FLAVIVIRUS (WEST NILE VIRUS, VIRUS DELLE ENCEFALITI DA ZECCHE)
BUNYAVIRUS (TOSCANAVIRUS)
Prof. O.E. Varnier – Dott.ssa Martini Isabella
Università degli Studi di Genova
Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia A.A. 2013-2014
Corso Integrato di Malattie Infettive e Microbiologia Clinica
Reovirus
Calicivirus
Norovirus
FLAVIVIRUS
Membri della famiglia Flaviviridae
Flavivirus – Caratteristiche e classificazione
Genere include > 70 virus; molti Arbovirus. (= trasmessi agli uomini da artropodi
vettori) → termine deriva da classificazione “datata”: arthropod-borne viruses.
Causano una varietà di patologie incluse encefaliti e febbri emorragiche.
I virus più importani dal punto di vista clinico sono:
Dengue Virus (DENV)
West Nile virus (WNV)
Japanese encephalitis virus (JEV)
Yellow Fever Virus
Tropismo per monociti e macrofagi, piccoli vasi (cellule R.E.) e cellule SNC, fegato etc.
Ampio spettro d’ospite: in grado di infettare, oltre all’uomo, mammiferi selvatici e
domestici e non-mammiferi (topi, uccelli, rettili, pipistrelli).
Diffusione in Italia: WNV in vasta zona pianura padana (Veneto-Emilia-Lombardia):
animali da allevamento infetti e sporadici casi umani; TBEV nelle regioni del nord-est.
Moltiplicano in colture cellulari di ≠ specie animali e nelle uova embrionate di pollo.
Con antisieri policlonali classificati i membri del genere Flavivirus in 8 complessi
antigenici (sierogruppi), corrispondenti a caratteristiche biologiche/ epidemiologiche.
Morfologia – Genus Flavivirus
Famiglia: Flaviviridae
Generi: Flavivirus, Pestivirus, Hepacitivirus
Dimensioni: virione sferico con diametro ~50 nm;
Pericapside: Involucro fosfolipidico in cui espresse la proteina di membrana M
(membrane) e la glicoproteina E (envelope).
Proteina E media legame del
virus e la fusione; ha attività
emagglutinante e induce produzione
Ab neutralizzanti.
Proteina M è un piccolo frammento
proteolitico ottenuto da precursore
prM durante la maturazione virale.
Capside: a simmetria icosaedrica;
formato da proteina C (capsidica).
Genoma: RNA lineare a singolo
filamento a polarità+(11 kb)
Morfologia
Forma immatura: trimeri di proteine E e prM; prM copre parte che protrude.
Maturazione virale: proteolisi di prM che diventa proteina M mentre proteine E
subiscono progressivo riarrangiamento fino ad assumere una configurazione di
dimeri “head-to-tail” giacenti parallelamente a doppio strato fosfolipidico.
Morfologia -Genoma
Genoma: RNA singolo filamento a polarità + (ssRNA+); 11 kb.
Contiene singola ORF (Open Reading Frame) codificante per una poliproteina e
fiancheggiato da due NCR (NonCoding Regions) che hanno un ruolo nel processo di
traduzione del genoma.
CAP all'estremo 5’, non ha poly-A al 3' dove invece presenta una struttura a loop.
Estremità 3’: 8 Non-Structural proteins (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, 2K, NS4B, NS5)
Estremità 5’: 3 structural proteins (Capsid, prM, Envelope)
Replicazione - ssRNA+
1
3a
2
3b
LA REPLICAZIONE VIRALE
E’ stato dimostrato che diverse molecole della superficie cellulare interagiscono con
i flavivirus ma ad oggi sono stati caratterizzati solo alcuni R.
Flaviviruses possono utilizzare R multipli in differenti tipi di cellule ed in differenti
specie ospiti:
Es. sembra che WNV utilizzi la molecola DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific
Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin) quale Recettore per
infettare cellule dendritiche (antigen presenting cells del sistema immunitario).
Altre proteine sono state identificate come R dei flavivirus: αvβ3 integrin, GRP78
(BiP) e CD14.
Glicosaminoglicani solfatati (es. heparan sulfate) hanno dimostrato di rivestire un
ruolo importante nell’attacco iniziale dei Flavivirus alle cellule target.
Replicazione
A. Interazione con R cellulari e endocitosi → endosoma → compartimento endocitico
pre-lisosomale (pH 5.5)
B. Basso PH induce fusione virus con membrana vescicola → rilascio del genoma virale.
C. Genoma è utilizzato come mRNA
per la sintesi proteica.
Un sola grossa poliproteina viene
tradotta dal genoma del virione.
