Elucigene® CF-EU2v1
Guida al software di analisi
Prodotto da:
Gen-Probe Life Sciences Ltd.
Heron House
Oaks Business Park
Crewe Road
Wythenshawe
Manchester
M23 9HZ
Vendita, assistenza clienti e assistenza tecnica:
T: +49 (0) 6122 7076451
F: +49 (0) 6122 7076155
E: [email protected]
E: [email protected]
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Analisi GeneMapper
Introduzione
La sezione seguente descrive le procedure per l’analisi dei campioni di risultati Elucigene
CF-EU2v1 mediante i pacchetti software Applied Biosystems GeneMapper (versione 3.7
o superiore).
Processo di analisi
Il processo per l’analisi dei campioni è riepilogato nel diagramma di flusso riportato di seguito.
Analizzare i campioni amplificati su Genetic Analyzer
Aprire il software GeneMapper
Aggiungere al progetto i file FSA dei campioni
Impostare la metodica di analisi e il
size standard in CF-EU2v1
Selezionare i pannelli di miscelazione appropriati
Eseguire l’analisi dei campioni
Salvare il progetto
Selezionare il campione e aprire la finestra del grafico
Esaminare i dati dei tracciati e dei genotipi
Valutare i genotipi campione
Stampare i tracciati dei campioni Elucigene CF-EU2v1
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GeneMapper
Aprire il file con il programma GeneMapper e importare i file FSA necessari facendo clic
sul pulsante ‘add samples to project’ (aggiungi campioni a progetto) (
).
Cercare la cartella di analisi desiderata nell’elenco delle cartelle sul lato sinistro della
finestra. Selezionare la cartella e fare clic sul pulsante ‘Add to List >>‘ (Aggiungi a
elenco >>). La cartella dell’analisi sarà ora visualizzata nella finestra dei campioni da
aggiungere. Facendo doppio clic sull’icona della cartella dell’analisi in questa finestra
viene visualizzato ciascun file FSA da importare (Figura 1).
Figura 1 - I campioni sono stati aggiunti all’elenco e sono pronti per essere aggiunti
al progetto.
Quindi, vengono aggiunti i campioni facendo clic sul pulsante ‘Add’ (Aggiungi) (
).
Importazione delle impostazioni di analisi di CF-EU2v1 GeneMapper in
GeneMapper Manager
È necessario importare le impostazioni CF-EU2v1 per GeneMapper. Questo processo
viene controllato tramite l’interfaccia ‘GeneMapper Manager’.
Le impostazioni di CF-EU2v1 GeneMapper sono disponibili sul sito web di Gen-Probe:
www.gen-probe.com. Scaricarle in una cartella appropriata sul proprio sistema.
1.
Avviare il programma GeneMapper Manager facendo doppio clic sull’icona
(Figure 2 e 3).
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Figura 2 - Apertura di GeneMapper Manager
Figura 3 - Interfaccia di GeneMapper Manager.
2.
Selezionare la scheda ‘Analysis Methods’ (Metodiche di analisi) e fare clic sul
pulsante di importazione.
3.
Cercare i necessari file con le impostazioni dell’analisi CFEU2 e importarli: 3130 o
3500 (Figura 4).
Figura 4 - Importazione delle metodiche di analisi.
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4.
Ripetere il processo selezionando la scheda corretta e importando i rispettivi file per:
● Table Settings (Impostazioni tabelle)
● Plot Settings (Impostazioni grafico)
● Size Standards (Size standard)
Nota: Cluster Plot Settings (Impostazioni grafico cluster), Matrices (Matrici), SNP Sets (Set
SNP) e Report Settings (Impostazioni rapporti) non richiedono l’importazione di file.
Importazione delle impostazioni dei pannelli CF-EU2v1 in Panel Manager
(Gestione pannelli)
È necessario importare le impostazioni dei pannelli CF-EU2v1 per GeneMapper.
Questo processo viene controllato tramite l’interfaccia ‘Panel Manager’ (Gestione pannelli).
1.
Aprire il programma di gestione pannelli in GeneMapper facendo clic sull’icona
2.
Fare clic su ‘Panel Manager’ (Gestione pannelli) nella finestra di navigazione
sinistra. La voce apparirà ora evidenziata in celeste.
3.
Selezionare ‘File/Import Panels’ (File/Importa pannelli). Cercare il file dei pannelli
CFEU2 ‘GeneMapper Panels’ .txt e importarlo (Figura 5).
4.
Fare clic su ‘CFEU2 panel’ (Pannello CFEU2) nella finestra di navigazione sinistra.
Il pannello CF-EU2v1 apparirà ora evidenziato in celeste.
5.
Selezionare ‘File/Import Bin Set’ (File/Importa set bin). Cercare il file bin CFEU2
‘GeneMapper Bins’ .txt e importarlo (Figura 6).
6.
Fare clic su ‘Apply’ (Applica) e poi su ‘OK’.
Figura 5 - Importazione del file del pannello CFEU2.
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.
Figura 6 - Importazione del file del set bin CFEU2.
Modifica del file con i parametri di analisi
Potrebbe essere necessario modificare la voce ‘Analysis Ranges’ (Intervallo di analisi)
nelle impostazioni di analisi CF-EU2v1 in previsione delle specifiche condizioni di analisi.
L’intervallo minimo di analisi dipenderà dal capillare e dal polimero utilizzati durante
l’acquisizione dei dati.
