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Scienze Lezione 4

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IL CITOFLUORIMETRO
E’ uno strumento di laboratorio che permette
un’analisi veloce ed automatica di
popolazioni cellulari in sospensione
misurandone le caratteristiche fisiche e/o biochimiche
(volume, granulosita’, fluorescenza).
Consente di:
- quantificare e memorizzare contemporaneamente più
parametri per ogni cellula che compone la popolazione
- analizzare i dati ottenuti anche dopo l’acquisizione
Basi della citofluorimetria a flusso
La popolazione cellulare in sospensione
viene spinta all’interno di una camera a flusso
dove le singole cellule si dispongono in fila e,
venendo colpite dalla luce di
un raggio laser, riflettono/rifrattono la luce ed
emettono fluorescenza.
Si generano così dei segnali che vengono
raccolti e trasformati in segnali digitali e inviati ad un
computer.
APPLICAZIONI
Determinazione dei marcatori di differenziamento
cellulare, di superficie, intracitoplasmatici e
intranucleari
Valutazione del contenuto cellulare di DNA
Discriminazione tra cellule vive, cellule
apoptotiche e necrotiche
Predisposizione per la separazione cellulare
VANTAGGI dell’ANALISI citofluorimetrica :
• multiparametricità
possibilità di mettere in relazione più caratteristiche
della stessa cellula
• analisi di grandi quantità di cellule
• riproducibilità ed affidabilità statistica delle
acquisizioni
• grande sensibilità
• rapidità di analisi
• possibilità di ulteriori analisi a posteriori ( DIVA,
CELL QUEST, FLOW JO)
FACScalibur
FACScanto
Il citofluorimetro è costituito da quattro elementi:
1. un sistema fluidico per il trasporto del campione nella
cella di analisi
2. un sistema di eccitazione che può essere costituito da
una o più sorgenti luminose.
3. un sistema ottico elettronico che raccoglie ed elabora i
segnali, composto da lenti, specchi e filtri che inviano i
segnali ai fotomoltiplicatori che ne permettono
l’acquisizione sottoforma di dati digitali.
4. un computer che, tramite specifici programmi, permette
(il controllo dello strumento) e l’analisi dei dati da parte
di un operatore mediante una rappresentazione grafica
(DIVA, FLOW JO, CELL QUEST).
1. Sistema fluidico per il trasporto del campione nella cella di
analisi
Passaggio delle cellule in sospensione in fila, attraverso il raggio laser.
Analisi di una
sospensione di
globuli bianchi
contente linfociti,
m o n o c i t i e
granulociti
granulocito
linfocito
monocito
Il campione viene spinto con
pressione verso il punto di
misura situato all’interno della
camera a flusso, in cui
avviene l’allineamento in
singola fila delle cellule.
La pressione di spinta consente di
contare centinaia di cellule
al secondo
2. Sistema di eccitazione costituito da una o più sorgenti
luminose che generano segnali monocromatici e unidirezionali
che intercettano le cellule nella cella di analisi.
- I citometri con sorgente a luce laser
- I citometri con sorgente a lampada ad arco (più economici perché le lampade
a vapori di Mercurio e Xenon non richiedono raffreddamento).
I citometri con luce laser, sono usati in immunologia ed ematologia, settori
in cui vengono utilizzati maggiormente i fluorocromi.
Il laser consente di misurare minime quantità di fluorocromo.
Nella maggior parte degli strumenti è impiegato un laser a ioni Argon, di
potenza variabile, centrato su una lunghezza di 488nm (blu).
Questa lunghezza d’onda consente un’efficiente misura dei parametri fisici
e può eccitare contemporaneamente diversi fluorocromi.
Per altre lunghezze d’onda si usano laser al Kripton, Elio neon, ecc
3. sistema ottico elettronico che raccoglie ed elabora i segnali,
composto da lenti, specchi e filtri ottici che inviano i segnali ai
fotomoltiplicatori, che amplificano i segnali e ne permettono
l’acquisizione sottoforma di dati digitali.
Fi l tri d i c ro i ci : i “ b a n d p a s s ”
permettono il passaggio della luce
solo ad una certa lunghezza
d’onda.
filtri dicroici
Fotomoltiplicatori
cella di flusso
I fotomoltiplicatori amplificano il segnale luminoso filtrato. Il PMT1
funziona come scatter a 90 gradi, raccoglie la luce rifratta/diffratta
(“scatterata”) dalle cellule.
