B3 L’ESPRESSIONE GENETICA E LA SUA REGOLAZIONE IL FLUSSO DELL’INFORMAZIONE GENETICA L’espressione genica è il processo che conduce dal DNA alle proteine. - Il primo a fare ricerche in questo campo fu Garrod nel 1908, che ipotizzò che alcune malattie fossero dovute a carenze enzimatiche. Queste malattie erano ereditarie, Garrod fornisce dunque una prima bozza della teoria secondo la quale i geni influenzano la produzione di enzimi. - A confermare questa teoria Beadle e Tatum mettono in atto una serie di esperimenti su una muffa del pane (Neurospora crassa), arrivando alla conclusione che ogni mutazione genetica danneggia un enzima della via metabolica. CORREZIONI: parlare solo di enzimi è un’eccessiva semplificazione, dobbiamo infatti parlare di polipeptidi. Inoltre l’affermazione “un gene, un polipeptide” è valida solo per i geni strutturali, ovvero quelli che non hanno funzione regolatrice (portano informazioni per RNA o DNA). CRICK formula il DOGMA CENTRALE DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE: Il gene è un tratto di DNA contenente informazioni per la produzione di una catena polipeptidica, e il flusso di informazioni è mono direzionale (DNA → RNA → proteine). e due ipotesi riguardo ai dubbi che potrebbero sorgere: 1. l’ipotesi del messaggero: come l’informazione passa dal nucleo (DNA) al citoplasma (proteine)? Dalla sequenza di DNA si forma una molecola complementare di RNA chiamato RNA messaggero (questo processo è chiamato trascrizione). L’RNA si sposta poi al citoplasma dove funge da stampo per la sintesi delle proteine. 2. l’ipotesi dell’adattatore: come si crea una sequenza di amminoacidi specifica per il polipeptide? Secondo Crick esiste un adattatore, che chiama RNA di trasporto o transfer capace di legarsi ad un amminoacido e riconoscere una sequenza di nucleotidi. L’RNA transfer è in grado di tradurre il linguaggio del DNA a quello delle proteine: processo di traduzione. I tRNA sono adattatori che mettono in relazione l’informazione dell’mRNA con la sequenza di amminoacidi. Ognuno dei 20 amminoacidi ha un tipo specifico di molecola tRNA, a parte alcuni tratti detti basi invariabili. Ha una configurazione a trifoglio mantenuta da legami a idrogeno, all’estremità 3’ si trova il sito d’attacco per l’amminoacido, a metà della sequenza si trova l’anticodone: un gruppo di 3 basi che costituisce il sito di appaiamento (ciascun tRNA ha un particolare anticodone). → L’appaiamento del tRNA con l’amminoacido è realizzato dagli enzimi amminoaciltRNA-sintasi. NB il legame che si forma tra trna e amminoacido crea l’energia necessaria al legame peptidico. SINTESI SULL’RNA: Ne sono ricche le cellule che sintetizzano molti polipeptidi, in particolare si trova nel citoplasma allo stesso livello dei ribosomi (sede della sintesi proteica). L’RNA può anche accoppiarsi al DNA secondo le stesse regole di complementarità della doppia elica. Le differenze col DNA sono: - la presenza di un unico filamento - contiene il ribosio invece del desossiribosio - ha la base azotata uracile al posto della timina Ne esistono 3 tipi: 1. RNA messaggero 2. RNA transfer 3. RNA ribosomiale (ruolo strutturale e funzionale) LA TRASCRIZIONE: DNA→ MRNA Assemblata a partire da uno dei due filamenti di DNA, la trascrizione nei procarioti ha inizio quando l’enzima RNA polimerasi si lega ad una specifica sequenza di DNA detta promotore all’estremità 5’. Il promotore fornisce 3 tipi di informazione: - da dove far partire la trascrizione - quale filamento trascrivere - in quale direzione procedere Dopodiché la doppia elica del DNA si apre ed ha inizio la fase di allungamento. NB: L’RNA non revisiona o corregge il proprio lavoro, ma commette errori trascurabili. IL CODICE GENETICO: Una proteina è formata da 20 amminoacidi, mentre in una molecola di DNA ci sono solo 4 nucleotidi. Se ciascun nucleotide codificasse 1 amminoacido, verrebbero coinvolti nel processo 4/20 amminoacidi, dunque per coinvolgerli tutti è necessario che ogni amminoacido