Per visualizzare le attuali impostazioni di analisi:
1. Aprire ‘GeneMapper Manager’.
2. Selezionare la scheda ‘Analysis Methods’ (Metodiche di analisi). Il file CF-EU2v1
importato sarà elencato come ‘CFEU2 Analysis Method’ (Metodica di analisi CFEU2).
3. Fare clic su ‘CFEU2 Analysis Method’ (Metodica di analisi CFEU2). La riga appare
ora evidenziata.
4. Fare clic sul pulsante ‘Open’ (Apri) e selezionare la scheda ‘Peak Detector’
(Rivelatore picco) (Figura 7)
Per impostazione predefinita l’intervallo di analisi è impostato in modo da iniziare a 1600
e finire a 8000.
Figura 7 - Intervallo di analisi (evidenziato).
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Per individuare il corretto intervallo di analisi per il proprio laboratorio:
1.
Nella finestra principale di GeneMapper, fare doppio clic sulla cartella di analisi
importata per visualizzare un elenco dei file FSA in essa contenuti.
2.
Selezionare un file FSA.
3.
Facendo clic sulla scheda ‘Raw data’ (Dati grezzi) viene visualizzato un
elettroferogramma dei dati grezzi.
4.
Utilizzando come guida il picco 100 bp GS600v2 LIZ (arancione), orientarsi verso un
punto di dati di circa 100 punti di dati più piccolo (Figura 8).
Figura 8 - Individuazione dell’intervallo minimo utilizzando i dati grezzi dei campioni.
5.
Assicurarsi che l’intervallo Massimo di analisi consenta circa 100 punti di dati dopo il
picco 600 bp GS600v2 LIZ.
6.
Inserire i nuovi valori nel file di analisi CF-EU2v1 (per accedervi procedere come
indicato sopra).
Potrebbe inoltre essere necessario modificare la voce ‘Peak Amplitude Thresholds’
(Livello ampiezza picco) a seconda della concentrazione dei campioni. I campioni con
una concentrazione elevata saranno caratterizzati da un elevato livello di sfondo che
potrebbe interferire con l’analisi. Per evitare che ciò si verifichi, si può aumentare il livello
di ampiezza del picco. Ad esempio il colorante verde può essere impostato su 100
anziché su 50. Anche in questo caso si utilizza la scheda ‘Peak Detector’ (Rilevatore
picco) in ‘CFEU2 Analysis method’ (Metodica di analisi) (Figura 7).
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Analisi e genotipizzazione dei file CF-EU2v1 importati
1.
Nella finestra principale di GeneMapper selezionare ‘CFEU2 Table Settings’
(Impostazioni tabella CFEU2) (Figura 9).
Figura 9 - Usare il menu a discesa per selezionare le impostazioni tabella CFEU2.
2.
Nella finestra principale di GeneMapper selezionare la prima cella sotto ‘Analysis
Method’ (Metodica di analisi), quindi selezionare la metodica di analisi appropriata dal
menu a discesa: CFEU2_3130 o CFEU2_3500. Ripetere il processo per Size Standard,
selezionando ‘CFEU2 size standard’ dal menu a discesa.
3.
Selezionare il pannello ‘CFEU2’ per ciascun campione (Figura 10). Per la miscela A
selezionare il sottopannello contenente la miscela A e per la miscela B selezionare il
sottopannello contenente la miscela B.
4.
Fare clic su
per avviare l’analisi dei campioni.
Figura 10 - Selezione delle impostazioni pannello CFEU2.
Esame dei dati dei tracciati e dei genotipi CF-EU2v1
1.
Selezionare ‘Edit/Sort’ (Modifica/Ordina). Ordinare i campioni in base a ‘Sample
Name’ (Nome campione) e fare clic su ‘OK’.
2.
Fare clic su
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per ‘Display Plots’ (Visualizzare i grafici).
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3.
Usare il menu a discesa per selezionare le corrette impostazioni del grafico
CF-EU2v1:
Per visualizzare la miscela A con i dati poly T selezionare: ‘CFEU2 Plot PT-on’
(CFEU2 grafico PT-attivo)
Per visualizzare la miscela A senza i dati poly T selezionare: ‘CFEU2 Plot PT-off’
(CFEU2 grafico PT-disattivo)
Figura 11 - Usare il menu a discesa per selezionare le impostazioni del grafico CFEU2.
4.
La finestra del grafico visualizza i dati dei tracciati dei campioni (Figura 12).
5.
Si consiglia di attivare l’opzione ‘Single click editing’ (Modifica con singolo clic)
nella finestra del grafico. A tal fine selezionare ‘Alleles/set click editing’
(Alleli/imposta modifica con clic) e assicurarsi che questa opzione sia selezionata.
Figura 12 - Finestra dei grafici dei campioni che visualizza i dati dei tracciati etichettati.
Elucigene CF-EU2v1 - Miscela A
Elucigene CF-EU2v1 - Miscela B
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Valutazione dei picchi diagnostici
Un individuo possiede due copie del gene CFTR. Qualora queste copie presentino la
stessa sequenza per un dato allelo, l’individuo viene descritto come omozigote per
questo sito. Qualora le copie presentino una sequenza diversa per un dato allelo,
l’individuo viene descritto come eterozigote (Figura 13).
La miscela A (mutante) determina se un individuo presenta una mutazione mostrata dalla
presenza di un picco celeste. La miscela mutante contiene anche primer per l’allelo
F508del normale, quindi questa miscela può determinare se una persona è normale per
F508del (solo picco verde), omozigote per F508del (solo picco celeste) o eterozigote per
F508del (picco celeste e verde).