4. Computer con specifici programmi permette l’analisi dei dati da
parte di un operatore
Scatter Frontale
granulocito
Laser
Sensore (FSC)
linfocito
monocito
Il passaggio delle cellule attraverso il laser, dà origine ad un segnale di
difrazione che viene captato dal sensore che raccoglie la luce nel canale
dello scatter frontale (forward), e che dà informazioni sul volume cellulare.
L’intensita’ del Forward Scatter (FSC) e’ proporzionale alla dimensione e
alla forma delle cellule.
Scatter Laterale
granulocito
Laser
linfocito
Sensore FSC
monocito
Sensore per il 90O SSC
Il passaggio delle cellule dà anche origine ad segnale di rifrazione/
riflessione, che viene captato dal sensore che raccoglie la luce dello Scatter
Laterale, (a 90 gradi) e dà informazioni sulla densità/granularità (compreso il
rapporto nucleo/citoplasma) delle cellule che passano attraverso il laser
Anche l’intensita’ del side scatter e’ proporzionale alla dimensione e alla
forma delle cellule
Proprietà tipiche del Forward e del Side Scatter
Il Forward Scatter è piu’ sensibile alle proprieta’ della superficie cellulare
e pertanto puo’ essere usato per distinguere cellule vive da cellule morte
Il Side Scatter è piu’ sensibile agli organuli presenti all’interno della cellula
e pertanto puo’ essere usato per distinguere cellule granulate da quelle
non-granulate.
La combinazione dei due
tipi di segnale (FSC ed
SSC) permette di ottenere
un diagramma di
dispersione denominato
CITOGRAMMA (a dot
plots), nel quale si
possono evidenziare
differenti popolazioni
cellulari, in base alle sole
caratteristiche fisiche.
detriti
monociti
Linfociti
T,B,NK
Striscio di sangue
Citogramma
Sangue periferico
CITOGRAMMA, nel quale si possono evidenziare 3 differenti
popolazioni cellulari, in base alle sole caratteristiche fisiche.
90 Degree Scatter (SSC)
Esempio di analisi dei leucociti
del sangue perriferico e
“gating” elettronico
si possono identificare tre
popolazioni:
- linfociti,
- monociti
- granulociti.
Forward Scatter (FSC)
Si può disegnare un ”gate”
elettronico che permetterà
in seguito l’analisi del
segnale di fluorescenza
proveniente soltanto della
popolazione scelta
(Isotiocianato di fluoresceina)
(ficoeritrina)
(alloficocianina)
Il diagramma ad istogrammi
rappresenta graficamente la
misura di un singolo parametro.
Gli eventi che si accumulano
nei vari canali vanno a costruire
un diagramma di distribuzione.
La statistica si basa sulla
impostazione di cursori che
definiscono le aree di interesse
calcolando gli eventi che
cadono al loro interno.
FENOTIPO cellule di coltura primaria
da tumore solido gine 2K/97 (Kovarico cellule chiare)
M1
% Gated % Total Mean
100.00 80.61 177.60
96.27 77.60 184.18
M1
% Gated % Total Mean
100.00 77.84
5.94
1.90
1.48 100.97
M1
% Gated % Total Mean
100.00 80.15 61.59
39.51 31.66 147.87
M1
% Gated % Total Mean
100.00 74.10 520.02
97.90 72.55 531.01
CD56 PC5
13%
11%
64%
CD3 FITC
0%
29%
0%
29%
Quad Events % Gated
UL
4081
40.61
UR
891
8.87
LL
1494
14.87
LR
3584
35.66
Quad Events % Gated
UL
9612
94.57
UR
61
0.60
LL
279
2.74
LR
212
2.09
Quad Events % Gated
UL
868
24.21
UR
1808
50.43
LL
293
8.17
LR
616
17.18
IMPORTANZA DELLA COMPENSAZIONE
Sottrarre dal canale del rosso una quota fissa di segnale
che deriva dal verde e viceversa
Cellule in fase G2 e M
hanno una quantità
doppia di DNA rispetto
a cellule in fase G1.
Cellule in fase S hanno
una quantità
intermedia di DNA
perché in fase di
replicazione.
Per determinare il tipo di morte cellulare (apoptosi o necrosi)
si utilizzano Annessina V-FITC e ioduro di propidio (PI)
L’annessina si lega alla fosfatidilserina
(fosfolipide normalmente situato nel
lato interno della membrana cellulare).
