Il volume della beuta dovrebbe essere 5 volte maggiore del volume del terreno per assicurare
un’adeguata aerazione del mezzo, ma agendo su altri fattori, è possibile ridurre questo rapporto.
Le cellule devono essere prelevate nel punto di massima attività metabolica che corrisponde ad una OD di circa
0,1; in realtà si preleva ad una OD di 0,2-0,3 poiché, nonostante l’efficienza di trasformazione sia minore, si avrà
una maggior quantità di cellule trasformate (è bene fare delle continue rilevazioni del valore della densità ottica
lungo le tre ore tenendo presente che se partiamo da una soluzione con più materiale raggiungeremo prima il
valore previsto).
3.
Trasferire sterilmente 15 ml di sospensione cellulare in un tubo Falcon preraffreddato e
mantenere in ghiaccio per 10 min.
Questa fase non è fondamentale, infatti non è necessario preraffreddare per 10 minuti la sospensione prima della
centrifugazione. È però indispensabile mantenere in ghiaccio le cellule se non è possibile eseguire
immediatamente la centrifugazione prevista dopo il trasferimento in tubo Falcon, per bloccare la divisione attiva
delle cellule così che non superino il flesso della curva di crescita.
4.
Centrifugare a 4000 rpm (circa 2000 g) per 10 min a 4°C.
Si precipitano le cellule per asportare il terreno di coltura, con l’accorgimento di non utilizzare la massima
velocità per non stressare le cellule, ottenendo un pellet poco compatto: non impaccare troppo le cellule.
5.
Eliminare il surnatante e porre immediatamente le cellule in ghiaccio.
Da questo punto in poi tutte le operazioni devono essere eseguite in ghiaccio per non danneggiare le cellule: la
permanenza in ambiente freddo rallenta il metabolismo evitando di sottoporre la cellula a stress che ne
diminuirebbero l’attitudine ad essere successivamente trasformata.
Si versa delicatamente il terreno di coltura prestando attenzione a non staccare il pellet dal fondo. Si deve
operare velocemente per evitare il riscaldamento delle cellule e dunque la riattivazione del metabolismo.
Quest’operazione, come le successive, può avvenire in ambiente non sterile perché:
• i contaminanti sono in estrema minoranza rispetto alle cellule di E. coli (si stima 1 contaminante ogni 106
cellule batteriche);
• il terreno viene eliminato e dunque essi non possono proliferare;
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•
6.
Tecnologie biomolecolari
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il CaCl2 non li rende competenti per la trasformazione perciò verranno uccisi durante la selezione con
antibiotico. Neanche i propaguli fungini resistenti all’antibiotico vanno considerati, per la loro lenta
velocità di crescita.
Risospendere agitando il pellet in 10 ml di CaCl2 100 mM raffreddato in ghiaccio e
mantenere le cellule in ghiaccio per 10 min.
Il calcio cloruro è conservato a 4°C dopo essere stato sterilizzato per filtrazione oppure autoclavato. La soluzione
aggiunta deve essere preraffreddata e successivamente anche la sospensione va mantenuta in ghiaccio, per
mantenere un metabolismo rallentato; solo così le cellule sono in grado di sopportare l’indebolimento della
membrana citoplasmatica. Qualsiasi passaggio fuori dal ghiaccio determina una perdita di efficienza delle
cellule. Per lo stesso motivo, la risospensione deve essere completa ma veloce.
7. Centrifugare a 4000 rpm (circa 2000 g) per 10 min. Eliminare il surnatante.
Si fanno precipitare le cellule, operando come nella precedente centrifugazione. Si versa la soluzione di calcio
cloruro senza disturbare il pellet che si presenta poco compatto.
8. Risospendere il pellet in 0.6 ml di CaCl2 100mM freddo per ogni 15 ml di coltura
inizialmente usata.
Nel caso le cellule competenti vengano conservate a -80°C (vedi sotto), risospendere il pellet in 0.6 ml di CaCl2
100 mM contenente 30% glicerolo (30 parti di glicerolo e 70 parti di CaCl2 100 mM)
Questo è un passaggio fondamentale infatti si può “aumentare” la resa finale lavorando ad una bassa efficienza di
trasformazione partendo da un numero maggiore di cellule (0.3 OD anziché 0.2) e risospendendo in un volume
finale minore.
Si risospende in circa 1/25 del volume iniziale. In questo caso si ottiene una concentrazione di cellule competenti
pari a 3*109 cellule/ml (partendo da una OD pari a 0.2). In seguito verranno prelevate aliquote di 200 μl che
conterranno ciascuna 5*108 cellule. In questo modo possiamo uniformare il numero di cellule per ogni eppendorf.
9. Conservare in ghiaccio per almeno 1 h.
La durata di questa fase è determinante per l’efficienza di trasformazione. L’andamento dell’acquisizione della
competenza alla trasformazione nel tempo aumenta da sei a quattro volte nelle prime 12-24 ore e poi decresce
bruscamente fino a zero, come mostrato nel grafico. In realtà già dopo 1 h di trattamento le cellule raggiungono
un discreto livello di efficienza di trasformazione. Tuttavia se non vengono utilizzate in tempi brevi, è necessario
conservare le cellule competenti a –80°C in presenza di una sostanza antifreezer.
Procedura per la conservazione delle cellule competenti
1. Aggiungere 30% (finale) di glicerolo, agitare e mantenere in ghiaccio.
Quest’aggiunta va fatta chiaramenet se il glicerolo non era presente nella soluzione di risospensione (vedi punto 8)
Il glicerolo riduce la formazione di cristalli di ghiaccio. Alternativamente, è possibile utilizzare dimetilsulfossido
(DMSO 7% vol/vol) che svolge analoga funzione in dosi di 35 μl per millilitro di sospensione. L’unico vantaggio
che il DMSO sembra avere rispetto al glicerolo (in stocks ghiacciati) è una minor viscosità, a cui corrisponde una
maggior facilità nel maneggiarlo.
2. Dividere la sospensione in aliquote da 200 μl, mantenere in ghiaccio e congelare a –80°C
immediatamente.
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Tecnologie biomolecolari
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Dopo aver omogeneizzato la sospensione si prelevano aliquote da 200 μl (120 μl di sospensione + 50% glicerolo),
da versare in eppendorf contrassegnate e preraffreddate in ghiaccio. Successivamente si trasferiscono dal ghiaccio
direttamente a –80°C per congelarle il più velocemente possibile.
Nota: È necessario dividere la sospensione originale in aliquote prima del congelamento perché le cellule possono
essere scongelate una sola volta. Cicli multipli di congelamento e scongelamento riducono drasticamente la
competenza delle cellule e causano mortalità elevata abbattendo sensibilmente l’efficienza di trasformazione.
Inoltre si suggerisce di testare da fresche le cellule competenti per valutare la loro effettiva efficienza di
trasformazione, perciò sapendo che l’efficienza diminuisce nelle aliquote conservate a -80°C è preferibile
aumentarne il volume in modo da avere una competenza paragonabile al test da fresco.
3. Scongelare mantenendo in ghiaccio.
Lo scongelamento della sospensione è realizzato in ghiaccio senza miscelare per eseguire un lento e graduale
scongelamento al fine di mantenere elevata la vitalità e la competenza delle cellule, evitando soprattutto di
riattivare il metabolismo.
È importante notare che il glicerolo aggiunto per la conservazione non influenza le fasi di trasformazione e può
essere mantenuto nella sospensione.
Preparazione di cellule elettrocompetenti
1. Preparare uno starter di coltura batterica e farlo crescere o/n (vedi Inoculo e crescita dei
batteri).
Un’incubazione con continua agitazione permette una migliore ossigenazione e quindi una crescita più rapida del
batterio. Il volume della beuta dovrebbe essere 5 volte maggiore del volume del terreno per assicurare
un’adeguata aerazione del mezzo, ma agendo su altri fattori, è possibile ridurre questo rapporto.
2. Diluire lo starter 1/100 in LB
3. Incubare la coltura a 37°C in agitazione fino ad una OD600 compresa fra 0.5 e 1.0 (l’optimum
di competenza si ha fra 0.6 e 0.8)
E’ bene fare delle continue rilevazioni per raggiungere ma non superare il valore di OD desiderato.
Con OD = 1 si hanno 10 9 cellule batteriche (considerando 1ml di coltura batterica).
4. Porre la coltura in ghiaccio per 15 min per fermare la crescita
Questa fase non è fondamentale, infatti non è necessario preraffreddare per 10 minuti la sospensione prima della
centrifugazione. È però indispensabile mantenere in ghiaccio le cellule se non è possibile eseguire immediatamente
la centrifugazione prevista dopo il trasferimento in tubo Falcon, per bloccare la divisione attiva delle cellule così
che non superino il flesso della curva di crescita.
5. Prelevare aliquote da 1,5 ml e centrifugare per 10 min a 5000 rpm a 4°C
Si precipitano le cellule per asportare il terreno di coltura, con l’accorgimento di non utilizzare la massima
velocità per non stressare le cellule, ottenendo un pellet poco compatto: non impaccare troppo le cellule.
6. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di acqua sterile fredda
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Da questo punto in poi tutte le operazioni devono essere eseguite in ghiaccio per non danneggiare le cellule: la
permanenza in ambiente freddo rallenta il metabolismo evitando di sottoporre la cellula a stress che ne
diminuirebbero l’attitudine ad essere successivamente trasformata.
Si versa delicatamente il terreno di coltura prestando attenzione a non staccare il pellet dal fondo. Si deve operare
velocemente per evitare il riscaldamento delle cellule e dunque la riattivazione del metabolismo.
E’ fondamentale lavare le cellule dai sali presenti nel terreno. La loro presenza comporta che la scarica elettrica
non passi all’interno della soluzione ma formi il cosiddetto arco voltaico fra il catodo e l’anodo della cuvetta. Le
cellule non vengono sottoposte alla scarica e non sono adatte alla trasformazione.
7. Centrifugare 10 min a 5000 rpm a 4°C
8. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 500 μl di glicerolo 15% freddo
Si può risospendere il pellet anche in acqua ma l’uso del glicerolo è imperativo se le cellule devono essere
conservate. Inoltre nel caso di cellule particolarmente suscettibili il glicerolo crea un ambiente osmoticamente più
stabile.
9. Centrifugare 10 min a 5000 rpm a 4°C
10. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 40 μl di glicerolo 15% freddo
Nota: A questo punto le cellule possono essere trasformate per elettroporazione oppure congelate e conservate a 80°C per al massimo 6 mesi. (vedi conservazione in preparazione cellule competenti con CaCl2).
Trasformazione mediante shock termico di cellule rese competenti con
CaCl2
1.
Prelevare due tubi contenenti 200 μl di cellule competenti conservati a –80°C, porli in
ghiaccio e lasciare scongelare per 15 min.
Nel caso in cui si abbiano a disposizione una sospensione di cellule competenti fresche, queste possono essere
impiegate dopo almeno 1 h dalla loro preparazione.
2.
Aggiungere ad una delle aliquote 5 μl della ligatura (~ 50 ng), mentre all’altra aggiungere
quantità nota di un plasmide superavvolto di riferimento (in questo caso 1 μl), come
controllo della trasformazione, per osservare l’efficienza delle cellule competenti.
Per la quantificazione del DNA da aggiungere osservare il gel di prova in cui sono stati fatti correre il frammento
e il vettore da ligare.
NOTE: Il vettore non è superavvolto perché la ligasi ha potuto fissare il frammento solamente in due punti, dato
che con la defosforilazione (CIP) sono stati eliminati i gruppi fosfati in 5'. Sarà poi la cellula ad impiegare i
sistemi di riparo per cucire i nick e permettere il corretto funzionamento del plasmide.
3. Agitare gentilmente la sospensione evitando che il tubo subisca innalzamenti di
temperatura. Riporre immediatamente in ghiaccio i tubi per 30 min.
4. Trasferire velocemente le eppendorf in un bagno termostatato a 42°C, mantenendole per 2
min e 45 sec.
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Lo shock termico dato da questo passaggio repentino da 0 a 42°C permette l’ingresso del plasmide nelle cellule
competenti. E’ perciò importante andare al bagnetto con il campione ancora in ghiaccio, ed evitare così la
permanenza a temperatura ambiente.
La fase a 42°C in cui le cellule assorbono il DNA della soluzione in cui si trovano dura circa 2’ e 45” al massimo,
difatti le cellule con plasmalemma indebolito dal CaCl2 non sopportano tale temperatura per un tempo superiore.
E’ tassativo non superare il tempo indicato in quanto dopo 3 min le cellule competenti sono morte. La durata di
questa fase è determinante per l’efficienza di trasformazione.
5. Trasferire immediatamente in ghiaccio e lasciare raffreddare per 1 o 2 min.
Si accelera il processo di raffreddamento delle cellule posizionando le eppendorf in ghiaccio; si completa così lo
shock termico riportando le cellule ad una condizione di metabolismo rallentato. D’altra parte è necessario fornire
nutrienti alle cellule affinché possano soddisfare le loro esigenze metaboliche e cominciare così il processo di
divisione.
6. Aggiungere 1 ml di LB privo di antibiotico in ogni eppendorf, agitare delicatamente e
incubare a 37°C per 1 ora.
Si aggiunge un ml di terreno fresco e si pone in camera di crescita. È molto utile che le cellule che hanno acquisito
il plasmide si dividano, così che le cellule figlie ne portino una copia intatta. Non è possibile incubarle in terreno
selettivo perché si deve attendere l’espressione del gene che codifica per la resistenza; si deve permettere alle
cellule trasformate di produrre l’enzima β-lattamasi (nel caso dell’ampicillina) e di espellerlo all’esterno della
cellula. Per questo motivo l’attivazione della resistenza all’ampicillina richiede 60’ di incubazione, superiore alle
resistenze fornite dalla degradazione interna dell’antibiotico o dalla rimozione dei suoi recettori (30 min per
tetraciclina, cloramfenicolo o kanamicina). Non superare 1 ora di incubazione perché potrebbe aumentare il
numero di cellule duplicate e si potrebbe avere un falso successo. Infatti se le cellule hanno il tempo di dividersi
ulteriormente, conteremmo successivamente in piastra un elevato numero di ricombinanti, ma tutti cloni delle
cellule di partenza, in pratica non corrispondenti a reali eventi di trasformazione.
7. Piastrare le cellule e incubare 16 h a 37°C
Concentrazione di componenti nelle piastre: IPTG 0.5 mM, Amp 100 μg/ml, X-GAL 40μg/ml
E’ buona norma usare tre piastre: 2 per diluizioni differenti (concentrata e diluita) e una di controllo (E. coli in cui
è stato inserito il plasmide donatore o il ricevente estratto) per valutare l’efficienza di trasformazione delle cellule.
Piastrare 100 µl di campione (piastra diluita), centrifugare per 30" la sospensione batterica rimanente (1,1 ml),
versare il surnatante in modo da lasciare nel tubo circa l00 µl di LB nei quali risospendere il pellet batterico, poi
piastrare (piastra concentrata circa 10 volte rispetto alla diluita). I 100 µl rappresentano un valore approssimato.
Quantità superiori (> 200 µl) possono essere difficili da far assorbire alla piastra, mentre quantità molto piccole
(< 50 µl) vengono in genere assorbite dalla piastra prima di aver distribuito i batteri in modo uniforme.
Nella terza piastra si semina solo la sospensione diluita in quanto contenente il plasmide superavvolto che ha una
efficienza di trasformazione molto maggiore rispetto al nostro costrutto. Inoltre non è necessario l’aggiunta di
IPTG e X-GAL nella piastra in quanto serve solo contrare il numero di colonie e il test colorimetrico è inutile.
L’incubazione deve essere tale da permettere la crescita di colonie osservabili.
Se troppo prolungata porta allo sviluppo di colonie satelliti. Questo è un problema tipico di resistenze date da
fattori secreti nel mezzo, come la resistenza all’ampicillina: le colonie resistenti producono β-lattamasi che
degrada l’ampicillina nel mezzo circostante. Si crea così un gradiente di antibiotico a partire dalle colonie in
esame attorno alle quali possono crescere colonie satelliti di batteri non trasformati. È pertanto necessario
adottare degli accorgimenti che riducano lo sviluppo di colonie satelliti:
* ottimizzare i trattamenti per ottenere le cellule competenti;
* preparare terreni contenenti [ampicillina]~ l00 γ;
* incubare le piastre a 37°C per meno di 20 ore ed eseguire subito lo screening;
* conservare le piastre a 4°C fino all’utilizzo per rallentare le divisioni cellulari.