Se si osserva qualsiasi altra mutazione il campione può essere amplificato con la miscela
B (WT) per determinare lo stato omozigote o eterozigote. La presenza di un picco verde
per il particolare allelo della miscela WT indica che l’individuo è eterozigote e l’assenza
del picco verde indica che l’individuo è omozigote per la particolare mutazione.
Figura 13 - Esempi di individui a) normali, b) eterozigoti e c) omozigoti per l’allelo 711+1G>T.
A
B
C
Un individuo che possiede due mutazioni diverse viene descritto come eterozigote
composto (Figura 14).
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Figura 14 - Esempi di campioni eterozigoti composti. A) G85E/D1152H
B) F508del/E60X.
A
B
In entrambe le miscele sono inclusi due marker STR ipervariabili (rossi). Questo consente il
confronto tra il campione amplificato con la miscela mutante e il campione amplificato con la
miscela WT per ridurre il rischio di confusione tra i campioni (Figura 15). L’assenza di questi
marker STR indica un campione non riuscito. La presenza dei marker STR a livelli RFU molto
bassi indica un campione debole che deve essere analizzato con cautela.
Figura 15 - Grafici della miscela A e della miscela B che mostrano i due marker STR per
un individuo.
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I marker STR ipervariabili possono essere nascosti disattivando i dati marcati in rosso
nella finestra del grafico. La disattivazione dei dati marcati in celeste e verde facilita la
visualizzazione dei marker STR.
Designazione dei marker GeneMapper
Quando si visualizzano i dati dei tracciati analizzati in GeneMapper, i picchi diagnostici
della miscela A vengono etichettati con il nome e il numero del marker. I picchi diagnostici
della miscela B vengono etichettati solo con il numero del marker.
I dati di picco per un marker rilevato etichettato possono essere controllati ulteriormente
facendo passare il cursore del mouse sull’etichetta del marker che interessa: nella parte
inferiore della finestra dei grafici dei campioni vengono visualizzati il nome del marker, la
dimensione del picco e l’altezza del picco.
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La correlazione tra i numeri dei marker e i marker è illustrata di seguito.
Marker rilevati
N. marker
Marker
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
5T*
7T
9T
R347H
R347P
2789+5 G>A
3120+1 G>A
711+1 G>T
R334W
I507del
F508del
3849+10kb C>T
1677delTA
1078delT
V520F
L206W
W1282X
R560T
2347delG
Q890X
R553X
G551D
S549R(T>G)
S549N
M1101K
G542X
3905insT
Y1092X(C>A)
S1251N
444delA
1811+1.6kb A>G
1717-1 G>A
R117H
R117C
N1303K
Y122X
394delTT
G85E
R1066C
1898+1 G>A
W846X
2184delA
D1152H
CFTRdel2_3
P67L
2143delT
E60X
3659delC
3272
621+1G
A455E
R1162X
R1158X
IVS8-5T
IVS8-7T
IVS8-9T
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Intervallo entità di prodotto in bp
(dati 3130/POP7)
110.5-116.5
117-123
124-130
132.5-138.5
141.5-147.5
147.5-154
156-162.5
163-169
172-178
180-188.5
193-199
206-211.5
215-220
224.5-230.5
234.5-240.5
242-246
250-252
255.5-261.5
265-267
267.5-269.5
275-280
282-288
289-295.5
297-303.5
308-314
315-321
323-326
332-338
341.5-347.5
349-355
357-360
360-366.5
367-373
377-383
384-390
391-397
398.5-404.5
406-411
413-418
423-429
433-439
439.5-445.5
446-450.5
453.5-460.5
461-465.5
470-476
485.5-491.5
496-503
506-512
516.5-524.5
110-130
140-160
175-195
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* Dimensioni alleli 5T
Intervallo entità di prodotto in bp
POP7/3130
117,25 – 118,75
119,25 – 120,75
121,25 – 122,75
123,25 – 124,75
125,25 – 126,75
Marker
5T (9)
5T (10)
5T (11)
5T (12)
5T (13)
Nota: l’intervallo dell’entità di ciascun marker può variare in base allo strumento e al
polimero utilizzati.
Marker CF-EU2v1 dI507del
Data la posizione della delezione I507 nel gene CFTR è possibile rilevare la presenza di
questo marker tramite una variazione di 3 bp nella dimensione del picco F508del e del
picco mutante specifico I507del.
Laddove sia presente un singolo allelo mutante, si osserverà il picco mutante I507del
come picco celeste a circa 159 bp. Si osserverà la presenza di un picco wild-type per
F508del, ma a un’altezza di picco pari all’incirca la metà di quella normalmente associata
a un genotipo wild-type omozigote; questo viene osservato come un picco verde a circa
167 bp. Si osserverà anche un altro picco verde a circa 164 bp (Figura 16).
Figura 16 - Campione eterozigote I507del.
Un campione I507del/F508del produrrà un picco WT F508del verde spostato all’incirca a
164 bp (3 bp in meno rispetto alla norma), un picco mutante F508del celeste a 166 bp e
un picco mutante I507del celeste all’incirca a 159 bp.
Un campione I507del/F507del produrrà un picco celeste all’incirca a 159 bp e un singolo
picco verde all’incirca a 164 bp (3 bp in meno rispetto al picco F508del normale osservato
quando I507del non è presente).
Va notato che la presenza di una mutazione F508del impedisce l’azione del primer
WT I507. Quindi, un individuo omozigote per F508del non presenterà un picco WT
I507 nella miscela WT e un individuo eterozigote per F508del presenterà un picco
WT I507 di altezza ridotta nella miscela WT.
