LE TECNICHE DI SEMINA Con il nome di semina si intende l’operazione attraverso la quale si immette un inoculo (cioè poche cellule vive) di un campione contente microrganismi a contatto con terreni di coltura allestiti in piastra e in provetta. L’inoculo può essere seminato: • in piastra contenete terreno solido, • in provetta con terreno liquido, • in provetta con terreno solidificato a”becco di clarino”. Dopo incubazione in termostato a 37°C per 2‐3 giorni le cellule batteriche inoculate, invisibili ad occhio nudo, si saranno moltiplicate in modo tale da formare delle colonie visibili ad occhio nudo. Per esercitarsi con le tecniche di semina, ad ogni gruppo di lavoro viene assegnata una coltura batterica pura (brodocoltura starter preparata dall’insegnante), cioè costituita da un unico ceppo microbico. Le colonie cresciute saranno oggetto di caratterizzazione microbica. SEMINA IN PIASTRA MEDIANTE INCLUSIONE O DIFFUSIONE La tecnica di inclusione in piastra prevede dapprima di inoculare la piastra con il campione liquido in esame e, successivamente, di versare sopra ad esso il terreno agarizzato liquefatto e raffreddato a circa 45°‐50°C (non superiore altrimenti l’eccessivo calore può uccidere le cellule batteriche). In questo modo le colonie, dopo incubazione in termostato a temperatura opportuna, crescono e si sviluppano sia all’interno che sulla superficie del terreno. Se la concentrazione microbica del campione seminato non è troppo elevata, si riesce ad ottenere una buona distribuzione delle colonie, cioè le colonie crescono isolate le une dalle altre. In genere tale tecnica di semina viene utilizzata: • per studiare la morfologia della colonia, in quanto le colonie isolate sono più facilmente osservabili, • per l’analisi quantitativa, in quanto, essendo le colonie isolate e non sovrapposte, si riescono a contare (per il momento, però, questo aspetto non verrà preso in considerazione), • per ottenere una coltura di partenza da cui effettuare poi successivi trapianti in altri tipi di terreni (anche questo aspetto, per il momento, non verrà affrontato). Materiale occorrente brodocoltura starter (preparata dall’insegnante) terreno di coltura: AGAR TRIPTONE SOIA (ATS) sterile liquefatto 1 piastra Petri in plastica sterile 1 pipetta monouso in plastica da 1 mL bunsen Procedimento Lavorare con tecnica sterile: disinfettare il piano di lavoro con alcool denaturato, accendere il bunsen. Siglare la piastra. Agitare senza capovolgere (i tappi a molla non sono a tenuta ermetica!!!) la brodocoltura starter. Togliere il tappo e flambare velocemente l’imboccatura della provetta. Prelevare 0,5 mL (≈10 gocce) della brodocoltura starter e depositarla al centro della piastra sollevando leggermente il coperchio. Richiudere subito il coperchio della piastra. Aprire e flambare il recipiente contenente il terreno di coltura ATS liquefatto e raffreddato a 45°‐50°C e versarne circa 4‐5 mm sopra all’inoculo nella piastra. Richiudere, flambando, il recipiente contenente il terreno. Chiudere rapidamente la piastra e miscelare con leggero movimento rotatorio sia in senso orario che antiorario, quindi lasciare la piastra ferma e chiusa in posizione orizzontale fino a quando il terreno non si è solidificato. Rovesciare la piastra e incubare in termostato a 36°C per 48 ore. S NTO SEMINA IN PIASTRA MEDIANTE STRISCIAMEN LLa tecnica di d strisciame ento in piasstra prevede e dapprima di allestiree la piastra con il terreeno agarizzatto liquefatto o e raffredda ato a 45°‐500°C (non sup periore altrim menti si form ma troppa co ondensa den ntro alla piasstra quando questa vien ne chiusa coon il suo cop perchio), di lasciarlo soliidificare com mpletamentee e, successivvamente di seminare so opra la sua superficie laa coltura miicrobica in eesame mediante opporttuni movimenti sulla sup perficie del terreno sol idificato (l’aansa non de eve scalfire iil terreno, da d cui deriva il termine “strisciamen nto”) dell’ansa sterile. Esistono o varie tecnicche di strisciamento su ppiastra (in se eguito sono riportate r duee modalità, ma ne esisto ono molte aaltre), aventti tutte l’ob biettivo com mune di ino oculare il terreno nel punto di inizio i con una u concentrrazione elevvata di micro organismi, chhe viene poi man mano diluita med iante opporttuni movimeenti nel dell’ansaa (strisciameento dell’anssa), dando coosì luogo allaa formazione di colonie batteriche concentrate c punto dii semina iniziale e poi ma an mano sem mpre più dilu uite e ben sep parate e isolaate le une da alle altre. In generale tale tecn nica di semina viene utilizzzata: • p per studiare la morfologia della colonnia, in quantto le colonie isolate sonoo più facilmen nte osservab bili, • p per verificarre la presenza/assenza di microrgan nismi in un campione i ncognito (pe er il momen nto, però, qu uesto aspetto o non verrà preso p in conssiderazione),, • p per otteneree una coltura a di partenzaa da cui effe ettuare poi successivi traapianti in altri tipi di terrreni (anche q questo aspetto, per il mo omento, non verrà affron ntato). Materialle occorrentee brodocoltura starter (preparata dall’insegnan d nte) terreno di coltura: AGAR TRIPTONE SOIA (ATTS) sterile liqu uefatto 2 pia astre Petri in plastica sterile 1 ansa di metallo bunsen Strisciam mento a linea continua Sterilizzare l’ansaa