UTILIZZO OTTIMALE DEI TEST
DI II° LIVELLO PER TALASSEMIA
Dr.ssa Anna Ravani
Laboratorio di Genetica Molecolare
Servizio di Genetica Medica
Azienda Ospedaliera-Universitaria S.Anna
FERRARA
EMOGLOBINOPATIE: EZIOPATOGENESI
TALASSEMIE:
PROTEINA ASSENTE
PROTEINA RIDOTTA
VARIANTI EMOGLOBINICHE:
PROTEINA MODIFICATA
FUNZIONE CONSERVATA
FUNZIONE RIDOTTA
O ASSENTE
β- talassemia
Diminuita o assente sintesi di catene β globiniche
Eccesso di catene α globiniche
Aggregati e precipitati di α globine nei precursori eritroidi
Danno cellulare e distruzione dei precursori a livello
midollare
Eritropoiesi inefficace
GENI
GLOBINICI
MUTAZIONI NEL GENE β−GLOBINICO
LEGENDA:
ROSSO: codone β°39
β°
GIALLO: IVS I-110
VERDE: IVS I-6
BLU: IVS I-1
FUCSIA: Hb Lepore
AZZURRO: Hb S
NERO: IVS II-745
ARANCIO: IVS II-1
BIANCO: Altri difetti
ß ° c o d .3 9
β
ß + IV S 1 - n t 1 1 0
ß + IV S 1 - n t 6
ß ° IV S 1 - n t 1
ß + IV S 2 - n t 7 4 5
ß° c o d . 6
ß+
-8 7
ß ° IV S 2 - n t 1
ß T h tipo Sic ilia
H b Le p o r e
Hb S
Hb C
Hb E
ß +I V S 2 n t 8 5 0
ß+
-1 01
ß+ -92
ß°c o d 3 0
ß°c o d 4 4
ß+ -86
ß +I V S 1
nt5
ß +I V S 2 n t 6 5 4
ß°c o d 5 1
ß°c o d 8
ß°c o d 5 9
ß°c o d 5
ß°c o d 7 6
ß + n t +2 2
ANEMIA FALCIFORME
DELEZIONI del gene beta globinico o del cluster beta-like causa di talassemia
DIAGNOSTICA RICHIESTA AL II° LIVELLO
RISCHIO DI COPPIA:
•CARATTERIZZAZIONE DEL DIFETTO MOLECOLARE
•DIAGNOSI DIFFERENZIALE BETA/ALFA/DELTA
TALASSEMIA
DIAGNOSI INCERTA IN SOGGETTI SINGOLI:
•DIAGNOSI DIFFERENZIALE BETA/ALFA/DELTA
TALASSEMIA
DIAGNOSI MOLECOLARE COMPLEMENTARE A QUELLA
CLINICA, PER PROGRAMMAZIONE TERAPEUTICA IN
SOGGETTI CON PATOLOGIA:
•CARATTERIZZAZIONE DEL DIFETTO MOLECOLARE
•IDENTIFICAZIONE FATTORI GENETICI MODIFICATORI DEL
FENOTIPO
CARATTERIZZAZIONE DEL DIFETTO MOLECOLARE
CAUSA DI BETA TALASSEMIA
METODICHE UTILIZZATE
RDB
SEQUENZIAMENTO DIRETTO GENE BETA GLOBINICO
GAP – PCR per delezioni nel cluster beta globinico
Diagnostica
-
PCR
REVERSE DOT BLOT - Mutazioni gene β−globinico
1
2
3
4
5
C
Campione n°1 - Eterozigote Cod. 39
Campione n°2 - Normale
Campione n°3 - Eterozigote Cod. 39
Campione n°4 - Eterozigote IVS1-nt6
Campione n°5 - Eterozigote IVS2-nt745
Sequenziamento automatico
Sequenza gene beta globinico:
Mutazione in eterozigosi C→T cod.39 gene beta globinico
GAP-PCR
Delezioni di dimensioni variabili che rimuovono i geni β e δ
globinici (es. δβ talassemia Sicilia).