Le colonie satellite complicano lo screening perché sono bianche ma corrispondenti a cellule non trasformate; per
contro sono abbastanza facili da riconoscere poiché si sviluppano attorno a colonie di cellule resistenti, e, se
reinoculate su un terreno selettivo, non crescono.
L’eventuale colorazione blu dovuta all’espressione di LacZ si manifesta successivamente alla proliferazione
cellulare. Per potenziare la colorazione è sufficiente mantenere le piastre a 4°C per qualche ora.
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8. Conservare le piastre a 4°C
Trasformazione mediante elettroporazione di cellule elettrocompetenti
1. Lasciar scongelare le cellule in ghiaccio
Nel caso in cui si abbiano a disposizione una sospensione di cellule competenti fresche , queste possono essere
impiegate immediatamente dopo la loro preparazione. Lo scongelamento della sospensione è realizzato in
ghiaccio.
2. Aggiungere 1-2 μl di DNA
Si usano solo 1 o 2 µl di DNA per impedire che siano presenti troppi sali. Una soluzione contenete sali
compromette la trasformazione tramite elettroporazione in quanto la scarica elettrica non passa attraverso la
cellula ma attraverso i sali. La durata dell’incubazione del DNA con le cellule prima dell’elettroporazione non
influenza l’efficienza di trasformazione. Since the resistance of the sample should be high, make sure that addition
of the DNA to the cells does not increase the total salt concentration in the cuvette by >1 mM.
3. Settare l’elettroporatore a 25 μF e 2.5 KV
4. Trasferire la soluzione di cellule e DNA nella cuvetta da elettroporazione fredda, inserirla
nell’elettroporatore e dare l’impulso elettrico.
Se in soluzione sono presenti troppi sali, può generarsi l’arco voltaico: la corrente passa attraverso i sali e forma
un arco al di fuori della soluzione. L’arco voltaico è accompagnato da un rumore sordo. Se si verifica l’arco
voltaico, è necessario ripetere tutto.
5. Immediatamente dopo l’impulso estrarre la cuvetta dall’elettroporatatore e aggiungervi 1
ml di terreno LB privo di antibiotico.
Questo passaggio è molto importante. Il trasferimento delle cellule elettroporate al mezzo di coltura deve avvenire
il più velocemente possibile per evitare dimunuizione dell’efficienza di trasformazione.
6. Controllare il valore della time constant: valori compresi fra 4 e 5 ms sono ottimali
Valori inferiori a 4 richiedono di ripetere la trasformazione.
7. Recuperare tutto il contenuto della cuvetta e porlo in una eppendorf da 1.5 ml e incubare
per 1 ora a 37°C.
Le cellule che hanno subito elettroforesi sono danneggiate e non possono essere utilizzate. Per questo motivo
vengono trasferite in LB: è molto utile che le cellule che hanno acquisito il plasmide si dividano, così che le cellule
figlie ne portino una copia intatta. Non è possibile incubarle in terreno selettivo perché si deve attendere
l’espressione del gene che codifica per la resistenza; si deve permettere alle cellule trasformate di produrre
l’enzima β-lattamasi (nel caso dell’ampicillina) e di espellerlo all’esterno della cellula. Per questo motivo
l’attivazione della resistenza all’ampicillina richiede 60’ di incubazione (tempo superiore rispetto alle resistenze
fornite dalla degradazione interna dell’antibiotico o dalla rimozione dei suoi recettori: 30 min per tetraciclina,
cloramfenicolo o kanamicina). In pratica il tempo di attesa dipende dall’antibiotico resistenza che abbiamo
inserito.
Importante non procedere all’incubazione oltre l’ora altrimenti non si può avere una stima attendibile nel
successivo piastramento dell’efficienza di trasformazione; infatti con il passare del tempo si ottengono tante cellule
ricombinanti ma tutte cloni di quelle di partenza. La sterilità non è importante in quanto successivamente andremo
a lavorare con antibiotico, eliminando così eventuali contaminanti.
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8. Piastrare 100 μl di tal quale e concentrato circa 10x su terreno selettivo adatto (vedi semina
batterica in piastra e nota su plating nella trasformazione con CaCl2).
9. Conservare le piastre a 4°C
Lavaggio cuvette
Il lavaggio delle cuvette è importante perché è necessario che non rimangano frammenti di DNA al loro interno.
Lavare bene le cuvette con acqua milliQ ed alcool denaturato, lasciarle in agitazione o/n in etanolo assoluto e lasciarle
poi asciugare rovesciate sotto cappa a flusso laminare.
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Tecnologie biomolecolari
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POLYMERASE CHAIN REACTION
Tecnica applicata in vitro che prevede l’amplificazione enzimatica esponenziale di una determinata regione di una
molecola di DNA. E’ stata ideata nel 1983 da Kary Mullis e ha permesso l’attuazione di esperimenti prima impossibili,
grazie anche alle sue molteplici applicazioni.
MECCANISMO MOLECOLARE
Il processo di PCR consiste nella ripetizione ciclica di tre passaggi:
La denaturazione del DNA al calore
l’annealing ovvero l’appaiamento dei primer al templato
l’estensione: la polimerasi sintetizza nuovi filamenti basandosi sulla sequenza del templato.
I due primer sono complementari a filamenti opposti e precisamente essi si appaiono alle due estremità 3’ del segmento
di DNA da amplificare. In questo modo offrono l’innesco per la polimerasi che sintetizza in direzione 5’Æ3’. E’
necessario che i primer siano aggiunti in eccesso rispetto alla quantità di DNA da amplificare.
Numero di molecole:
Il primo ciclo origina due filamenti di lunghezza indefinita, i quali, così come i filamenti parentali di partenza, possono
ibridare ai primer. Tuttavia al secondo ciclo vengono prodotte anche due molecole a singolo filamento di lunghezza
discreta e corrispondente alla distanza tra i due primer terminali. Ognuno di questi due filamenti presenta una porzione
complementare a uno dei due primer e può partecipare come templato ai cicli successivi. L’ammontare dei diversi
prodotti della PCR all’n-simo ciclo è quindi di:
-2n per le molecole “intermedie”, ovvero i filamenti a lunghezza indefinita;
-2n per i frammenti finiti, costituenti la regione compresa tra i due primer; in realtà 2n è un numero approssimato ed è
più esatto parlare di 2n-1 frammenti finiti poiché il primo ciclo non genera filamenti di lunghezza discreta.
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I filamenti parentali costituenti il DNA disponibile all’inizio della reazione rimangono in numero costante, cioè sono
pari a due.
Solitamente si eseguono tra 20 e 35 cicli. Durante tali cicli l’amplificazione procede esponenzialmente fino ad un
valore di plateau dove, a causa del troppo templato in soluzione, inizia la competizione tra i primer e l’amplificato per
l’appaiamento al filamento complementare (reanniling). Inoltre, si verifica la denaturazione della polimerasi per la
prolungata permanenza ad elevate temperature.
Numero di molecole iniziali:
Il valore di plateau prima enunciato è di 1012 molecole di templato; oltre questo numero le molecole di DNA
complementari cominciano a riassociarsi, diminuendo l’efficienza della PCR. E’ consigliabile utilizzare quindi un
numero di molecole di partenza pari a 105.
Taq polimerasi , Amplitaq ed Amplitaq Stoffel
L’uso del frammento di Klenow, DNA polimerasi I di E.coli, comportava l’aggiunta dell’enzima ad ogni ciclo in quanto
Klenow è attivo a temperature intorno ai 37°C e viene quindi denaturato a temperature più elevate.
Enzimi adatti alle reazioni di PCR si possono invece ottenere da batteri come Thermus acquaticus, che vive nelle
sorgenti calde a temperature che arrivano fino ai 95°C ed ha una polimerasi che funziona a una temperatura ottimale di
72°C. Per questo la sintesi di DNA nei cicli di PCR avviene a temperature elevate, intorno ai 72°C. Questo enzima è
stato battezzato Taq polimerasi e possiede un peso molecolare di 94 KDa. E’ possibile creare una Taq ricombinante
inserendo il vettore pTaq (depositato e disponibile se non usato a fini commerciali) in E.coli ceppo DH5α, e poi passare
all’estrazione dell’enzima secondo lo specifico protocollo.
La Taq polimerasi è dotata di notevole velocità di polimerizzazione (circa 1000 basi/min), elevato numero di turn-over
e alta processività. Tuttavia ha una velocità di errore stimata circa 2*10-4 nucleotidi/ciclo. Quest’alta probabilità d’errore
può essere controllata diminuendo la quantità di Mg++ utilizzata. Inoltre essa non possiede attività di proofreading
(attività esonucleasica 3’Æ5’) e non può pertanto correggere i propri errori. Per alcune applicazioni , come per esempio
la creazione di mutanti random, per studiare i domini funzionali delle proteine, per verificare la presenza di un
frammento di DNA questa scarsa fedeltà non comporta difficoltà di attuazione. Tuttavia per sequenziare cloni derivati
da PCR, o in presenza di poco templato di partenza, la mancanza di un’attività correttiva può diventare un serio
problema. Il sequenziamento diretto dei prodotti della PCR, il sequenziamento di numerosi cloni generati da PCR, e/o
l’uso di appropriati controlli negativi può aiutare a superare questi problemi. In alternativa può tornar utile cambiare le
condizioni di reazione (per esempio riducendo la concentrazione di Mg++) o utilizzare una polimerasi diversa (come Pfu
oppure Pwo polimerasi).
Nonostante sia universalmente accettato che la velocità della Taq è di 1000 nucleotidi/minuto, la Taq ha la capacità di
estendere fra 100 e 150 nucleotidi/secondo a temperatura ottimale (70-80°C). A 50°C è ancora possibile ottenere
un’estensione di 25 nucleotidi/secondo. Questa differenza (1000/minuto contro 100/secondo) è in parte determinata dai
tempi di riscaldamento del tubo (inerzia termica) che spesso vengono trascurati e non considerati nella definizione dei
cicli termici.
Un’altra importante proprietà della Taq polimerasi è la sua propensità ad aggiungere un nucleotide (dATP) all’estremità
3’ dei filamenti di DNA. Diventa quindi spesso necessario “pulire” i prodotti della PCR con altre DNA polimerasi per
avere estremità piatte. Tuttavia, l’aggiunta di una A all’estremità torna molto vantaggioso durante il clonaggio.
Altre polimerasi utilizzabili nella PCR sono:
Pfu polimerasi (Pyrococcus furiosus). Rispetto alla Taq:
-possiede una percentuale di errore inferiore :7*10-7
-è meno veloce:500 basi/min
-non lascia nucleotidi aggiuntivi al 3’
Pwo polimerasi ( Pyrococcus woesei)
-Non lascia nucleotidi aggiuntivi al 3’
-possiede attività di proofreading, esonucleasica 3’Æ5’
Come per la Pfu, la velocità di sintesi della Pwo è di circa 500 basi/min, e questo permette la replica anche di catene con
strutture secondarie forti, mentre la Taq in tali situazioni interrompe la sintesi. Pwo e Pfu riescono quindi a replicare
frammenti più lunghi.
Primer
→ Come disegnare un primer:
Esistono diversi programmi che permettono di disegnare primer tramite l’utilizzo di un computer., ma non sempre
quest’operazione è semplice e fornisce primer con uguale temperatura di melting (vedi step 2 della “descrizione di un
ciclo universale”). Diventa quindi spesso utile e più facile disegnare un primer a mano, una volta che si ha disponibile la
sequenza del templato. Ecco qui esemplificate le operazioni da effettuare:
Selezionare una sequenza compresa tra i 18 e 24 nucleotidi
Calcolarela loro rispettiva temperatura di melting, ricordando che:
Tm =2(AT) + 4(CG) per primer compresi tra 18 e 24 basi
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Aggiustare le sequenze aggiungendo o togliendo basi al 3’ o al 5’ in modo che la Tm calcolata con la formula sopra
descritta risulti la stessa per entrambi i primer. La percentuale di GC è quindi circa 50 % e AT circa 50%. Per esempio
se si decide di costruire primer lunghi 20 nucleotidi e con Tm pari a 60°C si disegneranno primer contenenti ognuno
10(AT) e 10(GC).
Tm = (2*10)+(4*10) = 60°C
Inoltre si deve:
-evitare sequenze ripetute che formerebbero strutture secondarie
-evitare poliT, poli A, poli G, poli C.
Per molte applicazioni , i primer sono disegnati per essere esattamente complementari al templato. Per altre, invece,
possono venire intenzionalmente creati siti di restrizione non presenti sul templato. E’ necessario che essi siano presenti
al 5’ del primer, affinché non siano di disturbo all’”ancoraggio” della polimerasi. Essi non devono tuttavia essere
considerati nel calcolo della Tm del primer.
Va inoltre ricordato nell’ordinare i primer che solo uno ha sequenza uguale a quella selezionata sul templato; il secondo
primer avrà sequenza complementare e inversa rispetto a quella evidenziata.
EFFICACIA
L’efficacia della PCR è definita dai seguenti parametri
− efficienza
− specificità
− fedeltà
EFFICIENZA
L’efficienza è la misura della resa della PCR. Una maggior efficienza si verifica quando a parità di numero di cicli e di
templato iniziale si ottiene una quantità di amplificato più elevata. Si ha maggiore efficienza se i templati hanno
lunghezza limitata: 2Kb; per templati di lunghezza maggiore : 15÷20 Kb si ha bassa efficienza ; tale lunghezza
rappresenta il limite amplificabile attualmente.
Efficienza massima = 1 Æ le molecole raddoppiano ad ogni ciclo.
Efficienza Taq = 0.6
SPECIFICITA’
La PCR è specifica quando si ottiene l’amplificazione della sola sequenza di interesse. A conferire una elevata
specificità sono i primer: essi devono avere in primo luogo una sequenza esattamente complementare al templato. Si
nota che fino a 30 nucleotidi, all’aumentare della lunghezza dei primer c’è un corrispettivo aumento di specificità; di
solito si usano dai 20 ai 30 nucleotidi. La specificità è influenzata dalla temperatura di annealing e dalla concentrazione
di MgCl2. Basse temperature oppure alte concentrazioni di magnesio portano a perdita di specificità in quanto
favoriscono l’appaiamento dei primer senza che ci sia omologia totale.
FEDELTA’
La fedeltà è la misura della quantità di errori della polimerasi nella sintesi. I fattori che influenzano la fedeltà sono:
La concentrazione di dNTP: alte concentrazioni di dNTP portano ad un diminuzione della fedeltà perché la Taq sbaglia
nel “prendere” il nucleotide dal mezzo
La concentrazione del Mg++ che, se troppo elevata, stabilizza la struttura anche se questa contiene errori di sequenza che
determinano l’allontanamento della base non complementare (formazione di dossi)
La concentrazione del Mn2+: elevati livelli favoriscono una lettura scorretta del templato da parte della polimerasi e
quindi l’incorporazione di nucleotidi sbagliati
La polimerasi utilizzata per l’amplificazione:
I migliori risultati di amplificazione si ottengono con miscele di Taq e Pfu.
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PCR su DNA
Per ottenere una corretta amplificazione del DNA è indispensabile impiegare soluzioni non contaminate:
• Utilizzare attrezzature sterili.
• Cambiare sempre i puntali e utilizzare i guanti
• È altresì consigliabile seguire un ordine di aggiunte nel preparare la soluzione per la PCR,
soprattutto per la Taq ed il templato.
NOTE: Se si prepara la reazione al bancone è possibile che la Taq inizi una polimerizzazione a temperatura ambiente:
in tali condizioni primer o molecole di DNA si appaierebbero al templato in modo aspecifico, determinando
l’amplificazione di filamenti privi di interesse. Per evitare tale problema, in passato era consuetudine aggiungere la Taq
dopo la denaturazione iniziale (hot start). Ciò era però alquanto scomodo e confusionario in quanto occorreva ogni
volta bloccare il termociclatore alla prima denaturazione per aggiungere la Taq e far di nuovo ripartire lo strumento.
Alcune Taq commerciali hanno oggi un anticorpo legato nel sito attivo che impedisce la loro attività enzimatica; con la
prima denaturazione a 94°-95°C l’anticorpo si denatura e la polimerasi ridiventa funzionale. Altro sistema per evitare
polimerizzazioni indesiderate è quello di mantenere i tubi in ghiaccio per ostacolare l’attività della Taq, che a basse
temperature è molto scarsa.
