bunyavirus (toscanavirus) - Sezione di Microbiologia

FLAVIVIRUS (WEST NILE VIRUS, VIRUS DELLE ENCEFALITI DA ZECCHE)
BUNYAVIRUS (TOSCANAVIRUS)
Prof. O.E. Varnier – Dott.ssa Martini Isabella
Università degli Studi di Genova
Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia A.A. 2013-2014
Corso Integrato di Malattie Infettive e Microbiologia Clinica
Reovirus
Calicivirus
Norovirus
FLAVIVIRUS
Membri della famiglia Flaviviridae
Flavivirus – Caratteristiche e classificazione

Genere include > 70 virus; molti Arbovirus. (= trasmessi agli uomini da artropodi
vettori) → termine deriva da classificazione “datata”: arthropod-borne viruses.

Causano una varietà di patologie incluse encefaliti e febbri emorragiche.


I virus più importani dal punto di vista clinico sono:
Dengue Virus (DENV)
West Nile virus (WNV)
Japanese encephalitis virus (JEV)
Yellow Fever Virus

Tropismo per monociti e macrofagi, piccoli vasi (cellule R.E.) e cellule SNC, fegato etc.

Ampio spettro d’ospite: in grado di infettare, oltre all’uomo, mammiferi selvatici e
domestici e non-mammiferi (topi, uccelli, rettili, pipistrelli).

Diffusione in Italia: WNV in vasta zona pianura padana (Veneto-Emilia-Lombardia):
animali da allevamento infetti e sporadici casi umani; TBEV nelle regioni del nord-est.

Moltiplicano in colture cellulari di ≠ specie animali e nelle uova embrionate di pollo.

Con antisieri policlonali classificati i membri del genere Flavivirus in 8 complessi
antigenici (sierogruppi), corrispondenti a caratteristiche biologiche/ epidemiologiche.

Morfologia – Genus Flavivirus
Famiglia: Flaviviridae
Generi: Flavivirus, Pestivirus, Hepacitivirus
Dimensioni: virione sferico con diametro ~50 nm;
 Pericapside: Involucro fosfolipidico in cui espresse la proteina di membrana M
(membrane) e la glicoproteina E (envelope).
 Proteina E media legame del
virus e la fusione; ha attività
emagglutinante e induce produzione
Ab neutralizzanti.
 Proteina M è un piccolo frammento
proteolitico ottenuto da precursore
prM durante la maturazione virale.
 Capside: a simmetria icosaedrica;
formato da proteina C (capsidica).
 Genoma: RNA lineare a singolo
filamento a polarità+(11 kb)

Morfologia


Forma immatura: trimeri di proteine E e prM; prM copre parte che protrude.
Maturazione virale: proteolisi di prM che diventa proteina M mentre proteine E
subiscono progressivo riarrangiamento fino ad assumere una configurazione di
dimeri “head-to-tail” giacenti parallelamente a doppio strato fosfolipidico.
Morfologia -Genoma





Genoma: RNA singolo filamento a polarità + (ssRNA+); 11 kb.
Contiene singola ORF (Open Reading Frame) codificante per una poliproteina e
fiancheggiato da due NCR (NonCoding Regions) che hanno un ruolo nel processo di
traduzione del genoma.
CAP all'estremo 5’, non ha poly-A al 3' dove invece presenta una struttura a loop.
Estremità 3’: 8 Non-Structural proteins (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, 2K, NS4B, NS5)
Estremità 5’: 3 structural proteins (Capsid, prM, Envelope)
Replicazione - ssRNA+
1
3a
2
3b
LA REPLICAZIONE VIRALE

E’ stato dimostrato che diverse molecole della superficie cellulare interagiscono con
i flavivirus ma ad oggi sono stati caratterizzati solo alcuni R.

