LE TECNICHE DI SEMINA
Con il nome di semina si intende l’operazione attraverso la quale si immette un inoculo (cioè poche cellule
vive) di un campione contente microrganismi a contatto con terreni di coltura allestiti in piastra e in
provetta.
L’inoculo può essere seminato:
•
in piastra contenete terreno solido,
•
in provetta con terreno liquido,
•
in provetta con terreno solidificato a”becco di clarino”.
Dopo incubazione in termostato a 37°C per 2‐3 giorni le cellule batteriche inoculate, invisibili ad occhio
nudo, si saranno moltiplicate in modo tale da formare delle colonie visibili ad occhio nudo.
Per esercitarsi con le tecniche di semina, ad ogni gruppo di lavoro viene assegnata una coltura batterica
pura (brodocoltura starter preparata dall’insegnante), cioè costituita da un unico ceppo microbico. Le
colonie cresciute saranno oggetto di caratterizzazione microbica.
SEMINA IN PIASTRA MEDIANTE INCLUSIONE O DIFFUSIONE
La tecnica di inclusione in piastra prevede dapprima di inoculare la piastra con il campione liquido
in esame e, successivamente, di versare sopra ad esso il terreno agarizzato liquefatto e raffreddato a circa
45°‐50°C (non superiore altrimenti l’eccessivo calore può uccidere le cellule batteriche).
In questo modo le colonie, dopo incubazione in termostato a temperatura opportuna, crescono e si
sviluppano sia all’interno che sulla superficie del terreno.
Se la concentrazione microbica del campione seminato non è troppo elevata, si riesce ad ottenere una
buona distribuzione delle colonie, cioè le colonie crescono isolate le une dalle altre. In genere tale tecnica
di semina viene utilizzata:
•
per studiare la morfologia della colonia, in quanto le colonie isolate sono più facilmente osservabili,
•
per l’analisi quantitativa, in quanto, essendo le colonie isolate e non sovrapposte, si riescono a
contare (per il momento, però, questo aspetto non verrà preso in considerazione),
•
per ottenere una coltura di partenza da cui effettuare poi successivi trapianti in altri tipi di terreni
(anche questo aspetto, per il momento, non verrà affrontato).
Materiale occorrente brodocoltura starter (preparata dall’insegnante)
terreno di coltura: AGAR TRIPTONE SOIA (ATS) sterile liquefatto 1 piastra Petri in plastica sterile
1 pipetta monouso in plastica da 1 mL bunsen
Procedimento
Lavorare con tecnica sterile: disinfettare il piano di lavoro con alcool denaturato, accendere il bunsen.
Siglare la piastra.
Agitare senza capovolgere (i tappi a molla non sono a tenuta ermetica!!!) la brodocoltura starter.
Togliere il tappo e flambare velocemente l’imboccatura della provetta.
Prelevare 0,5 mL (≈10 gocce) della brodocoltura starter e depositarla al centro della piastra sollevando
leggermente il coperchio. Richiudere subito il coperchio della piastra.
Aprire e flambare il recipiente contenente il terreno di coltura ATS liquefatto e raffreddato a 45°‐50°C e
versarne circa 4‐5 mm sopra all’inoculo nella piastra. Richiudere, flambando, il recipiente contenente il
terreno.
Chiudere rapidamente la piastra e miscelare con leggero movimento rotatorio sia in senso orario che
antiorario, quindi lasciare la piastra ferma e chiusa in posizione orizzontale fino a quando il terreno non si è
solidificato.
Rovesciare la piastra e incubare in termostato a 36°C per 48 ore.
S
NTO
SEMINA IN PIASTRA MEDIANTE STRISCIAMEN
LLa tecnica di
d strisciame
ento in piasstra prevede
e dapprima di allestiree la piastra con il terreeno
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mpletamentee e,
successivvamente di seminare so
opra la sua superficie laa coltura miicrobica in eesame mediante opporttuni
movimenti sulla sup
perficie del terreno sol idificato (l’aansa non de
eve scalfire iil terreno, da
d cui deriva il
termine “strisciamen
nto”) dell’ansa sterile.
Esistono
o varie tecnicche di strisciamento su ppiastra (in se
eguito sono riportate
r
duee modalità, ma ne esisto
ono
molte aaltre), aventti tutte l’ob
biettivo com
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In generale tale tecn
nica di semina viene utilizzzata:
•
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per studiare la morfologia della colonnia, in quantto le colonie isolate sonoo più facilmen
nte osservab
bili,
•
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per verificarre la presenza/assenza di microrgan
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nto,
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in conssiderazione),,
•
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per otteneree una coltura
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(anche q
questo aspetto, per il mo
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Materialle occorrentee brodocoltura starter (preparata dall’insegnan
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terreno di coltura: AGAR TRIPTONE SOIA (ATTS) sterile liqu
uefatto 2 pia
astre Petri in plastica sterile
1 ansa di metallo bunsen
Strisciam
mento a linea continua
Sterilizzare l’ansaa di metallo
o per arroveentamento sulla fiamm
ma del bunssen, farla
raffreddare per 20‐‐30 secondi all’aria, quiindi prelevare un’ansata
a della broddocoltura
starter e depositarlaa, tenendo so
olo leggermeente sollevatto il coperchio, in un punnto vicino
al bordo
o della prima piastra Petri con terrenoo solidificato
o.
Stando vicino allaa fiamma de
el bunsen e con il cope
erchio della piastra legggermente
o, strisciare l’inoculo
l
disttribuendolo avanti e indiietro da un bordo
b
all’altrro a linee
sollevato
continuee e parallelee su tutta la
a superficie del terreno
o, senza ma
ai staccare l ’ansa. Al
termine,, richiudere la
l piastra.
mento a lineee a zig‐zag
Strisciam

Sterilizzare
metallo per arroventam
mento sulla fiamma del bunsen, faarla
l’ansa di m
raaffreddare per
p 20‐30 seecondi all’arria, quindi prelevare un ’ansata della brodocolttura
sttarter e depositarla, teenendo solo
o leggermentte sollevato il coperchio, in un punto
vicino al bordo della piast ra Petri con terreno solid
dificato.