Tutti i componenti vengono inseriti in eppendorf da 0.2 ml oppure da 0.5 ml; tali eppendorf facilitano lo scambio
termico e hanno dimensioni idonee per alloggiare nel termoblocco del termociclatore.
1.
TAMPONE ( 10 μl di tampone 10 x).
Tampone 10x
50 mM di KCl
10 mM Tris-HCl pH 9.0
0.1% Triton 100
Æ Serve per creare un ambiente idoneo per il funzionamento e mantenimento della Taq polimerasi. Il pH deve
essere intorno al valore di nove perché ad alte temperature esso può ridursi anche di un’unità. Il Triton
funziona da detergente e stimola inoltre l’attività dell’enzima.
Il tampone deve essere aggiunto, insieme all’acqua, prima dell’enzima per evitarne la denaturazione.
2.
H2O ad un volume finale di 100 μl.
3.
MgCl2 (5 μl da stock 25 mM in 100 μl di soluzione)
Concentrazione finale: 1.25 mM
La concentrazione può variare da 1.25 mM – 1.5 mM.
Con il Mg2+ si può modulare la specificità di reazione. Basse concentrazioni riducono l’efficienza. Alte
concentrazioni diminuiscono la specificità provocando l’appaiamento dei primer con il templato senza che ci
sia omologia totale e favoriscono l’incorporazione di nucleotidi errati.
4. dNTP (1 μl da stock 20 mM)
La concentrazione può variare da 37 μM – 1.5 mM, a seconda della lunghezza del frammento da amplificare,
del numero di molecole iniziali e finali.
Alte concentrazioni di dNTP portano ad una diminuzione della fedeltà perché l’enzima ha maggior probabilità
di recuperare dNTP sbagliati in soluzione. Basse concentrazioni bloccano la reazione dando una resa
inferiore.
5.
PRIMER (2.5 μl da stock 20 μM)
Concentrazione finale 0.5 μM.
La concentrazione dei primer non deve essere troppo bassa (< 0.3 μM) altrimenti non procede la reazione, né
troppo alta (> 3 μM) per non favorire l’appaiamento aspecifico tra primer e templato.
I primer vengono forniti liofilizzati dalle ditte con la seguente indicazioni:
OD = densità ottica. 1 OD = 30 μg
PM = Peso molecolare
In laboratorio gli stock vengono portati ad un valore pari a 0.1 OD reidratando con un numero di μl di acqua
pari a 10 volte il numero di OD fornito (vedi esempio). Successivamente il primer viene portato in
concentrazione finale pari a 20 μM. Se il peso molecolare non viene specificato si può assumere che il peso
medio di ciascun nucleotide sia 325 gr/mol da moltiplicare per il numero di nucleotidi che costitiscono il
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primer.Un metodo approssimativo per primers compresi tra 15 e 25 basi, é quello di diluire gli stock con OD
pari a 0.1 di 18/20 volte per ottenere una concentrazione finale pari a 20 μM.
Esempio: Un
primer liofilizzato commerciale sulla confezione è indicato :
-μg/OD pari a 29.2, OD = 13.2 ,
- MW 7692.
Se voglio sz a 0.1 OD aggiungo 132μl di H2O, porto quindi le concentrazioni a 2.9μg/μl.
Per fare uno stock con concentrazione 20 μM: si diluisce la sz 2.9μg/μl per X volte.
1mM = 7,692 μg/μl ( 20μM è 1/50 di 1M)
per arrivare a 20 μM :7.692/50=0.15μg/μl)
(1mM * 2.9μg/μl )
= 0.377 mM =377 μM che è la molarità sz 0.1 OD.
7.6928 μg/μl
da stock 2,9μg/μl da diluire a 0.15 :
2.9/0.15=18= volte da diluire lo stock
L’utilità di fare uno stock sta nel fatto che è meglio non prelevare ogni volta il primer dalla confezione
originale perché con il continuo uso si rischia di contaminare. Sarebbe opportuno preparare nuovi
stock molto frequentemente così da poter eliminare la sz vecchia senza sprecare grosse quantità.
6.
TEMPLATO 1 μl.
- DNA genomico serve circa 1 μg
- DNA plasmidico pochi pg.
7.
Taq polimerasi: 0.5 μl da stock 5 u/μl.
Anche se si utilizzano volumi minori di reazione più piccoli, utillizzare sempre la stessa quantità di Taq
polimerasi..
8.
Olio minerale circa 25-30 μl.
Ha la funzione di impedire all’acqua di evaporare e condensare sotto il tappo del tubo durante il decorso della
reazione. L’evaporazione dell’acqua porta ad una riduzione del volume della soluzione e quindi ad un
aumento delle concentrazioni dei reagenti.
Oggi si utilizzano termociclatori in grado di riscaldare i tappi dei tubi eppendorf per evitare la formazione
della condensa nel tubo. In questi casi l’olio minerale non viene utilizzato, eccetto in caso di volumi di
campione molto piccoli dove una piccola perdita di acqua potrebbe causare una ingente variazione della
concentrazione dei reagenti.
Per avere PCR confrontabili il volume d’olio deve essere uguale per ciascun tubo, perché esso aumenta
l’inerzia termica del campione.
PROGRAMMA PCR
Le temperature e i tempi impostate per la PCR possono variare non solo per la natura del templato, per i reagenti e per
gli enzimi usati, ma anche per il termociclatore utilizzato e le sue caratteristiche tecniche. Essa eroga più o meno calore
a seconda di un sensore, e le misure risultano differenti a seconda se il sensore sia posto direttamente sul blocco o si
trovi dentro un’eppendorf con un volume d’olio identico al volume dei campioni sottoposti a PCR: esiste inerzia
termica per cui nel tubo la T° varia più lentamente, anche in funzione dello spessore delle eppendorf e del volume di
reazione. Il controllo della T° nei tubi è più preciso, in quanto si misura la T° a cui sono sottoposti i campioni. Esistono
apparecchi che possono essere regolati nella loro velocità di riscaldamento e di raffreddamento (ramping-PCR).
E’ molto importante quindi non trascurare la scelta dei tempi oltre che delle temperature per ogni passaggio.
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Descrizione di un ciclo universale:
DENATURAZIONE INIZIALE 93 °C per 1’ 30”.
Questo passaggio consiste nella denaturazione iniziale, senza compromettere l’attività della polimerasi.
Seguono poi 30-40 cicli di questo tipo:
DENATURAZIONE 93 °C per 1’.
Durante questo passaggio si ha la denaturazione dei filamenti di DNA.
Temperature più alte provocherebbero la degradazione della Taq polimerasi, mentre temperature più basse
causerebbero una parziale denaturazione dei filamenti e di conseguenza una resa minore
Tempi di denaturazione più lunghi danneggiano la Taq, mentre tempi troppo corti riducono l’efficienza della PCR.
APPAIAMENTO (Annealing) 55 °C per 1’.
E’ forse il passaggio piu’ delicato per l’efficacia della PCR. Durante questo passaggio si verifica l’appaiamento dei
primers al templato. La temperatura è rilevante perché determina la specificità dell’appaiamento: più siamo vicini
alla T° di melting, temperatura alla quale la metà dei primer è dissociata dal templato, più l’amplificazione è
specifica. Una temperatura troppo elevata diminuisce l’efficienza, in quanto i primer si legano poco al templato.
Una temperatura troppo bassa permette ai primer di legarsi in modo aspecifico con conseguente amplificazione di
frammenti di interesse nullo.
La temperatura di annealing si calcola nel modo seguente:
T annealing = T melting – 5 °C
La formula per calcolare la temperatura di Melting (per sequenze fino a 24 nucleotidi) è:
T melting = (A+T)*2 + (G+C)*4
Essa sostiene che per contrastare la forza di attrazione tra una A e una T servono 2°C, mentre per separare una
G da una C servono 4°C.
ESTENSIONE 72 °C per 1’.
Durante questa fase si verifica l’allungamento dei filamenti. L’alta temperatura evita la formazione di strutture
secondarie forti da parte del templato, che impedirebbero l’azione di alcune delle polimerasi.
La temperatura é determinata dal tipo di polimerasi utilizzata e solitamente é intermedia tra quella di
denaturazione e quella di annealing. Il tempo dipende dalla lunghezza del filamento da amplificare e dalla velocità
di polimerizzazione dell’enzima scelto.[Taq 1000 basi/min; Pfu 500 basi/min] quindi a seconda della lunghezza del
filamento da amplificare e del tipo di polimerasi impiegata, si modula il tempo in modo tale che sia sufficiente per
la sintesi della sequenza nucleotidica compresa tra i due primer.
ESTENSIONE FINALE 72 °C per 5’.
Questo passaggio serve per completare i filamenti non terminati. E’ un passaggio utile nel caso in cui il DNA
amplificato debba essere utilizzato per il clonaggio.
20 °C per 1’
Questo passaggio serve a portare lo strumento a temperatura ambiente in tempi brevi. Non è un
passaggio fondamentale. Data la sterilità del campione è inutile mantenere il termociclatore a 4°C, anzi, cosi’
facendo si utilizza inutilmente l’apparato refrigerante del termociclatore
CONSERVAZIONE
Non serve mantenere la PCR a basse temperature ( es. 4°C) perché non sono presenti Dnasi attive che potrebbero
degradare l’amplificato. Tuttavia, meglio conservare i tubi in frigorifero (4°C) per limitare l’evaporazione
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RT-PCR
L’RNA può essere retrotrascritto (cDNA) e quindi amplificato mediante PCR; l’abbinamento della trascrittasi inversa,
per dare cDNA, con PCR, per ottenere l’amplificazione, prende il nome di RT-PCR.
Qui è riportato il protocollo di un kit che permette di ridurre il numero di passaggi per la messa in opera di una RT-PCR
aumentando la riproducibilità e minimizzando il rischio di contaminazione.
NOTE
-
-
Nella confezione sono compresi oltre ai poli(T)12-18 anche una miscela di poli(N)6 che sono necessari per la
retrotrascrizione in organismi che non presentano la coda poli-A (batteri).
È possibile aumentare la concentrazione di Mg++ per diminuire la specificità; non è possibile però diminuirne la
concentrazione senza abbassare anche la concentrazione degli altri reagenti. In tutte queste operazioni è necessario
non introdurre RNAsi per non compromettere tutta la procedura : indossare quindi guanti e utilizzare materiale
sterile RNasi-free.
Assicurarsi che l’RNA da utilizzare non contenga DNA contaminante:
o Trattare con DNasi priva di RNasi
o Controllare una aliquota su gel per verificare l’assenza di DNA genomico
o Un controllo negativo può essere quello di assemblare una PCR senza trascrittasi inversa: se si evidenzia un
prodotto, questo deriva sicuramente dall’amplificazione del DNA inquinante.
Di questa procedura esistono diverse varianti:
1) Retrotrascrizione tramite poli-T con procedura one-step:
prevede che vengano aggiunti all’inizio dell’operazione i poli-T , il primer-5’ , il primer-3’.
2) Retrotrascrizione tramite poli-T con procedura two-step:
prevede un primo passaggio di retrotrascrizione solo in presenza di poli-T , gli altri primer vengono aggiunti in
seguito alla denaturazione dell’enzima trascrittasi.
Non conviene utilizzare questa tecnica in quanto dà gli stessi risultati della one step che però è molto più veloce.
3) Retrotrascrizione tramite primer-3’ con procedura one-step:
i primer vengono aggiunti tutti all’inizio (è il più utilizzato).
4) Retrotrascrizione tramite primer-3’ con procedura two-step:
prevede la retrotrascrizione solo in presenza di primer al 3’ , il primer-5’ viene aggiunto solo dopo la denaturazione
della trascrittasi.
Protocollo di retrotrascrizione one-step
(con aggiunta di entrambi i primer all’inizio)
Il Kit si presenta in tubi eppendorf studiati per un volume di reazione finale di 50 μl, sigillati (i relativi tappi sono
annessi al Kit stesso), che contengono una sferetta nella quale sono già presenti i reagenti per l’RT-PCR, tranne i
primers, il templato e l’acqua.
Volumi di reazione: è riportato un esempio dei volumi dei reagenti mancanti da aggiungere al Kit
COMPONENTE VOLUME
primer-5’
2.5 μl
primer-3’
2.5 μl
mRNA templato
1 μl
44 μl
H2O RNasi free
olio minerale
30 μl
CONCENTRAZIONE FINALE
per 100 pg – 1 μg di mRNAÆ 5- 10 pM
il kit consiglia 20 ng – 2 μg
NOTE:
• L’RNA dovrebbe esser aggiunto dopo quantificazione su gel di agarosio, ma data la difficoltà che spesso si
incontra nel fare ciò si utilizza spesso una quantità approssimata ad 1 μl che dopo prove sperimentali si è vista
funzionare.
• La concentrazione dei primer riportata sopra è quella indicata come ottimale dal Kit: effettivamente però
l’esperienza ha portato ad ottimizzare la concentrazione dei primer utilizzati da alcuni gruppi prendendo come
funzionante la stessa quantità che si usa in PCR tradizionale, che è assai differente da quella sopra riportata,
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poiché 2,5 μl di ciascuno sono corrispondenti a 0.05 pmol (considerazione: è pochissimo, per quale ragione
funziona? è il kit che sovrastima?)
• Il MgCl2 già contenuto nel Kit è in concentrazione di 1.5 mM: essa va aumentato solo se l’RNA è stato sospeso
per errore in TE, poiché l’EDTA presente chela il magnesio stesso.
1.
Aggiungere l’acqua RNAsi-free alla pastiglia e lasciare in ghiaccio per 5 minuti
mescolando ogni tanto.
L’acqua utilizzata viene sottoposta a trattamento DEPC per denaturare l’RNasi eventualmente presente. E ‘
importante che in questa fase sia a T° ambiente per facilitare il discioglimento della sferetta. Il ghiaccio serve per
preservare l’attività della trascrittasi inversa e minimizzare la produzione di retrotrascritti non specifici.
2.
Aggiungere i primer e il templato.
3.
Se encessario, aggiungere olio minerale.
Se l’apparecchio non dispone di un coperchio riscaldato è necessario mettere uno strato di olio sulla superficie
per evitare la completa evaporazione del liquido di reazione, come nelle normali PCR.
4.
Nel frattempo procedere con l’incubazione a 95°C per 10 minuti della miscela di reazione
per i controlli negativi (consigliati 2 campioni).
5.
Assemblare i controlli negativi:
a. senza templato per verificare la presenza di DNA contaminante nei materiali utilizzati
b. con templato per verificare la presenza di DNA contaminante nel campione di RNA
estratto
7.
Incubare il campione a 42°C per 15 - 30 minuti.
Questa incubazione può essere fatta direttamente nel termociclatore aggiungendo anche i controlli negativi. In
questo passaggio si sintetizza il primo filamento di cDNA.
Si incuba a 42°C per evitare la formazione di strutture secondarie e favorire dunque la trascrizione , che avviene
più velocemente rispetto a 37°C. E’ un passaggio critico se si desidera amplificare l’intero gene in quanto spesso
la retrotrascrizione si interrompe prima di aver raggiunto l’estremità 5’ del templato: questo spiega la lunghezza
del tempo di incubazione. Per una semplice amplificazione di un frammento di DNA questo problema non
sussiste: si verifica semplicemente la presenza del trascritto.
8.
Incubare il campione a 95°C per 5 minuti.
La trascrittasi inversa non resiste a questo trattamento e viene completamente denaturata mentre la Taq non ne
risente.
9.
Eseguire la procedura di PCR e controllare se l’amplificazione è avvenuta mediante corsa
elettroforetica.
Esempio 35 cicli cosi formati:
FASE
TEMPERATURA
MINUTI
denaturazione iniziale
denaturazione
appaiamento
allungamento
allungamento finale
94°C
94°C
50°C
72°C
72°C
1
1
1
1’30’’
3
145
x 35
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Protocollo di retrotrascrizione two-step: sintesi del first-strand cDNA
Se si hanno piu’ di 5 μg di RNA, aumentare proporzionalmente i volumi di reazione e la quantità di SuperScript II RT.
1.
2.
Mescolare e centrifugare brevemente ogni componente prima dell’uso.