Flaviviruses possono utilizzare R multipli in differenti tipi di cellule ed in differenti
specie ospiti:

Es. sembra che WNV utilizzi la molecola DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific
Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin) quale Recettore per
infettare cellule dendritiche (antigen presenting cells del sistema immunitario).

Altre proteine sono state identificate come R dei flavivirus: αvβ3 integrin, GRP78
(BiP) e CD14.

Glicosaminoglicani solfatati (es. heparan sulfate) hanno dimostrato di rivestire un
ruolo importante nell’attacco iniziale dei Flavivirus alle cellule target.
Replicazione
A. Interazione con R cellulari e endocitosi → endosoma → compartimento endocitico
pre-lisosomale (pH 5.5)
B. Basso PH induce fusione virus con membrana vescicola → rilascio del genoma virale.
C. Genoma è utilizzato come mRNA
per la sintesi proteica.
 Un sola grossa poliproteina viene
tradotta dal genoma del virione.
 Poliproteina scissa da proteasi
(dell’ospite e virali) in singole
proteine virali strutturali e non strutturali,
compresa la RdRp.
 Alcune proteine strutturali restano nel
citoplasma (proteina C) altre inserite
nella membrana del R.E. (glicoproteina prM, E)
Replicazione
D. RdRp produce filamento (−) dal genoma e lo replica in tanti RNA+ genomici virali
(processo avviene in associazione a membrana perinucleare)
 Proteine strutturali, nel citoplasma, formano capside in cui viene inserito il genoma.
E. Capside (immaturo) lega E.R. e gemma
all’interno (gemmazione intracellulare).
acquisendo prM e E→ trasporto
attraverso E.R. al Golgi.
F. Dal Golgi → vescicole
contenenti particelle virali verso
membrana cellulare.
In questa fase abbiamo maturazione
del virus con clivaggio di prM , ad opera
della proteina del Golgi, furina.
Clivaggio in: pr (rilasciata) + M (envelope).
G. Rilascio del virus maturo
Patogenesi

Infezione dell’uomo attraverso puntura di un artropode infetto (zanzara, zecca) che
acquisisce l’infezione cibandosi del sangue di un vertebrato viremico.

Perpetuarsi della trasmissione dei flavivirus è dipendente dal ciclo di amplificazione
virale insetto vettore – ospite vertebrato che funziona da «serbatoio» (reservoir).

West Nile Virus/Virus dell’encefalite di St. Louis (encefaliti trasmesse da zanzare):
ospiti intermedi sono gli uccelli selvatici.

Le zanzare risultano infettate per tutta la vita,
che dura da poche settimane ad alcuni mesi,
in assenza di malattia, mentre gli animali
domestici e l’uomo, che risulta essere
l’ospite occasionale, manifestano i segni
clinici di un’encefalite fatale.
Patogenesi
Nelle encefaliti trasmesse da zecche, il virus (TBEV) viene trasferito ai successivi stadi
di sviluppo durante la muta (trasmissione tra stadi) e può anche passare di
generazione in generazione attraverso la via transovarica: in questo caso
l’artropode e insieme serbatoio e vettore.
 Il virus trasmesso dalle zecche infetta
diversi animali, selvatici o domestici
(roditori, caprioli, ovini, caprini) che
contribuiscono al mantenimento del
ciclo di trasmissione dell’infezione.
 Gli uccelli, molto probabilmente,
contribuiscono a trasportare
passivamente zecche infette anche a
notevole distanza durante le loro
migrazioni.

Patogenesi

I virus si moltiplicano nelle cellule epiteliali del tratto digerente dell’artropode →
infettano le ghiandole salivari, dove si moltiplicano attivamente: infezione
persistente in assenza di malattia.

Quando vettore punge l’ospite, rigurgita la saliva contenente i virioni, che si
replicano nei tessuti locali (monociti e macrofagi) e successivamente, nei linfonodi
regionali → circolo sanguigno → viremia primaria → moltiplicazione massiva nelle
cellule del sistema reticolo-endoteliale → viremia secondaria → infezione organi
bersaglio a seconda del tropismo tissutale (cervello, fegato, cute, miocardio,
muscolatura scheletrica).