Lo ioduro di propidio (intercalante del
DNA), si intercala stechiometricamente
quando la membrana cellulare non è
integra.
Le cellule negative all’annessina e allo ioduro di propidio sono cellule vive.
Le cellule positive solo all’annessina sono cellule in fase precoce di apoptosi
poiché presentano la traslocazione del fosfolipide;
Le cellule positive all’annessina e allo ioduro di propidio sono invece
cellule o in fase avanzata di apoptosi o cellule necrotiche.
Il “Sorting cellulare”
FACS:
Fluorescence
Activated
Cell
Sorting
Piastre cariche
elettricamente
Cellule singole separate
dentro diverse provette
FSC
Fluorescence detector
Il campione viene
frammentato in minuscole
goccioline, ognuna delle
quali contiene una cellula.
Le gocce che contengono
cellule con caratteristiche
rientranti nei parametri
prefissati si presentano
elettricamente cariche ed
indirizzate in appositi
raccoglitori da placche di
deflessione.
Il “Sorting cellulare”
Il campione viene
frammentato in minuscole
goccioline, ognuna delle
quali contiene una cellula.
Piastre cariche
elettricamente
Cellule singole separate
Le gocce che contengono
cellule con caratteristiche
rientranti nei parametri
prefissati si presentano
elettricamente cariche ed
indirizzate in appositi
raccoglitori da placche di
deflessione.
Le NK rappresentano una sottopopolazione di linfociti
presenti nel sangue periferico dal 5% al 20%. Sono cellule
dell’immunità innata in grado di riconoscere ed uccidere cellule
tumorali e/o infettate da virus
DNAM-1
CD2
CD16
Ogni cellula NK presenta recettori
attivatori e inibitori
I recettori inibitori riconoscono
sulla cellula bersaglio le molecole
HLA di classe I self
I recettori attivatori riconoscono
ligandi ancora non del tutto noti
sulla superficie delle cellule
bersaglio
+
KIR
KAR
+
CD94/NKG2A
CD94/NKG2C
ILT2
+
+
NK
Cell
+ +
+
+
+
+
+
+
LAIR 1 p75/ IRp60
AIRM1
NTB-A
2B4
NKp46
NKp30
NKp44
NKG2D
NKp80
LINEE DI RICERCA DEL NOSTRO LABORATORIO
-Immunodeficienze primarie (pazienti pediatrici)
-Pazienti adulte affette da vari tipi carcinaoma ovarico
-Produzione di anticorpi monoclonali
Materiale utilizzato:
-Sangue periferico
-Liquido peritoneale
-Pezzo bioptico (tumorale) (incluso in paraffina o congelato)
Valutazioni fenotipiche e funzionali delle NK presenti in circolo, nel liquido peritoneale
e nei tessuti tumorali.
Analisi dei ligandi riconosciuti dalle cellule NK a livello delle cellule tumorali purificate
dalla massa tumorale.
Isoliamo le cellule mononucelate presenti nel sangue periferico mediante
centrifugazione in gradiente di densità e analizziamo il campione linfocitario così
separato
A livello del PLB troviamo le NK Resting, cioè le NK “non attivate” .
Quando le NK si attivano, sotto stimoli specifici, esprimono con Intensità differente
vari recettori di superficie.
Possiamo inoltre far crescere in coltura popolazioni policlonali di NK attivate con IL2
sulle quali fare ulteriori analisi dei recettori espressi in superficie.
Esistono due diversi subsets di cellule Natural Killer
Caratteristiche fenotipiche delle cellule Natural Killer
umane.
38%
CD3 CD56 CD56 Le cellule natural Killer rappresentano la terza linea linfocitaria del sistema
immunitario (dal 5% al 20% dei linfociti nel sangue periferico). Sono presenti nella
milza mentre negli organi linfoidi sono scarsamente rappresentate.
Si differenziano dai linfociti T e B per l’assenza dei convenzionali recettori per
l’antigene quali le immunoglobuline di membrana o il recettore delle cellule T (TCR),
e sono caratterizzate dall’espressione sulla loro superficie della molecola CD16 e CD56
CD16 PBL CTR
R4
CD56+/CD3-
CD56 bright 19%
CD56 dim Anti-NKp46
Anti-CD16
Anti-KIRs
Anti-HLA classe I
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