Poliproteina scissa da proteasi
(dell’ospite e virali) in singole
proteine virali strutturali e non strutturali,
compresa la RdRp.
Alcune proteine strutturali restano nel
citoplasma (proteina C) altre inserite
nella membrana del R.E. (glicoproteina prM, E)
Replicazione
D. RdRp produce filamento (−) dal genoma e lo replica in tanti RNA+ genomici virali
(processo avviene in associazione a membrana perinucleare)
Proteine strutturali, nel citoplasma, formano capside in cui viene inserito il genoma.
E. Capside (immaturo) lega E.R. e gemma
all’interno (gemmazione intracellulare).
acquisendo prM e E→ trasporto
attraverso E.R. al Golgi.
F. Dal Golgi → vescicole
contenenti particelle virali verso
membrana cellulare.
In questa fase abbiamo maturazione
del virus con clivaggio di prM , ad opera
della proteina del Golgi, furina.
Clivaggio in: pr (rilasciata) + M (envelope).
G. Rilascio del virus maturo
Patogenesi
Infezione dell’uomo attraverso puntura di un artropode infetto (zanzara, zecca) che
acquisisce l’infezione cibandosi del sangue di un vertebrato viremico.
Perpetuarsi della trasmissione dei flavivirus è dipendente dal ciclo di amplificazione
virale insetto vettore – ospite vertebrato che funziona da «serbatoio» (reservoir).
West Nile Virus/Virus dell’encefalite di St. Louis (encefaliti trasmesse da zanzare):
ospiti intermedi sono gli uccelli selvatici.
Le zanzare risultano infettate per tutta la vita,
che dura da poche settimane ad alcuni mesi,
in assenza di malattia, mentre gli animali
domestici e l’uomo, che risulta essere
l’ospite occasionale, manifestano i segni
clinici di un’encefalite fatale.
Patogenesi
Nelle encefaliti trasmesse da zecche, il virus (TBEV) viene trasferito ai successivi stadi
di sviluppo durante la muta (trasmissione tra stadi) e può anche passare di
generazione in generazione attraverso la via transovarica: in questo caso
l’artropode e insieme serbatoio e vettore.
Il virus trasmesso dalle zecche infetta
diversi animali, selvatici o domestici
(roditori, caprioli, ovini, caprini) che
contribuiscono al mantenimento del
ciclo di trasmissione dell’infezione.
Gli uccelli, molto probabilmente,
contribuiscono a trasportare
passivamente zecche infette anche a
notevole distanza durante le loro
migrazioni.
Patogenesi
I virus si moltiplicano nelle cellule epiteliali del tratto digerente dell’artropode →
infettano le ghiandole salivari, dove si moltiplicano attivamente: infezione
persistente in assenza di malattia.
Quando vettore punge l’ospite, rigurgita la saliva contenente i virioni, che si
replicano nei tessuti locali (monociti e macrofagi) e successivamente, nei linfonodi
regionali → circolo sanguigno → viremia primaria → moltiplicazione massiva nelle
cellule del sistema reticolo-endoteliale → viremia secondaria → infezione organi
bersaglio a seconda del tropismo tissutale (cervello, fegato, cute, miocardio,
muscolatura scheletrica).
Virus induce necrosi cellulare che degenera in un’infiammazione e provoca febbre.
Patogenesi
Maggior parte delle infezioni decorre in modo asintomatico, dal momento che la
risposta immunitaria umorale e cellulare e in grado di limitare il processo infettivo.
Occasionalmente l’infezione puo decorrere in una malattia sistemica grave.
Flavivirus piu comunemente responsabili di encefaliti sono:
West Nile Virus
Virus di St. Louis
Virus dell’encefalite giapponese
TBEV (Tick Borne Encephalitis Virus)
capacità del virus di attraversare la
barriera ematoencefalica
infiltrazione cellule mononucleate alle
meningi, degenerazione neuronale
associata a fagocitosi
Risposta Immunitara
Aumento del titolo anticorpale è generalmente correlato ad un
miglioramento del quadro sintomatologico.
Ab neutralizzanti sono sierotipo-specifici e persistono normalmente per
molti anni dopo l’infezione.
Immunità cellulare e umorale alle reinfezioni è sierotipo-specifica e sembra
essere di lunga durata.
Vaccino profilassi
E possibile attuare una vaccino-profilassi nel caso del virus della febbre gialla.
Il vaccino e costituto dal ceppo attenuato 17D, coltivato in embrione di pollo
In grado di conferire un’immunita duratura in circa il 95% dei soggetti vaccinati, entro
10 giorni dall’inoculazione.