WM 1 2 3 4 5
b WM 1 2 3 4 5 b
δ β TALASSEMIA
Lane1, 3: Soggetti normali
Lane 2, 4,5: Eterozigoti δβ° talassemia
Gap-PCR: delezione
Gene β: controllo
DIAGNOSI DIFFERENZIALE
METODICHE UTILIZZATE
LONG RANGE PCR per delezioni nei geni alfa globinici
SEQUENZIAMENTO DIRETTO per geni beta, delta, gamma ed alfa
globinici
GAP – PCR per delezioni nel cluster beta globinico
CLUSTER α−GLOBINICO:
GRANDI DELEZIONI
LONG RANGE PCR per identificazione di delezioni ed
inserzioni del cluster alfa globinico
WM6
1 2 3 4
b
WM6 1 2 3 4
b
DELEZIONE -(α)3.7 [A, B, C]
TRIPLICAZIONE ααα anti 3.7 [T37,D,F,G]
Lane 1: Soggetto normale
Lane 1-2-3: Soggetti normali
Lane 2 – 3: Soggetti eterozigoti
Lane 4: Soggetto portatore della triplicazione
Lane 4: Soggetto omozigote
A
D
C
L
ζ
5’MED
ψα
G
B
L
α2
F
T37
α1
E
3’MED
5’-20.5
B
WM 6 1 2 c
3 4 c
WM6 1 2 3 c 4 5 6 c WM6
POINT MUTATIONS [α1: T37, B -- α2 : A, D]
Lane 1-2: Wild type
Lane 3: Heterozygote αNcoI ( α2 gene)
Lane 4-5: Wild type
Lane 6: Heterozygote αHphI (α2 gene)
Lane 7-8: Wild type (α1 gene)
LARGE MEDITERRANEAN
DELETIONS
Lane1: Wild type
Lane 2: Heterozygote –MED [5’MED, 3’MED,L,D]
Lane 3: Wild type
Lane 4: Heterozygote -(α)20 [-20.5, B, L, D]
A
D
C
L
ζ
5’MED
ψα
G
T37
B
L
α2
F
α1
E
3’MED
5’-20.5
7 8 c
B
Sequenza geni α−globinici:
Mutazione puntiforme codon d’inizio gene α2-globinico
DIAGNOSTICA RICHIESTA AL II° LIVELLO
RISCHIO DI COPPIA:
•CARATTERIZZAZIONE DEL DIFETTO MOLECOLARE
•DIAGNOSI DIFFERENZIALE BETA/ALFA/DELTA
TALASSEMIA
DIAGNOSI INCERTA IN SOGGETTI SINGOLI:
•DIAGNOSI DIFFERENZIALE BETA/ALFA/DELTA
TALASSEMIA
DIAGNOSI MOLECOLARE COMPLEMENTARE A QUELLA
CLINICA, PER PROGRAMMAZIONE TERAPEUTICA IN
SOGGETTI CON PATOLOGIA:
•CARATTERIZZAZIONE DEL DIFETTO MOLECOLARE
•IDENTIFICAZIONE FATTORI GENETICI MODIFICATORI DEL
FENOTIPO
RISCHIO DI COPPIA
•ENTRAMBI PORTATORI ACCERTATI DI BETA TALASSEMIA:
OCCORRE IDENTIFICARE IL DIFETTO MOLECOLARE PER DEFINIRE LA
GRAVITA’ DEL RISCHIO PER LA PROLE E PER POTER EFFETTUARE
UNA EVENTUALE DIAGNOSI PRENATALE
•CONDIZIONE DI PORTATORE BETA DUBBIA IN UNO O ENTRAMBI I
PARTNER:
OCCORRE ANALIZZARE I VARI GENI GLOBINICI PER STABILIRE
L’EFFETTIVO RISCHIO PER LA COPPIA
•SOSPETTO DI ALFA TALASSEMIA IN ENTRAMBI I PARTNER:
OCCORRE TIPIZZARE IL DIFETTO MOLECOLARE PER STABILIRE
L’EVENTUALE RISCHIO DI IDROPE FETALE O EMOGLOBINOSI H
NELLA PROLE
DIAGNOSI INCERTA
•MUTAZIONI GENE BETA GLOBINICO MILD O SILENTI
•GENI ALFA GLOBINICI TRIPLICATI O QUADRUPLICATI
•COSEGREGAZIONE ALFA E BETA TALASSEMIA
•COSEGREGAZIONE BETA E DELTA TALASSEMIA
•DELTA-BETA TALASSEMIE (BASSA HB A2 - ELEVATA HB F)
•HPFH
•VARIANTI BETA O ALFA GLOBINICHE
•BETA TALASSEMIA DI TIPO DOMINANTE
Spettro di variabilità fenotipica
Talassemia
Eterozigote
(1 allele β coinvolto)
Talassemia intermedia
(1 o 2 alleli β coinvolti)
Talassemia
Major
(2 alleli β coinvolti)
DIAGNOSI INCERTA
Mutazioni
MILD o “SILENTI”
Mutazione mild
β+ nt –29 (A→G)
in eterozigosi
DIAGNOSI INCERTA
Presenza di triplo o quadruplo gene α
WM 1 2 3 4
b
TRIPLICAZIONE ααα anti 3.7
Lane 1-2-3: Soggetti normali
Lane 4: Soggetto portatore della
triplicazione
DIAGNOSI INCERTA
COSEGREGAZIONE ALFA E BETA TALASSEMIA
Il risultato fenotipico dipende dalle caratteristiche della β e
dell’ α talassemia cosegreganti
L’ampio range di espressioni fenotipiche degli alleli α
costituisce un ulteriore meccanismo di variabilità
WM6
1 2
3 4
b
Sequenza gene beta globinico:
Mutazione in eterozigosi C→T cod.39 gene beta globinico
DELEZIONE -(α)3.7 [A, B, C]
Lane 1: Soggetto normale
Lane 2 – 3: Soggetti eterozigoti
Lane 4: Soggetto omozigote
DIAGNOSI INCERTA
COSEGREGAZIONE DI BETA E DELTA TALASSEMIA
L’effetto fenotipico piu’ evidente è la normalizzazione
della quota di Hb A2.