sia codificato da 3 nucleotidi chiamati tripletta o codone, tutti i codoni insieme formano il codice genetico. Ovviamente ci saranno più codoni (43 = 64) che amminoacidi, dunque alcuni amminoacidi verranno codificati da più codoni, per questo motivo il codice è definito degenerato, poiché ridondante. Tuttavia non è ambiguo poiché un amminoacido può essere codificato da più codoni, ma un codone può codificare un solo amminoacido. → codone di inizio: AUG; codoni di fine: UAA, UAG, UGA Gli scienziati Nirenberg e Matthaei proposero degli studi a riguardo il codice genetico: prima di tutto testarono che i ribosomi producevano proteine anche se messi in contatto con mRNA di altri organismi, dunque provarono ad aggiungere un mRNA artificiale, che conteneva una sola base azotata (l'uracile, viene infatti chiamato poli-U), a 20 provette contenenti gli estratti escherichia coli necessari e in ogni provetta un diverso amminoacido era marcato radioattivamente. In un’unica provetta, quella contenente la fenilalanina marcata, si ottennero catene radioattive. Se ne deduce dunque che UUU=feniftaleina, e sul modello di questo esperimento venne decifrato il codice genetico. Il codice genetico è definito universale poiché identico in ogni organismo, e rappresenta l’unità base di ogni essere vivente. Ciò indica che il linguaggio dell’evoluzione è uno solo. LA TRADUZIONE: RNA → PROTEINE Si parla di sintesi proteica: processo attraverso il quale il codice genetico viene tradotto in molecole necessarie alla vita della cellula. - nei PROCARIOTI l’mRNA viene tradotto immediatamente in proteine (non c’è divisione tra nucleo e citoplasma) - negli EUCARIOTI i prodotti della trascrizione devono subire alcune modifiche, per aumentare la stabilità e diminuire il rischio di una progressiva degradazione La traduzione avviene nei ribosomi. Ognuno di essi è costituito da una subunità maggiore (3 rRNA e 45 proteine) e una minore (1 rRNA e 33 proteine). Sulla parte maggiore un Trna carico passa tra i 3 siti di legame con un ordine preciso: il sito A (amminoacidico) dove l’anticodone tRNA carico si lega al codone dell’mRNA; poi il sito P (peptidico) dove il tRNA cede l’amminoacido alla catena polipeptidica; infine il sito E (exit) dove il Trna si stacca dal ribosoma per tornare nel citosol, raccogliere un altro amminoacido e ricominciare il processo. La traduzione avviene in tre fasi: 1. complesso d’inizio: la subunità minore del ribosoma inizia a scorrere l’mRNA dall’unità 3’ al codone d’inizio AUG. Qui il tRNA carico di metionina si lega all’mRNA e la subunità maggiore del ribosoma si unisce al compesso. Il tRNA scorre dunque al sito P e il sito A si allinea al secondo codone. 2. allungamento: il tutto si sosta di nuovo di modo che il primo tRNA si sposti nel sito E venga liberato, il secondo slitta nel sito P ed un nuovo tRNA carico entra nel sito A, e il processo continua in modo ripetitivo. 3. terminazione: ovvero quando il ribosoma incontra uno dei tre codoni di stop (non esistono Trna con anticodoni corrispondenti a questi, e dunque nel sito si inserisce un fattore di rilascio e la traduzione cessa e le due subunità ribosomiali si separano. NB Mentre nella cellula procariotica trascrizione e traduzione avvengono entrambe nel citoplasma e dunque anche simultaneamente, in quella eucariotica la trascrizione avviene nel nucleo, e la traduzione nel citoplasma, dunque l’mRNA deve prima uscire dal nucleo (e subire alcune modifiche) per essere tradotto. I PRINCIPI GENERALI DELLA REGOLAZIONE GENETICA - Alcuni geni sono presenti in tutti gli organismi: questi compongono il genoma minimo, costituito soltanto da sequenze di DNA indispensabili alla vita. Nel 2016 un gruppo di scienziati ha creato la cellula sintetica minima (genoma più piccolo mai osservato - 473 geni, e conosciamo la funzione solo di 300 di questi). - Esiste un processo chiamato regolazione genica che permette di attivare o disattivare geni non sempre necessari alla cellula (geni regolati) di