Preparare la mix RNA-primer in tubi sterili da 0.2-0.5 ml.
componenti
RNA (fino a 5 μg)
RNA di controllo
(50 ng/μl)
dNTP 10 mM
Oligo(dT)12-18 (0.5 μg/μl)
campioni
n μl
-
Controllo senza RT
n μl
-
Controllo con RNA
1 μl
1 μl
1 μl
1 μl
1 μl
GSP* 2 μM
Acqua DEPC
1 μl
a volume (10 μl)
1 μl
1 μl
o
1 μl
a volume (10 μl)
a volume (10 μl)
*GSP (gene specific primer) e’ il primer 3’ che si usa al posto dell’oligo dT per sintetizzare il
cDNA da un trascritto specifico senza amplificare tutta la popolazione di mRNA.
3.
Incubare ogni campione a 65°C per 5 minuti, poi porre in ghiaccio per al massimo 1 minuto.
Questo passaggio a 65°C serve per rilassare le eventuali struttute secondarie dell’RNA e per far
avvenire l’annealing tra oligo dT (o GSP) e poliA (o mRNA).
4.
Preparare la seguente mix aggiungendo ogni componente nell’ordine indicato:
Componenti
Buffer 10X per la RT
MgCl 2 25mM
DTT 0.1 M
RNaseOUT: inibitore delle RNasi
1 reazione
2 μl
4 μl
2μl
1 μl
Il DTT e’ un riducente che rompe i ponti SS delle Rnasi per permettere alla RnaseOUT di denaturarle. Anche la RT che
viene aggiunta successivamente potrebbe essere denaturata da questi componenti e per questo viene aggiunta in
eccesso.
5.
Aggiungere questa mix ad ogni tubo preparato al punto 2, mescolare gentilmente.
6.
Incubare a 42°C per 2 minuti.
7.
Aggiungere 1 μl (50 unità) di SuperScript II RT ad ogni tubo, mescolare ed incubare a 42°C per 40 minuti.
8.
Terminare la reazione a 70°C per 15 minuti poi raffreddare in ghiaccio.
9.
Centrifugare brevemente per togliere le gocce di condensa. Aggiungere 1 μl di RNasi H in ciascun tubo e incubare
a 37°C per 20 minuti prima di procedere dell’amplificazione del cDNA appena sintetizzato con la PCR standard.
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Tecnologie biomolecolari
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IBRIDAZIONE MOLECOLARE
Southern Blot
Nel 1975, E. M. Southern pubblicò un’importante nuova procedura che permetteva ai ricercatori di identificare i
frammenti di restrizione, separati per elettroforesi su gel, contenenti geni e altre sequenze di DNA oggetto di studio. Il
Southern Transfer e le tecniche di ibridazione associate resero possibile per la prima volta di ottenere informazioni
riguardanti l’organizzazione fisica delle sequenze singole o multicopie in un menoma complesso. Grazie al Southern si
applicarono tecniche come il Fingerprinting genetico e la diagnosi prenatale di malattie genetiche.
L’analisi Southern consiste nel trasferimento delle bande di DNA ottenute per corsa elettroforetica su gel di agarosio o
acrilammide ad una membrana di nylon o nitrocellulosa, in modo che la membrana sia una riproduzione del bandeggio
del gel.
Trasferimento
Per effettuare un Southern blot è necessario (come per il northern) sottoporre i campioni da trasferire sul filtro ad una
gel-elettroforesi. Una volta terminata la corsa bisogna trattare il gel con una serie di soluzioni per migliorare l’efficienza
del trasferimento del DNA dal gel alla membrana di nylon:
•
soluzione di depurinazione: HCl 0.25 M
il DNA viene ulteriormente frammentato e ciò permette un miglior trasferimento. La depurinazione non
pregiudica l’ibridazione della sonda e neppure la valutazione della lunghezza dei frammenti, in quanto già
migrati. Questo passaggio comunque non viene più svolto se non con DNA genomico ad alto PM in cui si
vogliono separare i cromosomi (ad esempio dopo un elettroforesi pulsata) perché comunque la procedura del
Southern è stata ottimizzata a tal punto che non ci sono più problemi nel trasferimento. La soluzione di
depurinazione, taglia parzialmente i filamenti a livello delle basi puriniche, accorciandone la lunghezza e
aumentandone l’efficienza di trasferimento; questo passaggio non e’ necessario per frammenti minori di 4 Kb,
o se non e’ richiesta un’ alta efficienza di trasferimento per i frammenti maggiori di 5 Kb; lo spessore del gel e
la concentrazione influenzano la durata del trattamento.
•
soluzione di denaturazione: NaCl 1.5 M
NaOH 0.5 M
La soluzione di denaturazione separa i due filamenti complementari di DNA a dare molecole a singolo
filamento, rendendole disponibili alla successiva ibridazione con la sonda.
Si effettuano due lavaggi da 10-15 min: il primo ha solo lo scopo di allontanare il TBE, ha una ridotta
capacità di denaturazione in quanto la soluzione è diluita e tamponata dal tampone di corsa presente tra le
maglie del gel; durante il secondo lavaggio si ottiene invece la denaturazione grazie ad un pH alcalino e ad
una concentrazione salina ottimale per la rottura dei legami idrogeno che tengono legate le due eliche di
DNA; in questo modo il DNA, una volta fissato alla membrana, è in grado di ibridare con la sonda.
•
Soluzione di neutralizzazione:
NaCl 1.5 M
Tris 0.5 M pH 7.5
La soluzione di neutralizzazione serve per portare il pH del gel alla neutralità dopo il passaggio denaturante,
dato che in condizioni basiche il DNA non viene trasferito sulla membrana di nitrocellulosa, o trasferito meno
efficacemente su membrana di nylon.
Si effettuano due lavaggi da 10-15 min:. è utile per riportare il gel ad un pH neutro ma è una
operazione che può essere omessa senza conseguenze per la riuscita dell’esperimento
Dopo ogni soluzione sarebbe opportuno sciacquare il gel in acqua bidistillata.
Ora si può passare al trasferimento su filtro, che avviene per capillarità. Si può effettuare anche un trasferimento
“veloce” in cui il filtro viene posto direttamente sul gel e questo non è posto su di un impianto contenente SSC ma
direttamente sul bancone (trasferimento “a secco”). In questo caso l’SSC che trasferisce per capillarità è quello presente
nel gel che è rimasto dopo i lavaggi.
L’unica differenza rispetto ad un Northern sono i precedenti passaggi con le soluzioni denaturanti, in quanto nel
Northern l’RNA è già denaturato dalla formaldeide e formammide presenti nel gel e quindi non necessita di passaggi di
denaturazione.
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Tecnologie biomolecolari
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La durata del trasferimento è difficile da valutare e dipende dalla quantità di DNA, dalla concentrazione di agarosio e
dalla densità del gel. Il trasferimento capillare verso l’alto è lento, circa 18ore con tampone ad alta concentrazione di
sale.
Membrane
Quando si assembla un Southern, la scelta può essere fatta tra differenti tipi di membrane:
• Nitrocellulosa
• Nylon
• Nylon carico positivamente
Le tre membrane hanno proprietà diverse, ma sono intercambiabili per molte applicazioni.
La membrana di nylon lega il DNA covalentemente tramite fissaggio agli UV, può essere riutilizzata più di dieci volte,
lega una quantità cinque volte maggiore di DNA per cm2 rispetto alla nitrocellulosa e il limite minimo di lunghezza dei
frammenti per un’efficiente ritenzione del DNA è di 50 bp.
La membrana di nitrocellulosa è fragile e non lega il DNA covalentemente; la “cottura” in forno del DNA (2 h a 80°C)
ne permette l’immobilizzazione grazie alla formazione di legami idrofobici relativamente deboli ottenuti tramite
l’esclusione dell’acqua. Il limite minimo di lunghezza dei frammenti per un’efficiente ritenzione del DNA è di 500 bp.
Fissaggio del DNA:
Nylon: è consigliato un UV cross-linking (tramite transilluminatore o stratalinker) per formare un legame
covalente DNA-membrana. La membrana deve essere disidratata prima di questo passaggio. Taluni usano
cuocere in forno per 30 min a 80°C prima del trattamento. Si usa un avvolgimento di plastica UV trasparente
per proteggere la membrana (tipo Domopak pellicola). Il lato di membrana a cui è legato il DNA va rivolto
verso la sorgente UV.
Nitrocellulosa: queste membrane non devono essere irradiate con UV; il trattamento prevede cottura sotto
vuoto per due ore a 80°C. La sottrazione di O2 impedisce alla membrana di incendiarsi.
PROTOCOLLO
- Soluzione di denaturazione
NaCl
NaOH
1.5 M
0.5 M
- Soluzione di neutralizzazione
NaCl
Tris HCl (pH 7.5)
1.5 M
0.5 M
- SSPE 20 X (soluzione di trasferimento)
NaCl
3M
200 mM
NaH2PO4-H2O
EDTA
20 mM
portare a pH 7.4 con soda concentrata
1. Tagliare il DNA con gli enzimi di restrizione scelti e caricare la reazione di restrizione su
gel di agarosio 0.8%. Far avvenire la migrazione elettroforetica
2. Immergere il gel nella soluzione denaturante ( 2 x 15 min)
In questa fase, da effettuare mantenendo il gel in agitazione nel liquido, il DNA viene denaturato
3. Immergere il gel nella soluzione neutralizzante ( 2 x 15 min)
Neutralizzare il DNA lavando il gel per due volte nella soluzione di neutralizzazione per 15 min in agitazione
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4. Immergere il gel in SSPE 20X ( 2 x 15 min)
Equilibrare il gel con la soluzione di trasferimento SSPE 20X per 30 min in agitazione.
5. Preparare l’apparato di trasferimento come illustrato in figura
Preparare una vaschetta su cui sovrapporre una lastra di vetro/plastica: coprire la lastra con 2 fogli di carta 3MM
in modo che i due lembi peschino nella vaschetta. Versare SSPE 20X nella vaschetta e bagnare completamente la
carta 3MM. Disporre il gel sulla carta 3MM. Preparare la membrana (nylon o nitrocellulosa) tagliata sulle
dimensioni del gel, bagnarla prima in acqua (appoggiandola e poi immergendola) e poi in SSPE 20X. Disporre la
membrana sul gel facendo attenzione a non lasciare bolle d’aria fra gel e membrana. Sovrapporre 2 fogli di carta
3MM (stesse dimensioni del gel) bagnata in SSPE 20X e 2 fogli di carta 3MM asciutta. Con il Domopak pellicola
isolare la superficie della carta 3MM non occupata dal gel per evitare risalite capillari non passanti attraverso il
gel. Aggiungere 1-2 pacchi di fazzoletti, sovrapporre una lastra di vetro/plastica ed un peso in modo da comprimere
la struttura
6. Lasciare avvenire il trasferimento durante tutta la notte.
7. Smontare con cautela l'apparato, lasciare asciugare la membrana su carta 3MM (fino a
scomparsa delle goccie) avvolgerla nel Domopak pellicola ed esporla ai raggi UV del
transilluminatore per 3 min. con il DNA rivolto verso le lampade:
NON bisogna lasciare per più di tre minuti sotto i raggi UV perché altrimenti c’è il rischio che tutti i siti di
riconoscimento per la sonda vengano impegnati nei legami con la maglia del filtro.
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DOT AND SLOT BLOT
Il Dot e lo Slot blotting sono semplici tecniche per l’immobilizzazione di DNA non frazionato su una membrana di
nitrocellulosa o di nylon. L’analisi di ibridazione può essere condotta per determinare la quantità relativa di sequenze
target nelle preparazioni di DNA blotted.
Dot e Slot blot differiscono nella geometria del blot, una serie di spot danno un pattern di ibridazione che è soggetto
all’analisi condotta per mezzo di una scansione densitometrica .
I Dot blot sono preparati per semplice deposizione di una goccia contenente DNA su di un filtro. L’inconveniente di
questo metodo è che la dimensione dello spot dipende dalla quantità di liquido depositato, perciò la scansione
densitometrica per stabilire la dimensione dello spot e quindi risalire alla sua radioattività dopo l’ibridazione non può
essere effettuata. Nel caso dello Slot blot, i campioni sono applicati su una membrana utilizzando un collettore attaccato
a una pompa aspirante. Il protocollo di base descrive come una procedura per dot o slot blotting su una membrana di
nylon non carica.
Dot e slot blot sono tuttavia metodi più rapidi, perché non richiedono una corsa elettroforetica; vengono utilizzati nel
caso in cui non è necessario determinare il peso molecolare dei frammenti.
Apparato per slot blot:
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Northern Blot
Le analisi northern sono estremamente utili negli studi dell’espressione genica. Esse possono essere usate per
determinare se un particolare gene è trascritto in tutti i tessuti di un organismo o solo in alcuni di essi. Esse possono
essere anche usate per studiare il quadro temporale dell’espressione di singoli geni durante la crescita e lo sviluppo
oppure in determinati tessuti o condizioni. Sequenze specifiche di RNA possono essere rivelate con il blotting e con
analisi di ibridazione usando tecniche molto simili a quelle sviluppate originariamente per il DNA.
L’RNA frazionato è trasferito da un gel di agarosio a una membrana, mentre l’RNA non frazionato è immobilizzato
attraverso slot o dot blotting, seguite da analisi di ibridazione con sonde di DNA o RNA marcate.
Il Northern blotting differisce dal Southern nello step iniziale di frazionamento su gel. Molti RNA possono formare
strutture secondarie per appaiamento intramolecolare, e quindi per un’ottimale corsa elettroforetica e’ necessario
lavorare in condizioni denaturanti, utilizzando per la preparazione del gel della formaldeide, oppure aggiungendo alla
soluzione contenente RNA gliossale e dimetilsolfossido (DMSO).
Il protocollo è diviso in tre sezioni:
1. elettroforesi di RNA in condizioni denaturanti in un gel di agarosio-formaldeide
2. trasferimento di RNA dal gel a una membrana di nylon o nitrocellulosa per capillarità
3. ibridazione delle sequenze di interesse usando sonde.
Prima del trasferimento il gel deve essere lavato con acqua deionizzata per eliminare la formaldeide che ridurrebbe la
ritenzione della membrana di nitrocellulosa o ostacolerebbe il trasferimento alla membrana di nylon. La denaturazione
e’ un passaggio opzionale, anzi molecole di RNA troppo frammentate non sono efficientemente ritenute dalla
membrana. Il trasferimento e l’immobilizzazione avvengono con le stesse modalità del Southern (l’immobilizzazione su
membrana di nylon carica positivamente in ambiente alcalino può causare la parziale degradazione idrolitica
dell’RNA).
Membrane e trasferimento
La maggior parte dei trasferimenti viene condotta usando nylon al posto della nitrocellulosa per la sua elasticità e per il
fatto che l’RNA può essere legato covalentemente tramite UV cross-linking. Inoltre il nylon ha il vantaggio di resistere
a condizioni stringenti (50% formamide a 60°C) che possono essere richieste durante ibridazione con RNA.
Una prima indicazione del successo del trasferimento è l’osservazione dell’aspetto del gel. Se tutto l’RNA è stato
trasferito non si osservano macchie nella parte di gel vicina all’elettrodo positivo. Ulteriore indicazione è ottenuta
colorando la membrana con blu di metilene, ma spesso un problema di trasferimento non è riconosciuto fino a che non
è stata effettuata l’ibridazione.
Anche l’RNA, come il DNA, può essere immobilizzato su nylon carico positivamente tramite trasferimento alcalino,
ma la procedura è sconsigliata per il fatto che le condizioni alcaline portano ad una parziale degradazione idrolitica
dell’RNA. Tale idrolisi è di difficile controllo e le piccole molecole sono facilmente rotte in frammenti troppo corti per
una ritenzione efficiente della membrana. Ciò porta ad un abbassamento di segnale dopo ibridazione. Il trasferimento
alcalino si effettua solo nei casi in cui il segnale che ci si aspetta è forte.
Per inibire l’attività dell’RNasi tutte le soluzioni per il Northern devono essere preparate usando acqua deionizzata
sterile che è stata trattata con dietilpirocarbonato (DEPC), e devono essere utilizzato guanti per evitare ulteriori
contaminazioni.