di metallo o per arroveentamento sulla fiamm ma del bunssen, farla raffreddare per 20‐‐30 secondi all’aria, quiindi prelevare un’ansata a della broddocoltura starter e depositarlaa, tenendo so olo leggermeente sollevatto il coperchio, in un punnto vicino al bordo o della prima piastra Petri con terrenoo solidificato o. Stando vicino allaa fiamma de el bunsen e con il cope erchio della piastra legggermente o, strisciare l’inoculo l disttribuendolo avanti e indiietro da un bordo b all’altrro a linee sollevato continuee e parallelee su tutta la a superficie del terreno o, senza ma ai staccare l ’ansa. Al termine,, richiudere la l piastra. mento a lineee a zig‐zag Strisciam Sterilizzare metallo per arroventam mento sulla fiamma del bunsen, faarla l’ansa di m raaffreddare per p 20‐30 seecondi all’arria, quindi prelevare un ’ansata della brodocolttura sttarter e depositarla, teenendo solo o leggermentte sollevato il coperchio, in un punto vicino al bordo della piast ra Petri con terreno solid dificato. Stando vicino alla fiam mma del bun nsen e con il coperchioo della piastrra leggermente so ollevato, strissciare l’inocuulo distribue endolo avantti e indietro dda un bordo all’altro a lin nee co ontinue e pa arallele fino a ricoprire circa un terzo della piaastra; sterilizzare di nuo ovo l’aansa sulla fia amma e raffrreddarla, ruo otare la piasttra di circa 445° e continu uare a seminare paartendo dalll’estremità ffinale preced dente fino a ricoprire uun altro terzo della piasttra. Co ontinuare in questo moddo, sterilizzaando e raffre eddando l’annsa ogni volta che si cam mbia diirezione. Rovesciare le piastre e iincubare in termostato t a 36°C per 488 ore. SEMINA IN PROV VETTA CON TTERRENO A BECCO B DI CLA ARINO Le colture sviluppate in provetta con terreno a becco di clarino (anche chiamato slant o agar inclinato) vengono utilizzate in laboratorio per il mantenimento e la conservazione dei batteri aerobi che, se collocati in ambiente refrigerato e in provetta sempre mantenuta sterile, sono in grado di sopravvivere anche per alcuni mesi. La coltura su slant viene perciò utilizzata come coltura di mantenimento e di riserva del microrganismo in esame, dalla quale si possono periodicamente effettuare altri trapianti su terreno fresco per mantenere in vita i microrganismi. Materiale occorrente brodocoltura starter (preparata dall’insegnante) terreno di coltura: AGAR TRIPTONE SOIA (ATS) sterile liquefatto 1 provetta con tappo sterile portaprovette 1 ansa di metallo bunsen Procedimento Lavorare con tecnica sterile: disinfettare il piano di lavoro con alcool denaturato, accendere il bunsen. Siglare la provetta. Aprire e flambare il recipiente contenente il terreno di coltura ATS liquefatto e raffreddato a 45°‐50°C e la provetta, quindi versare in essa circa 10 mL di terreno. Richiudere, flambando, sia il recipiente con il terreno, sia la provetta e i rispettivi tappi di metallo. Lasciare solidificare il terreno su piano inclinato, in modo tale che approssimativamente 2/3 del contenuto risulti inclinato e 1/3 cilindrico. Agitare senza capovolgere (i tappi a molla non sono a tenuta ermetica!!!) la brodocoltura starter. Togliere il tappo e flambare velocemente l’imboccatura della provetta. Sterilizzare l’ansa di metallo sulla fiamma del bunsen, farla raffreddare per 20‐30 secondi all’aria, quindi prelevare un’ansata della brodocoltura. Aprire rapidamente lo slant, flambare velocemente l’imboccatura, quindi depositare l’inoculo sul fondo della superficie inclinata del terreno e risalire verso l’alto con l’ansa strisciando a zig‐zag sulla superficie del terreno senza scalfirlo. Ripetere più volte l’inoculo in modo da ottenere un’abbondante crescita sullo slant. Richiudere entrambe le provette riflambando imboccature e tappi. Incubare in termostato a 36°C per 48 ore. SEMINA IN PROVETTA CON TERRENO LIQUIDO Il trapianto di una colonia da un terreno liquido ad un altro viene effettuata per preparare una coltura di lavoro del microrganismo in esame, cioè una sospensione batterica adatta ad ogni tipo di indagine microbiologica di identificazione. Materiale occorrente brodocoltura starter (preparata dall’insegnante) terreno di coltura: BRODO TRIPTONE SOIA (BTS) sterile 1 provetta con tappo sterile portaprovette 1 ansa di metallo bunsen Procedimento Lavorare con tecnica sterile: disinfettare il piano di lavoro con alcool denaturato, accendere il bunsen. Siglare la provetta. Aprire e flambare il recipiente contenente il terreno di coltura BTS e la provetta, quindi versare in essa circa 5 mL di terreno. Richiudere, flambando, sia il recipiente con il terreno, sia la provetta e i rispettivi tappi di metallo. Agitare senza capovolgere (i tappi a molla non sono a tenuta ermetica!!!) la brodocoltura starter. Togliere il tappo e flambare velocemente l’imboccatura della provetta. Sterilizzare l’ansa di metallo sulla fiamma del bunsen, farla raffreddare per 20‐30 secondi all’aria, quindi prelevare un’ansata della brodocoltura starter. Aprire rapidamente la provetta con BTS, flambare velocemente l’imboccatura, quindi immergete l’ansa con l’inoculo in profondità nel BTS. Ripetere più volte l’inoculo in modo da ottenere un’abbondante crescita nel BTS. Richiudere entrambe le provette riflambando imboccature e tappi. Incubare in termostato a 36°C per 48 ore.