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Marker poly T
Elucigene CF-EU2v1 contiene primer ARMS fluorescenti marcati con NED (giallo) per la
rilevazione delle varianti IVS8-5T, IVS8-7T e IVS8-9T. Le informazioni su poly T per un
campione possono essere determinate attivando la visualizzazione dei dati marcati in
giallo nelle impostazioni CF-EU2v1 in GeneMapper. L’operatore può quindi scegliere di
visualizzare questi dati come ritiene necessario nell’ambito della procedura di analisi del
laboratorio.
Nota: La miscela B non contiene primer poly T, quindi i prodotti saranno visualizzati solo
nei campioni di miscela A.
Analisi poly T
I seguenti esempi di GeneMapper mostrano morfologie di picco caratteristiche delle
regioni varianti di IVS8 analizzate.
Esempio 1: Campione IVS8-5T / IVS8-9T
L’esempio in basso mostra il risultato della miscela A osservato utilizzando le
impostazioni del grafico ‘CFEU2 Plot PT-on’ (CFEU2 grafico PT-attivo).
La rimozione delle informazioni di colore verde e celeste nelle impostazioni del grafico
per lo stesso campione mostra chiaramente il marker poly T, mostrato in basso.
Esempio 2: Campione IVS8-7T / IVS8-7T
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Esempio 3: Campione IVS8-7T / IVS8-7T (variabilità ripetizione TG).
I due picchi sono dovuti all’eterozigosità della regione di ripetizione TG che rientra nel
nostro amplicone. Questo effetto può essere osservato anche con i campioni omozigoti
5T e 9T. È quindi possibile determinare il numero di ripetizioni TG all’interno di ogni
variante poly T (politimidina) dell’IVS8.
Esempio 4: Campione IVS8-9T / IVS8-9T
Avviso importante
In certe condizioni di analisi è possibile che artefatti del colore osservabili possano
interferire con l’analisi di routine. È importante che l’operatore sia consapevole della
possibilità di interferenza per garantire la corretta analisi dei dati.
Gli artefatti del colore di marcatura possono essere osservati come picchi celesti o verdi
piccoli. Questi artefatti del colore sono generalmente di dimensione inferiore a 100 bp e
solitamente non interferiscono con l’analisi dei dati. In condizioni normali questi picchi
artefatti sono insignificanti in relazione ai picchi di ampliconi reali e non causano alcun
problema con l’analisi. Tuttavia, quando la quantità di amplicone caricata è piccola,
probabilmente a causa di un DNA genomico limitante, i picchi causati da artefatti del
colore si presentano relativamente più grandi con il rischio di essere analizzati come
picchi di ampliconi reali.
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Analisi GeneMarker
Introduzione
La sezione seguente descrive le procedure per l’analisi dei campioni di risultati Elucigene
CF-EU2v1 mediante il pacchetto software SoftGenetics GeneMarker versione 1.95.
Processo di analisi
Il processo per l’analisi dei campioni è riepilogato nel diagramma di flusso riportato di seguito.
Analizzare i campioni amplificati su Genetic Analyzer
Aprire il software GeneMarker
Aggiungere al progetto i file FSA dei campioni
Selezionare il pannello CF-EU2v1 appropriato
e le impostazioni di analisi
Eseguire l’analisi dei campioni
Selezionare l’applicazione:
ARMS/Comparative Analysis
(ARMS/Analisi comparativa)
Selezionare “Mutant + Wild-type”
(Mutante + wild-type) o
“Mutant Only” (Solo mutante)
Selezionare Print (Stampa)
Selezionare Preview (Anteprima)
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Aggiunta dei file dei campioni a GeneMarker
Aprire il file del programma GeneMarker e quando viene richiesto selezionare ‘Open
Data’ (Apri dati). Appare la finestra Open Data Files (Apri file di dati).
Fare clic sul pulsante ‘Add’ (Aggiungi). Appare la finestra Open (Apri).
Cercare la directory contenente i file di dati grezzi.
● Selezionare tutti i file con CTRL+A o usare i tasti CTRL e/o MAIUSC per
selezionare singoli campioni.
● Fare clic sul pulsante Open (Apri) nella finestra di dialogo Open (Apri).
I file selezionati appaiono nel campo Data File List (Elenco file di dati) (Figura 1).
Fare clic sul pulsante OK nella finestra Open Data Files (Apri file di dati) e i campioni
saranno caricati in GeneMarker.
Il software apre quindi automaticamente la finestra Raw Data Analysis (Analisi dati
grezzi) (Figura 2).
Figura 1 - Campioni aggiunti all’elenco dei file di dati.
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Figura 2 - Finestra Raw Data Analysis (Analisi dati grezzi).
Elenco campioni
Immagine gel
sintetica
Tracciato dei
dati grezzi
Elaborazione dei dati
Dopo il caricamento in GeneMarker, i file di dati grezzi sono pronti per essere elaborati.
La fase di elaborazione include l’applicazione di size standard, l’applicazione di filtri ai
picchi rumorosi e, volendo, il confronto con un pannello di alleli noto.
GeneMarker combina tutte queste fasi in unico, semplice strumento denominato Run Wizard
(Procedura guidata di analisi) (Figura 3). Per accedere alla procedura guidata di analisi basta
fare clic sull’icona del progetto di analisi nella barra degli strumenti principale.
Figura 3 - Procedura guidata di analisi – Finestra di selezione del modello.
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Procedura guidata di analisi – Finestra di selezione del modello
Creare un modello CF-EU2v1 e selezionare le impostazioni per Size Standard, Standard
Colour (Colore standard) e Analysis Type (Tipo di analisi) (Figura 3).