Virus induce necrosi cellulare che degenera in un’infiammazione e provoca febbre.
Patogenesi

Maggior parte delle infezioni decorre in modo asintomatico, dal momento che la
risposta immunitaria umorale e cellulare e in grado di limitare il processo infettivo.

Occasionalmente l’infezione puo decorrere in una malattia sistemica grave.

Flavivirus piu comunemente responsabili di encefaliti sono:

West Nile Virus

Virus di St. Louis

Virus dell’encefalite giapponese

TBEV (Tick Borne Encephalitis Virus)
capacità del virus di attraversare la
barriera ematoencefalica
infiltrazione cellule mononucleate alle
meningi, degenerazione neuronale
associata a fagocitosi
Risposta Immunitara

Aumento del titolo anticorpale è generalmente correlato ad un
miglioramento del quadro sintomatologico.

Ab neutralizzanti sono sierotipo-specifici e persistono normalmente per
molti anni dopo l’infezione.

Immunità cellulare e umorale alle reinfezioni è sierotipo-specifica e sembra
essere di lunga durata.
Vaccino profilassi

E possibile attuare una vaccino-profilassi nel caso del virus della febbre gialla.

Il vaccino e costituto dal ceppo attenuato 17D, coltivato in embrione di pollo






In grado di conferire un’immunita duratura in circa il 95% dei soggetti vaccinati, entro
10 giorni dall’inoculazione.
La vaccinazione è consigliata per i viaggiatori che si spostano in aree a elevata
endemia.
Esiste la possibilità di effettuare una vaccino-profilassi contro la TBE.
Vaccino, da tempo in uso in molti Paesi dell’Europa centrale e settentrionale, utilizzato
anche in Italia (dal 2006).
Ciclo vaccinale prevede la somministrazione di tre dosi ( tempo 0, 1-3 mesi, 5-12 mesi)
con richiami a cadenza triennale, per via intramuscolare → copertura del 96-100%.
Vaccinazione fortemente consigliata per le persone che, per motivi ludicoricreazionali (caccia, raccolta funghi, escursionismo) o lavorativi (guardie forestali), si
recano in zone a rischio (nord-est Italia).
ACCERTAMENTI MICROBIOLOGICI, DIAGNOSTICA

Nella fase viremica (~ 3 gg dall’infezione): tecniche molecolari (PCR) o
immunoenzimatiche (ELISA) per il rilevamento di Ag virali.

A ~ 1 settimana dall’infezione è possibile diagnosi sierologica mediante riscontro di
Ab delle classi IgM o IgG con metodiche ELISA, inibizione dell’emoagglutinazione,
neutralizzazione anticorpale.
Sintomi clinici
ACCERTAMENTI MICROBIOLOGICI, DIAGNOSTICA

Isolamento possibile in adeguato substrato cellulare durante la fase acuta della
malattia (fluido cerebrospinale, tessuti infetti, sangue).

Colture cellulari su varie linee: es. WNV può essere isolato su diverse linee cellulari
di mammiferi ed in particolare su RK-13 (rabbit kidney), VERO (African green
monkey kidney), BHK (baby hamster Kidney), su cellule di zanzara, sulle quali non si
evidenzia effetto citopatico, su uova embrionate di pollo.

Per virus potenzialmente responsabili di meningiti è possibile isolamento attraverso
inoculazione intracerebrale in topi neonati → encefalite e morte.

Metodiche di complessa esecuzione e che necessitano di strutture laboratoristiche
speciali: laboratorio livello di sicurezza biologica BSL3 o stabulario.