PROTOCOLLO
Mops 10 X pH 7.0
400 mM MOPS
100 mM NaOAc
10 mM EDTA
Portare a pH con acido acetico o NaOH
Sample Buffer
150 µl MOPS 10X
225 µl formaldeide 37%
650 µl formammide
5 µl
etidio bromuro (stock 10 mg/ml) (l’etidio va aggiunto qui; non è possibile metterlo nel gel di
formaldeide)
100 µl loading buffer 10X
Conservare a –80° C
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SSC 20 X pH 7.2
NaCl 3 M
Sodio citrato 0.3 M
1. Preparare un gel all’ 1.2% di agarosio, aggiungere formaldeide e MOPS 10X in quantità
tali da ottenere una concentrazione finale rispettivamente di 2.2 M di formaldeide e 1X di
MOPS e colare il gel nello stampo.
Es.: 3 g Agarosio in 180 ml H2O, Sciogliere in microonde e aggiungere 25 ml 10 X MOPS Buffer. Mescolare e
aggiungere 45 ml Formaldeide. Mescolare e versare. La formaldeide tende ad uscire nel gel ed entrare nel buffer;
una delle possibilità per evitarlo è di mettere una lastra di plastica sotto il gel.
N.B. la formaldeide è tossica e perciò va aggiunta sotto cappa chimica. Il gel deve essere fatto correre sotto cappa
per le stesse ragioni
2. Mescolare ad 1 volume di RNA 1 volume di sample-buffer e incubare 10 min a 65°C. Porre
in ghiaccio 30 sec e centrifugare brevemente per recuperare la condensa
Es.: 5 μl di RNA totale + 5μl di Sample Buffer
3. Caricare il campione sul gel ed eseguire la corsa elettroforetica in tampone MOPS 1X
far correre i campioni per i 2/3 del gel, impiegando un voltaggio elevato per minimizzare la durata della corsa.
Con il passare del tempo infatti la formaldeide evapora dal gel alterando la corsa dell’RNA
4. Dopo la corsa elettroforetica lavare il gel in acqua per 5 min, cambiando l'acqua ogni
minuto e mantenendo in agitazione (≤ 50 rpm)
5. Lavare il gel per 1 ora in SSC 10X in agitazione.
6. Assemblare l'apparato per il blotting usando come soluzione di trasferimento SSC 20X o
10X
Come preparare l'apparato di trasferimento: Il ponte di carta Whatmann 3mm va imbevuto di soluzione di
trasferimento SSC20X (o 10X) e fatto completamente aderire al supporto, per evitare la formazione di bolle.
Appoggiare quindi il gel, sempre evitando di formare bolle; coprire la superficie del ponte e del supporto non
occupata dal gel con pellicola trasparente, per impedire l'efflusso laterale della soluzione di trasferimento e forzarla
quindi tra le maglie del gel. Distendere sopra il gel la membrana della stessa dimensione del gel (ricordarsi di
tagliarne un angolo per segnare la posizione del DNA una volta trasferito), che può essere precedentemente
imbevuta in tampone di trasferimento o applicata asciutta. Appoggiare sopra la membrana tre fogli di carta
Whatmann 3 MM della stessa dimensione della membrana, eventualmente imbevuti in SSC 20X. Impilare un
numero di fogli di carta assorbente asciutti ed infine applicare un peso.
7.
Lasciare che il trasferimento avvenga per 12-16 h.
Dopo il trasferimento si può eseguire un lavaggio del filtro in una soluzione salina a minore forza ionica (Es. 5×
SSC)
8. Smontare l'apparato, avvolgere il filtro in pellicola trasparente e porlo agli UV per 2-3
min con l’RNA verso rivolto verso le lampade
Per facilitare il legame degli acidi nucleici al filtro si può:
• riscaldare 80° per 1h avendo cura di porre la membrana fra due fogli di carta assorbente
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•
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esporre ai raggi UV per 3 : ATTENZIONE ai tempi NON bisogna lasciare per più di tre minuti sotto i raggi
UV perché altrimenti c’è il rischio che tutti i siti di riconoscimento per la sonda vengano impegnati nei
legami con la maglia del filtro. Si preferisce l’esposizione ai raggi UV, piuttosto che il riscaldamento, perché
oltre a risparmiare tempo è un metodo più efficiente soprattutto se si vuole usare il filtro per successive
ibridazioni con altre sonde.
Note
Al contrario del gel d’ agarosio che si prepara di solito per la corsa del DNA, in questo caso non si possono preparare
dosi in eccesso di gel con la previsione di usarlo in futuro, in quanto la formaldeide evapora molto più facilmente
dell’acqua e perciò nel tempo la sua concentrazione nella soluzione diminuirebbe drasticamente; questo comporterebbe
un rallentamento del RNA superiore rispetto a quello inferiore. Per lo stesso motivo, soprattutto per le corse lunghe,
sarebbe opportuno coprire il gel durante la corsa con una pellicola di nylon in modo che si formi un’atmosfera satura
sopra il gel di formaldeide e così non ci sia il problema della evaporazione.
Quando si assembla il sistema di trasferimento dell’RNA dal gel alla membrana, è opportuno circondare con parafilm o
altro materiale isolante la zona della carta 3MM che non è coperta dal gel, in modo da evitare corti circuiti, ovvero che
la soluzione salina riesca a raggiungere il filtro per vie a minore resistenza, senza passare attraverso il gel (perciò non
portando con sé gli acidi nucleici). Fino a pochi anni fa si utilizzavano filtri di nitrocellulosa, ma oggi si utilizzano filtri
di nylon; tali filtri non hanno la stessa buona affinità di legame per gli acidi nulcleici che hanno i filtri di nitrocellulosa,
ma sono più resistenti e possono essere perciò usati più volte in ripetuti cicli di ibridazione con notevole risparmio di
materiale e di tempo.
Marcatura sonde radioattive
Marcatura uniforme del DNA con Nick Translation
La Nick Translation è un metodo rapido, semplice e relativamente poco costoso per produrre DNA uniformemente
radioattivo con un’alta attività specifica. E’ usato frequentemente per la preparazione di sonde sequenza-specifiche, per
lo screening di librerie, per il blot di DNA genomico e per RNA blot. La reazione è condotta con un frammento di DNA
purificato con gel elettroforesi. Il meccanismo di Nick Translation coinvolge l’attività combinata polimerasica 5’Æ 3’ e
esonucleasica 5’Æ 3’ della DNA polimerasi I di E. coli. Fornendo una molecola nicked duplex DNA la polimerasi
sposta il nick rimovendo i nucleotidi in avanti usando l’attività esonucleasica 5’Æ 3’, mentre simultaneamente
sintetizza DNA all’estremità 3’. I nick nel templato sono generalmente prodotti aggiungendo DNasi I al mix di
reazione. Con la Nick Translation il DNA potrebbe diventare tutto marcato.
La Nick Translation può essere condotta su frammenti purificati con gel elettroforesi o su molecole intatte di DNA. Per
la produzione di sonde ad attività altamente specifica è cruciale ottimizzare la quantità di DNasi I e il tempo di reazione.
Se il tempo di reazione è troppo corto la quantità di DNasi I è troppo bassa, quindi la marcatura è insufficiente. Al
contrario se il tempo di reazione è troppo lungo la quantità di DNasi I è troppo alta e quindi il DNA sarà degradato. Per
la Nick Translation di frammenti di lunghezza inferiore a 500 bp è necessario aumentare la quantità di DNasi I per
assicurasi che la maggior parte delle molecole abbiano almeno un nick. Inoltre, dato che è molto difficile mantenere
sempre lo stesso rapporto DNA/Dnasi, questa procedura è difficile da eseguire correttamente (poco DNA: le DNasi
degradano troopo il DNA. Troppo DNA: le Dnasi generano pochi nick, per cui se non ci sono nick verso il 5’ tutta
questa regione non viene marcata). Per questo si preferisce utilizzare sistema Random Primer
Marcatura del DNA tramite Random Primer
La sintesi random priming è un’alternativa alla Nick Translation per la produzione di DNA uniformemente radioattivo
con alta attività specifica. La procedura di marcatura prevede la rottura del DNA con una endonucleasi di restrizione e,
se desiderato, la purificazione dei frammenti di DNA che contengono la sequenza di interesse con gel-elettroforesi.
Segue denaturazione tramite bollitura del DNA lineare, l’appaiamento a oligonucleotidi random-sequence (esameri
random); tali esameri fanno da primer per la polimerasi.
Quindi si incuba con Klenow in presenza di dNTPs (99% α[32P]dCTP, o α [32P]dATP); Klenow è la DNA polimerasi I
di E. coli priva dell’attività esonucleasica 5’Æ 3’.
In questo modo gli esanucleotidi fanno da primer al DNA di interesse lungo varie posizioni del templato e vengono
estesi generando DNA a doppio filamento che è uniformemente marcato su entrambi i filamenti.
Il random priming è un metodo estremamente riproducibile ma solo il 50% della doppia elica risulta marcato
radioattivamente.
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Frammento Klenow della DNA polimerasi I di E. coli
Klenow, di PM 76.000, è costituito dalla parte C-terminale corrispondente al 70% della DNA polimerasi I di E. coli.
Conserva ancora l’attività esonucleasica 3’Æ5’, ma ha perso l’attività esonucleasica 5’Æ 3’ della DNA polimerasi I di
E: coli. Originariamente Klenow veniva prodotto dalla digestione proteolitica di DNA polimerasi I di E. coli. Oggi
viene overprodotto direttamente dal gene clonato per la DNA polimerasi I modificato per eliminare i 323 residui
aminoacidici della parte N-terminale della polimerasi.
Random Priming
Preparare la sonda marcata radioattivamente utilizzando il kit Ready-To-GO DNA Labelling Beads (-dCTP)
(Amersham Pharmacia Biotech), che marca la sonda mediante random priming
1. Reidratare il kit con 25 µl di acqua sterile
2. Denaturare a 100° C per 2-3 min. circa 25 ng di DNA diluiti in 22 µl di acqua sterile.
3. Porre in ghiaccio per almeno 30 sec l’eppendorf con il DNA denaturato e aggiungerlo al kit
reidratato.
4. Aggiungere 3 µl di α[32P]dCTP (equivalenti a 30 µCi), per un volume finale di 50 µl
5. Porre l’eppendorf a 37°C per 30 min in modo da far avvenire la reazione di marcatura.
6. Preparare la colonna Probe Quant G-50 Micro Columns (Amersham Pharmacia Biotech)
per la purificazione della sonda dai nucleotidi radioattivi, centrifugandola a 735 x g a RT
per 1 min. Purificare la sonda caricando i 50 µl nella colonnina e centrifugando per 2 min a
735 x g a RT.
La sonda è utilizzata immediatamente per l’ibridazione oppure può essere conservata a –20° C per alcuni giorni.
Ibridazione
Un singolo filamento di DNA o RNA a sequenza nota (sonda) può appaiarsi ad un’altra molecola di sequenza
complementare (target); la quantità di basi appaiate tra la sonda ed il target determina la stabilità dell’ibrido.
Sperimentalmente, l'analisi è solitamente eseguita con una sonda marcata e una sequenza target di DNA che viene
immobilizzata su di una membrana.
L'ibridazione è una tecnica sensibile che permette il rilevamento di un singolo gene all'interno di un genoma complesso.
Il primo passaggio nell'ibridazione è quello di immobilizzare acidi nucleici denaturati su un adeguato supporto solido.
E’ ovviamente importante che la sonda non si fissi aspecificamente al filtro. Per evitare questo inconveniente si usa
preincubare il filtro, prima dell’ibridazione vera e propria, in una soluzione contenente DNA di sperma di aringa
(herring sperm DNA) denaturato, che formerà una patina protettiva su tutta la superficie della membrana, in questo
modo tutti gli eventuali siti di legami non specifici saranno saturati dal DNA di aringa.
Dopo un sufficiente tempo di incubazione, la membrana è lavata in modo da eliminare le sonde legate aspecificamente,
lasciando quindi solo quelle che sono complementari alla sequenza target. Controllando la stringenza delle condizioni di
lavaggio, è possibile ottenere un legame omologo al 100% o che contiene dei mismatch (appaiamenti eterologhi), in
modo tale da rilevare sequenze con un basso grado di similarità.
Originariamente l'ibridazione era eseguita con sonde di DNA marcata radioattivamente lunghe da 100 a 1000 bp,
attualmente sono state introdotte altri tipi di sonde (RNA, oligonucleotidi).
Dopo l’eliminazione della sonda in eccesso l’ibrido viene rivelato mediante autoradiografia, rilevazione della
chemioluminescenza o della colorimetria, a seconda del tipo di sonda utilizzato (sonde radioattive, biotinilate, marcate
con digossigenina).
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Particolari considerazioni vanno fatte a proposito di due parametri importanti: la temperatura e il tempo. Per quanto
riguarda la scelta della temperatura alla quale effettuare l’ibridazione bisogna tener conto della temperatura di
denaturazione del DNA legato alla sonda, tenendo conto di lavorare 20-25°C in meno, in modo che almeno la metà
delle molecole sia denaturata. La durata dell’ibridazione deve essere sufficientemente lunga per permettere
l’appaiamento tra la sonda ed il target, generalmente va effettuata overnight.
La rilevazione avviene tramite lastra fotografica nei casi di sonde radioattive o chemioluminescenti e per la formazione
di precipitati colorati in corrispondenza delle bande contenenti l’ibrido sonda-target. Il numero delle bande osservate
corrisponde al numero di sequenze target presenti nel DNA analizzato.
PARAMETRI CRITICI DELL’IBRIDAZIONE
Affinché un’ibridazione abbia successo due sono i criteri importanti:
•
•
Sensibilità: una quantità sufficiente di sonda deve appaiarsi al target producendo un segnale rilevabile con
autoradiografia
Specificità: dopo l’ultimo lavaggio la sonda deve essere attaccata solo alle sequenze target di interesse (o
famiglie di sequenze nel caso di probing eterologo)
FATTORI CHE INFLUENZANO LA SENSIBILITA’
La sensibilità dell’ibridazione è determinata dalla quantità di sonda che si attacca al DNA target. Maggiore è il numero
di sonde che si appaiano, maggiore sarà l’intensità del segnale di ibridazione visto con l’autoradiografia.
•
•
•
Attività specifica della sonda: le moderne procedure di marcatura, sia Nick Translation, sia Random Priming,
sia sintesi in vitro di RNA, forniscono sonde con un’attività specifica maggiore di 108 dpm/μg. Se la specificità
fosse minore il segnale sarebbe troppo basso per essere rilevato. Se la sonda è marcata 108 - 109 dpm/ug, sarà
in grado di rilevare fino a 0.5 pg di DNA target. Cosa questo significa dipende dalla dimensione del genoma
oggetto di studio e dal numero di copie della sequenza target. Nel caso di DNA genomico umano, 0.5 pg di una
seuqneza a singola copia lunga 500 bp corrisponde a 3.3 ug di DNA totale. Questa è perciò la quantità minima
di DNA umano che dovrebbe essere impiegata in un dot blot oppure in un Southern blot se il gene oggetto di
investigazione è a singola copia
Quantità di DNA target: un fattore importante non è la quantità assoluta di DNA (che dipende dall’efficienza
di immobilizzazione e da quante volte la membrana è stata marcata), ma la parte di DNA fatta di sequenze
capaci di ibridarsi alla sonda. 10 μg di DNA sono sufficienti per la maggior parte dei genomi.
Utilizzo di un polimero inerte: un miglioramento della sensibilità può essere ottenuto aggiungendo un polimero
inerte (10% destrano solfato) alla soluzione di ibridazione.
FATTORI CHE INFLUENZANO LA SPECIFICITA’
Forza ionica e temperatura della soluzione finale di lavaggio: la specificità non è influenzata dalla fase di incubazione,
ma è funzione dei lavaggi di post-ibridazione. Parametri critici sono quindi la forza ionica della soluzione finale e la sua
temperatura. Le stringenti condizioni di lavaggio destabilizzano tutti i mismatched heteroduplexes, in modo che i
segnali di ibridazione siano ottenuti solo dalle sequenze perfettamente omologhe alla sonda.
ALTRI PARAMETRI:
• Durata dell’incubazione di preibridazione e ibridazione: il protocollo prevede una preibridazione di 3 h per
nitrocellulosa e 15 min per membrane di nylon. Una inadeguata ibridazione può portare alti background: così
questi tempi posso essere allungati ma non possono essere ridotti.
• Tamponi di ibridazione: la formammide contenuta nel tampone destabilizza i duplex di acidi nucleici,
riducendo la temperatura di melting.
• Lunghezza della sonda: la sonda non dovrebbe essere più lunga di 1000-2000 bp.