Selezionare il pannello appropriato in base alla piattaforma utilizzati, ad esempio CFEU2v1_POP7. Questi sono disponibili sul sito web di Gen-Probe: www.gen-probe.com.
Scaricarle in una cartella appropriata sul proprio sistema.
Fare clic su ‘Next’ (Avanti) per continuare.
Procedura guidata di analisi – Data Process (Elaborazione dati)
La finestra Data Process (Elaborazione dati) della procedura guidata di analisi consente
di selezionare i parametri dei filtri da applicare ai picchi.
Assicurarsi che le impostazioni siano selezionate come mostrato nella Figura 4.
Fare clic su ‘Next’ (Avanti) per continuare.
Figura 4 - Procedura guidata di analisi – Finestra Data Process (Elaborazione dati).
NOTA: Per 3500 dati aumentare Min Intensity (Intensità min.) a 300.
Procedura guidata di analisi – Altre impostazioni
Quando si esegue l’analisi CF-EU2v1, non sono richieste altre impostazioni.
Fare clic su ‘OK’ per continuare.
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Figura 5 - Procedura guidata di analisi – Additional Settings (Altre impostazioni).
Finestra Data Processing (Elaborazione dei dati)
Dopo aver fatto clic su OK nella finestra Run Wizard Additional Settings (Procedura
guidata di analisi – Altre impostazioni) viene visualizzata la finestra Data Processing
(Elaborazione dei dati) (Figura 6). I dati grezzi vengono elaborati e calibrati, vengono
applicati i parametri dei filtri, quindi viene applicato il pannello CF-EU2v1 selezionato.
Al termine dell’analisi, fare clic su ‘OK’ nella finestra Data Processing (Elaborazione dei dati).
Figura 6 - Finestra Data Processing (Elaborazione dei dati).
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Finestra di analisi principale
La finestra di analisi principale (Figura 7) di GeneMarker presenta un formato facile da
usare. Questo formato include:
●
The sample files list (elenco dei file dei campioni) - visualizzato a sinistra della
finestra;
●
The Synthetic Gel Image (immagine gel sintetica) - visualizzata nella parte
superiore della finestra;
●
Data Electropherograms (elettroferogrammi dei dati) - sotto l’immagine gel;
●
A Report Table (tabella dei rapporti) - visualizzata sul lato destro della finestra.
In questa finestra è importante controllare che tutti i picchi appropriati di ciascun profilo
siano stati denominati correttamente.
Fare doppio clic su ciascun campione in sequenza nell’elenco dei file dei campioni sul
lato sinistro dello schermo. Fare clic con il pulsante destro del mouse su qualsiasi picco in
questione e scegliere tra le opzioni nella finestra di dialogo, ad esempio modificare o
eliminare alleli, confermare o meno come pertinente.
Nei casi in cui un picco non sia stato denominato affatto poiché è al di sotto della soglia, è
possibile assegnare un allelo manualmente. Selezionare il ‘Marker’ appropriato nella
casella a discesa, tenendo premuto il tasto Maiusc fare clic con il pulsante destro del
mouse sul picco in questione, quindi fare clic su ‘Insert Allele’ (Inserisci allelo) e poi su
‘OK’. Quando si analizzano i dati della miscela A e della miscela B insieme, è importante
garantire che siano stati denominati tutti i picchi STR.
Una volta completato questo processo per tutti i campioni, è possibile eseguire la fase
successive dell’analisi.
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Figura 7 - Finestra di analisi principale.
Elenco dei file dei
campioni
Immagine gel
sintetica
Elettroferogramma
Tabella dei
rapporti
Analisi del solo mutante (miscela A)
Nella finestra di analisi principale selezionare l’opzione del menu a discesa
‘Applications’ (Applicazioni) nella parte superiore dello schermo.
Selezionare ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Analisi comparativa) e poi ‘Mutant
Only’ (Solo mutante). Nella finestra di dialogo ‘ARMS/Comparative Print Settings’
(Impostazioni di stampa ARMS/Comparativa) selezionare ‘Poly-T Analysis’ (Analisi
poly T) se si desidera effettuare questa l’analisi (Figura 8).
Fare clic su ‘Preview’ (Anteprima) nella finestra di dialogo ‘ARMS/Comparative Print
Settings’ (Impostazioni di stampa ARMS/Comparativa) per visualizzare il rapporto
Elucigene CF-EU2v1 solo mutante (miscela A) (Figura 11). Questa finestra consente di
esaminare e stampare il rapporto di ciascun campione.
Fare clic su ‘OK’ nella finestra di dialogo ‘ARMS/Comparative Print Settings’
(Impostazioni di stampa ARMS/Comparativa) per stampare il rapporto Elucigene
CF-EU2v1 solo mutante (miscela A) (Figura 11) senza visualizzare un’anteprima.
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Figura 8 - Finestra ARMS/Comparative Print Settings
(ARMS/Analisi comparativa) per Mutant only (Solo mutante).
Visualizzazione in anteprima del rapporto Elucigene CF-EU2v1
Rapporto del solo mutante (miscela A)
Fare clic su ‘Preview’ (Anteprima) nella finestra di dialogo ‘ARMS/Comparative Print
Settings’ (Impostazioni di stampa ARMS/Comparativa) per visualizzare il rapporto
Elucigene CF-EU2v1 miscela A (Figura 11). Questa finestra consente di esaminare e
stampare il rapporto di ciascun campione.
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Figura 11 - Finestra del rapporto CF-EU2v1 solo mutante (miscela A).