Utilizzate eventualmente nella prassi veterinaria delle zoonosi per isolamento ad es.
WNV da tessuto cerebrale per i cavalli (midollo spinale e cervello), cuore, cervello
e intestino per i volatili e su pool di visceri (contenente cuore e cervello) per gli altri
mammiferi.
ACCERTAMENTI MICROBIOLOGICI, DIAGNOSTICA

La diagnosi in casi di malattia neurologica acuta costituisce una problematica
aperta: numerosi sono i virus potenzialmente responsabili di meningiti o
meningoencefaliti (Herpes, Coxackie, Phlebovirus, Flavivirus etc.) e in alcuni casi
impossibile fare diagnosi differenziale → problema della cross-reattività dei test
sierologici per la diagnosi dei virus trasmessi da artropodi quali i Flavivirus
(es. per TBEV (Encefalite da zecche) reazioni crociate con altri flavivirus, quali virus della febbre
gialla, febbre Dengue, encefalite giapponese, nonché con i virus strettamente imparentati, Powassan,
Louping ill, febbre emorragica di Omsk, Kyasanur Forest Disease e Alkhurma)
DIAGNOSI DIFFERENZIALE con PCR da fluido cerebrospinale, sangue
(tecniche colturali difficilmente impiegate)
DIAGNOSTICA- West Nile Virus






A causa dell’assoluta aspecificità dei sintomi clinici, la diagnosi di infezione da
WNV viene effettuata esclusivamente attraverso test di laboratorio
Elisa o Immunofluorescenza effettuati su siero e dove indicato, su fluido
cerebrospinale, per la ricerca di Ab IgM-IgG.
IgM possono persistere per periodi anche molto lunghi (fino a un anno), pertanto la
positività ai test può indicare anche un’infezione pregressa.
I campioni raccolti entro 8 giorni dall’insorgenza dei sintomi potrebbero risultare
negativi, pertanto è consigliabile ripetere a distanza di tempo il test di laboratorio
prima di escludere la malattia.
In alternativa (o in parallelo): diagnosi con PCR su campioni di siero e CSF.
L’isolamento virale è riservato a strutture laboratoristiche specialistiche.
BUNYAVIRUS
Membri della famiglia Bunyavirus
1
2
3
4
Bunyavirus – Caratteristiche e classificazione







Nome da Bunyamwera (Uganda) dove, dalle zanzare, è stato isolato il primo virus.
La maggior parte sono arbovirus (arthropod-borne viruses) essendo prevalentemente
diffusi tramite artropodi (zanzare, zecche, flebotomi).
Fanno eccezione gli hantavirus - robovirus (rodent borne virus) – che infettano solo i
mammiferi e sono diffusi tramite le urine e le feci di roditori.
Caratteristiche strutturali/biochimiche e analisi filogenetica hanno consentito
suddivisione in 4 generi principali di interesse medico, suddivisi in 35 sierogruppi con
oltre 330 tipi e sottotipi.
Phlebovirus comprendono circa 37 specie, raggruppate in 9 sierotipi
Virioni sono sensibili al trattamento con detergenti, formaldeide e calore.
Moltiplicano in colture cellulari di ≠ specie animali (vertebrati e invertebrati). In
particolare in un’ampia varietà di linee cellulari d’origine renale, incluse le cellule
Vero e in cellule macrofagiche di topo, dove sono in grado di produrre un evidente
effetto citopatico (altrimenti infezione evidenziata con immunofluorescenza).
Bunyavirus – Caratteristiche e classificazione

Infettano uomo e vertebrati in genere (esiste anche 5° genere Bunyavirus delle piante).

Tropismo per endotelio vascolare, SNC, fegato, rene, polmoni.

