Gene trapping

Ingegneria animale:
I topi reporter
Sara Della Torre
Adriana Maggi Lab
10.11.11
I reporters
Gene trapping
Animali reporter
Gene trapping
Trap mutagenesis
• SCOPO: inserzione di costrutto contenente gene
reporter (entrapment vector)
• CARATTERISTICA: integrazione casuale nel genoma.
L’integrazione “produttiva” porta il gene reporter
sotto la regolazione trascrizionale di un gene
endogeno
Gene trapping
Gene trapping
Elementi essenziali
Gene Trap
• ES embrionali di Topo o Uomo
• “Entrapment vector” contenente :
- gene reporter
- marker di selezione
Gene trapping
Elementi importanti per espressione di un gene e
utilizzati per il GENE TRAPPING
• Promotore: combinazione di elementi ai quali si lega
l’RNA polimerasi per iniziare la trascrizione di un gene
• Enhancer: corte sequenze che stimolano l’attività
trascrizionale di un promotore
• Poliadenilazione: aggiunta di circa 200 A all’estremità 3’
di un mRNA. La coda poly(A) è importante per la stabilità
dell’mRNA
Gene trapping
Vettori utilizzati per il GENE TRAPPING
• Gene trap vector
• Poly A trap vector
• Enhancer trap vector
• Promoter trap vector
Gene trapping
Geni reporter
• E.coli lacZ gene (produzione di β-Gal)
• Firefly luciferase gene
• Jelly fish green flourescence protein (GFP) gene
Gene trapping
Markers di selezione:
• POSITIVA:
Neomycin phosphotransferase gene (neoR)
Puromycin selection (Puro)
• NEGATIVA:
Herpes Simplex Thymidine kinase gene (hsv-tk)
Diphtheria toxin gene
Gene trapping
Gene
trapping
Gene
trapping
Gene trapping
Gene trapping
Gene trapping
Gene trapping
La strategia
Gene trapping
Il GENE TRAPPING consente:
• Identificazione NUOVI GENI
• Produzione di TOPI TRANSGENICI (KO)
• ANALISI dell’ESPRESSIONE di GENI
Gene trapping
Gene trapping
Attività di β-gal:
espressione di
differenti linee di
Gene Trapping
Gene trapping
Mice with a homozygous
gene trap vector insertion
in mgcRacGAP die
during pre-implantation
development
Mechanisms of Development, 2001
Gene trapping
The secretory trap-vector
Gene trapping
The secretory trap-vector
Gene trapping
The PLAP secretory trap vector
Leighton et al,
Nature 2001
To help identify subtle wiring defects against a background of normal axonal projections, we added a second marker, human
placental alkaline phosphatase (PLAP) and an internal ribosome entry site (IRES). PLAP is a glycosyl phosphatidylinositol
(GPI)-linked cell-surface protein that, when expressed transgenically in neurons, labels axons completely. When a gene is
trapped, the endogenous promoter and enhancer elements direct production of a bicistronic transcript that encodes two
proteins: the b-geo fusion to the endogenous protein and the PLAP protein, which is translated independently using the
IRES.
Gene trapping
Leighton et al,
Nature 2001
Gene trapping
Leighton et al,
Nature 2001
Gene trapping
Gene trapping
Gene trapping
Animali reporter
Inserimento di un gene codificante una proteina facilmente
identificabile e rilevabile
• SCOPO: la proteina reporter dà informazioni rapide e
dinamiche sugli eventi molecolari che si vogliono studiare
Generazione di un topo
reporter
La scelta del:
 SISTEMA di ingegneria animale
 REPORTER
bioluminescenza, fluorescenza, PET, NMR
 COSTRUTTO
IN VIVO IMAGING
MULTI-MODALITY MOLECULAR IMAGING IN LIVING SMALL ANIMALS
Bioluminescence
Optical imaging
Fluorescence
MicroPET
Nuclear imaging
Positron emission tomography
Micro SPECT
single-photon emission
computerized tomography
Functional Magnetic Nuclear Resonance
Ultrasound
IMAGING
Animali reporter
Reporter bioluminescenti e fluorescenti
Animali reporter
La luciferasi è uno dei geni reporter più utilizzati nei topi
• Gene ESOGENO
• Emivita breve
• Facilmente detectabile
Sequenze
regolatorie
Differenti GFPs
I geni reporter
GENE
B-Galattosidasi
(Batterica)
Ben caratterizzata, stabile,
rilevazione automatizzabile
Utile per studi di tipo
anatomico-funzionale
Presenza di attività endogena in
cellule di mammifero, enzima
tetramerico (risposta non
lineare)
Luciferasi
(Lucciola)
Alta attività specifica, mancanza
di attività endogena (basso bkg)
Richiede l’aggiunta di cofattore,
O2, ATP.