Il rapporto Elucigene CF-EU2v1 include gli elementi descritti di seguito.
● Report Header (titolo del rapporto): contiene informazioni sull’analisi, sul
progetto, sul campione e sui parametri.
● Signature Box (Casella della firma): data e spazio per le iniziali dei revisori del
rapporto.
● Electropherogram (Elettroferogramma): simile alla finestra ARMS/analisi
comparativa, visualizza tutti i colori del tracciato del campione.
● Report Table (Tabella dei rapporti): la tabella principale visualizza tutte le
mutazioni analizzate con questo kit. La presenza o l’assenza di una mutazione
viene indicata con 1 o con 0. Si noti che lo stato di zigosità totale può essere
riportato solo per il locus F508 quando si analizza solo la miscela A. La
seconda tabella mostra lo stato poly T del campione se questa funzione è stata
selezionata.
Analisi della miscela mutante + wild-type (A e B)
Nella finestra di analisi principale selezionare l’opzione del menu a discesa ‘Tools’
(Strumenti) nella parte superiore dello schermo e poi ‘File Name Group Tool’
(Strumento gruppo nomi file). Si apre la schermata ‘File Name Group Editor’ (Modifica
gruppo nomi file). Nella casella ‘Compare by Section’ (Confronta in base a sezione),
digitare il numero della colonna in cui appare il nome del campione. Nella casella ‘Match
to Identifier by Section’ (Abbina a identificativo in base a sezione), digitare il numero
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della colonna in cui appare il tipo di miscela (ovvero A o B). Nella casella ‘Control
Identifier’ (Identificativo controllo), digitare ‘A’. Fare clic sul pulsante ‘Match’ (Abbina) e
sul lato destro della finestra di dialogo appariranno i campioni corrispondenti (Figura 9).
Figura 9 - Schermata File Name Group Editor (Modifica gruppo nomi file).
Salvare il gruppo corrispondente in una cartella appropriata facendo clic sull’icona nella
parte superiore della sezione ‘Matched Groups’ (Gruppi corrispondenti).
Nella finestra di analisi principale selezionare l’opzione del menu a discesa
‘Applications’ (Applicazioni) nella parte superiore dello schermo.
Selezionare ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Analisi comparativa) e poi ‘Mutant +
Wildtype’ (Mutante + wild-type). Nella finestra ‘ARMS/Comparative Analysis’
(ARMS/Analisi comparativa) selezionare prima il ‘Group File’ (File gruppo) rilevante, quindi
selezionare ‘Poly-T Analysis’ (Analisi poly T) se si desidera effettuare questa analisi e/o
‘STR Check’ (Controllo STR) (Figura 10a). Quindi fare clic su ‘OK’ per visualizzare la
finestra ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Analisi comparativa) (Figura 10b).
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Figura 10a - Finestra ARMS/Comparative Analysis Settings Box
(Impostazioni di ARMS/analisi comparativa).
Figura 10b - Finestra ARMS/Comparative Analysis (ARMS/Analisi comparativa).
File in
gruppi
Elettroferogrammi
Istogramma
delle
differenze
Tabella
dei
rapporti
Visualizzazione in anteprima del rapporto Elucigene CF-EU2v1
Rapporto mutante + wild-type (miscela A + B)
Fare clic sull’icona di stampa nella finestra ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Analisi
comparativa). Selezionare ‘Poly-T Analysis’ (Analisi poly T) se si desidera effettuare questa
analisi e/o ‘STR Check’ (Controllo STR) (Figura 12a). Selezionare ‘Preview’ (Anteprima) per
visualizzare il rapporto Elucigene CF-EU2v1 A + B (Figura 12b). Questa finestra consente di
esaminare e stampare il rapporto di ciascun campione.
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Figure 12a - Finestra ARMS/Comparative Print Settings
(Impostazioni di stampa ARMS/comparativa).
Figura 12b - Finestra del rapporto CF-EU2v1 mutante + wild-type (miscela A e B).
Il rapporto Elucigene CF-EU2v1 include gli elementi descritti di seguito.
● Report Header (titolo del rapporto): contiene informazioni sull’analisi, sul
progetto, sul campione e sui parametri.
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● Signature Box (casella della firma): data e spazio per le iniziali dei revisori del
rapporto. È disponibile un’ulteriore colonna Check (Controllo) per le iniziali del
revisore.
● Electropherogram (elettroferogramma): simile alla finestra ARMS/Comparative
Analysis Settings Box (ARMS/analisi comparativa), visualizza tutti i colori del
tracciato del campione.
● Report Tables (tabelle dei report): la tabella principale visualizza tutte le
mutazioni analizzate con questo kit. lo stato omozigote o eterozigote è indicato
dal numero di alleli wild-type o mutanti riportati da ciascun locus. La seconda
tabella mostra lo stato poly T del campione se questa funzione è stata
selezionata.
● Trace (Istogramma di confronto dei tracciati): GeneMarker calcola le differenze
alleliche tra i tracciati della miscela A e della miscela B e le visualizza in un
istogramma situato sotto gli elettroferogrammi dei campioni.
Etichette dei picchi
Le etichette dei picchi sono contrassegnate a colori in base alla qualità della
corrispondenza tra il picco rilevato e i bin dei pannelli osservati. Nell’elettroferogramma, i
marcatori sono barre grigie orizzontali e il centro dei picchi è contrassegnato con una
barra grigia verticale.
I picchi che cadono al di fuori dei marker o bin del pannello sono contrassegnati in rosso
come Off Ladder (OL) (Fuori scala).