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16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
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Ibridazione classica
Soluzione di Ibridazione
0.2 g PVP (polyvinilpirrolidone)
0.2 g Ficoll 400
1 g SDS
300 ml SSPE 20x
Portare a 1000 ml con H2O
10x MOPS buffer (250 ml)
400 mM MOPS (Morfolino propansulfonico; 83,72 g/l)
100 mM NaOAc
10 mM EDTA
portare a pH 7 con NaOH idrato gocce
Soluzione Wash 1
per il northern:
SSC 2X
SDS 0.1 % p/v;
per il Southern:
SSPE 2X,
SDS 0.5 % p/v
Soluzione Wash 2
per il northern:
SSC 0.2X,
SDS 0.1 % p/v;
per il Southern:
SDS 0.1% p/v,
Tris-HCl 5 mM
CT-DNA (calf thymus DNA)
Dissolvere in H2O a 5 mg/ml
Bollire 10-15 min per favorire la solubilizzazione
Frantumare mediante passaggio (ripetuto piu’ volte) in siringa ad ago sottile (17 G)
Suddividere in aliquote da 1 ml e conservare a –20°C
1) Preibridare la membrana a 65-68°C per almeno 30 min . in Soluzione di Ibridazione + CTDNA alla concentrazione finale di 50 µg/ml.
Il CT-DNA deve essere bollito 5 min. e immediatamente raffreddato in ghiaccio prima di essere aggiunto alla
soluzione.
2) Aggiungere la sonda radioattiva e incubare o/n a 65-68°C .
3) Effettuare 2 x 15 min. lavaggi con Soluzione Wash 1
4) Effettuare 1 x 15 min. lavaggio con Soluzione Wash 2
Aumenta la stringenza perché ha una minor concentrazione di sale e quindi permette alla sonda di legarsi
soltanto alle sequenze omologhe.
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Tecnologie biomolecolari
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Ibridazione con il metodo di Church
(Church Method)
Il metodo Church è facile da realizzare ed estremamente riproducibile, ma ha lo svantaggio di dare un segnale
leggermente più debole del metodo precedentedebole. Prevede l’utilizzo di BSA (albumina) al posto di CT DNA (timo
di vitello, ibridazione classica) per saturare i siti di legame aspecifico e non prevede il passaggio di preibridazione.
Church Buffer
BSA 1% p/v
SDS 7% p/v
Na2HPO4 0.5 M tamponato a pH 7.2 con H3PO4 85% v/v
Soluzione Wash 1
per il northern:
SSC 2X
SDS 0.1 % p/v;
per il Southern:
SSPE 2X,
SDS 0.5 % p/v
Soluzione Wash 2
per il northern:
SSC 0.2X,
SDS 0.1 % p/v;
per il Southern:
SDS 0.1% p/v,
Tris-HCl 5 mM
PROTOCOLLO
1. Preibridare la membrana in 30-40 ml di tampone Church Buffer per almeno 30 min a
65° C
Questo passaggio serve a saturare i siti aspecifici di legame presenti sulla membrana. In teoria si dovrebbero
impiegare 100 μl tampone/cm2 di membrana, in pratica si usa tampone a volontà
2. Ridurre al minimo la quantità di tampone di ibridazione
Versare via buona parte del liquido presente nel tubo mantenendo solamente 5-10 ml in modo da mantenere
concentrata la sonda radioattiva che sarà aggiunta in seguito
3. Denaturare la sonda radioattiva a 100° C per 2-3 min, porre in ghiaccio 1 min,
centrifugare brevemente per recuperare la condensa e aggiungere la sonda al liquido
di preibridazione.
4. Condurre l’ibridazione a 65°C per tutta la notte; se condotta a 68°C l’appaiamento
avviene con omologia dell’80%, mentre a 65°C si ha una minor stringenza e
l’appaiamento avviene con omologia del 65%.
5. Rimuovere il tampone di ibridazione ed effettuare 2 lavaggi di 15 min ciascuno, a
65°C, con 50 ml di Soluzione Wash 1
La wash 1 può essere utilizzata fredda (non preriscaldata a 65°) senza alterare il risultato dell’ibridazione
6. Effettuare 2 lavaggi di 15 min. ciascuno, a 65°, con 50 ml di Soluzione Wash 2
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Tecnologie biomolecolari
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La wash 2 deve essere utilizzata calda (preriscaldata a 65°) per non diminuire la stringenza dei lavaggi
7. Avvolgere la membrana con Domopak pellicola, aggiungere la lastra radiografica ed
impressionare a –80°C, utilizzando una casetta radiografica dotata di schermo
amplificatore.
La durata dell’esposizione varia da poche ore a qualche giorno, in funzione dell’intensità del segnale misurato
direttamente sul filtro con il contatore geiger.
Stripping (rimozione della sonda dalla membrana)
La sonda impiegata nell’ibridazione può essere rimossa dalla membrana la quale può quindi essere reibridata con una
nuova sonda. Questa procedura, di uso comune, permette di riutilizzare la membrana più volte. Se il DNA è stato
immobilizzato su una membrana con UV cross-linking (nel caso di membrane di nylon) o con trasferimento alcalino
(nylon plus), l’interazione tra il DNA target e la matrice, di natura covalente, è più forte dell’interazione sonda-DNA
target, che risulta da legami idrogeno. E’ quindi possibile rimuovere l’ibrido sonda-DNA senza rimuovere rimuovere il
legame DNA target-membrana. In questo modo la membrana può essere utilizzata più volte. L’ibrido sonda-DNA può
anche essere rimosso dalle membrane di nitrocellulosa, ma la debolezza delle interazioni idrofobiche che legano il DNA
target alla matrice, oltrechè la fragilità della nitrocellulosa, limita il tempo di vita di queste a solo tre riutilizzi. Il
protocollo descrive tre metodi di stripping; i trattamenti utilizzati dipendono dalla forza del legame sonda-DNA target,
che a sua volta dipende dal contenuto in GC della sonda e il numero di coppie di basi che si formano.
Fare attenzione alle differenti soluzioni impiegate per la rimozione della sonda da una membrana contenente DNA
(Southern) oppure RNA (Northern). Lo stripping di un Southern è molto efficiente, dato che è basato sulla
denaturazione dell’ibrido DNA/sonda mediante una soluzione alcalina. Tale soluzione alcalina però degrada
completamente l’RNA, per cui nel caso dei Northern la procedura di stripping deve necessariamente essere diversa e
risulta meno efficiente. Pertanto, è necessario verificare l’avvenuta rimozione della sonda esponendo il Northern con
una lastra radiografica per valutare l’eventuale necessità di ripetere il trattamento.
SOUTHERN (in agitazione)
1 lavaggio per 20 min. a RT con: 0.1 M NaOH
0.2% SDS
1 lavaggio per 20 min. a RT con:
0.1 X SSC
0.2% SDS
0.2 M Tris pH 7.5
NORTHERN (in agitazione)
1 lavaggio con 0.5% SDS bollente.
Far bollire la soluzione di SDS, aggiungerla alla membrana e mantenere in agitazione per 15 min. Questo
procedimento permette di avere un’alta stringenza anche in presenza di sale. Lo stripping funziona solo se la
membrana non è seccata, altrimenti il legame è troppo forte. Eventualmente ripeter. L’ NaOH non può essere
impiegato perché l’RNA.
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Nucleic Acid Labelling and detection
(From Amersham Biosciences Guide to Nucleic acid Labelling and Detection)
For many years the use of radiolabels was the method of choice for nucleic acid labelling and detection.
More recently, however, considerable research has lead to the development of a comprehensive range of
quality systems using both radioactive and non-radioactive technologies.
This extensive range now provides you with an excellent choice of systems for use with DNA, RNA and
oligonucleotides in a variety of applications. Significant developments in the area of non-radioactive labelling
and detection include the use of light-based detection systems and direct labelling. The introduction of these
techniques means that non-radioactive methods now present a viable alternative to the use of traditional
radioactive techniques for many applications. This breadth of choice can in itself cause problems. Choosing
the most appropriate system for a particular application can be a challenge for even the most experienced
researchers.
The choice is influenced by many factors, not all of which are directly related to the application. For example
radioactive labelling has the advantage of high sensitivity and extremely robust protocols, however safety
and longterm probe storage are serious considerations. The aim of this guide is to give an overall
introduction to the different radioactive and non-radioactive methodologies available, highlighting their
advantages and drawbacks. Individual products are then presented in more detail allowing you to choose the
most appropriate system for your application.
Factor
Considerations
Blotting system
Southern, Northern, dot/slot, library screen.
Amount of target nucleic acid present
Label
Radioactive or non-radioactive
Direct or indirect
Probe
DNA, RNA, oligonucleotide
Size and purity of probe
Speed and convenience
Multiple exposures
Time constraints
Probe storage
Stability
Results
Autoradiography film
Image analysis with scanners
Membrane
Charged or uncharged nylon
Nitrocellulose
Table 1 Factors affecting the choice of labelling and detection system
Non-radioactive labelling methods
In the past the use of non-radioactive labelling and detection technologies has been limited by the
relatively low levels of detection sensitivity as compared with radioactive detection. However, the
further development of non-radioactive labelling methods, coupled with light-based detection has
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resulted in systems that now offer a real alternative to the use of radioisotopes in many applications
where target levels are 50 fg and above.
Non-radioactive systems offer the following benefits:
• Speed Exposure times with nonradioactive systems range from minutes to hours.
•
Sensitivity Applications where target levels are 50 fg and above, e.g. single copy Southern and
Northern blotting, colony/plaque blots.
•
Stable probes Non-radioactively labelled probes are stable for at least 6 months, removing the need
to label probes immediately before use.
•
Ease of handling Eliminates handling and waste regulatory issues associated with the use of
radioactivity.
Making the correct choice of non-radioactive system requires consideration of both the labelling and
detection procedures.
Labelling
Non-radioactive labelling methods are separated into two different approaches. Early non-radioactive
systems utilized indirect labelling techniques, but these have now been largely superseded by the
introduction of superior direct labelling methods, an example of which is AlkPhos Direct™.
Direct labelling Direct labelling* using alkaline phosphatase is the most recent advance in the
nonradioactive labelling of nucleic acids. It offers significant improvements in speed and convenience over
indirect systems without compromising sensitivity.
With direct labelling systems, the enzyme molecule (alkaline phosphatase or horseradish peroxidase) is
directly crosslinked to the nucleic acid probe in a simple 30-minute reaction. Detection is rapid because
direct labelling methods eliminate the need for an antibody conjugate incubation and the associated blocking
and multiple washing steps.
Figure 1 Direct labelling
Indirect labelling Indirect labelling involves the introduction into the probe of nucleotides tagged with a
hapten or ‘ reporter’
molecule. Amersham Biosciences kits use fluorescein as the hapten molecule. The
nucleotide analogues are readily incorporated into the probe by standard labelling methods and hybridization
and stringency washing are carried out under standard conditions. Labelled probes are then detected with a
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highly specific anti-fluorescein antibody conjugated to either alkaline phosphatase (AP) or horseradish
peroxidase (HRP) enzyme. This is followed by enzyme catalysed detection, using the appropriate substrate.
Figure 2 Indirect labelling
Detection
Choice of detection method will depend on the enzyme used in the labelling stage as well as the detection
medium required. Horseradish peroxidase can only be detected using a chemiluminescent substrate, but
alkaline phosphatase can be detected using chemiluminescent and chemifluorescent substrates.
Chemiluminescent detection systems are designed for use with autoradiography film whereas fluorescence
based detection systems require the use of suitable scanning equipment.
ECL
Based on the enhanced chemiluminescent reaction of luminol with horseradish peroxidase, ECL™ substrate
can be used to detect probes which have been labelled either directly or indirectly with horseradish
peroxidase.
Rapid light output enables results to be achieved in 10 to 15 minutes. It is the substrate of choice for target
amounts above 500 fg.
CDP-Star
Based on the chemiluminescent breakdown of the dioxetane CDP-Star™ by alkaline phosphatase*, this
substrate can be used to detect probes which have been labelled either directly or indirectly with alkaline
phosphatase. It is ideal for applications requiring high sensitivity detection such as genomic Southern and
Northern blots. Light output is rapid and continues for up to five days allowing exposure optimization and
multiple exposures to be taken.
ECF
Based on the breakdown of the ECF™ substrate by alkaline phosphatase*, resulting in a highly fluorescent
product which is localized at the site of hybridization. This chemifluorescent signal is detected using a
suitable fluorescence scanner such as the Amersham Biosciences ™ FluorImager™ or Storm™. ECF
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16 aprile 2010
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detection can be used to detect probes which have been either directly or indirectly labelled with alkaline
phosphatase and is particularly suitable for applications where quantification is important.
Labelling
and
detection system
Sensitivity
Time
from
hybridization to
detection
Duration
of
light output
Strip before reprobing
Quantification
Recommended
application
AlkPhos Direct
0.06 pg
1 hour
5 days
yes
no
Single copy
Southern
and Northern
ECL Direct
0.5 pg
1 hour
1-2 hours
no
no
High target
applications
e.g.
colony/plaques
Gene Images
0.1 pg
3 hours
5 days
yes
no
Random-Prime
0.1 pg
3 hours
5 days
yes
no
High
sensitivity
Northerns
Oligo screening
Gene Images 3’ -
with
end
control
labelling
with
stringency
CDP-Star
Gene Images 3’ end
labelling
120 pg
3 hours
1-2 days
yes
yes
Quantification
0.5 pg
3 hours
1-2 hours
yes
no
Medium target
with
ECF
ECL Random-Prime
Southern
with DNA probes
ECL
3’ -end
0.2 pg
3 hours
1-2 hours
yes
no
labelling with oligo
Medium to high
target Southern
probes
ECF Random-Prime
0.25 pg
3 hours
1-2 days
yes
yes
Quantification
Table 2 Guide to the properties of non-radioactive labelling and detection systems
AlkPhos Direct Labelling and Detection Systems
AlkPhos Direct™ combines the convenience of direct enzyme labelling (no blocking or antibody
stages) with those of alkaline phosphatase detection (long light output and high sensitivity).
Labelling is complete within 30 minutes in a single tube protocol and the resulting probe is ready for
use in hybridizations without further purification. Due to the thermostable nature of the enzyme,
hybridization stringency can be controlled by adjusting temperature as well as salt concentration.
The system can be used with either chemiluminescent or fluorescent detection reagents. The most
sensitive result is achieved with CDP-Star, a chemiluminescent substrate with a fast light output.
Alternatively, the use of ECF substrate generates a fluorescent signal suitable for use with
fluorescence scanning devices such as Amersham Biosciences FluorImager or Storm instruments.
Protocol Summary
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Probe labelling
Denatured or single-stranded DNA or RNA probe is mixed with the labelling buffer and alkaline phosphatase.
Formaldehyde is then added to covalently crosslink the enzyme to the probe. There is no need to purify the
probe before hybridization.
Hybridization and stringency
The probe is hybridized to the blot using the specially formulated AlkPhos Direct hybridization buffer, which
stabilizes the activity of the enzyme. After a 15 minute prehybridization step, hybridization with probe is
performed overnight at the required temperature. For higher target amounts, a 2 to 4 hour hybridization may
be sufficient.
Detection
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Chemiluminescence with CDP-Star:
Hybridized blots are detected with CDP-Star reagent. Following a two-minute incubation, blots are exposed
to Hyperfilm™ MP for 1 to 2 hours or a light capture scanning device. Sensitivities as low as 60fg can be
achieved using CDP-Star.
or
Chemifluorescence with ECF:
Hybridized blots are detected with ECF substrate. Non-fluorescent substrate is catalysed by alkaline
phosphatase to produce a fluorescent signal which accumulates over time; low sensitivity applications yield
results after 1 hour, high sensitivity applications usually require overnight incubation.
Recommended Applications
AlkPhos Direct is a fast and easy-to-use system suitable for the majority of routine blotting applications using
either DNA, RNA or oligonucleotide probes. The versatility of the system, combined with the fact that both
DNA and RNA probes are labelled equally efficiently, makes it the ideal choice for a busy laboratory carrying
out a variety of different blotting and hybridization techniques.
For Southern and Northern blotting applications AlkPhos Direct, combined with CDP-Star detection, offers a
highly sensitive system capable of detecting down to 60 fg of target DNA. Thus making it the ideal choice for
the non-radioactive detection of single-copy genomic Southern blots.