Applicabile a studi di
bioluminescenza in vivo
Ligandi per
sostanze
radiomarcate
Difficoltà nel generare i ligandi
radiomarcati
Utilizzabili per PET
fluorescent
proteins (GFP,
varianti RFP,
BFP)
Monomerico, non richiede
substrato, assente nei
mammiferi, varianti con diversa l
di fluorescenza. Bassa sensibilità
per mancanza di amplificazione
Applicabile a studi di
fluorescenza in vivo
Chimica dei geni reporter
Reporter a confronto
Reporter a confronto
Reporter a confronto
Applicazioni dei sistemi reporter
 Studio della funzione di promotore
 Studio di tipo anatomico/funzionale
 Studio di rilascio/sintesi di trasduttori del
segnale di promotore
 Studio di interazioni tra proteine
I sistemi reporter
Studio della funzione di promotore
reporter gene
reporter gene
Animali reporter
Il topo ERE-Luc
Luciferin + ATP + O2 = oxyluciferin + AMP + LIGHT
Activated
Estrogen Receptor
ERE-luc
transgenic mouse
Activated
Estrogen Receptor
+/-
+/TK
INSULATOR
( MAR )
ERE 2x
firefly luciferase
INSULATOR
( MAR )
luciferin + ATP = oxyluciferin + AMP + light
in vivo
BioluminescenceImaging,
imaging BLI
Bioluminescence
(CCD
camera)
(CCD
camera)
Ciana et al., 2001
ex vivo
Enzymatic
assay
Enzimatic assay
(luminomiter)
(luminometer)
Photon Emission
Il topo ERE-Luc come strumento per
studiare l’attività trascrizionale di ER
Treatment with 17-estradiol
Maggi et al., 2009
Il topo ERE-Luc come strumento per
studiare l’attività trascrizionale di ER
Stell et al., 2008
Animali reporter
Il topo PPRE-Luc
luciferase
Ciana, Biserni et al., Mol. Endo. 2007
Animali reporter
Studio di tipo anatomico/funzionale
Animali reporter:
GFP nude mouse
Nude mouse with ubiquitous GFP expression,
obtained by crossing nontransgenic nude mice
with the transgenic C57/B6 mouse in which the
β-actin promoter drives GFP expression in
essentially all tissues.
Red fluorescent protein (RFP)–expressing
human cancer cell lines, were
transplanted to the transgenic GFP nude
mice.
Dual-color fluorescence imaging enabled
visualization of human tumor–host
interaction by whole-body imaging and
at the cellular level in fresh and frozen
tissues.
Yang et al., CANCER RESEARCH 2004
Animali reporter:
mT/mG, a double-fluorescent Cre reporter mouse
mT/mG expresses
membrane-targeted tandem
dimer Tomato (mT)
mT/mG expresses
membrane-targeted green
fluorescent protein (mG)
prior to Cre-mediated excision
after Cre-mediated excision
Muzumdar et al., Genesis 2007
Animali reporter:
Global Double-Fluorescent Cre Reporter mouse
Ubiquitous mT labeling in mT/mG mice prior to recombination
Muzumdar et al., Genesis 2007
Animali reporter:
Global Double-Fluorescent Cre Reporter mouse
mG labeling in mT/mG mice after Cre-mediated recombination
Muzumdar et al., Genesis 2007
Mosaic and complementary expression after
Tamoxifen injection of mT/mG;actin-CreER mice
a. liver
hepatocytes
b. lung alveoli
c. intestinal villi
d. Crypts
e. Skin
f. kidney
glomerulus
g. kidney tubules
h. bone
i. smooth muscle
of the bladder
j. cardiac muscle
k. skeletal muscle
l. testes
Muzumdar et al., Genesis 2007
Animali reporter:
Global Double-Fluorescent Cre Reporter mouse
The double-fluorescent nature of mT/mG
provides several useful features:
- direct live visualization of recombined and non-recombined
cells at single cell resolution
- used to trace lineage and perform single or multi-cell mosaic
analysis due to the permanent genetic change that occurs with
Cre-mediated excision.