Diffusione in Italia: Toscana Virus
isolato per la prima volta nel 1971
all’Argentario (Grosseto).
Successivamente riscontrato in Piemonte,
Emilia Romagna, Marche, Umbria, Lazio,
Campania, Sardegna.
(sieroprevalenza 22% nell’Italia Centrale).
Morfologia – Bunyavirus
Famiglia: Bunyavirus
Generi: Bunyavirus, Nairovirus, Phlebovirus, Hantavirus

Dimensioni: virione sferico con diametro ~ 80-120 nm;

Pericapside: involucro fosfolipidico, espresse 2 glicoproteine virus specifiche (G1/G2)
Formano proiezioni superficiali
Bersaglio Ab neutralizzanti
Capacità emoagglutinanti
Responsabili dello spettro d’ospite e del tropismo
di tessuto (legame con cellula ospite e fusione)





Non contiene proteine di matrice

Nucleocapside elicoidale
3 segmenti di RNA a singola elica
2 proteine: proteina nucleocapsidica (N)
RNA-polimerasi (L).
Morfologia - Genoma




RNA singolo filamento polarità negativa (ssRNA-), 11-12 kb totali, segmentato in 3 parti.
Segmento L (grande): codifica per la proteina L (RNA polimerasi-RNA dipendente).
Segmento M (medio): codifica per le proteine superficiali G1 e G2.
Segmento S (piccolo): codifica per la proteina nucleocapsidica N.
Replicazione – ssRNA-
Replicazione
1. Interazione G1 con R cellulari e endocitosi R mediata→ endosoma
2. Endosoma a compartimento
endocitico pre-lisosomale (pH 5.5)
Basso PH induce fusione virus con
membrana vescicola →
rilascio del genoma virale nel
citoplasma (uncoating).
3. RNA genomico è trascritto in mRNA
dalla polimerasi virale (RdRp).
4. Traduzione degli mRNA e sintesi
delle proteine virali:
glicoproteine (G1 e G2) glicosilate
nel Golgi ed espresse in membrana
Golgi/membrana citoplasmatica.
Replicazione
5.
Replicazione citoplasmatica
dell’RNA genomico (ssRNA-)
attraverso la produzione di un
intermedio di RNA
complementare a polarità
positiva ssRNA+ (cRNA).
Assemblaggio della proteina N
virale con genoma virale
neoformato (ssRNA+) →
nucleocapside
→ trasporto al Golgi
→ trasporto a membrana
citoplasmatica
2 Vie
Replicazione
6.Formazione particelle virali mature
(nucleocapside + proteine dell’envelope)
→ gemmazione intracellulare nel Golgi.
Successiva fuoriuscita dal Golgi di
vescicole intracitoplasmatiche, contenenti
virione maturo, che, si fondono con
membrana cellulare (esocitosi)
rilasciando all’esterno il virus (7).
In alternativa: liberazione dei virioni
tramite lisi cellulare
→ in alcuni casi il nucleocapside è
trasportato nei pressi della membrana
plasmatica → rilascio del virus (7) per
gemmazione attraverso membrana
cellulare con acquisizione dell’envelope.
Patogenesi

Bunyavirus, con l’eccezione degli hantavirus, si replicano negli artropodi.

Persistenza in natura è legata alla possibilità di instaurare un ciclo artropode
vettore (zanzara, zecca o flebotomo) – ospite vertebrato [generalmente un piccolo
mammifero (roditori), ma anche uccelli] che diventa quindi il serbatoio del virus.

Nell’artropode: infezione persistente in assenza di malattia.

Alcuni bunyavirus (es. virus della febbre da flebotomi, presente in Italia, tipo napoletano o
tipo siciliano), sono trasmessi per via transovarica: in questo caso l’artropode e
insieme serbatoio e vettore.

Nel ciclo naturale l’uomo si ammala quando è punto da un artropode infetto, ma il
sangue umano raramente può infettare l’artropode, cosicché l’uomo rappresenta
l’ospite terminale.
Patogenesi

Virus moltiplicano in cellule epiteliali del tratto digerente dell’artropode →
infettano ghiandole salivari e moltiplicano.