modo da evitare un consumo eccessivo di energia. In questi termini i geni indispensabili alla cellula per tutto l’arco della sua vita sono detti geni costitutivi. - Il controllo della trascrizione avviene mediante alcune proteine chiamate fattori di regolazione della trascrizione, che si legano al DNA nel promotore -dove ha inizio la trascrizione- al fine di impedire (repressori) o favorire (attivatori) il processo. LA REGOLAZIONE GENICA NEI PROCARIOTI Le nostre conoscenze si basano su un modello noto come operone: un’unità di trascrizione sotto il controllo di una sequenza regolatrice chiamata operatore. L’operone è controllato da dei fattori proteici che possono indurre (attivatori, controllo positivo) o reprimere (repressori, controllo negativo) la trascrizione. Esistono due tipologie di controllo negativo: - gli operoni inducibili dove il repressore blocca l’operatore, rimosso se dall’esterno giunge l’induttore. Esempio: l’operone lac, che codifica gli enzimi che digeriscono il lattosio (l’induttore è il lattosio) - gli operoni reprimibili dove il repressore funziona solo in presenza del corepressore. Esempio: l’operone trp, controlla la sintesi del triptofano (il corepressore è il triptofano) LA REGOLAZIONE GENETICA PRIMA E DURANTE LA TRASCRIZIONE I genomi eucariotici presentano una maggiore complessità: all’azione dei promotori si somma quella si sequenze supplementari. Grazie a queste si possono ottenere varie intensità del processo di trascrizione di un gene, inoltre la regolazione genica può avvenire prima, durante o dopo il processo di trascrizione. In stratta relazione con il tasso di espressione genica è il grado di condensazione della cromatina: mentre durante la divisione cellulare la cromatina è strettamente spiralizzata (etero-cromatina), e dunque inibisce la trascrizione (poiché impedisce il contatto tra i cromosomi e il complesso della trascrizione), durante l’interfase la cromatina è decondensata (eu-cromatina) dunque favorisce il processo. È possibile comunque che un segmento di DNA si despiralizzi temporaneamente per permettere la trascrizione, grazie a degli attivatori proteici in grado di alterare la struttura dei nucleosomi (istoni). Unica analogia con i procarioti è la presenza di un promotore e un terminatore. Alcune differenze: - negli eucarioti, invece che raggruppati in operoni, i geni tendono ad essere sparsi. - presenza di tre RNA polimerasi, ciascuna specifica alla produzione di un gene (che codifica rRNA, proteine, tRNA). - i promotori sono costituiti da più elementi promotori: • la TATA box, sito d’attacco della RNA polimerasi • la RNA polimerasi non riconosce il promotore, ma necessita di almeno 5 fattori di trascrizione • le enhancer o silencer, a seconda se favoriscono o inibiscono la trascrizione LA MATURAZIONE DELL’MRNA E LO SPLICING ALTERNATIVO Spesso le sequenze codificanti dei geni, dette esoni, si alternano ad altre, dette introni. Prima di passare al citoplasma il pre-mRNA affronta lo splicing, meccanismo all’interno del quale gli introni vengono tagliati attraverso lo splicesoma e gli esoni vengono saldati. A concludere la maturazione dell’mRNA l’aggiunta alla coda 3’ di una sequenza nucleotidica, la coda poliA, formata da sole basi di adenina, che favorisce la stabilità della molecola e la sua permanenza nel citoplasma. Prima che la trascrizione sia completata viene aggiunto all’estremità 5’ un cappuccio necessario all’uscita dell’mRNA. LA REGOLAZIONE TRADUZIONALE E POST-TRADUZIONALE L’azione di un repressore traduzionale può impedire all’mRNA di attaccarsi ai ribosomi. I repressori più comuni sono quelli che interferiscono con l’mRNA (ad esempio neutralizzandolo una volta svolta la sua funzione). Alcuni esempi sono i microRNA e i brevi RNA interferenti. Si può inoltre regolare la longevità di una cellula con il sistema ubiquitina-proteasoma: prima di tutto viene marcata la molecola con l’obliquitina, poi entra nel proteasoma che le separa e demolisce la molecola.