Nota: Le differenze in termini di tipo di polimero della macchina e size standard
potrebbero necessitare di un’ottimizzazione dei marker bin al fine di adattare il software
alle condizioni di analisi utilizzate. Ulteriori informazioni sulla modifica dei panel bin sono
disponibili nel manuale GeneMarker in dotazione al software.
Valutazione dei picchi diagnostici
Un individuo possiede due copie del gene CFTR. Qualora queste copie presentino la
stessa sequenza per un dato allelo, l’individuo viene descritto come omozigote per
questo sito. Qualora le copie presentino una sequenza diversa per un dato allelo,
l’individuo viene descritto come eterozigote (Figura 13).
La miscela A (mutante) determina se un individuo presenta una mutazione mostrata dalla
presenza di un picco celeste. La miscela mutante contiene anche primer per l’allelo
F508del normale, quindi questa miscela può determinare se una persona è normale per
F508del (solo picco verde), omozigote per F508del (solo picco celeste) o eterozigote per
F508del (picco celeste e verde).
Se si osserva qualsiasi altra mutazione il campione può essere amplificato con la miscela
B (WT) per determinare lo stato omozigote o eterozigote. La presenza di un picco verde
per il particolare allelo della miscela WT indica che l’individuo è eterozigote e l’assenza
del picco verde indica che l’individuo è omozigote per la particolare mutazione.
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Figura 13 - Esempi di individui a) normali, b) eterozigoti e c) omozigoti per l’allelo 711+1G>T.
A
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B
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C
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Un individuo che possiede due mutazioni diverse viene descritto come eterozigote
composto (Figura 14).
Figura 14 - Esempi di campioni eterozigoti composti. A) W1282X/S1251N
B) F508del/R560T.
A
B
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In entrambe le miscele sono inclusi due marker STR ipervariabili (rossi). Questo consente
il confronto tra il campione amplificato con la miscela mutante e il campione amplificato
con la miscela WT per ridurre il rischio di confusione tra i campioni (Figura 15). L’assenza
di questi marker STR indica un campione non riuscito. La presenza dei marker STR a livelli
rfu molto bassi indica un campione debole che deve essere analizzato con cautela.
Figura 15 - Grafici della miscela A e della miscela B che mostrano i due marker STR per
un individuo.
I marker STR ipervariabili possono essere nascosti deselezionando ‘STR Check’ (Controllo
STR) nella finestra ‘ARMS/Comparative Print Settings’ (Impostazioni di stampa
ARMS/Comparativa), se si analizza solo la miscela A, o nella finestra ‘ARMS/Comparative
Analysis’ (ARMS/Analisi comparativa), se si analizzano la miscela A e la miscela B. La
visualizzazione dei soli dati di colore rosso nella finestra ‘ARMS/Comparative Analysis’
(ARMS/Analisi comparativa) facilita la visualizzazione dei marker STR.
Designazione dei marker GeneMarker
Quando si visualizzano i dati dei tracciati analizzati in GeneMarker, i picchi diagnostici
della miscela A vengono etichettati con il nome del marker. I picchi diagnostici della
miscela B vengono etichettati solo con il numero del marker seguito dal suffisso ‘WT’ se
visualizzati solo con il colore verde selezionato.
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La correlazione tra i numeri dei marker e i marker è illustrata di seguito.
Marker rilevati
N. marker
Marker
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
5T*
7T
9T
R347H
R347P
2789+5 G>A
3120+1 G>A
711+1 G>T
R334W
I507del
F508del
3849+10kb C>T
1677delTA
1078delT
V520F
L206W
W1282X
R560T
2347delG
Q890X
R553X
G551D
S549R(T>G)
S549N
M1101K
G542X
3905insT
Y1092X(C>A)
S1251N
444delA
1811+1.6kb A>G
1717-1 G>A
R117H
R117C
N1303K
Y122X
394delTT
G85E
R1066C
1898+1 G>A
W846X
2184delA
D1152H
CFTRdel2_3
P67L
2143delT
E60X
3659delC
3272
621+1G
A455E
R1162X
R1158X
IVS8-5T
IVS8-7T
IVS8-9T
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Intervallo entità di prodotto in bp
(dati 3130/POP7)
110.5-116.5
117-123
124-130
132.5-138.5
141.5-147.5
147.5-154
156-162.5
163-169
172-178
180-188.5
193-199
206-211.5
215-220
224.5-230.5
234.5-240.5
242-246
250-252
255.5-261.5
265-267
267.5-269.5
275-280
282-288
289-295.5
297-303.5
308-314
315-321
323-326
332-338
341.5-347.5
349-355
357-360
360-366.5
367-373
377-383
384-390
391-397
398.5-404.5
406-411
413-418
423-429
433-439
439.5-445.5
446-450.5
453.5-460.5
461-465.5
470-476
485.5-491.5
496-503
506-512
516.5-524.5
110-130
140-160
175-195
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* Dimensioni alleli 5T
Marker
5T (9)
5T (10)
5T (11)
5T (12)
5T (13)
Intervallo entità di prodotto in
bp POP7/3130
117,25 – 118,75
119,25 – 120,75
121,25 – 122,75
123,25 – 124,75
125,25 – 126,75
Nota: l’intervallo dell’entità di ciascun marker può variare in base allo strumento e al
polimero utilizzati.
Marker CF-EU2v1 dI507del
Data la posizione della delezione I507 nel gene CFTR è possibile rilevare la presenza di
questo marker tramite una variazione di 3 bp nella dimensione del picco F508del e del
picco mutante specifico I507del.