- tracing of axons and other fine processes.
- in vivo imaging of endogenous cells within mT/mG;Cre mice or
transplanted mT- or mG-labeled cells derived from these mice.
Muzumdar et al., Genesis 2007
Visualizzare connessioni neuronali
Il metodo Ramon y Cajal
Santiago Ramon y Cajal
Nobel Physiology or
Medicine 1906
One of Santiago Ramón y Cajal's original
preparations shows a pyramidal cell from
layer III of mouse cerebral cortex,
impregnated with the Golgi method.
“Connectomica” neuronale
a
b
c
a | Single-cell staining by dye impregnation (Ramón y Cajal staining method)
b | The introduction of diffusible or transportable labelling agents
c | Serial electron microscopy
Lichtman & Sanes, Nat Rev Neurosci 2008
La strategia BRAINBOW
Combinatorial expression of 3
distinct fluorescent proteins
can generate a large spectrum
of colours
Lichtman & Sanes,
Nat Rev Neurosci
2008
Animali reporter:
La strategia BRAINBOW
Lichtman & Sanes, Nat Rev Neurosci 2008
Animali reporter:
BRAINBOW test in vitro
Livet et al., Nature 2007
Animali reporter:
BRAINBOW (BRAIN+RAINBOW) mouse
Livet et al., Nature 2007
Animali reporter:
BRAINBOW (BRAIN+RAINBOW) mouse
a
b
a | A motor nerve innervating ear muscle.
b | An axon tract in the brainstem.
c | The hippocampal dentate gyrus.
c
Lichtman & Sanes, Nat Rev Neurosci 2008
Up to ∼160 colours were observed as a result of the co-integration of several tandem copies of
the transgene into the mouse genome and the independent recombination of each by Cre
recombinase
I sistemi reporter
Studio di rilascio/sintesi di trasduttori del segnale di promotore
Esempio: in vivo imaging del
signaling del calcio
Esempio: in vivo imaging del
signaling del calcio
Rogers et al
PLOS one
2007
I sistemi reporter
Studio di interazione tra proteine
Villalobos et al, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2007
Studio di interazione tra proteine
FRET: Fluorescence resonance energy transfer
BRET: Bioluminescence resonance energy transfer
.
Villalobos et al, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2007
Studio di interazione tra proteine:
cAMP reporter mouse
Studio di interazione tra proteine
Protein fragment complementation monitors protein interactions
as an increase in reporter activity caused by reversible
approximation of two fragments, which when separate are inactive,
yet when brought together reconstitute activity.
Villalobos et al, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2007
Applicazioni: studio di interazione
tra proteine
FKBP12-rapamycin binding domain of mTOR
Database & Consortium
Diagramma temporale
Database & Consortium
Database & Consortium
IKMC
Database & Consortium
MGI
Database & Consortium
Database & Consortium
Database & Consortium
Database & Consortium
Applicazioni pratiche dell’
Ingegneria animale
Transgenesi
standard
Gene
targeting
Studio di
funzione genica
(ricerca di base)

Modelli di
patologia umana

Produzione di
biofarmaci

Clonaggio
KO
condizionale
Animale
reporter







Screening di
farmaci
Produzione di
organi per
xenotrapianti


Studio di funzione genica
Ricerca di base
Inserimento di gene (o boost
dell’espressione di un gene)
tramite transgenesi standard
Palmiter et al, Nature, 1982
Delezione di un gene tramite
gene targeting
Studio di funzione genica
Ricerca di base
I topi LID-ERE-Luc
per comprendere il ruolo dell’IGF-1 circolante
Della Torre et al.,
Cell metabolism 2011
Modelli di patologia umana
Inserimento di gene (o boost
dell’espressione di un gene) tramite
transgenesi standard:
Delezione di un gene tramite gene
targeting:
• Apolipoproteina E: aterosclerosi
• Oncogeni (c-neu, c-myc, H-ras):
tumori