Stando
vicino alla fiam
mma del bun
nsen e con il coperchioo della piastrra leggermente
so
ollevato, strissciare l’inocuulo distribue
endolo avantti e indietro dda un bordo all’altro a lin
nee
co
ontinue e pa
arallele fino a ricoprire circa un terzo della piaastra; sterilizzare di nuo
ovo
l’aansa sulla fia
amma e raffrreddarla, ruo
otare la piasttra di circa 445° e continu
uare a seminare
paartendo dalll’estremità ffinale preced
dente fino a ricoprire uun altro terzo della piasttra.
Co
ontinuare in questo moddo, sterilizzaando e raffre
eddando l’annsa ogni volta che si cam
mbia
diirezione.

Rovesciare
le piastre e iincubare in termostato
t
a 36°C per 488 ore.
SEMINA IN PROV
VETTA CON TTERRENO A BECCO
B
DI CLA
ARINO
Le colture sviluppate in provetta con terreno a becco di clarino (anche chiamato slant o agar
inclinato) vengono utilizzate in laboratorio per il mantenimento e la conservazione dei batteri aerobi che, se
collocati in ambiente refrigerato e in provetta sempre mantenuta sterile, sono in grado di sopravvivere
anche per alcuni mesi.
La coltura su slant viene perciò utilizzata come coltura di mantenimento e di riserva del microrganismo in
esame, dalla quale si possono periodicamente effettuare altri trapianti su terreno fresco per mantenere in
vita i microrganismi.
Materiale occorrente brodocoltura starter (preparata dall’insegnante)
terreno di coltura: AGAR TRIPTONE SOIA (ATS) sterile liquefatto 1 provetta con tappo sterile
portaprovette
1 ansa di metallo bunsen
Procedimento
Lavorare con tecnica sterile: disinfettare il piano di lavoro con alcool denaturato, accendere il bunsen.
Siglare la provetta.
Aprire e flambare il recipiente contenente il terreno di coltura ATS liquefatto e raffreddato a 45°‐50°C e
la provetta, quindi versare in essa circa 10 mL di terreno. Richiudere, flambando, sia il recipiente con il
terreno, sia la provetta e i rispettivi tappi di metallo.
Lasciare solidificare il terreno su piano inclinato, in modo tale che approssimativamente 2/3 del
contenuto risulti inclinato e 1/3 cilindrico.
Agitare senza capovolgere (i tappi a molla non sono a tenuta ermetica!!!) la brodocoltura starter.
Togliere il tappo e flambare velocemente l’imboccatura della provetta.
Sterilizzare l’ansa di metallo sulla fiamma del bunsen, farla raffreddare per 20‐30 secondi all’aria, quindi
prelevare un’ansata della brodocoltura.
Aprire rapidamente lo slant, flambare velocemente l’imboccatura, quindi depositare l’inoculo sul fondo
della superficie inclinata del terreno e risalire verso l’alto con l’ansa strisciando a zig‐zag sulla superficie del
terreno senza scalfirlo.
Ripetere più volte l’inoculo in modo da ottenere un’abbondante crescita sullo slant.
Richiudere entrambe le provette riflambando imboccature e tappi.
Incubare in termostato a 36°C per 48 ore.
SEMINA IN PROVETTA CON TERRENO LIQUIDO
Il trapianto di una colonia da un terreno liquido ad un altro viene effettuata per preparare una coltura di
lavoro del microrganismo in esame, cioè una sospensione batterica adatta ad ogni tipo di indagine
microbiologica di identificazione.
Materiale occorrente brodocoltura starter (preparata dall’insegnante)
terreno di coltura: BRODO TRIPTONE SOIA (BTS) sterile 1 provetta con tappo sterile
portaprovette
1 ansa di metallo bunsen
Procedimento
Lavorare con tecnica sterile: disinfettare il piano di lavoro con alcool denaturato, accendere il bunsen.
Siglare la provetta.
Aprire e flambare il recipiente contenente il terreno di coltura BTS e la provetta, quindi versare in essa
circa 5 mL di terreno. Richiudere, flambando, sia il recipiente con il terreno, sia la provetta e i rispettivi
tappi di metallo.
Agitare senza capovolgere (i tappi a molla non sono a tenuta ermetica!!!) la brodocoltura starter.
Togliere il tappo e flambare velocemente l’imboccatura della provetta.
Sterilizzare l’ansa di metallo sulla fiamma del bunsen, farla raffreddare per 20‐30 secondi all’aria, quindi
prelevare un’ansata della brodocoltura starter.
Aprire rapidamente la provetta con BTS, flambare velocemente l’imboccatura, quindi immergete l’ansa
con l’inoculo in profondità nel BTS.
Ripetere più volte l’inoculo in modo da ottenere un’abbondante crescita nel BTS.
Richiudere entrambe le provette riflambando imboccature e tappi.
Incubare in termostato a 36°C per 48 ore.