La vaccinazione è consigliata per i viaggiatori che si spostano in aree a elevata
endemia.
Esiste la possibilità di effettuare una vaccino-profilassi contro la TBE.
Vaccino, da tempo in uso in molti Paesi dell’Europa centrale e settentrionale, utilizzato
anche in Italia (dal 2006).
Ciclo vaccinale prevede la somministrazione di tre dosi ( tempo 0, 1-3 mesi, 5-12 mesi)
con richiami a cadenza triennale, per via intramuscolare → copertura del 96-100%.
Vaccinazione fortemente consigliata per le persone che, per motivi ludicoricreazionali (caccia, raccolta funghi, escursionismo) o lavorativi (guardie forestali), si
recano in zone a rischio (nord-est Italia).
ACCERTAMENTI MICROBIOLOGICI, DIAGNOSTICA
Nella fase viremica (~ 3 gg dall’infezione): tecniche molecolari (PCR) o
immunoenzimatiche (ELISA) per il rilevamento di Ag virali.
A ~ 1 settimana dall’infezione è possibile diagnosi sierologica mediante riscontro di
Ab delle classi IgM o IgG con metodiche ELISA, inibizione dell’emoagglutinazione,
neutralizzazione anticorpale.
Sintomi clinici
ACCERTAMENTI MICROBIOLOGICI, DIAGNOSTICA
Isolamento possibile in adeguato substrato cellulare durante la fase acuta della
malattia (fluido cerebrospinale, tessuti infetti, sangue).
Colture cellulari su varie linee: es. WNV può essere isolato su diverse linee cellulari
di mammiferi ed in particolare su RK-13 (rabbit kidney), VERO (African green
monkey kidney), BHK (baby hamster Kidney), su cellule di zanzara, sulle quali non si
evidenzia effetto citopatico, su uova embrionate di pollo.
Per virus potenzialmente responsabili di meningiti è possibile isolamento attraverso
inoculazione intracerebrale in topi neonati → encefalite e morte.
Metodiche di complessa esecuzione e che necessitano di strutture laboratoristiche
speciali: laboratorio livello di sicurezza biologica BSL3 o stabulario.
Utilizzate eventualmente nella prassi veterinaria delle zoonosi per isolamento ad es.
WNV da tessuto cerebrale per i cavalli (midollo spinale e cervello), cuore, cervello
e intestino per i volatili e su pool di visceri (contenente cuore e cervello) per gli altri
mammiferi.
ACCERTAMENTI MICROBIOLOGICI, DIAGNOSTICA
La diagnosi in casi di malattia neurologica acuta costituisce una problematica
aperta: numerosi sono i virus potenzialmente responsabili di meningiti o
meningoencefaliti (Herpes, Coxackie, Phlebovirus, Flavivirus etc.) e in alcuni casi
impossibile fare diagnosi differenziale → problema della cross-reattività dei test
sierologici per la diagnosi dei virus trasmessi da artropodi quali i Flavivirus
(es. per TBEV (Encefalite da zecche) reazioni crociate con altri flavivirus, quali virus della febbre
gialla, febbre Dengue, encefalite giapponese, nonché con i virus strettamente imparentati, Powassan,
Louping ill, febbre emorragica di Omsk, Kyasanur Forest Disease e Alkhurma)
DIAGNOSI DIFFERENZIALE con PCR da fluido cerebrospinale, sangue
(tecniche colturali difficilmente impiegate)
DIAGNOSTICA- West Nile Virus
A causa dell’assoluta aspecificità dei sintomi clinici, la diagnosi di infezione da
WNV viene effettuata esclusivamente attraverso test di laboratorio
Elisa o Immunofluorescenza effettuati su siero e dove indicato, su fluido
cerebrospinale, per la ricerca di Ab IgM-IgG.
IgM possono persistere per periodi anche molto lunghi (fino a un anno), pertanto la
positività ai test può indicare anche un’infezione pregressa.
I campioni raccolti entro 8 giorni dall’insorgenza dei sintomi potrebbero risultare
negativi, pertanto è consigliabile ripetere a distanza di tempo il test di laboratorio
prima di escludere la malattia.
In alternativa (o in parallelo): diagnosi con PCR su campioni di siero e CSF.
L’isolamento virale è riservato a strutture laboratoristiche specialistiche.
BUNYAVIRUS
Membri della famiglia Bunyavirus
1
2
3
4
Bunyavirus – Caratteristiche e classificazione
Nome da Bunyamwera (Uganda) dove, dalle zanzare, è stato isolato il primo virus.
La maggior parte sono arbovirus (arthropod-borne viruses) essendo prevalentemente
diffusi tramite artropodi (zanzare, zecche, flebotomi).