• Glucocerebrosidasi: malattia di
Gaucher
• Antigeni di istocompatibilità:
autoimmunità
• CFTR umana: fibrosi cistica
• β-globina umana: talassemia
• […]
• Recettore LDL: aterosclerosi
• APP umana: morbo di Alzheimer
Modelli di patologia umana
Esempio: modelli di overespressione di APP umana
precursore proteina amiloide) - malattia di Alzheimer
Lord A, Neurobiol Aging, 2006
Modelli di patologia umana
I topi SOD-PPRE-Luc
per comprendere il ruolo dei PPARs nella SLA
♂ hSOD1G93A
♀ PPRE-Luc
Ciana, Biserni et al., Mol Endocrinol., 2007
Gurney et al., Science, 1994
hSOD1G93A; PPRE-Luc
Benedusi et al.,
CONFIDENTIAL
luciferase
Modelli di patologia umana
Ovariectomia come modello di menopausa
OVX
ERE-LUC
INTACT
ERE-LUC
OVX
Modelli di patologia umana
Ovariectomia come modello di menopausa
ERE-LUC
INTACT
OVX
ERE-LUC
OVX
Della Torre et al., Endocrinology 2011
+ Emoglobina
+ tPA
+ GH
+ Insulina
Pro/contro del “biopharming”
Produzione di biofarmaci
Produzione di proteine ricombinanti
biologicamente attive nella ghiandola
mammaria di animali transgenici
Pro/contro del “biopharming”
Produzione di biofarmaci
Pro/contro del “biopharming”
Produzione di biofarmaci
Transgeni della ghiandola mammaria, sequenze promotrici e
organismi riceventi
Transgene
Promotore
Specie transgenica
Attivatore tissutale del plasminogeno ad azione prolungata proteina acida del siero
capra
Antitripsina α1
lattoglobulina β
pecora
Fattore di coagulazione IX
lattoglobulina β
pecora
Proteina solubile CD4
proteina acida del siero
topo
Lattoferrina
Caseina αs1
mucca
Urochinasi
Caseina αs2
topo
CFTR
Caseina β
topo
Interleuchina 2
Caseina β
coniglio
Pro/contro
del “biopharming”
Produzione
di biofarmaci
Pro e contro
• Abbondanza: 5–10g/L al giorno
paragonato ad 1 g/L delle cellule.
• Tempistiche: lunghi tempi per
messa a punto e validazione di
animali transgenici
• Costo
• Attesa della lattazione
• Adattabilità alle richieste
• Funzionalità: le proteine sono
folded in maniera naturale
• Raccolta: facile purificazione dal
latte
• Inserzione casuale: può causare
problemi all’animale
• Reazioni immunitarie: presenza
antigeni dell’animale dopo
purificazione del latte
Pro/contro del “biopharming”
Screening di farmaci
Promotore
attivato
REPORTER
• L’attività del promotore è osservata
in tempo reale e nel contesto
fisiologico dell’intero organismo
Pro/contro
del
“biopharming”
Screening di farmaci
Ovariectomia come modello di MENOPAUSA & SERMs
INTACT
ERE-Luc
OVX
SERMs: selective estrogen
receptor modulators
CE: conjugated estrogen
(Premarin)
BZA: bazedoxifene
OVX
ERE-Luc
+/- SERMs
TSEC: tissue selective estrogen
complex ,CE+BZA
RAL: raloxifene
Pro/contro
del
“biopharming”
Screening di farmaci
Ovariectomia come modello di MENOPAUSA & SERMs
Della Torre et al., Endocrinology 2011
Pro/contro
del
“biopharming”
Screening di farmaci
Ovariectomia come modello di MENOPAUSA & SERMs
Della Torre et al., Endocrinology 2011
Pro/contro
del
“biopharming”
Screening di farmaci
Ovariectomia come modello di MENOPAUSA & SERMs
Della Torre et al., Endocrinology 2011
Pro/contro
del “biopharming”
Screening
di farmaci
Che caratteristiche deve avere un animale reporter?
• Permettere di localizzare le aree
dove il composto è attivo
• Permettere di valutare la risposta
del farmaco dopo ripetute
somministrazioni
• Permettere la misurazione della
minima dose efficace
• Permettere di identificare siti di
accumulo in caso di somministrazioni
croniche
Produzione di organi per
xenotrapianti
Inserimento in animali transgenici
della fucosio-transferasi
Rigetto dovuto alla reattività degli
anticorpi umani verso le proteine
endoteliali esogene (che mancano di
uno zucchero, il fucosio)