I parametri emocromocitometrici restano alterati
Hb A2 Yalousa
δ Codon 27 (GCC->TCC)
Mutazione frameshift β° Cod.6 (−Α)
DIAGNOSI INCERTA
DELTA-BETA TALASSEMIE (BASSA HB A2 - ELEVATA HB F)
•Delezioni di dimensioni variabili che rimuovono i geni β e δ
globinici (es. δβ talassemia Sicilia).
WM 1 2 3 4 5
b WM 1 2 3 4 5 b
δ β TALASSEMIA
Lane1, 3: Soggetti normali
Lane 2, 4,5: Eterozigoti δβ° talassemia
Gap-PCR: delezione
Gene β: controllo
DIAGNOSI INCERTA
•HPFH
•Cosegregazione di HPFH dovuta a singole mutazioni puntiformi
nel promotore di uno del geni γ globinici (es.: –158 G γ).
Polimorfismo Gγ
-158 C / T
http://globin.cse.psu.edu/
Welcome to the Globin Gene Server
Total entries in database: 1233
Total hemoglobin variant entries: 926
Total thalassemia entries: 355
Total entries in both variant and thalassemia categories: 48
VARIANTI EMOGLOBINICHE attualmente di maggior
interesse patogenetico ed epidemiologico:
Hb S – Hb C – Hb E – Hb Lepore – Hb Hasharon
Eterozigosi per Hb E [GAG>AAG] Cod. 26
Glu > Lys
Eterozigosi per Hb S [GAG > GTG] Cod. 6
Glu > Val
Identificazione Hb Lepore mediante PCR + Gel di agarosio
Amplificazione specifica
per Hb Lepore
WM 1 2 3 4 5
Amplificazione specifica per
Hb A1, normale
WM 1 2 3 4 5
1 - Soggetto normale
2, 4, 5 – Soggetti eterozigoti per Hb Lepore
3 - Soggetto omozigote per Hb Lepore
Sequenza geni α−globinici:
Sequenza gene di fusione α2α1:
1:sequenza normale - 2: sequenza con variante emoglobinica Hb Hasharon (Asp His)
1
2
DIAGNOSI INCERTA
•Eterozigosi per mutazioni che producono una catena
β-globinica altamente instabile
(β-talassemia con trasmissione di tipo dominante)
DIAGNOSTICA MOLECOLARE EMOGLOBINOPATIE
mediante sequenziamento diretto su ABI PRISM 3100
TEMPI DI
ATTESA
DIAGNOSTICA
BETA
TALASSEMIA
48 ore
DIAGNOSTICA
ALFA
TALASSEMIA
10 giorni
(Estrazione
PCR
Sequenziamento
Refertazione)
(Estrazione
PCR
Sequenziamento
Refertazione)
DETECTION
RATE
99%
Mutazioni
Note e
Mutazioni
Nuove
70%
Mutazioni
Puntiformi o
piccole delezioni
Note e Nuove
LABORATORIO di GENETICA MOLECOLARE
GENETICA MEDICA DI FERRARA
Responsabile: Dr.ssa Alessandra Ferlini
Dr.ssa Anna Ravani
Dr.ssa Bernardetta Dolcini
Dr.ssa Anna Venturoli
Dr.ssa Marina Taddei Masieri
Dr.ssa Alessandra Brandi
Dr.ssa Francesca Gualandi
Dr.ssa Paola Rimessi
Dr.ssa Cecilia Trabanelli
Dr.ssa Marcella Neri
Dr. Pietro Spittali
Dr. Matteo Bovolenta