Quando vettore punge l’ospite, rigurgita la saliva contenente i virioni → saliva
infetta penetra nei capillari e nei vasi linfatici.

Endotelio vascolare della cute e i linfonodi regionali rappresentano quindi il sito
primario di replicazione del virus → circolo sanguigno → viremia

Al termine della viremia, con comparsa Ab, ospite va incontro a guarigione.

Infezione è generalmente asintomatica, a meno che non sia stato infettato uno
specifico organo (endotelio vascolare, fegato, encefalo, reni, polmoni)→
nell’uomo manifestazioni patologiche caratteristiche del virus infettante.
Patogenesi
 Il
danno è prevalentemente attribuibile alla diretta invasione dei tessuti da
parte del virus, piuttosto che a una reazione infiammatoria mediata dall’ospite.
 La
risposta iniziale all’infezione da bunyavirus consiste nella produzione di
interferone (IFN).
 La
scomparsa del virus nel sangue si accompagna alla comparsa di anticorpi.
 IFN,
unitamente all’immunità umorale, svolge un ruolo protettivo sull’andamento
dell’infezione.
Vaccino profilassi

Virus della valle del Rift (Phlebovirus), sono stati allestiti vaccini per uso umano
preparati con virus inattivati con formalina.

Questi vaccini non sono ancora ottimali, poiché sono necessari diversi richiami per
ottenere un’adeguata risposta anticorpale.

Per la febbre emorragica con sindrome renale (Hantavirus) sono stati utilizzati diversi
tipi di vaccini inattivati nei confronti dei virus Hantaan e Seoul e numerosi vaccini
ricombinanti sono attualmente allo studio.

In assenza di vaccini efficaci in commercio, la prevenzione verso l’infezione da
bunyavirus (esclusi gli hantavirus) consiste nell’evitare il contatto tra l’uomo e
l’artropode vettore (repellenti, insetticidi, vestiti protettivi, zanzariere, tende).

Per quanto riguarda la prevenzione dell’infezione da hantavirus deve essere
effettuata principalmente con il controllo dei roditori.
ACCERTAMENTI MICROBIOLOGICI, DIAGNOSTICA

Diagnosi sierologica mediante riscontro di Ab delle classi IgM o IgG con metodiche
ELISA e immunofluorescenza indiretta (test inibizione dell’emoagglutinazione e
fissazione complemento ormai poco impiegati).

Presenza IgM nei sieri di pazienti in fase acuta deve essere confermta da IgG in
prelievo effettuato dopo circa 2 settimane.

Nella fase viremica possibile applicare tecniche immunoenzimatiche (ELISA) per il
rilevamento di Ag virali o indagini molecolari (RT-PCR) per l’amplificazione di
sequenze specifiche.

Nel caso di virus neurotropi: DIAGNOSI DIFFERENZIALE con PCR da fluido
cerebrospinale (CSF).

Disponibilità di colture cellulari permissive per isolamento ma applicazione in
strutture laboratoristiche specialistiche.

Per alcuni virus particolarmente pericolosi si rende indispensabile la disponibilità di
un laboratorio autorizzato al trattamento di agenti infettanti di classe 3 (es. Febbre
della Valle del Rift) e 4 (Virus della febbre emorragica di Crimea/Congo).
*USUV= Usutu virus, famiglia
Flaviviridae, genere
Flavivirus, trasmesso da
zanzare). Incluso nel gruppo
del Japanese encephalitis
virus (JEV) ed è strettamente
correlato a WNV.
*
Centro Riferimento Regionale Emergenze Microbiologiche
FLAVUVIRUS (WEST NILE VIRUS, VIRUS DELLE ENCEFALITI DA ZECCHE)
BUNYAVIRUS (TOSCANAVIRUS)
Prof. O.E. Varnier – Dott.ssa Martini Isabella
Università degli Studi di Genova
Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia A.A. 2013-2014
Corso Integrato di Malattie Infettive e Microbiologia Clinica