Fanno eccezione gli hantavirus - robovirus (rodent borne virus) – che infettano solo i
mammiferi e sono diffusi tramite le urine e le feci di roditori.
Caratteristiche strutturali/biochimiche e analisi filogenetica hanno consentito
suddivisione in 4 generi principali di interesse medico, suddivisi in 35 sierogruppi con
oltre 330 tipi e sottotipi.
Phlebovirus comprendono circa 37 specie, raggruppate in 9 sierotipi
Virioni sono sensibili al trattamento con detergenti, formaldeide e calore.
Moltiplicano in colture cellulari di ≠ specie animali (vertebrati e invertebrati). In
particolare in un’ampia varietà di linee cellulari d’origine renale, incluse le cellule
Vero e in cellule macrofagiche di topo, dove sono in grado di produrre un evidente
effetto citopatico (altrimenti infezione evidenziata con immunofluorescenza).
Bunyavirus – Caratteristiche e classificazione
Infettano uomo e vertebrati in genere (esiste anche 5° genere Bunyavirus delle piante).
Tropismo per endotelio vascolare, SNC, fegato, rene, polmoni.
Diffusione in Italia: Toscana Virus
isolato per la prima volta nel 1971
all’Argentario (Grosseto).
Successivamente riscontrato in Piemonte,
Emilia Romagna, Marche, Umbria, Lazio,
Campania, Sardegna.
(sieroprevalenza 22% nell’Italia Centrale).
Morfologia – Bunyavirus
Famiglia: Bunyavirus
Generi: Bunyavirus, Nairovirus, Phlebovirus, Hantavirus
Dimensioni: virione sferico con diametro ~ 80-120 nm;
Pericapside: involucro fosfolipidico, espresse 2 glicoproteine virus specifiche (G1/G2)
Formano proiezioni superficiali
Bersaglio Ab neutralizzanti
Capacità emoagglutinanti
Responsabili dello spettro d’ospite e del tropismo
di tessuto (legame con cellula ospite e fusione)
Non contiene proteine di matrice
Nucleocapside elicoidale
3 segmenti di RNA a singola elica
2 proteine: proteina nucleocapsidica (N)
RNA-polimerasi (L).
Morfologia - Genoma
RNA singolo filamento polarità negativa (ssRNA-), 11-12 kb totali, segmentato in 3 parti.
Segmento L (grande): codifica per la proteina L (RNA polimerasi-RNA dipendente).
Segmento M (medio): codifica per le proteine superficiali G1 e G2.
Segmento S (piccolo): codifica per la proteina nucleocapsidica N.
Replicazione – ssRNA-
Replicazione
1. Interazione G1 con R cellulari e endocitosi R mediata→ endosoma
2. Endosoma a compartimento
endocitico pre-lisosomale (pH 5.5)
Basso PH induce fusione virus con
membrana vescicola →
rilascio del genoma virale nel
citoplasma (uncoating).
3. RNA genomico è trascritto in mRNA
dalla polimerasi virale (RdRp).
4. Traduzione degli mRNA e sintesi
delle proteine virali:
glicoproteine (G1 e G2) glicosilate
nel Golgi ed espresse in membrana
Golgi/membrana citoplasmatica.
Replicazione
5.
Replicazione citoplasmatica
dell’RNA genomico (ssRNA-)
attraverso la produzione di un
intermedio di RNA
complementare a polarità
positiva ssRNA+ (cRNA).
Assemblaggio della proteina N
virale con genoma virale
neoformato (ssRNA+) →
nucleocapside
→ trasporto al Golgi
→ trasporto a membrana
citoplasmatica
2 Vie
Replicazione
6.Formazione particelle virali mature
(nucleocapside + proteine dell’envelope)
→ gemmazione intracellulare nel Golgi.
Successiva fuoriuscita dal Golgi di
vescicole intracitoplasmatiche, contenenti
virione maturo, che, si fondono con
membrana cellulare (esocitosi)
rilasciando all’esterno il virus (7).
In alternativa: liberazione dei virioni
tramite lisi cellulare
→ in alcuni casi il nucleocapside è
trasportato nei pressi della membrana
plasmatica → rilascio del virus (7) per
gemmazione attraverso membrana
cellulare con acquisizione dell’envelope.
Patogenesi
Bunyavirus, con l’eccezione degli hantavirus, si replicano negli artropodi.
Persistenza in natura è legata alla possibilità di instaurare un ciclo artropode
vettore (zanzara, zecca o flebotomo) – ospite vertebrato [generalmente un piccolo
mammifero (roditori), ma anche uccelli] che diventa quindi il serbatoio del virus.