Re-probing can be difficult with non-radioactive systems due to the need to remove both probe and antibody
layers in an indirect system. The simplicity of the AlkPhos Direct system means that there are less
components to be removed during the stripping procedure. Probe removal is therefore more effective with
less damage to the membrane.
For labelling oligonucleotides, an optimized protocol has been developed which is capable of labelling
probes down to 17 basepairs in length. Request TechTip number 174 for additional information.
Quantification of dot and slot blots is possible by using ECF detection in conjunction with AlkPhos Direct.
Analysing results on a fluorescence scanner such as Amersham Biosciences Storm or FluorImager allows
accurate quantification and analysis of results.
Speed Time savings of 3 to 4 hours over conventional indirect methods are achievable as a result of the
rapid and simple labelling reaction, and the absence of antibody incubations.
Consistency Quality control on each batch ensures consistent performance and provides confidence in
probe labelling and concentration.
Stringency control Due to the thermostable nature of the enzyme, hybridization stringency can be
controlled by
elevating temperatures up to 75癈 as well as by decreasing salt concentrations.
Versatility Labelling of DNA, RNA and oligonucleotide probes with detection by chemiluminescence or
chemifluorescence offers a high degree of versatility.
Stability Probes are stable for up to six months if stored at – 20° in 50% glycerol.
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Efficiency Nucleic acid probes are labelled efficiently and uniformly with enzyme.
Accuracy The crosslinking labelling reaction does not result in any net synthesis of probe and the amount of
probe present before and after labelling does not change. Therefore probe concentrations during
hybridization can be determined more accurately.
165
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Gene Images Random-Prime Labelling and Detection
Gene Images™ Random-Prime is designed to generate fluorescein labelled DNA probes using a
random prime labelling reaction. The reaction requires only 50 ng of template DNA as the strand
displacement properties of the enzyme, coupled with non-limiting concentrations of nucleotide,
result in net synthesis of probe. The use of fluorescein allows the efficiency of the reaction to be
checked before hybridization by a fluorescence assay.
Protocol Summary
Probe labelling
Fluorescein dUTP is incorporated into DNA in a random prime labelling reaction using Klenow DNA
polymerase.
Nonamer primers are used to ensure efficient hybridization to probe. Probes can be used without purification.
Optional rapid labelling assay
The efficiency of probe labelling can be checked by spotting a small aliquot of labelled probe onto Hybond™N+
membrane, washing to remove unincorporated fluorescein and visualizing on a UV transilluminator or
fluorescent scanner.
Hybridization
For optimum performance use the recommended hybridization buffer. Sensitive detection is achieved by the
use of a monoclonal antibody which is highly specific for alkaline phosphatase. 50 fg of target can be
routinely detected in a human genomic Southern blot.
Detection
Chemiluminescence with CDP-Star:
Hybridized blots are detected with CDP-Star reagent. Following a 2 minute incubation, blots are exposed to
Hyperfilm MP for 1 to 2 hours. Sensitivities as low as 50 fg can be detected.
or
Chemifluorescence with ECF:
Hybridized blots are detected with ECF substrate. Non-fluorescent substrate is catalysed by alkaline
phosphatase to produce a fluorescent signal which accumulates over time; low sensitivity applications yield
results after 1 hour, high sensitivity applications usually require overnight incubation.
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Recommended Applications
Probes labelled with the Gene Images Random-Prime Labelling and Detection System can be used for most
membrane applications especially in situations where there is insufficient probe for labelling by direct
methods.
Gene Images Random-Prime Labelling and Detection Systems may be used with either the detection
reagent CDP-Star for high sensitivity applications, or with ECF substrate for quantification on fluorescence
scanning instrumentation. Gene Images Random-Prime is especially recommended for high sensitivity
Northern applications.
Confidence The use of fluorescein-dUTP allows a simple and rapid (30 minute) probe labelling assay to be
performed by monitoring the fluorescence of labelled probes on a UV transilluminator. This enables the
efficiency of the labelling reaction to be checked before proceeding with the hybridization.
Stability Probes are stable for at least 9 months under recommended conditions minimizing the requirement
for
continual labelling of frequently used probes.
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Gene Images 3’-Oligolabelling and Detection
Gene Images™ 3’-Oligolabelling system is based on the labelling of standard unmodified
oligonucleotide sequences with fluoresceindUTP in a reaction catalysed by terminal
deoxynucleotidyl transferase. The optimized protocol results in a tail of 6-8 nucleotides, which
provides good sensitivity with low background, and does not interfere with the specificity of
hybridization. The use of fluorescein as the label allows the efficiency of the labelling reaction to be
checked using a fluorescence assay before hybridization.
Protocol Summary
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Probe labelling
Standard oligonucleotides are tailed with fluorescein-dUTP using the enzyme terminal deoxynucleotidyl transferase.
There is no need to purify the probe before hybridization.
Optional rapid labelling assay
Labelling efficiency can be checked by spotting a small aliquot of labelled probe onto Hybond-N+ membrane, washing to
remove unincorporated fluorescein and visualizing on a transilluminator or fluorescence scanner.
Hybridization
For optimum performance use the recommended hybridization buffer.
Detection
Chemiluminescence with CDP-Star: Hybridized blots are detected with CDP-Star reagent. Following a two minute
incubation, blots are exposed to autoradiography film for 1 to 2 hours or detected using a light collection device.
or
Chemifluorescence with ECF:
Hybridized blots are detected with ECF substrate. Non-fluorescent substrate is catalysed by alkaline phosphatase to
produce a fluorescent signal which accumulates over time; low sensitivity applications yield results after 1 hour; high
sensitivity applications usually require overnight incubation.
Recommended Applications
The 3’ -Oligolabelling system can be used to label probes for a wide variety of applications. The indirect labelling
method and high sensitivity makes it especially suited to oligo screening applications requiring a high degree of
stringency control.
Ease of use Simple protocols, and ready-to-use reagents ensures first-time success.
Confidence The use of fluorescein-dUTP allows a simple and rapid (30 minute) probe labelling assay to be
performed by monitoring the fluorescence of labelled probes on a UV transilluminator. This enables the efficiency
of the labelling reaction to be checked before proceeding with the hybridization. Use with any oligonucleotide, special
synthesis is not required.
Stability Labelled probes are stable for at least 9 months, under recommended conditions allowing batches of probe
to be prepared and stored until needed.
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ECL Direct Labelling and Detection System
The ECL Direct™ nucleic acid labelling and detection system is based on the direct labelling of DNA
or RNA probes with the enzyme horseradish peroxidase (HRP) in a simple chemical reaction.
Labelling takes only 10 minutes in a single tube reaction, and the resulting probe can be used
directly in hybridization experiments without further purification. Detection of hybridized probe is
achieved by generation of light via HRP catalysed oxidation of luminol with the use of an enhancer
maximizing light output.
Protocol Summary
Probe labelling
The labelling solution is added to the unlabelled, denatured single-stranded DNA or RNA probe. The positively charged
HRP complex is bound electrostatically to the negatively charged DNA. Glutaraldehyde is added to covalently cross-link
the HRP to the probe. There is no need to purify the probe before hybridization. Labelled probes can be stores in 50%
glycerol for several months at -15°C to -30°C.
Hybridization
The labelled probe is hybridized to the blot using the specially formulated ECL Gold Buffer, which stabilizes the activity of
the enzyme. Following a 15 minute pre-hybridization, hybridization with probe is performed overnight. For colony or
plaque screens a 2 to 4 hour hybridization is sufficient.
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Detection
The hybridized blot is soaked in the detection reagent. Where the probe is bound there is peroxidase-catalysed oxidation
of luminol and subsequent enhanced chemiluminescence. The resulting light signal is detected on autoradiography film.
Recommended Applications
ECL Direct™ is a fast and easy system for high to medium target amount applications such as colony/plaque screens,
dot blots, genome mapping, and PCR* product analysis. It is particularly useful for applications which require a blot to
be re-probed several times and screening applications requiring rapid throughput and results.
Ease of use Simple protocol coupled with high initial signal output makes it the most rapid non-radioactive system
available.
Speed Less than 4 hours from probe labelling to detection in high target amount applications with no lengthy antibody
steps.
Ease of re-probing HRP is inactivated by the chemiluminescent reaction therefore no need to strip blots before
reprobing. This saves time and avoids possible membrane damage.
Consistency Consistent results combining strong signals with very low backgrounds on nylon membranes.
Convenience Convenient, ready-to-use ECL Direct Gold hybridization buffer formulated with an exclusive rate
enhancer*.
Efficiency DNA or RNA probes are labelled equally efficiently.
Stability Probes can be stored for at least 3 months in 50% glycerol, avoiding the need for frequent labelling.
Choosing a radioactive labelling system
Labelling with 32P-labelled nucleotides remains the most sensitive and robust technology available.
Radiolabelled probes offer the following benefits:
Sensitivity 32P-labelled probes offer the highest level of sensitivity, ideal for detection where there is a very low
abundance of target.
Prolonged emission Radioactively labelled blots continue to emit signal for several weeks enabling multiple exposures
and long exposure times to be carried out as required.
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Reliability Radioactive labelling systems are very forgiving. Precise optimization of hybridization conditions is less
critical, and hence less time is used determining ideal hybridization and stringency conditions.
Flexibility Incorporation of radiolabelled nucleotides into a probe can be controlled by the labelling conditions. Therefore
probes can be produced with differing specific activities and incorporation levels can be measured accurately, allowing
exact probe concentrations to be determined.
Choice of radiolabel
The selection of radiolabel for a particular application depends on the level of sensitivity and resolution required.
For most membrane hybridization techniques sensitivity is most important, so a high-emission energy label will
provide sensitive results with shorter exposure times but resolution will be compromised.
In applications where resolution is most important, such as microsatellite analysis and sequencing, a lower
energyemitting isotope will give improved resolution, but longer exposure times will be required.
The three most widely used isotopes in the life science field are:
P For high-sensitivity membrane applications 32P is the label of choice due to its high ®-energy and the elevated specific
32
activity of
P-labelled probes. Labelled nucleotides with a specific activity of >110 TBq/mmol, >3000 Ci/mMol are
32
available for these applications.
P With the advantage of a lower emission energy, 33P offers increased resolution as compared to 32P. It may be used for
33
membrane hybridizations, but its lower energy emission means that longer exposure times are required. It is ideally
suited to sequencing and in situ hybridization applications.
S This label can be used for hybridizations but is not recommended because of its low emission energy. However, it
35
provides high resolution and is suited to sequencing and in situ hybridization applications.
Choice of labelling method
Random prime The most widely used method for the uniform labelling of DNA to provide high label density probes.
Ready-To-Go™ DNA Labelling Beads, Rediprime™ II, Megaprime™ and Multiprime™ are all based on the random prime
technique which uses random sequence hexamers or nonamers to prime DNA synthesis on a denatured DNA template
at numerous sites along its length. The reaction uses the Klenow fragment of DNA polymerase I and leads to an efficient
use of labelled nucleotides and net synthesis of probe. Therefore, very small amounts of input DNA are required,
enabling high specific activity DNA probes to be produced with relatively small quantities of added label.
Nick translation This method provides uniformly labelled DNA probes by the introduction of random nicks into the
template by the action of DNase I and subsequent filling in by DNA polymerase I. The existing nucleotide sequence of
the DNA probe is renewed without net synthesis occurring. Nick translation can be used for the production of large
amounts of high-specific activity probes. NOT USED ANYMORE because unreliable (difficile bilanciare attività Dnasica)
End labelling This is the method of choice for labelling oligonucleotide probes. Either the 3’
or 5’
end can be labelled
by the use of different techniques. End-labelled oligonucleotide probes may be used for membrane hybridizations.
Probes labelled with 35S and 33P are suitable for use with in situ hybridization.
RNA labelling This technique produces radiolabelled RNA probes from inserts cloned into appropriate vectors. SP6 and
T7 RNA polymerase may be used to produce asymmetric probes from the same or different vectors. Asymmetric probes
are used in in situ hybridization applications to provide both positive results and negative controls.
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16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
Rediprime II DNA Labelling System
Amersham Biosciences ' premium radioactive labelling system consists of individually dispensed
reaction mixes which are dried in the presence of a stabilizer and a dye to make labelling of probes
easier. The system can be stored at 4°C or at room temperature ready for use.
ACDB
Rediprime II reaction mixes have been formulated using an improved exonuclease free Klenow to give
probes with specific activities of 1.9 x 109 dpm/mg or greater after 10 minutes incubation at 37° with the
majority of DNA substrates. When used with Redivue™ [32P]dCTP, Rediprime II reactions can be set up and
completed to produce a DNA probe ready for hybridization in less than 15 minutes.
Protocol Summary
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Recommended Applications
Labelling of DNA from a variety of sources to a high specific activity for use in Southern and Northern blot hybridizations.
The system is designed for use with Redivue [32P]dCTP with a specific activity of 110TBq/mmol, 3000 Ci/mmol.
Speed Quick and convenient protocol requires the addition of template and labelled nucleotide only.
Stability Ambient temperature stable, therefore can be stored at room temperature.
Flexibility DNA can be labelled in the presence of Low Melting Point agarose or restriction enzyme buffers.
Efficiency Each labelling mix can label up to 25 ng of DNA to a specific activity of >10 9 dpm/∝g.
5’-End Labelling Kit
The 5’-End Labelling Kit exploits an optimized exchange buffer and T4 polynucleotide kinase to label
oligonucleotides with or without a 5’-phosphate group. Labelling is complete within 30 minutes.
Protocol Summary
Recommended Applications
174
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Oligonucleotides labelled in this way are suitable for use in high target amount applications. For example as probes or
primers to track PCR products, or in gel-shift and fragment analysis assays.
Flexibility Very small fragments of both DNA and RNA can be labelled.
Reliability Location of the labelled group is known.
3’-End Labelling Kit
Terminal deoxynucleotidyl transferase adds deoxyribonucleotides onto the 3’-ends of DNA
fragments. It can be used in conjunction with 32P-, 33P- 35S- or 3H labelled nucleotides to label DNA for a
variety of applications.
Protocol Summary
Recommended Applications
One of the major applications for the 3’ -End Labelling Kit is in the production of 32P end-labelled oligonucleotide probes
for screening applications involving colony, plaque or PCR clones. 35S or 33P end-labelled probes are used for in situ
hybridization applications.
Flexibilty Template independent and all types of 3’ -Ends can be labelled.
Reliability Location of the labelled group is known.
Ready-To-Go PCR Beads
Ready-To-Go™ PCR Beads are pre-mixed, pre-dispensed, individual reactions designed for
performing PCR amplification. Each dried room-temperature stable bead contains Taq* DNA
polymerase, nucleotides and buffer, all optimized for standard PCR. Results are typically comparable
with, or superior to, those using pre-formulated, aqueous ‘master-mixes’.
Protocol Summary
Each pre-dispensed Ready-To-Go PCR Bead contains Taq DNA polymerase, nucleotides and buffer, all optimized for
PCR. Ready-To-Go PCR Beads are designed for 25 µl reactions. Simply add DNA template and primers and begin
temperature cycling.
The beads are provided in either 0.5 ml or 0.2 ml tubes that are compatible with most thermocyclers. The 0.2 ml tubes
come assembled in a convenient 96-well (8 x 12) plate format that allows individual strips of tubes to be easily removed.
This flexibility allows the use of either the entire 96-well plate, strips of 8 or individual 0.2 ml tubes.
Recommended Applications
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Ready-To-Go PCR Beads can be used with a variety of templates including genomic DNA, viral DNA, plasmid DNA and
cDNA. They provide an excellent source of probe template for both radioactive and non-radioactive labelling techniques.
In addition low levels of radioactivity may be directly incorporated for use in applications such as single stranded
conformational polymorphism (SSCP) assays.
Convienience PCR components are provided in preformulated, single dose beads, reducing risk of pipetting errors and
introducing contaminants. Pre-dispensed, individually packed PCR reactions, ensures a fresh reaction that dissolves
quickly in a PCR compatible tube.
Consistency Application testing ensures each batch of beads delivers consistent results.
Compatability Each reaction is provided in a thin-walled 0.5 ml or 0.2ml tube, which fit directly into most thermocyclers.
RNA Labelling Kit
The RNA Labelling Kit has been designed to give high-specific activity single-stranded RNA probes
in vitro. This kit contains RNase-free DNase I for template removal and pre-prepared dithiothreitol
(DTT) for added convenience. The kit comes with SP6 and T7 RNA polymerases and can also be used
with T3 RNA polymerase, which must be purchased separately.