Laddove sia presente un singolo allelo mutante, si osserverà il picco mutante I507del
come picco celeste a circa 159 bp. Si osserverà la presenza di un picco wild-type per
F508del, ma a un’altezza di picco pari all’incirca la metà di quella normalmente associata
a un genotipo wild-type omozigote; questo viene osservato come un picco verde a circa
167 bp. Si osserverà anche un altro picco verde a circa 164 bp (Figura 16).
Figura 16 - Campione eterozigote I507del
Un campione I507del/F508del produrrà un picco WT F508del verde spostato all’incirca a
164 bp (3 bp in meno rispetto alla norma), un picco mutante F508del celeste a 166 bp e
un picco mutante I507del celeste all’incirca a 159 bp.
Un campione I507del/F507del produrrà un picco celeste all’incirca a 159 bp e un singolo
picco verde all’incirca a 164 bp (3 bp in meno rispetto al picco F508del normale osservato
quando I507del non è presente).
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Va notato che la presenza di una mutazione F508del impedisce l’azione del primer
WT I507. Quindi, un individuo omozigote per F508del non presenterà un picco WT
I507 nella miscela WT e un individuo eterozigote per F508del presenterà un picco
WT I507 di altezza ridotta nella miscela WT.
Marker poly T
Elucigene CF-EU2v1 contiene primer ARMS fluorescenti marcati con NED (giallo) per la
rilevazione delle varianti IVS8-5T, IVS8-7T e IVS8-9T. Le informazioni poly T per un
campione possono essere determinate attivando la visualizzazione dei dati marcati in
giallo nella finestra di analisi principale di GeneMarker (Figura 7). I marker poly T
possono essere nascosti deselezionando ‘Poly-T Analysis’ (Analisi poly T) nella finestra
‘ARMS/Comparative Print Settings’ (Impostazioni di stampa ARMS/Comparativa), se si
analizza solo la miscela A, o nella finestra ‘ARMS/Comparative Analysis’
(ARMS/Analisi comparativa), se si analizzano la miscela A e la miscela B. L’operatore
può quindi scegliere di visualizzare questi dati come ritiene necessario nell’ambito della
procedura di analisi del laboratorio.
Nota: La miscela B non contiene primer poly T, quindi i prodotti saranno visualizzati solo
nei campioni di miscela A.
Analisi poly T
I seguenti esempi di GeneMarker mostrano morfologie di picco caratteristiche delle
regioni varianti di IVS8 analizzate.
Gli esempi riportati in basso mostrano i risultati della miscela A osservati quando nella
finestra di dialogo ‘ARMS/Comparative Print Settings’ (Impostazioni di stampa
ARMS/Comparativa) è stata selezionata l’opzione ‘Poly-T Analysis’ (Analisi poly T) ed è
stato scelto di analizzare solo la miscela A.
Esempio 1: Campione IVS8-5T / IVS8-7T
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Esempio 2: Campione IVS8-7T / IVS8-7T
Esempio 3: Campione IVS8-7T / IVS8-7T (variabilità ripetizione TG)
I due picchi sono dovuti all’eterozigosità della regione di ripetizione TG che rientra nel
nostro amplicone. Questo effetto può essere osservato anche con i campioni omozigoti
5T e 9T. È quindi possibile determinare il numero di ripetizioni TG all’interno di ogni
variante poly T (politimidina) dell’IVS8.
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Esempio 4: Campione IVS8-9T / IVS8-9T
Avviso importante
In certe condizioni di analisi è possibile che artefatti del colore osservabili possano
interferire con l’analisi di routine. È importante che l’operatore sia consapevole della
possibilità di interferenza per garantire la corretta analisi dei dati.
Gli artefatti del colore di marcatura possono essere osservati come picchi celesti o verdi
piccoli. Questi artefatti del colore sono generalmente di dimensione inferiore a 100 bp e
solitamente non interferiscono con l’analisi dei dati. In condizioni normali questi picchi
artefatti sono insignificanti in relazione ai picchi di ampliconi reali e non causano alcun
problema con l’analisi. Tuttavia, quando la quantità di amplicone caricata è piccola,
probabilmente a causa di un DNA genomico limitante, i picchi causati da artefatti del
colore si presentano relativamente più grandi con il rischio di essere analizzati come
picchi di ampliconi reali.
ELUCIGENE è un marchio di Gen-Probe Life Sciences Ltd.
ARMS è un marchio di AstraZeneca UK Ltd. QIAAMP è un marchio di Qiagen GmbH.
GENEMARKER è un marchio di SoftGenetics Corporation. GENEMAPPER, VIC, NED,
POP-7, HI-DI e PET sono marchi di Life Technologies Corporation.
AVVISO PER L’ACQUIRENTE: LICENZA LIMITATA
I polinucleotidi marcati con coloranti VIC, NED e PET e/o il rispettivo impiego possono
essere coperti da uno o più brevetti di proprietà di Applied Biosystems, LLC. Il prezzo di
acquisto di questo prodotto include diritti limitati non trasferibili secondo specifiche
rivendicazioni di alcuni brevetti appartenenti ad Applied Biosystems, LLC, che prevedono
l’uso della sola quantità stabilita di prodotto esclusivamente per procedure condotte
dall’acquirente a scopo di rilevamento del/dei target nel settore della diagnostica umana.
Non sono concessi altri diritti. Per altre informazioni sull’acquisto di licenze relative ai
coloranti sopra indicati, rivolgersi al Director of Licensing, Applied Biosystems,
850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA.
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