Nell’artropode: infezione persistente in assenza di malattia.
Alcuni bunyavirus (es. virus della febbre da flebotomi, presente in Italia, tipo napoletano o
tipo siciliano), sono trasmessi per via transovarica: in questo caso l’artropode e
insieme serbatoio e vettore.
Nel ciclo naturale l’uomo si ammala quando è punto da un artropode infetto, ma il
sangue umano raramente può infettare l’artropode, cosicché l’uomo rappresenta
l’ospite terminale.
Patogenesi
Virus moltiplicano in cellule epiteliali del tratto digerente dell’artropode →
infettano ghiandole salivari e moltiplicano.
Quando vettore punge l’ospite, rigurgita la saliva contenente i virioni → saliva
infetta penetra nei capillari e nei vasi linfatici.
Endotelio vascolare della cute e i linfonodi regionali rappresentano quindi il sito
primario di replicazione del virus → circolo sanguigno → viremia
Al termine della viremia, con comparsa Ab, ospite va incontro a guarigione.
Infezione è generalmente asintomatica, a meno che non sia stato infettato uno
specifico organo (endotelio vascolare, fegato, encefalo, reni, polmoni)→
nell’uomo manifestazioni patologiche caratteristiche del virus infettante.
Patogenesi
Il
danno è prevalentemente attribuibile alla diretta invasione dei tessuti da
parte del virus, piuttosto che a una reazione infiammatoria mediata dall’ospite.
La
risposta iniziale all’infezione da bunyavirus consiste nella produzione di
interferone (IFN).
La
scomparsa del virus nel sangue si accompagna alla comparsa di anticorpi.
IFN,
unitamente all’immunità umorale, svolge un ruolo protettivo sull’andamento
dell’infezione.
Vaccino profilassi
Virus della valle del Rift (Phlebovirus), sono stati allestiti vaccini per uso umano
preparati con virus inattivati con formalina.
Questi vaccini non sono ancora ottimali, poiché sono necessari diversi richiami per
ottenere un’adeguata risposta anticorpale.
Per la febbre emorragica con sindrome renale (Hantavirus) sono stati utilizzati diversi
tipi di vaccini inattivati nei confronti dei virus Hantaan e Seoul e numerosi vaccini
ricombinanti sono attualmente allo studio.
In assenza di vaccini efficaci in commercio, la prevenzione verso l’infezione da
bunyavirus (esclusi gli hantavirus) consiste nell’evitare il contatto tra l’uomo e
l’artropode vettore (repellenti, insetticidi, vestiti protettivi, zanzariere, tende).
Per quanto riguarda la prevenzione dell’infezione da hantavirus deve essere
effettuata principalmente con il controllo dei roditori.
ACCERTAMENTI MICROBIOLOGICI, DIAGNOSTICA
Diagnosi sierologica mediante riscontro di Ab delle classi IgM o IgG con metodiche
ELISA e immunofluorescenza indiretta (test inibizione dell’emoagglutinazione e
fissazione complemento ormai poco impiegati).
Presenza IgM nei sieri di pazienti in fase acuta deve essere confermta da IgG in
prelievo effettuato dopo circa 2 settimane.
Nella fase viremica possibile applicare tecniche immunoenzimatiche (ELISA) per il
rilevamento di Ag virali o indagini molecolari (RT-PCR) per l’amplificazione di
sequenze specifiche.
Nel caso di virus neurotropi: DIAGNOSI DIFFERENZIALE con PCR da fluido
cerebrospinale (CSF).
Disponibilità di colture cellulari permissive per isolamento ma applicazione in
strutture laboratoristiche specialistiche.
Per alcuni virus particolarmente pericolosi si rende indispensabile la disponibilità di
un laboratorio autorizzato al trattamento di agenti infettanti di classe 3 (es. Febbre
della Valle del Rift) e 4 (Virus della febbre emorragica di Crimea/Congo).
*USUV= Usutu virus, famiglia
Flaviviridae, genere
Flavivirus, trasmesso da
zanzare). Incluso nel gruppo
del Japanese encephalitis
virus (JEV) ed è strettamente
correlato a WNV.
*
Centro Riferimento Regionale Emergenze Microbiologiche
FLAVUVIRUS (WEST NILE VIRUS, VIRUS DELLE ENCEFALITI DA ZECCHE)
BUNYAVIRUS (TOSCANAVIRUS)
Prof. O.E. Varnier – Dott.ssa Martini Isabella
Università degli Studi di Genova
Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia A.A. 2013-2014
Corso Integrato di Malattie Infettive e Microbiologia Clinica