Recommended Applications
For the generation of high specific activity RNA probes for membrane hybridization and in situ applications. Also full
length RNA probes for RNase protection studies.
Sensitivity RNA probes show higher sensitivity than equivalent nick-translated probes in both Northern and in situ
hybridizations.
Stability RNA:RNA hybrids are more stable than DNA:DNA or DNA:RNA hybrids, due to avoidance of reannealing and
stronger hydrogen bonding.
Specificity Removal of non-specific bound probe by treatment with RNase A which is very specific for singlestranded
RNA.
Rapid-hyb Buffer
Rapid-hyb™ Buffer is a rate enhancing hybridization buffer for rapid hybridization of radiolabelled
nucleic acid probes to membrane-bound targets. In some Northern blotting experiments Rapid-hyb
Buffer contributed to a five fold improvement in sensitivity.
Recommended Applications
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Rapid-hyb Buffer is optimized for use in a wide range of applications, including Southern, Northern, dot/slot blots and
colony/plaque lifts.
Speed Single-copy gene detection is possible after only a 2 hour hybridization with 32P-labelled probes.
High signal to noise ratio Inclusion of chemical blocking agents ensures low backgrounds.
Stability Stores at room temperature – ready to use without addition of carrier DNA.
Compatibility Compatible with DNA, RNA and oligonucleotide probes.
Versatility A wide range of hybridization temperatures (42°C – 70°C) can be used for optimal results.
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Tecnologie biomolecolari
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COMMONLY USED REAGENTS AND EQUIPMENT
This collection describes the preparation of buffers and reagents used in the manipulation of nucleic acids and proteins
(see Table 1). When preparing solutions, use deionized, distilled water and reagents of the highest grade available.
Sterilization⎯by filtration through a 0.22-um filter or by autoclaving⎯is recommended for most applications. Recipes
for the following can be found elsewhere in the manual: culture media, antibiotics (Table 5), lactose analogs (Table 4),
and enzyme buffers.
CAUTION: Handle strong acids and bases carefully.
Acid precipitation solution
1 M HCl
0.1 M sodium pyrophosphate
Nucleic acids can also be precipitated with a 10% (w/v) solution of trichloroacetic acid (TCA); however, this
recipe is cheaper, easier to prepare, and just as efficient.
Ammonium acetate, 10 M
Dissolve 385.4 g ammonium acetate in 150 ml H2O
Add H2O to 500 ml
BBS (BES-buffered solution), 2×
50 mM N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES; Calbiochem)
280 mM NaCl
1.5 mM Na2HPO4, pH 6.95
800 ml H2O
Adjust pH to 6.95 with room temperature 1 N NaOH
H2O to 1 liter
Filter sterilize through a 0.45-um nitrocellulose filter (Nalgene)
Store in aliquots at −20°C (can be frozen and thawed repeatedly)
The pH of this solution is critical (pH 6.95 to 6.98). When a new batch of 2× BES buffer is prepared, its pH
should be checked against a reference stock prepared (and tested) earlier.
CaCl2, 1 M
147 g CaCl2⋅2H2O
H2O to 1 liter
Denhardt solution, 100×
10 g Ficoll 400
10 g polyvinylpyrrolidone
10 g bovine serum albumin (Pentax Fraction V; Miles Laboratories)
H2O to 500 ml
Filter sterilize and store at −20°C in 25-ml aliquots
Dithiothreitol (DTT), 1 M
Dissolve 15.45 g DTT in 100 ml H2O
Store at −20°C
EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid), 0.5 M (pH 8.0)
Dissolve 186.1 g Na2EDTA⋅2H2O in 700 ml H2O
Adjust pH to 8.0 with 10 M NaOH (~50 ml)
Add H2O to 1 liter
Ethidium bromide, 10 mg/ml
Dissolve 0.2 g ethidium bromide in 20 ml H2O
Mix well and store at 4°C in dark
178
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CAUTION: Ethidium bromide is a mutagen and must be handled carefully.
HBSS (Hanks balanced salt solution)
5.4 mM KCl
0.3 mM Na2HPO4
0.4 mM KH2PO4
4.2 mM NaHCO3
1.3 mM CaCl2
0.5 mM MgCl2
0.6 mM MgSO4
137 mM NaCl
5.6 mM D-glucose
0.02% phenol red (optional)
Add H2O to l liter and adjust pH to 7.4
HBSS can be purchased from Biofluids or Whittaker. HBSS may be made or purchased without CaCl2 and
MgCl2. These are optional components that usually have no effect on an experiment. In some cases, however,
their presence may be detrimental to a procedure. Consult the individual protocol to see if the presence or
absence of these components is recommended in the materials list.
HCl, 1 M
Mix in the following order:
913.8 ml H2O
86.2 ml concentrated HCl
HeBS (HEPES-buffered saline) solution, 2×
16.4 g NaCl
11.9 g HEPES acid
0.21 g Na2HPO4
800 ml H2O
Titrate to pH 7.05 with 5 N NaOH
Add H2O to 1 liter
Filter sterilize through a 0.45-um nitrocellulose filter
Test for transfection efficiency and store at −20°C in 50-ml aliquots
An exact pH is extremely important for efficient transfection. The optimal pH range is 7.05 to 7.12.
KCl, 1 M
74.6 g KCl
H2O to 1 liter
MgCl2, 1 M
20.3 g MgCl2⋅6 H2O
H2O to 100 ml
MgSO4, 1 M
24.6 g MgSO4⋅7 H2O
H2O to 100 ml
MOPS buffer
0.2 M MOPS [3-(N-morpholino)-propanesulfonic acid], pH 7.0
0.5 M sodium acetate
0.01 M EDTA
Store in the dark and discard if it turns yellow
NaCl, 5 M
292 g NaCl
H2O to 1 liter
NaOH, 10 M
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Dissolve 400 g NaOH in 450 ml H2O
Add H2O to 1 liter
PBS (phosphate-buffered saline)
10× stock solution, 1 liter:
80 g NaCl
2 g KCl
11.5 g Na2HPO4⋅7 H2O
2 g KH2PO4
Working solution, pH ~7.3:
137 mM NaCl
2.7 mM KCl
4.3 mM Na2HPO4⋅7 H2O
1.4 mM KH2PO4
Potassium acetate buffer, 0.1 M
Solution A: 11.55 ml glacial acetic acid/liter (0.2 M).
Solution B: 19.6 g potassium acetate (KC2H3O2)/liter (0.2 M).
Referring to Table 2 for desired pH, mix the indicated volumes of solutions A and B, then dilute with H2O to
100 ml.
This may be made as a 5- or 10-fold concentrate by scaling up the amount of potassium acetate in the same
volume. Acetate buffers show concentration-dependent pH changes, so check concentrate pH by diluting an
aliquot to the final concentration.
To prepare buffers with pH intermediate between the points listed in Table2, prepare closest higher pH, then
titrate with solution A.
Potassium phosphate buffer, 0.1 M
Solution A: 27.2 g KH2PO4 per liter (0.2 M).
Solution B: 34.8 g K2HPO4 per liter (0.2 M).
Referring to Table 3 for desired pH, mix the indicated volumes of solutions A and B, then dilute with H2O to
200 ml.
This may be made as a 5- or 10-fold concentrate by scaling up the amount of potassium phosphate in the same
volume. Phosphate buffers show concentration-dependent pH changes, so check concentrate pH by diluting an
aliquot to the final concentration.
SDS 10%
50 g Sodium dodecyl sulfate disodium salt
H2O to 500 ml
Scaldare 400 ml di H2O a circa 60-70°C, aggiungere SDS mantenendo la soluzione in agitazione
Aggiungere H2O a 500 ml
SDS electrophoresis buffer, 5×
15.1 g Tris base
72.0 g glycine
5.0 g SDS
H2O to 1000 ml
Dilute to 1× or 2× for working solution, as appropriate
Store up to 1 month at 0° to 4°C
Do not adjust the pH of the stock solution, as the solution is pH 8.3 when diluted.
SED (standard enzyme diluent)
20 mM Tris⋅Cl, pH 7.5
500 ug/ml bovine serum albumin (Pentax Fraction V)
10 mM α-mercaptoethanol
Store at 4°C for up to 1 month
180
16 aprile 2010
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Sodium acetate, 3 M
Dissolve 408 g sodium acetate⋅3 H2O in 800 ml H2O
Add H2O to 1 liter
Adjust pH to 4.8 or 5.2 (as desired) with 3 M acetic acid
Sodium acetate buffer, 0.1 M
Solution A: 11.55 ml glacial acetic acid/liter (0.2 M).
Solution B: 27.2 g sodium acetate (NaC2H3O2⋅3 H2O)/liter (0.2 M).
Referring to Table 2 for desired pH, mix the indicated volumes of solutions A and B, then dilute with H2O to
100 ml. (See Potassium acetate buffer recipe for further details.)
Sodium phosphate buffer, 0.1 M
Solution A: 27.6 g NaH2PO4⋅ H2O per liter (0.2 M).
Solution B: 53.65 g Na2HPO4⋅7 H2O per liter (0.2 M).
Referring to Table A.2.3 for desired pH, mix the indicated volumes of solutions A and B, then dilute with H2O
to 200 ml. (See Potassium phosphate buffer recipe for further details.)
SSC (sodium chloride/sodium citrate), 20×
3 M NaCl (175 g/liter)
0.3 M Na3citrate⋅2 H2O (88 g/liter)
Adjust pH to 7.0 with 1 M HCl
STE buffer
10 mM Tris⋅Cl, pH 7.5
10 mM NaCl
1 mM EDTA, pH 8.0
TAE (Tris/acetate/EDTA) electrophoresis buffer
50× stock solution:
242 g Tris base
57.1 ml glacial acetic acid
37.2 g Na2EDTA⋅2 H2O
H2O to 1 liter
Working solution, pH ~8.5:
40 mM Tris⋅acetate
2 mM Na2EDTA⋅2 H2O
TBE (Tris/borate/EDTA) electrophoresis buffer
10× stock solution, 1 liter:
108 g Tris base (890 mM)
55 g boric acid (890 mM)
40 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0 (see recipe; 20 mM)
TE (Tris/EDTA) buffer
10 mM Tris⋅Cl, pH 7.4, 7.5, or 8.0 (or other pH; see recipe)
1 mM EDTA, pH 8.0
TEA (triethanolamine) solution
50 mM triethanolamine, pH ~11.5
0.1% Triton X-100
0.15 M NaCl
Add Triton X-100 as a 10% stock sterilized by Millipore filtration and stored in the dark to prevent
photooxidation (stock is stable 5 years at room temperature).
TEN (Tris/EDTA/NaCl) solution
40 mM Tris⋅Cl, pH 7.5
181
16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
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1 mM EDTA, pH 8.0
150 mM NaCl
Store up to 6 months at room temperature
TM buffer, 10×
100 mM Tris⋅Cl, pH 8.0
100 mM MgCl2
Tris-buffered saline (TBS)
100 mM Tris⋅Cl, pH 7.5
0.9% (w/v) NaCl (150 mM)
Store up to several months at 4°C
Tris⋅Cl [tris(hydroxymethyl)aminomethane], 1 M
Dissolve 121 g Tris base in 800 ml H2O
Adjust to desired pH with concentrated HCl
Mix and add H2O to 1 liter
Approximately 70 ml of HCl is needed to achieve a pH 7.4 solution, and approximately 42 ml for a solution
that is pH 8.0.
NOTE: The pH of Tris buffers changes significantly with temperature, decreasing approximately 0.028 pH
units per 1°C. Tris-buffered solutions should be adjusted to the desired pH at the temperature at which they
will be used. Because the pKa of Tris is 8.08, Tris should not be used as a buffer below pH ~7.2 or above pH
~9.0.
TTBS (Tween 20/TBS)
0.1% Tween 20 in Tris-buffered saline (TBS; see recipe)
Store up to several months at 4°C
Table 1 Molarities and Specific Gravities of Concentrated Acids and Bases
Acid/base
Molecular
% by
Molarity
1 M solution
weight
weight
(approx.)
(ml/liter)
Acids
Acetic acid (glacial)
60.05
99.6
17.4
57.5
Formic acid
46.03
90
23.6
42.4
98
25.9
38.5
Hydrochloric acid
36.46
36
11.6
85.9
Nitric acid
63.01
70
15.7
63.7
Perchloric acid
100.46
60
9.2
108.8
72
12.2
82.1
Phosphoric acid
98.00
85
14.7
67.8
Sulfuric acid
98.07
98
18.3
54.5
Bases
Ammonium hydroxide
35.0
28
14.8
67.6
Potassium hydroxide
56.11
45
11.6
82.2
Potassium hydroxide
56.11
50
13.4
74.6
Sodium hydroxide
40.0
50
19.1
52.4
Table 2 Preparation of 0.1 M Sodium and Potassium Acetate Buffersa
Desired
Solution A
Solution B
pH
(ml)
(ml)
3.6
46.3
3.7
3.8
44.0
6.0
4.0
41.0
9.0
4.2
36.8
13.2
4.4
30.5
19.5
4.6
25.5
24.5
4.8
20.0
30.0
182
Specific
gravity
1.05
1.205
1.22
1.18
1.42
1.54
1.70
1.70
1.835
0.90
1.447
1.51
1.53
16 aprile 2010
5.0
5.2
5.4
5.6
Tecnologie biomolecolari
14.8
10.5
8.8
4.8
Massimo Delledonne
35.2
39.5
41.2
45.2
a Adapted by permission from CRC, 1975.
Table 3 Preparation of 0.1 M Sodium and Potassium Phosphate Buffersa
Desired
Solution A (ml)
Solution B (ml)
Desired
pH
pH
5.7
93.5
6.5
6.9
5.8
92.0
8.0
7.0
5.9
90.0
10.0
7.1
6.0
87.7
12.3
7.2
6.1
85.0
15.0
7.3
6.2
81.5
18.5
7.4
6.3
77.5
22.5
7.5
6.4
73.5
26.5
7.6
6.5
68.5
31.5
7.7
6.6
62.5
37.5
7.8
6.7
56.5
43.5
7.9
6.8
51.0
49.0
8.0
a Adapted by permission from CRC, 1975.
Solution A (ml)
Solution B (ml)
45.0
39.0
33.0
28.0
23.0
19.0
16.0
13.0
10.5
8.5
7.0
5.3
55.0
61.0
67.0
72.0
77.0
81.0
84.0
87.0
90.5
91.5
93.0
94.7
Table 4 Lactose Analogs Used in DNA Cloning Technology
Stock
concentrationa
100 mM
Use
Characteristics
Very effective inducer
20 mg/ml
(dissolved in
N,N dimethyl
formamide)
Identification of lacZ+ bacteria,
especially useful for detecting βgalactosidase made by
recombinant vectors
10 mM
β-galactosidase assays
Phenyl-β-D-galacto-side (Pgal)
2 mg/ml
Selection for lac constitutive
mutants
Orthonitrophenyl-β-D-thiogalacto-side
(TONPG)
10 mM
Selection for lac- mutants
Nonmetabolizable
inducer
Noninducing chromogenic
substrate of β-galactosidase
(cleavage of Xgal results in blue
color); production of blue color
independent of lacY gene product
Chromogenic substrate of βgalactosidase (cleavage of ONPG
results in yellow color)
Inducer of the lactose operon
in vivo; lactose is converted into
allolactose by β-galactosidase
Noninducing substrate of βgalactosidase; uptake partly
dependent on lacY gene product
Transported into cells by lac
permease (the lacY gene product);
inhibits cell growth at high
concentration
Galactoside
Isopropyl-1-thio-β-D-galactoside
(IPTG)
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-Dgalactoside (Xgal)
Orthonitrophenyl-β-D-galactoside
(ONPG)
54-Ο-β-D-Galacto-pyranosyl D-glucose
(allolactose)
183
16 aprile 2010
Tecnologie biomolecolari
Massimo Delledonne
From The RED BOOK BULLETIN of Current Protocols in Molecular Biology:
184
28 settembre 2005
Tecnologie biomolecolari
185
Massimo Delledonne
![mutazioni genetiche [al DNA] effetti evolutivi [fetali] effetti tardivi](http://s1.studylibit.com/store/data/004205334_1-d8ada56ee9f5184276979f04a9a248a9-300x300.png)
